專利名稱：一株發(fā)酵乳桿菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株發(fā)酵乳桿菌及其應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
飼料中添加抗生素能夠抵抗疾病，促進(jìn)動(dòng)物的生長(zhǎng)，加快集約化畜牧業(yè)的發(fā)展。但是隨著人們生活水平的提高和對(duì)健康程度的不斷重視，抗生素添加劑在給人們帶來巨大的經(jīng)濟(jì)利益的同時(shí)其負(fù)面效應(yīng)逐漸顯現(xiàn)，最典型的特征就是抗生素引起的耐藥性，內(nèi)源性感染、二重感染以及食品中殘留，這些將對(duì)養(yǎng)殖業(yè)、飼料工業(yè)和動(dòng)物帶來嚴(yán)重威脅，進(jìn)而通過食物鏈危機(jī)人類健康。因此，禁止抗生素添加劑在畜牧業(yè)中使用的呼聲越來越高，研究和開發(fā)新的抗生素替代品的工作迫在眉睫。近年來，益生菌因其安全、綠色無污染且對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)具有顯著作用而被作為抗生素替代品的首要選擇。乳酸桿菌是益生菌中的主要菌種，它是動(dòng)物消化道棲生微生物，在防治胃腸道感染、調(diào)節(jié)免疫功能和調(diào)節(jié)腸道的微生物菌群平衡中具有較好作用，如能夠促進(jìn)仔豬增重、降低豬腸道的PH值、改善血液生化指標(biāo)，增強(qiáng)消化道內(nèi)酶活性及降低腸道大腸桿菌數(shù)等，使用乳酸桿菌益生素可以調(diào)整胃腸道微生態(tài)平衡，所以乳酸桿菌是一種很有前途的益生素生產(chǎn)菌種。美國FDA和AAFCO在1989年公布的安全微生物品種共43種，其中乳酸桿菌占12種，中華人民共和國農(nóng)業(yè)部2011年公布允許使用的19種飼用微生物中有6 種是乳酸桿菌。在美國，益生素工業(yè)上應(yīng)用的產(chǎn)品57%含有乳酸桿菌屬。大連醫(yī)學(xué)院康白等開發(fā)研制的乳酶生，是一種乳酸桿菌的干燥制劑，保存期間穩(wěn)定性好，每克產(chǎn)品含活乳酸桿菌約IO7個(gè)，仔豬每日口服3-4克可以有效治療腹瀉。乳酸桿菌除了能提高動(dòng)物的生產(chǎn)性能以外，還能提高動(dòng)物的抗病力，趙庶吏等 (2004)研究發(fā)現(xiàn)生物菌對(duì)致病性大腸桿菌有很強(qiáng)的抵抗作用，使仔豬下痢和發(fā)病率降低 87.4%，治療效果非常顯著。Peran等Q006)研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵乳桿菌通過釋放谷胱甘肽及調(diào)節(jié)細(xì)胞因子(如TNF-α)和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶的表達(dá)，來防止鼠結(jié)腸炎的發(fā)生。乳酸菌類產(chǎn)品的開發(fā)利用已成為飼料工業(yè)一個(gè)活躍領(lǐng)域，但也存在一些亟待解決的問題如產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定、活菌數(shù)量不夠、消化率低和成本高等。