專利名稱：一種黃籽甘藍(lán)型油菜種質(zhì)的創(chuàng)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于作物的新種質(zhì)創(chuàng)建領(lǐng)域，具體的說是屬于甘藍(lán)型油菜黃籽新種質(zhì)的創(chuàng)建方法的發(fā)明。涉及十字花科蕓薹屬內(nèi)的遠(yuǎn)緣雜交技術(shù)和常規(guī)田間雜交技術(shù)。
背景技術(shù)：
油菜為十字花科蕓薹屬栽培植物，而甘藍(lán)型油菜則是蕓薹屬中作為油料作物的主要栽培種。日本學(xué)者盛永、禹長(zhǎng)春等人(實(shí)用油菜栽培學(xué)，劉后利主編，上海科學(xué)技術(shù)出版社，1987，P37-40)，通過對(duì)蕓薹屬內(nèi)植物不同的種間雜交及其雜種細(xì)胞學(xué)研究，提出了“禹氏三角”的模型，即十字花科蕓薹屬的三個(gè)基本種為甘藍(lán)(染色體組為CC，η = 9)、白菜(染色體組為ΑΑ，η = 10)和黑芥(染色體組為ΒΒ，η = 8)，三者兩兩雜交分別可人工合成三個(gè)異源四倍體復(fù)合種甘藍(lán)型油菜(染色體組為AACC，η = 19)、薺菜型油菜(染色體組為ΑΑΒΒ， η = 18)和埃芥(染色體組為BBCC，n = 17)。它首次系統(tǒng)的在理論上明確了采用甘藍(lán)(染色體組為CC，η = 9)和白菜(染色體組成為ΑΑ，η = 10)可以定向的合成甘藍(lán)型油菜(染色體組為AACC，n = 19)。該模型也在隨后大量的人工合成實(shí)踐中得到證實(shí)。近年來，隨著甘藍(lán)型油菜應(yīng)用研究的迅速深入，甘藍(lán)型油菜的遺傳資源也日顯狹窄。研究者積極通過采用不同的甘藍(lán)和白菜品系來合成甘藍(lán)型油菜新品系，以擴(kuò)充甘藍(lán)型油菜種質(zhì)的遺傳基礎(chǔ)。黃籽油菜，顧名思義，是指種子顏色表現(xiàn)為偏黃色至純黃色的甘藍(lán)型油菜。黃籽油菜所生產(chǎn)的菜籽以其含油量相對(duì)較高、纖維素少、油脂鮮亮等優(yōu)點(diǎn)，在國(guó)際市場(chǎng)具有較高的競(jìng)爭(zhēng)力，因此黃籽性狀是現(xiàn)今油菜育種上一個(gè)十分重要的目標(biāo)。黃籽油菜品種的選育離不開黃籽種質(zhì)的利用，因此創(chuàng)建新的黃籽甘藍(lán)型油菜種質(zhì)，擴(kuò)大黃籽基因源是促進(jìn)我國(guó)黃籽油菜品種選育的一個(gè)重要內(nèi)容。黃籽油菜種質(zhì)創(chuàng)建的方法很多，大致有以下幾種1)利用天然突變技術(shù)人工定向選擇黃籽種質(zhì)。在自然界中，甘藍(lán)型油菜本身具有一些偏向于黃籽的種子顏色，如棕黃、淺黃等，通過人工定向選擇，將偏黃的種子選出播種，多代選擇，有可能選育出具有黃籽性狀的株系。該方法是較傳統(tǒng)的黃籽選育方法，但存在選育時(shí)間長(zhǎng)、株系經(jīng)濟(jì)性狀差等缺點(diǎn)；2) 利用誘變技術(shù)改變基因序列從而獲得具有黃籽突變進(jìn)而選擇黃籽材料。利用物理的射線或化學(xué)的誘變劑對(duì)種子等外植體進(jìn)行誘變，在后代分離群體中尋找具有黃籽性狀的單株，再結(jié)合定向選擇獲得黃籽種質(zhì)。該方法存在誘變方向不明確、工作量極大、選育時(shí)間很長(zhǎng)等缺點(diǎn)；3)利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將外源黃籽基因轉(zhuǎn)入油菜中獲得黃籽材料。