專利名稱：斜生纖孔菌3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶a還原酶基因及其編碼的蛋白質(zhì)和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)、基因工程技術(shù)領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及一種在斜生纖孔菌中表達(dá)的IoHMGR蛋白(斜生纖孔菌3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶蛋白，Inonotus obliquus3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase, IoHMGR)及其核酸序列，是斜生纖孔菌3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶基因及其編碼的蛋白質(zhì)和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
斜生纖孑L 菌 Inonotus obliquus (Pers. :Fr. ) J. Schroet.,俗稱薔甘(chaga)、 樺褐孔菌、白樺茸，屬于擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、層菌綱(Hymeno-mycetes)、非褶菌目 (Aphyllophorales)、 秀革孑L菌禾斗(Hymenochaetaceae)、揭孑L菌屬(Inonotus),主要分布于北緯45° -50°地區(qū)，在我國主要生長于吉林、黑龍江、西藏、青海等高海拔山區(qū)的樺屬樹木上，形成顯著的黑色瘤狀菌核。斜生纖孔菌作為藥用真菌具有抗腫瘤、防治艾滋病、抗衰老、增強(qiáng)免疫、防治糖尿病等療效。其藥效作用主要跟斜生纖孔菌中的三萜類化合物樺褐孔菌醇、白樺脂醇等的活性有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)樺褐孔菌醇在野生斜生纖孔菌原藥材中的含量可達(dá)0. 2%，而人工培養(yǎng)的斜生纖孔菌菌絲體中，樺褐孔菌醇的含量大大降低。隨著野生資源的日益枯竭及對(duì)藥用真菌斜生纖孔菌需求量的日益增加，有必要通過現(xiàn)代生物技術(shù)提高人工培養(yǎng)斜生纖孔菌菌絲體樺褐孔菌醇及其前體的含量來滿足人們對(duì)斜生纖孔菌的需求。3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶 A 還原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl_CoA reductase)，簡稱HMGR，催化3，羥基，3，甲基戊二酰輔酶A還原為甲羥戊酸，由于該過程不可逆，被認(rèn)為是異戊二烯生物合成的第一個(gè)關(guān)鍵步驟。HMGR對(duì)存在于細(xì)胞質(zhì)中的萜類物質(zhì)的代謝起重要調(diào)控作用，作為早期酶類，它決定“碳流”的流向。khaller等將橡膠樹HMGl 基因轉(zhuǎn)入煙草，并對(duì)該轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其形態(tài)未發(fā)生變化，但HMGR的活性增加了 4-8倍，且留醇含量增加了 6倍。因此利用現(xiàn)代生物技術(shù)將萜類代謝途徑關(guān)鍵酶基因?qū)胄鄙w孔菌中，獲得轉(zhuǎn)基因的真菌菌株，并進(jìn)行大規(guī)模的培養(yǎng)，是實(shí)現(xiàn)從根本上提高樺褐孔菌醇等三萜類物質(zhì)含量的最佳途徑。在對(duì)現(xiàn)有文獻(xiàn)的分析中，"Biosci.Biotechnol. Biochem.，2008，72 (5) 1333-1339”等報(bào)道了從靈芝中克隆了 3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶基因，但至今尚未發(fā)現(xiàn)有與本發(fā)明主題相同的文獻(xiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種斜生纖孔菌3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶基因及其編碼的蛋白質(zhì)和應(yīng)用。使其包含所述基因的融合基因構(gòu)建體，攜帶該構(gòu)建體的新的重組表達(dá)載體，被所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化真菌原生質(zhì)體細(xì)胞，以及由轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體產(chǎn)生的所述基因的轉(zhuǎn)基因菌株及其后代，包括菌絲體及發(fā)酵液，所獲得的轉(zhuǎn)基因菌株將具有顯著提高的樺褐孔菌醇等三萜類化合物含量。
