專利名稱：發(fā)酵乳桿菌的高密度培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵工程領(lǐng)域，尤其是一種發(fā)酵乳桿菌的高密度培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
發(fā)酵乳桿菌(LactcAacillus fermentum)作為潛在的益生菌，廣泛分布于人和動(dòng)物的胃腸道中，是腸道、口腔和陰道的正常菌群，發(fā)酵乳桿菌均有一定的耐酸和耐膽汁鹽能力，目前發(fā)酵乳桿菌多用于泡菜、豆乳發(fā)酵、香腸發(fā)酵和飼料中。現(xiàn)有報(bào)道指出發(fā)酵乳桿菌能夠水解膽鹽，降膽固醇，調(diào)節(jié)宿主體內(nèi)微生物菌群的平衡，改善宿主體內(nèi)系統(tǒng)環(huán)境，對(duì)宿主健康具有促進(jìn)作用，因此發(fā)酵乳桿菌在食品和醫(yī)藥工業(yè)中有著很好的應(yīng)用前景，然而益生菌只有耐受消化道的不良環(huán)境，以一定的數(shù)量活著到達(dá)并定植于宿主腸道，才能發(fā)揮其益生作用，益生菌的活性與活菌數(shù)密切相關(guān)，因此益生菌的高密度培養(yǎng)顯得十分重要。發(fā)酵乳桿菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)的要求較高，需要適合其生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基，在發(fā)酵乳桿菌生長(zhǎng)過程中會(huì)產(chǎn)生乳酸等代謝產(chǎn)物，使發(fā)酵液的PH不斷下降，菌體生長(zhǎng)受pH的影響非常顯著，發(fā)酵過程中各種營(yíng)養(yǎng)成分的不斷消耗，碳源的短缺對(duì)菌體生長(zhǎng)的限制最為顯著，上述問題亟待解決。由于以上因素的限制，常規(guī)發(fā)酵乳桿菌使用MRS培養(yǎng)基分批發(fā)酵的最高菌濃一般維持在 2 6X108cfu/mlo

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供一種發(fā)酵乳桿菌的高密度培養(yǎng)方法，本方法采用促進(jìn)發(fā)酵乳桿菌增殖的專用培養(yǎng)基，并且在發(fā)酵過程中添加堿性物質(zhì)以中和菌體代謝產(chǎn)生的酸，并適當(dāng)補(bǔ)糖，較好地克服了發(fā)酵過程中碳源短缺和產(chǎn)酸抑制菌體生長(zhǎng)的問題。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)目的的技術(shù)方案如下一種發(fā)酵乳桿菌的高密度培養(yǎng)方法，步驟如下(1)獲得種子液將活化好的發(fā)酵乳桿菌接入裝有培養(yǎng)基的容器內(nèi)，35-40°C下在厭氧環(huán)境下靜置培養(yǎng)10_20h，得到種子液；培養(yǎng)基的成分包括葡萄糖8 15g/L，酪蛋白胨8 15g/L，酵母粉8 15g/ L,番茄汁50 200ml/L，黃瓜汁50 200ml/L，乙酸鈉1 5g/L，磷酸氫二鉀2 5g/L， FeSO4 ·7Η200· 1 0. 5g/L, MgSO4 ·7Η20 0· 1 0. 5g/L,吐溫 800. 05-0. 2ml/L，初始 ρΗ6· 7 7. 0，(2)發(fā)酵培養(yǎng)在發(fā)酵罐中倒入培養(yǎng)基，培養(yǎng)基成分同上，高壓蒸汽滅菌后冷卻至 37°C，將種子液以重量百分比3 6%接種量接種到發(fā)酵罐中，厭氧、間歇攪拌發(fā)酵2 ；(3)調(diào)pH 發(fā)酵過程中當(dāng)pH低于5. 5時(shí)開始補(bǔ)堿，通過補(bǔ)加堿保持pH在5 7 ；(4)補(bǔ)糖發(fā)酵過程中當(dāng)殘?zhí)墙抵?g/L時(shí)開始間歇性補(bǔ)糖，維持殘?zhí)橇吭?g/L 10g/L。 而且，所述堿為Na2CO3或NaOH。
而且，所述糖為葡萄糖。而且，所述步驟(1)和步驟⑵的容器內(nèi)通入80% N2+10% C02+10% H2的混合氣。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果為1、本發(fā)明采用黃瓜，番茄等果蔬提取物添加的培養(yǎng)基中不僅可以代替部分碳氮源，而且含有豐富的維生素和微量元素，可作為發(fā)酵乳桿菌的生長(zhǎng)因子，對(duì)于促進(jìn)菌體增殖有顯著作用，發(fā)酵過程中添加Na2CO3保持發(fā)酵液pH穩(wěn)定，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后期開始補(bǔ)加葡萄糖保持一定殘?zhí)橇恳源龠M(jìn)菌體持續(xù)生長(zhǎng)，最終獲得培養(yǎng)液發(fā)酵乳桿菌達(dá)到較高密度，最終菌種密度可高達(dá)1. 2-3. 4X 101Qcfu/ml。2、本方法采用促進(jìn)發(fā)酵乳桿菌增殖的專用培養(yǎng)基，并且在發(fā)酵過程中添加堿性物質(zhì)以中和菌體代謝產(chǎn)生的酸，并適當(dāng)補(bǔ)糖，較好地克服了發(fā)酵過程中碳源短缺和產(chǎn)酸抑制菌體生長(zhǎng)的問題。