因此，培養(yǎng)繁殖力強(qiáng)、耐受能力強(qiáng)、產(chǎn)生較高消化酶的菌種以生產(chǎn)出產(chǎn)量高、質(zhì)量穩(wěn)定、在體溫范圍內(nèi)具有較高活性的乳酸桿菌類產(chǎn)品，以提高其利用率，同時(shí)改進(jìn)工藝、降低生產(chǎn)成本、提高產(chǎn)品的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力以及對(duì)于畜牧業(yè)的發(fā)展和人類的健康都非常有意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一株發(fā)酵乳桿菌(LactcAaci llus fermentum) HAFI5007。本發(fā)明所提供的發(fā)酵乳桿菌(LactcAacillus fermentum) HAFI5007，在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏中心登記入冊(cè)編號(hào)=CGMCC No. 4648。該發(fā)酵乳桿菌具有抗逆性強(qiáng)、抗雜菌能力強(qiáng)和益生特性。
發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)HAFI5007具有以下生物學(xué)特性(1)在ρΗ2· 0處理6小時(shí)之后的存活率為78. 6% ；(2)在75°C水浴中加熱15min后的存活率為45. 5% ；
(3)室溫下放置1個(gè)月后的存活率為78. 9 % ；(4)接種在肉湯培養(yǎng)基于37°C，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)M小時(shí)達(dá)到最高生長(zhǎng)濃度為 IO11CfVml (圖 1)。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種發(fā)酵乳桿菌菌劑。該菌劑能夠替代現(xiàn)有的飼用抗生素，并具有抗病、促生長(zhǎng)的作用。本發(fā)明所提供的發(fā)酵乳桿菌菌劑，其活性成分為發(fā)酵乳桿菌(LactcAacillus fermentum)HAFI5007。所述菌劑具有下述至少一種用途1)清除動(dòng)物自由基的產(chǎn)品；2)緩解動(dòng)物氧化應(yīng)激的產(chǎn)品；3)增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體抗氧化能力的產(chǎn)品；4)制備調(diào)解動(dòng)物腸內(nèi)微生態(tài)平衡的產(chǎn)品；5)增強(qiáng)動(dòng)物腸道黏膜屏障的產(chǎn)品；6)調(diào)節(jié)動(dòng)物粘膜免疫功能的產(chǎn)品；7)促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)的產(chǎn)品。上述發(fā)酵乳桿菌(LactcAacillus fermentum) HAFI5007或菌劑可用于制備大腸桿菌抑制劑。所述大腸桿菌抑制劑中的大腸桿菌具體可為大腸桿菌K88、大腸桿菌K99、大腸桿菌 K987P。所述自由基為下述三種自由基中的至少一種輕基自由基、超氧陰離子自由基、1，
1-二苯基苦基苯胼自由基。所述緩解動(dòng)物氧化應(yīng)激體現(xiàn)為下述1)-3)中至少一種1)提高動(dòng)物肌肉、肝臟和 /或血漿中抗氧化酶的活性；2)降低動(dòng)物丙二醛的含量；幻增強(qiáng)動(dòng)物抑制自由基產(chǎn)生的能力。所述增強(qiáng)動(dòng)物腸道黏膜屏障體現(xiàn)為改善動(dòng)物腸道菌群組成和/或促進(jìn)動(dòng)物腸道粘液蛋白的表達(dá)。所述調(diào)節(jié)動(dòng)物粘膜免疫功能體現(xiàn)為下述1)-3)中至少一種1)增加動(dòng)物外周血 T淋巴細(xì)胞⑶4+淋巴細(xì)胞亞群的比例；2)促進(jìn)回腸中TNF-α基因的表達(dá)；3)促進(jìn)回腸中 IFN-Y基因的表達(dá)。