本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的—種斜生纖孔菌3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶基因，為以下核苷酸序列之1)所述基因具有SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列；2) SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列添加、取代、插入或缺失一個(gè)或多個(gè)核苷酸的同源序列；3) SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列其等位基因及衍生的核苷酸序列。 一種斜生纖孔菌3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶基因編碼的蛋白質(zhì)，具有以下氨基酸之一1)所述蛋白質(zhì)具有SEQ ID No. 2中所示的第1-1381位的氨基酸序列；2) SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列添加、取代、插入或缺失一個(gè)或多個(gè)氨基酸的同源序列。含有本發(fā)明的斜生纖孔菌3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶基因全序列或部分片段的重組載體，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。這些重組載體包括質(zhì)粒和真菌表達(dá)載體。含有本發(fā)明的斜生纖孔菌3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶基因的宿主細(xì)胞， 如含有上述重組載體的宿主細(xì)胞也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌細(xì)胞、農(nóng)桿菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞或一些真菌的原生質(zhì)體。優(yōu)選大腸桿菌細(xì)胞、農(nóng)桿菌細(xì)胞或斜生纖孔菌原生質(zhì)體。本發(fā)明的斜生纖孔菌3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶基因的應(yīng)用，包括用所述的真菌表達(dá)載體轉(zhuǎn)化斜生纖孔菌原生質(zhì)體；斜生纖孔菌3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶基因序列提供一種轉(zhuǎn)基因斜生纖孔菌菌株。具體解釋說明如下本發(fā)明所分離出的DNA分子包括編碼具有斜生纖孔菌Io-HMGR蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID No. 1中從核苷酸第1-4146位的核苷酸序列至少70%的同源性；或者所述的核苷酸序列能在40-55°C條件下與SEQ ID No. 1中從核苷酸第1-4146位的核苷酸序列雜交。所述的編碼具有SEQ ID No. 2所述的氨基酸序列的多肽。所述的序列具有SEQ ID No. 1中從核苷酸第1_4146位的核苷酸序列。本發(fā)明分離出的斜生纖孔菌Io-HMGR蛋白多肽，它包括具有SEQ ID NO. 2氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。所述的蛋白多肽是具有SEQ ID NO. 2序列的多肽。本發(fā)明所提供的載體DNA分子轉(zhuǎn)化的宿主原生質(zhì)體，它是真核細(xì)胞。該宿主原生質(zhì)體包含所述的DNA分子中8-100個(gè)連續(xù)核苷酸。在本發(fā)明中，“分離的”、“純化的，，DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組分分開，而且已經(jīng)與在細(xì)胞中伴隨其的蛋白質(zhì)分開。在本發(fā)明中，術(shù)語“斜生纖孔菌Io-HMGR蛋白(或多肽)編碼序列”指編碼具有斜生纖孔菌Io-HMGR蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO. 1中第1-4146位核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指，位于SEQ ID NO. 1序列的編碼框第1-4146位核苷酸中，有一個(gè)或多個(gè)密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQ ID NO. 1中第1-4146位核苷酸序列同源性低至約70%的簡并序列也能編碼出SEQ ID NO. 2所述的序列。該術(shù)語還包括能在中度嚴(yán)緊條件下，更佳的在高度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO. 1中從核苷酸第1-4146位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該術(shù)語還包括與SEQ ID NO. 1中從核苷酸第1-4146位的核苷酸序列的同源性至少70%，較佳地至少80 %，更佳地至少90 %，最佳地至少95 %的核苷酸序列。該術(shù)語還包括能編碼具有與天然的斜生纖孔菌Io-HMGR蛋白相同功能的蛋白的 SEQ IDN0.1中開放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-90個(gè)，較佳地1-60個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加數(shù)個(gè)(通常為60個(gè)以內(nèi)，較佳地為30個(gè)以內(nèi)，更佳地為 10個(gè)以內(nèi)，最佳地為5個(gè)以內(nèi))核苷酸。在本發(fā)明中，術(shù)語“斜生纖孔菌Io-HMGR蛋白或多肽”指具有斜生纖孔菌Io-HMGR 蛋白活性的SEQ ID NO. 2序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與天然斜生纖孔菌Io-HMGR蛋白相同功能的SEQ ID N0. 