具體實(shí)施例方式下面通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳述，以下實(shí)施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。番茄汁制備方法新鮮的番茄洗凈，稱取IOOg于榨汁機(jī)內(nèi)粉碎充分，煮沸5min，三層紗布過濾，濾液用水補(bǔ)至100ml。黃瓜汁制備方法新鮮黃瓜洗凈，切片，稱取IOOg于榨汁機(jī)內(nèi)補(bǔ)充IOOml水后榨汁后煮沸5min，三層紗布過濾后，用水補(bǔ)至200ml。活菌計(jì)數(shù)的方法是將被培養(yǎng)液制成幾個(gè)不同的10倍遞增稀釋液，然后從每個(gè)稀釋液中分別取出0. ImL置于滅菌平皿中與融化好冷卻至45°C左右的固體培養(yǎng)基混合均勻， 在37°C恒溫厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h，記錄每個(gè)平皿中形成的菌落數(shù)量，依據(jù)稀釋倍數(shù)，計(jì)算出每mL原始樣品中所含細(xì)菌菌落總數(shù)為平皿中菌落數(shù)X稀釋倍數(shù)XlOcfu/ml。實(shí)施例1 一種發(fā)酵乳桿菌的高密度培養(yǎng)方法，步驟如下(1)獲得種子液將活化好的發(fā)酵乳桿菌接入裝有IOOml培養(yǎng)基的IOOml平底燒瓶中，37°C下在厭氧箱80% N2+10% C02+10% H2的混合氣環(huán)境下靜置培養(yǎng)12h，得到種子液；培養(yǎng)基的成分包括葡萄糖8g，酪蛋白胨8g，酵母粉8g，番茄汁200ml，黃瓜汁 200ml，乙酸鈉 lg，磷酸氫二鉀 4g，F(xiàn)eSO4 · 7H20 0. 2g，MgSO4 · 7H20 0. 2g，吐溫 800. 1ml，用水補(bǔ)至1000ml，初始pH為6. 7。(2)發(fā)酵培養(yǎng)7L發(fā)酵罐中倒入培養(yǎng)基(成分同上)4200ml，高壓蒸汽滅菌后冷卻至37°C，將種子液以重量百分比4%接種量接種到發(fā)酵罐中，通入80% N2+10% C02+10% H2 的混合氣以維持罐內(nèi)正壓，間歇攪拌發(fā)酵^h ；(3)調(diào)pH 發(fā)酵過程中當(dāng)pH低于5. 5時(shí)開始補(bǔ)堿Na2CO3,通過補(bǔ)加Na2CO3保持pH 在 5. 5 士 0. 1 ；(4)補(bǔ)糖發(fā)酵過程中當(dāng)殘?zhí)墙抵?g/L時(shí)開始間歇性補(bǔ)葡萄糖，維持殘?zhí)橇吭?g/ L 4g/L。獲得的發(fā)酵液的最高菌體濃度為1. 2X1010cfu/mL·
實(shí)施例2 一種發(fā)酵乳桿菌的高密度培養(yǎng)方法，步驟如下(1)獲得種子液將活化好的發(fā)酵乳桿菌接入裝有IOOml的IOOml平底燒瓶中， 37°C下在厭氧箱80% N2+10% C02+10% H2的混合氣環(huán)境下靜置培養(yǎng)12h，得到種子液；培養(yǎng)基的成分為葡萄糖10g，酪蛋白胨10g，酵母粉10g，番茄汁100ml，黃瓜汁 130ml，乙酸鈉 2g，磷酸氫二鉀 4g，F(xiàn)eSO4 · 7H20 0. 3g，MgSO4 · 7H20 0. 3g，吐溫 800. 1ml，用水補(bǔ)至1000ml，初始pH為6. 9。(2)發(fā)酵培養(yǎng)7L發(fā)酵罐中倒入培養(yǎng)基(成分同上)4200ml，高壓蒸汽滅菌后冷卻至37°C，將種子液以重量百分比5%接種量接種到發(fā)酵罐中，通入80% N2+10% C02+10% H2 的混合氣以維持罐內(nèi)正壓，間歇攪拌發(fā)酵^h。(3)發(fā)酵過程中當(dāng)pH低于6.0時(shí)開始補(bǔ)堿，通過補(bǔ)加Na2CO3保持pH在6.0 士0. 1 ；(4)補(bǔ)糖發(fā)酵過程中當(dāng)殘?zhí)墙抵?g/L時(shí)開始間歇性補(bǔ)葡萄糖，維持殘?zhí)橇吭?g/ L 5g/L。獲得的發(fā)酵液的最高菌體濃度為3. 