所述腸道粘液蛋白為MUC2。所述菌劑具體可由發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)HAFI5007和保護(hù)劑混合后，冷凍干燥，制成發(fā)酵乳桿菌干燥制劑，所述的保護(hù)劑為脫脂奶粉、麥芽糊精、稻殼粉、 麥麩中的一種或多種。本發(fā)明所述發(fā)酵乳桿菌(LactcAacillus fermentum) HAFI5007或所述菌可以作為添加劑用于動(dòng)物飼料，其中的動(dòng)物包括但不限于豬、羊、牛、雞等各種動(dòng)物。該飼料具有與抗生素飼料類似的功能，但無抗生素飼料的副作用。
本發(fā)明的發(fā)酵乳桿菌及其發(fā)酵乳桿菌菌劑主要作為動(dòng)物的飼料添加劑，其可以替代現(xiàn)有動(dòng)物日糧中的抗生素，調(diào)節(jié)動(dòng)物腸內(nèi)微生態(tài)平衡，清除體內(nèi)的自由基，提高抗氧化能力，從而具有增強(qiáng)非特異性免疫功能來預(yù)防疾病的作用，同時(shí)還可以提供營養(yǎng)因子、促進(jìn)營養(yǎng)物的消化吸收、促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)和提高飼料轉(zhuǎn)化率、提高斷奶仔豬的生產(chǎn)性能。本發(fā)明的發(fā)酵乳桿菌及其發(fā)酵乳桿菌菌劑對(duì)防治動(dòng)物消化系統(tǒng)疾病起到保健作用，同時(shí)對(duì)幼年動(dòng)物可刺激其胃腸道發(fā)育，所以將之作為飼料添加劑應(yīng)用在飼料中能起到抗病促生長(zhǎng)的作用。同時(shí)，本發(fā)明的發(fā)酵乳桿菌及其發(fā)酵乳桿菌菌劑無耐藥性和藥物在動(dòng)物產(chǎn)品中殘留從而對(duì)人類的健康產(chǎn)生潛在的危害的可能，是一種有前途的綠色飼料添加劑。下面結(jié)合具體實(shí)施例詳細(xì)描述本發(fā)明，所述實(shí)施例用于理解而不是限制本發(fā)明。保藏說明菌種名稱發(fā)酵乳桿菌拉丁名Lactobacillus fermentum菌株編號(hào)HAFI5007保藏機(jī)構(gòu)中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏機(jī)構(gòu)簡(jiǎn)稱CGMCC地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)保藏日期2011年3月11日保藏中心登記入冊(cè)編號(hào)CGMCC No. 4648


圖1為發(fā)酵乳桿菌生長(zhǎng)曲線。圖2為平皿挖溝法測(cè)定乳酸桿菌培養(yǎng)物對(duì)大腸桿菌的抑制。圖3為發(fā)酵乳桿菌在過氧化氫存在時(shí)的存活能力。圖4為發(fā)酵乳桿菌對(duì)羥自由基的清除能力。圖5為發(fā)酵乳桿菌對(duì)超氧陰離子的清除能力。圖6為發(fā)酵乳桿菌對(duì)DPPH的清除能力。圖7為發(fā)酵乳桿菌對(duì)斷奶仔豬腸道粘液蛋白的影響(標(biāo)尺200 μ m) (10X20)。ACE分別是對(duì)照組的十二指腸、空腸和回腸，BDF分別是發(fā)酵乳桿菌組的十二指腸、空腸和回腸，粘液蛋白(如深棕色顆?；驁F(tuán)塊)。圖8為發(fā)酵乳桿菌對(duì)斷奶仔豬腸道組織形態(tài)的影響(標(biāo)尺200 μ m) (10X20)。ACE分別是對(duì)照組的十二指腸、空腸和回腸，BDF分別是發(fā)酵乳桿菌組的十二指腸、空腸和回腸。