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)的不斷完善，將外源黃籽基因轉(zhuǎn)入油菜已相對(duì)容易，但由于缺乏已知的黃籽基因、基因表達(dá)不穩(wěn)定以及性狀不表現(xiàn)等諸多缺陷，到目前為止，該技術(shù)在油菜黃籽研究領(lǐng)域還未能進(jìn)入實(shí)用階段；4)利用蕓薹屬黃籽原始親本進(jìn)行遠(yuǎn)緣雜交獲得黃籽材料。已有研究者利用該方法獲得黃籽甘藍(lán)型油菜種質(zhì)。但此法成功率相對(duì)較低。以上方法在實(shí)用中均具有各自的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。在黃籽甘藍(lán)型油菜的種質(zhì)創(chuàng)建過程中，仍需要一種成功率更高的方法。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明的目的就是針對(duì)目前我國(guó)黃籽油菜種質(zhì)創(chuàng)建效率不高的現(xiàn)狀，利用現(xiàn)有蕓薹屬原始親本的黃籽資源創(chuàng)建黃籽甘藍(lán)型油菜新種質(zhì)，擴(kuò)大黃籽油菜種質(zhì)資源，從而獲得能夠商業(yè)化利用的新的基因資源，以提高我國(guó)商品油菜籽的優(yōu)質(zhì)化，提升其國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)力。同時(shí)該技術(shù)僅涉及遠(yuǎn)緣雜交技術(shù)和常規(guī)田間雜交技術(shù)，比較容易操作而且具有較高的成功率。技術(shù)方案
一種黃籽甘藍(lán)型油菜種質(zhì)的創(chuàng)建方法，包括
1)原始親本采用具有黃籽性狀的甘藍(lán)品種(系)和黃籽性狀的白菜品種(系)雜交；
2)遠(yuǎn)緣雜交采用花期人工授粉，并結(jié)合胚搶救和染色體加倍技術(shù)獲得四倍體雜種； 通過對(duì)Fl代胚搶救、染色體加倍技術(shù)和人工進(jìn)行自交授粉后得到四倍體遠(yuǎn)緣雜種；
3)細(xì)胞學(xué)鑒定對(duì)獲得的雜種進(jìn)行細(xì)胞學(xué)鑒定，確認(rèn)所獲得雜交種為甘藍(lán)型油菜(染色體組為 AACC，η = 19)；
4)開放授粉雜種種植后采取開放授粉獲得后代種子；
5)雜交后代單株采用兩兩套袋雜交的方式促進(jìn)黃籽基因的組合，對(duì)具有黃籽性狀的株系進(jìn)行系譜法選擇，進(jìn)而獲得黃籽甘藍(lán)型油菜新種質(zhì)。所述胚搶救為將胚取出放于MS培養(yǎng)基上，待其長(zhǎng)成小苗后，移栽入大田；
所述染色體加倍技術(shù)為在遠(yuǎn)緣雜種花期，對(duì)雜種單株的花蕾噴施0. 5g/L的秋水仙素溶液，連續(xù)噴施7天，待發(fā)現(xiàn)其花藥具有花粉，證實(shí)加倍成功；
所述細(xì)胞學(xué)鑒定為于雜種花期取花蕾固定壓片，并選取處于中期或后期的花粉母細(xì)胞進(jìn)行染色體數(shù)目計(jì)數(shù)，若為19對(duì)，該雜種即是甘藍(lán)型油菜，染色體組為AACC，η = 19。有益效果本發(fā)明的技術(shù)思路是
1、選擇黃籽的甘藍(lán)和白菜品種(系)，保證在后代選擇中具有黃籽基因來源；
2、遠(yuǎn)緣雜種開放授粉，不僅讓兩原始親本的黃籽微效基因在雜種內(nèi)互作，而且使原始親本中黃籽基因位點(diǎn)的等位基因能夠重新組合；
3、采用兩兩雜交的方式進(jìn)一步促進(jìn)黃籽基因在內(nèi)部重組進(jìn)而提高黃籽出現(xiàn)頻率，提高新種質(zhì)選擇效果。本發(fā)明主要技術(shù)效果
1、采用具有黃籽性狀的原始親本，可保證后代具有黃籽基因來源；