4X1010cfu/mL·實(shí)施例3 一種發(fā)酵乳桿菌的高密度培養(yǎng)方法，步驟如下(1)獲得種子液將活化好的發(fā)酵乳桿菌接入裝有IOOml的IOOml平底燒瓶中， 37°C下在厭氧箱80% N2+10% C02+10% H2的混合氣環(huán)境下靜置培養(yǎng)12h，得到種子液；培養(yǎng)基的成分為葡萄糖15g，酪蛋白胨15g，酵母粉15g，番茄汁80ml，黃瓜汁 100ml，乙酸鈉 3g，磷酸氫二鉀 3g，F(xiàn)eSO4 · 7H20 0. 5g，MgSO4 · 7H20 0. 5g，吐溫 800. 1ml，用水補(bǔ)至1000ml，初始pH為7.0。(2)發(fā)酵培養(yǎng)7L發(fā)酵罐中倒入培養(yǎng)基(成分同上)4200ml，高壓蒸汽滅菌后冷卻至37°C，將種子液以重量百分比6%接種量接種到發(fā)酵罐中，通入80% N2+10% C02+10% H2 的混合氣以維持罐內(nèi)正壓，間歇攪拌發(fā)酵^h ；(3)發(fā)酵時(shí)當(dāng)pH低于6. 5時(shí)開始補(bǔ)堿，通過補(bǔ)加NaOH保持pH在6.5士0. 1 ；(4)補(bǔ)糖發(fā)酵過程中當(dāng)殘?zhí)墙抵?g/L時(shí)開始間歇性補(bǔ)葡萄糖，維持殘?zhí)橇吭?g/ L 7g/L。獲得的發(fā)酵液的最高菌體濃度為2. 9X 101(lCfU/ml。
權(quán)利要求
1.一種發(fā)酵乳桿菌的高密度培養(yǎng)方法，其特征在于步驟如下(1)獲得種子液將活化好的發(fā)酵乳桿菌接入裝有培養(yǎng)基的容器內(nèi)，35-40°C下在厭氧環(huán)境下靜置培養(yǎng)10-20h，得到種子液；培養(yǎng)基的成分包括葡萄糖8 15g/L，酪蛋白胨8 15g/L，酵母粉8 15g/L， 番茄汁50 200ml/L，黃瓜汁50 200ml/L，乙酸鈉1 5g/L，磷酸氫二鉀2 5g/L， FeSO4 ·7Η200· 1 0. 5g/L, MgSO4 ·7Η20 0· 1 0. 5g/L,吐溫 800. 05-0. 2ml/L，初始 ρΗ6· 7 7. 0，(2)發(fā)酵培養(yǎng)在發(fā)酵罐中倒入培養(yǎng)基，培養(yǎng)基成分同上，高壓蒸汽滅菌后冷卻至 37°C，將種子液以重量百分比3 6%接種量接種到發(fā)酵罐中，厭氧、間歇攪拌發(fā)酵2 ；(3)調(diào)pH發(fā)酵過程中當(dāng)pH低于5. 5時(shí)開始補(bǔ)堿，通過補(bǔ)加堿保持pH在5 7 ；(4)補(bǔ)糖發(fā)酵過程中當(dāng)殘?zhí)墙抵?g/L時(shí)開始間歇性補(bǔ)糖，維持殘?zhí)橇吭?g/L IOg/L0
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵乳桿菌的高密度培養(yǎng)方法，其特征在于所述堿為Na2CO3 或 NaOH。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵乳桿菌的高密度培養(yǎng)方法，其特征在于所述糖為葡萄糖。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵乳桿菌的高密度培養(yǎng)方法，其特征在于所述步驟(1) 和步驟(2)的容器內(nèi)通入80% N2+10% C02+10% H2的混合氣。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種發(fā)酵乳桿菌的高密度培養(yǎng)方法，將活化好的發(fā)酵乳桿菌接入裝有培養(yǎng)基的容器內(nèi)，35-40℃下在厭氧環(huán)境下靜置培養(yǎng)10-20h，得到種子液，在發(fā)酵罐中倒入培養(yǎng)基，培養(yǎng)基成分同上，高壓蒸汽滅菌后冷卻至37℃，將種子液以重量百分比3～6％接種量接種到發(fā)酵罐中，厭氧、間歇攪拌發(fā)酵，種子培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中后期按3％～6％的接種量接種發(fā)酵，發(fā)酵過程中添加NaOH或Na2CO3維持pH在5～7，補(bǔ)加葡萄糖維持殘?zhí)橇吭?g/L～10g/L。本方法采用促進(jìn)發(fā)酵乳桿菌增殖的專用培養(yǎng)基，并且在發(fā)酵過程中添加堿性物質(zhì)以中和菌體代謝產(chǎn)生的酸，并適當(dāng)補(bǔ)糖，較好地克服了發(fā)酵過程中碳源短缺和產(chǎn)酸抑制菌體生長(zhǎng)的問題。
文檔編號(hào)C12N1/20GK102226164SQ201110169109
公開日2011年10月26日 申請(qǐng)日期2011年6月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月22日
發(fā)明者劉曉光, 劉逸寒, 曹月婷, 李江, 李玉, 路福平 申請(qǐng)人:天津科技大學(xué)