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum) HAFI5007，可先接種于 Rogosa SL瓊脂的Himgates滾管培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，得到的種子培養(yǎng)物再接種于Rogosa SL肉湯厭氧培養(yǎng)基里進(jìn)行培養(yǎng)。其中所述的瓊脂培養(yǎng)基為適合發(fā)酵乳桿菌培養(yǎng)的任何培養(yǎng)基，本領(lǐng)域技術(shù)人員都
5知曉何種培養(yǎng)基適合發(fā)酵乳桿菌培養(yǎng)。然而可以優(yōu)選為Rogosa SL瓊脂的Himgates滾管培養(yǎng)基，這里所述的Rogosa SL瓊脂的Hungates滾管培養(yǎng)基理解為以在Rogosa SL完全選擇性培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，適當(dāng)修改的適合發(fā)酵乳桿菌培養(yǎng)的培養(yǎng)基。所述適合發(fā)酵乳桿菌培養(yǎng)的培養(yǎng)基可以為現(xiàn)有技術(shù)任何適合發(fā)酵乳桿菌培養(yǎng)的培養(yǎng)基，這為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知曉，但是仍可進(jìn)一步優(yōu)選培養(yǎng)基的配方為胰蛋白胨1 20g，牛肉膏1 20g，酵母浸粉1 15g，葡萄糖1 20g，阿拉伯糖1 15g，蔗糖1 15g，醋酸鈉5 25g，枸櫞酸鈉 1 10g，磷酸二氫鉀1 15g，七水硫酸鎂0. 1 1. 5g，四水硫酸錳0. 1 1. 5g，硫酸亞鐵 0. 01 0. IOg,吐溫-800. 1 2. OmL,瓊脂5 20g，蒸餾水100 2500mL ；優(yōu)選為胰蛋白胨5 15g，牛肉膏5-15g，酵母浸粉3 10g，葡萄糖5 15g，阿拉伯糖3 10g，蔗糖3 10g，醋酸鈉10 20g，枸櫞酸鈉1 5g，磷酸二氫鉀1 10g，七水硫酸鎂0. 1 lg，四水硫酸錳0. 1 lg，硫酸亞鐵0. 01 0. 05g,吐溫-80 0. 5 1. 5mL,瓊脂10 15g，蒸餾水 500 2000mL ；更優(yōu)選為胰蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母浸粉5g，葡萄糖10g，阿拉伯糖5g， 蔗糖5g，醋酸鈉15g，枸櫞酸鈉2g，磷酸二氫鉀6g，七水硫酸鎂0. 58g，四水硫酸錳0. 25g，硫酸亞鐵0. 03g,吐溫-80 ImL,瓊脂13g，蒸餾水IOOOmL0其中的液體培養(yǎng)基為適合發(fā)酵乳桿菌培養(yǎng)的任何培養(yǎng)基，本領(lǐng)域技術(shù)人員也知曉這種液體培養(yǎng)基，其中可優(yōu)選肉湯厭氧培養(yǎng)基，這里所述的肉湯厭氧培養(yǎng)基理解為在普通肉湯厭氧培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，適當(dāng)修改的培養(yǎng)基，所述適當(dāng)修改的培養(yǎng)基可以為現(xiàn)有技術(shù)任何適合發(fā)酵乳桿菌培養(yǎng)的培養(yǎng)基，這為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知曉，優(yōu)選Rogosa SL肉湯厭氧培養(yǎng)基，其中培養(yǎng)基的配方為胰蛋白胨5 15g，牛肉膏1 20g，酵母浸粉3 10g，葡萄糖5 15g，阿拉伯糖3 10g，蔗糖3 10g，醋酸鈉10 20g，枸櫞酸鈉1 5g，磷酸二氫鉀1 10g，七水硫酸鎂0. 