2、雜種后代開放授粉加速黃籽基因重組，可提高分離世代選擇到黃籽種質(zhì)的頻率；
3、兩兩套袋雜交進(jìn)一步促進(jìn)黃籽基因內(nèi)部重組，促進(jìn)黃籽種質(zhì)出現(xiàn)。本發(fā)明
具體實(shí)施例方式
一種黃籽甘藍(lán)型油菜種質(zhì)的創(chuàng)建方法，包括
1、原始親本選擇選取我國(guó)較為廣泛存在的黃籽白菜和黃籽甘藍(lán)資源；
2、遠(yuǎn)緣雜交采用花期人工授粉，并結(jié)合胚搶救和染色體加倍技術(shù)獲得四倍體雜種；
3、開放授粉由于甘藍(lán)與白菜雜交后代多表現(xiàn)為自交不親合，因此采取開放授粉獲得后代種子；
4、后代單株兩兩雜交采用兩兩套袋雜交的方式促進(jìn)黃籽基因的迅速組合，提高黃籽種質(zhì)出現(xiàn)頻率；5，常規(guī)選擇黃籽種質(zhì)利用目測(cè)比較，系譜法選擇獲得黃籽甘藍(lán)型油菜新種質(zhì)。實(shí)施時(shí)間2005-2009年度
實(shí)施地點(diǎn)江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物所油菜育種試驗(yàn)田
實(shí)施方案2005年秋田間種植黃籽白菜品種揚(yáng)油3號(hào)(江蘇省油菜審定品種)和黃籽甘藍(lán)品種青峰(國(guó)家甘藍(lán)審定品種)，2006年春季花期以揚(yáng)油3號(hào)為母本，于當(dāng)日午后人工授以甘藍(lán)花粉， 隨后套袋以免外來花粉傳入，約20-25天后，選取具有膨大狀角果(仍呈現(xiàn)綠色的角果)進(jìn)行胚搶救處理，即將胚取出放于MS培養(yǎng)基上，待其長(zhǎng)成小苗后，于2006年秋季移栽入大田。2007年春季花期，對(duì)雜種株的花蕾噴施0. 5mg/L的秋水仙素溶液，連續(xù)噴施7 天，發(fā)現(xiàn)其花藥具有花粉，證實(shí)加倍成功，隨后進(jìn)行人工自交授粉，套袋，得到雜種種子。2007年秋季播種大田，2008年春季花期雜種開花正常。于蕾期取長(zhǎng)度約2mm的花蕾直接放入卡諾固定液中固定，直至花蕾褪色變白。從幼嫩花蕾中任意取出花藥并搗碎， 滴加番紅染液，鏡檢選擇具有減數(shù)分裂時(shí)期花粉母細(xì)胞的花蕾。中選花蕾重新放入固定液中-20°C保存?zhèn)溆?。然后將花藥從中選花蕾中剝出，置于檸檬酸緩沖液中靜置20分鐘后，取出吸干水分，酸解后，采用卡寶品紅染液染色，壓片后鏡檢觀察。染色體計(jì)數(shù)后發(fā)現(xiàn)雜種為 19對(duì)染色體，因此確認(rèn)其染色體組組成為AACC (η = 19)，即為甘藍(lán)型油菜。選取部分單株套袋，其余開放授粉，收獲時(shí)發(fā)現(xiàn)套袋分支未收到一粒種子，而未套袋分支結(jié)實(shí)良好，說明遠(yuǎn)緣雜種表現(xiàn)為高度自交不親合。故收取開放結(jié)實(shí)種子。2008年秋種植該種子，2009年花期采取大量(約100對(duì))兩兩單株套袋的方式進(jìn)行雜交，收獲種子時(shí)獲得14份黃籽率>90%的株系(比率達(dá)14%)，其中黃籽率> 95%、含油量大于43%的材料有5份，這在甘藍(lán)型油菜新種質(zhì)選育中比率已經(jīng)很可觀，較常規(guī)選育頻率高。因此這些黃籽株系為定向合成的具有實(shí)用價(jià)值的新型黃籽甘藍(lán)型油菜種質(zhì)。實(shí)施效果僅經(jīng)過4年的時(shí)間即得到基因組組成為AACC (η = 19)的黃籽甘藍(lán)型油菜新種質(zhì)14份，這在油菜新種質(zhì)創(chuàng)建中具有相對(duì)較高的效率。本方法是利用具有黃籽性狀的原始親本，故在后期的選擇中有的放矢，比利用其它方法創(chuàng)建黃籽新種質(zhì)具有較高的成功率。