2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè) (通常為1-50個(gè)，較佳地1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))氨基酸的缺失、插入和 /或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè)以內(nèi)，較佳地為10個(gè)以內(nèi)，更佳地為5個(gè)以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括斜生纖孔菌Io-HMGR蛋白的活性片段和活性衍生物。本發(fā)明的斜生纖孔菌Io-HMGR蛋白多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊條件下能與斜生纖孔菌Io-HMGR 蛋白DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用斜生纖孔菌Io-HMGR蛋白多肽的血清獲得的多肽或蛋白。在本發(fā)明中，“斜生纖孔菌Io-HMGR蛋白保守性變異多肽”指與SEQ ID N0. 2的氨基酸序列相比，有至多10個(gè)，較佳地至多8個(gè)，更佳地至多5個(gè)氨基酸性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進(jìn)行替換而產(chǎn)生。表1.保守性變異多肽中的取代殘基
權(quán)利要求
1.斜生纖孔菌3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶基因及其編碼的蛋白質(zhì)和應(yīng)用， 斜生纖孔菌3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶基因的特征在于所述的核苷酸序列由 SEQ ID NO. 1中第1-4146位的核苷酸序列所構(gòu)成；所述的氨基酸序列由SEQ ID NO. 2中第 1-1381位的氨基酸序列所構(gòu)成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的斜生纖孔菌3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶基因及其編碼的蛋白質(zhì)和應(yīng)用，其質(zhì)粒的特征在于所述質(zhì)粒含有權(quán)利要求1所述的斜生纖孔菌3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶基因的完整編碼閱讀框序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的斜生纖孔菌3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶基因及其編碼的蛋白質(zhì)和應(yīng)用，其真菌表達(dá)載體的特征在于所述真菌表達(dá)載體含有權(quán)利要求1所述的斜生纖孔菌3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶基因的完整編碼閱讀框序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的斜生纖孔菌3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶基因及其編碼的蛋白質(zhì)和應(yīng)用，其應(yīng)用的特征在于用權(quán)利要求4所述的真菌表達(dá)載體轉(zhuǎn)化斜生纖孔菌原生質(zhì)體。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的斜生纖孔菌3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶基因及其編碼的蛋白質(zhì)和應(yīng)用，其應(yīng)用的特征在于用權(quán)利要求1所述的斜生纖孔菌3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶基因序列提供的一種轉(zhuǎn)基因斜生纖孔菌。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種斜生纖孔菌3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶基因及其編碼的蛋白質(zhì)與用途，本發(fā)明所提供的鯊烯合酶基因具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或者添加、取代、插入或缺失一個(gè)或多個(gè)核苷酸的同源序列或其等位基因及其衍生的核苷酸序列。所示基因編碼的蛋白質(zhì)具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列或者添加、取代、插入或缺失一個(gè)或多個(gè)氨基酸的同源序列。本發(fā)明提供的3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶基因可以通過基因工程技術(shù)提高斜生纖孔菌中樺褐孔菌醇的含量，可用于利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)來提高斜生纖孔菌中樺褐孔菌醇含量的研究和產(chǎn)業(yè)化中。而這些次生代謝產(chǎn)物在臨床上具有巨大的應(yīng)用價(jià)值，對(duì)保護(hù)人民的健康生長有所幫助。因而本發(fā)明具有很大的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12R1/645GK102304530SQ20111020597
公開日2012年1月4日 申請(qǐng)日期2011年7月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月17日
發(fā)明者馮友建, 孫勇, 曹小迎, 李長根, 王力, 蔣繼宏, 鄭竹君, 陳鳳美, 魏江春 申請(qǐng)人:徐州師范大學(xué)