1 lg，四水硫酸錳0. 1 lg，硫酸亞鐵0. 01 0. 05g,吐溫-800. 5 1. 5mL，蒸餾水500 2000mL ；更優(yōu)選為胰蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母浸粉 5g，葡萄糖10g，阿拉伯糖5g，蔗糖5g，醋酸鈉15g，枸櫞酸鈉2g，磷酸二氫鉀6g，七水硫酸鎂 0. 58g，四水硫酸錳0. 25g，硫酸亞鐵0. 03g,吐溫-80 ImL,蒸餾水IOOOmL0應(yīng)用上述培養(yǎng)基，本領(lǐng)域技術(shù)人員一般都知曉具體培養(yǎng)過程，這里優(yōu)選為上述 Rogosa SL瓊脂培養(yǎng)基的Hungates滾管中培養(yǎng)，優(yōu)選在培養(yǎng)箱中，37°C下，培養(yǎng)15 72小時(shí)；其中的發(fā)酵乳桿菌擴(kuò)大培養(yǎng)優(yōu)選在Rogosa SL肉湯厭氧培養(yǎng)基中，37°C下培養(yǎng)15 80 小時(shí)。前面所述的保護(hù)劑為本領(lǐng)域技術(shù)人員通常使用的能夠作為發(fā)酵乳桿菌菌劑的保護(hù)劑，本發(fā)明優(yōu)選所述載體為為脫脂奶粉、麥芽糊精、稻殼粉、麩皮的一種或多種，優(yōu)選為脫脂奶粉，其發(fā)酵乳桿菌菌液與脫脂奶粉按照重量體積比1 8 0.1 2體積比混合，優(yōu)選為3 5 0. 5 1。本發(fā)明含有發(fā)酵乳桿菌的動(dòng)物飼料，其特征在于，該發(fā)酵乳桿菌飼料在提高動(dòng)物抗氧化和免疫力中的作用。所述動(dòng)物為家禽和家畜。本發(fā)明的動(dòng)物飼料包括常用動(dòng)物飼料和本發(fā)明的發(fā)酵乳桿菌菌劑。其中發(fā)酵乳桿菌菌劑的含量至少為0. 001%，優(yōu)選為0. 001 3%，更優(yōu)選0.01% 2%，最優(yōu)選 0.05% 0.2%。主要研究該配合飼料在提高動(dòng)物抗氧化和免疫力中的作用。所述動(dòng)物為家禽和家畜。本發(fā)明的發(fā)酵乳桿菌菌劑可以同目前市面上任何常用動(dòng)物飼料進(jìn)行配合，即本發(fā)明所述動(dòng)物飼料保護(hù)范圍不為配合的常用動(dòng)物飼料種類所限制。。
然而其中的常用動(dòng)物飼料可優(yōu)選為日糧，進(jìn)一步優(yōu)選為豬用日糧、雞用日糧、反芻動(dòng)物用日糧和水產(chǎn)動(dòng)物用日糧。對(duì)于不同的動(dòng)物，其日糧的配方各不相同，但是，現(xiàn)有技術(shù)中公開的任何日糧都可以作為本發(fā)明的動(dòng)物飼料，其配方都是該領(lǐng)域的公知常識(shí)。下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實(shí)施例2 6中的發(fā)酵乳桿菌如無特殊說明，均指發(fā)酵乳桿菌 (Lactobacillus fermentum)HAFI5007 CGMCC No. 4648實(shí)施例1、發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)HAFI5007 的分離鑒定本發(fā)明的發(fā)酵乳桿菌是從豬胃腸道粘膜中提取、分離、篩選、純化得到的。(一 )發(fā)酵乳桿菌的分離與純化1. 1試驗(yàn)材料取健康仔豬胃腸道粘膜5cm2(胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸和結(jié)腸)，在滅菌杯中，用無菌生理鹽水沖洗粘膜上的食糜，將粘膜浸入裝有15mL HEPES緩沖液的燒杯中，用鑷子來回?fù)u動(dòng)粘膜5min后，得到上清液。