權(quán)利要求
1.一種黃籽甘藍(lán)型油菜種質(zhì)的創(chuàng)建方法，其特征在于1)原始親本均具有黃籽性狀；2)遠(yuǎn)緣雜交采用花期人工授粉，并結(jié)合胚搶救和染色體加倍技術(shù)獲得四倍體雜種； 通過對(duì)Fl代胚搶救、染色體加倍技術(shù)和人工進(jìn)行自交授粉后得到四倍體遠(yuǎn)緣雜種；3)細(xì)胞學(xué)鑒定對(duì)獲得的雜交種進(jìn)行細(xì)胞學(xué)鑒定，確認(rèn)所獲得雜種為甘藍(lán)型油菜；4)開放授粉雜種種植后采取開放授粉的方式獲得后代種子；5)雜交后代單株采用兩兩套袋雜交的方式促進(jìn)黃籽基因的組合，對(duì)具有黃籽性狀的株系進(jìn)行系譜法選擇，進(jìn)而獲得黃籽甘藍(lán)型油菜新種質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種黃籽甘藍(lán)型油菜種質(zhì)的創(chuàng)建方法，其特征在于所述原始親本為具有黃籽性狀的白菜品種，染色體組為AA，n = 10和具有黃籽性狀的甘藍(lán)品種，染色體組為 CC，n = 9。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述一種黃籽甘藍(lán)型油菜種質(zhì)的創(chuàng)建方法，其特征在于所述胚搶救為將雜種胚取出后放于MS培養(yǎng)基上，待其長(zhǎng)成小苗后，移栽入大田；所述染色體加倍技術(shù)為在遠(yuǎn)緣雜種花期，對(duì)雜種單株的花蕾噴施0. 5g/L的秋水仙素溶液，連續(xù)噴施7天，待發(fā)現(xiàn)其花藥具有花粉，證實(shí)加倍成功；所述細(xì)胞學(xué)鑒定為于雜種花期取花蕾固定壓片，并選取處于中期或后期的花粉母細(xì)胞進(jìn)行染色體數(shù)目計(jì)數(shù)，若為19對(duì)，該雜種即是甘藍(lán)型油菜，染色體組為AACC，η = 19。
全文摘要
本發(fā)明屬于作物新種質(zhì)創(chuàng)建領(lǐng)域，具體的說是屬于黃籽甘藍(lán)型油菜新種質(zhì)的創(chuàng)建方法的發(fā)明。涉及十字花科蕓薹屬內(nèi)的遠(yuǎn)緣雜交技術(shù)和常規(guī)田間雜交技術(shù)。選擇具有黃籽性狀的白菜(染色體組為AA，n＝10)和黃籽性狀的甘藍(lán)(染色體組為CC，n＝9)為親本，兩者雜交后利用胚搶救技術(shù)和染色體加倍技術(shù)得到異源四倍體雜種苗，即為甘藍(lán)型油菜(染色體組成為AACC，n＝19)，花期開放授粉后收獲種子。次年種植于大田，在花期采用人工兩兩單株套袋的方式雜交并收獲種子，篩選偏黃種子的株系，經(jīng)系譜法選擇得到黃籽甘藍(lán)型油菜種質(zhì)。此方法不僅具有效率高、選育周期短的優(yōu)點(diǎn)，而且得到的黃籽種質(zhì)可用于黃籽甘藍(lán)型油菜品種的選育。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102301946SQ20111021041
公開日2012年1月4日 申請(qǐng)日期2011年7月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月26日
發(fā)明者付三雄, 張潔夫, 戚存扣, 浦惠明, 胡茂龍, 陳 峰, 陳松, 顧慧, 高建芹, 龍衛(wèi)華 申請(qǐng)人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院