1. 2培養(yǎng)基1.2.1 Rogosa SL 瓊脂的培養(yǎng)基胰蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母浸粉5g，葡萄糖10g，阿拉伯糖5g，蔗糖5g，醋酸鈉 15g，枸櫞酸鈉2g，磷酸二氫鉀6g，七水硫酸鎂0. 58g，四水硫酸錳0. 25g，硫酸亞鐵0. 03g,吐溫-80 lmL，瓊脂13g，蒸餾水lOOOmL，用醋酸調(diào)節(jié)pH至5. 0。1. 2. 2Rogosa SL肉湯厭氧培養(yǎng)基配方同1.2. 1，不添加瓊脂，蒸餾水IOOOmL,用醋酸調(diào)節(jié)pH至5.0。用新配制的 0. 忍天青溶液作氧指示劑，趁熱分裝入Himgates管，沖CO2至無色，迅速封口。121°C高壓蒸汽滅菌5min。1. 3菌株的分離培養(yǎng)用無菌注射器吸取0.2mL上清液注入裝有Rogosa SL瓊脂的Hungates滾管中，用手輕輕滾動(dòng)使上清液均勻分布在管中瓊脂表面。放入5% CO2培養(yǎng)箱，37°C培養(yǎng)7 之后， 在生物安全柜里無菌操作將白色針尖大小的菌落用針頭挑取轉(zhuǎn)移到厭氧無菌Rogosa肉湯里進(jìn)行培養(yǎng)，觀察肉湯是否變渾濁，有渾濁的放置4°C冰箱貯藏備用。1.4革蘭氏染色用無菌注射器吸取少量Rogosa SL肉湯培養(yǎng)物，滴在載玻片上，在酒精燈火焰上輕輕烘干固定。滴加結(jié)晶紫染色液，染lmin，水洗；滴加革蘭氏碘液媒染，作用lmin，水洗；滴加丙酮乙醇混合液(丙酮95%乙醇=3 7)脫色30s，水洗；滴加沙黃染色液復(fù)染lmin， 水洗，待干，在普通光學(xué)顯微鏡上觀察，菌體成紅色為陰性，紫色的為陽性。呈革蘭氏陽性形態(tài)一致的桿菌，進(jìn)一步進(jìn)行接觸酶試驗(yàn)。1. 5接觸酶試驗(yàn)作Rogosa SL斜面培養(yǎng)基，取培養(yǎng)物約0.2mL注入裝有Rogosa SL培養(yǎng)基斜面，5% 0)2培養(yǎng)箱，37°C培養(yǎng)Mh，長(zhǎng)出菌落后，將3%過氧化氫溶液滴加到菌落上，若沒有氣泡產(chǎn)生說明是陰性，若有氣泡產(chǎn)生說明是陽性。通過Rogosa SL厭氧培養(yǎng)的培養(yǎng)物經(jīng)革蘭氏染色陽性和接觸酶試驗(yàn)陰性可初步認(rèn)為是乳酸桿菌屬(Lactobacillus)。
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2結(jié)果與討論本試驗(yàn)從健康仔豬胃腸道粘膜中利用經(jīng)過鹽酸校正后Rogosa SL完全選擇性培養(yǎng)基篩選出5907株乳酸桿菌株。將仔豬胃腸道粘膜在HEPES緩沖液中搖動(dòng)5min，用無菌注射器吸取0. 2mL上清液裝入含Rogosa SL瓊脂的滾管中培養(yǎng)Mh，再挑去白色菌落在厭氧無菌 RogosaSL肉湯里進(jìn)行培養(yǎng)。經(jīng)過革蘭氏染色和接觸酶試驗(yàn)，證明乳酸桿菌是健康仔豬胃腸道的優(yōu)勢(shì)菌群，說明經(jīng)鹽酸校正的Rogosa SL培養(yǎng)基適合分離胃腸道粘膜乳酸桿菌。菌種的篩選是及其煩瑣的過程。大多數(shù)乳酸菌的選育過程是從消化道上皮分離益生菌，這樣便可以獲得具有良好定植效果的菌種。( 二)發(fā)酵乳桿菌的抗逆性選育1. 1培養(yǎng)基1. 1. IRogosa SL 肉湯培養(yǎng)基同(一)中的1.2. 2。1.1.2厭氧斜面培養(yǎng)基同(一)中的1.2.1。1. 2耐酸性能選育制備含pH3. O和pH2. 5的Rogosa SL肉湯培養(yǎng)基，分別接種已培養(yǎng)Mh的胃乳酸桿菌和腸乳酸桿菌，接種量1 %，于37°C培養(yǎng)24h后觀察。如果培養(yǎng)基變的渾濁，說明該菌株耐酸。從接種開始和第他用無菌注射器取出ImL進(jìn)行梯度稀釋至10_5后，取0.3mL稀釋液在MRS瓊脂(pH5. 2)上均勻涂布，平皿放置在37°C，5% 0)2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)Mh，計(jì)算存活率。然后鏡檢看是否染菌。能夠生長(zhǎng)的菌株的最初分離樣品保存在_80°C冰箱備用。1. 3耐膽鹽性能選育制備含豬膽鹽0. 3 %的厭氧斜面培養(yǎng)基，接種已培養(yǎng)Mh的菌株，接種量1 %，于培養(yǎng)24h后觀察。如果培養(yǎng)基變的渾濁，說明該菌株耐膽鹽。然后鏡檢看是否染菌。能
夠生長(zhǎng)的菌株的最初分離樣品保存在_80°C冰箱備用。1. 4耐高銅性能選育制備含有250mg/kg五水硫酸銅的肉湯厭氧培養(yǎng)基，接種已培養(yǎng)Mh的菌培養(yǎng)物， 接種量1%，于培養(yǎng)12 7 后觀察。如果培養(yǎng)基變的渾濁，說明該菌株耐高銅。然后鏡檢看是否染菌。能夠生長(zhǎng)的菌株的最初分離樣品保存在_80°C冰箱備用。1. 5耐高鋅性能選育制備含有氧化鋅的肉湯厭氧培養(yǎng)基，接種已培養(yǎng)24h的菌培養(yǎng)物，接種量1%， 于培養(yǎng)12 7 后觀察。如果培養(yǎng)基變的渾濁，說明該菌株耐高鋅。然后鏡檢看是否染菌。能夠生長(zhǎng)的菌株的最初分離樣品保存在_80°C冰箱備用。2.結(jié)果與討論2. 1耐酸性能選育通過耐酸性能選育，有513株乳酸桿菌可以在pH2. 1的Rogosa SL培養(yǎng)基中生長(zhǎng)繁殖，淘汰率為30%。這說明胃腸道的大多數(shù)乳酸桿菌耐酸性能較好，有70%可以在仔豬的胃腸道中進(jìn)行繁殖。乳酸桿菌一般通過定植在消化道上皮發(fā)生益生特性。因此，如果菌種對(duì)胃酸沒有耐受性很難對(duì)動(dòng)物的生產(chǎn)性能產(chǎn)生良好的作用。2. 2耐膽鹽性能選育
將通過耐酸性能選育的513株乳酸桿菌進(jìn)行耐膽鹽性能選育，有103株乳酸桿菌可以在含膽鹽0.3^WR0g0sa SL培養(yǎng)基中生長(zhǎng)繁殖，淘汰率為79.92%。研究表明，膽鹽是腸乳酸桿菌在動(dòng)物胃腸道內(nèi)遇到的比胃酸更不利的因素。Chou和Weimer (1999)研究發(fā)現(xiàn)用膽鹽選擇性馴化乳酸桿菌對(duì)膽鹽的耐受力是有效的，經(jīng)過幾代膽鹽馴化之后得到的乳酸桿菌耐膽鹽的能力比親代乳酸桿菌強(qiáng)，乳酸桿菌容易對(duì)膽鹽性能產(chǎn)生耐受性，且具有一定的遺傳性，選育出耐膽鹽的發(fā)酵乳桿菌在生產(chǎn)中具有重要的意義。2. 3耐高銅性能選育將通過耐膽鹽性能選育的103株乳酸桿菌進(jìn)行耐高銅性能選育，有87株乳酸桿菌可以在含250mg/kg五水硫酸銅的Rogosa SL培養(yǎng)基中生長(zhǎng)繁殖，淘汰率為15. 53%。證明該乳酸桿菌具有較強(qiáng)的耐高銅特性。由于高銅日糧具有促生長(zhǎng)的作用，是目前我國比較普遍使用的日糧，因此選擇具有耐高銅的發(fā)酵乳桿菌是極其必要的。2. 4耐高鋅性能選育將通過耐高銅性能選育的87株乳酸桿菌進(jìn)行耐高鋅性能選育，有76株乳酸桿菌可以在含氧化鋅的Rogosa SL培養(yǎng)基中生長(zhǎng)繁殖，淘汰率為12.64%。高鋅具有防止腹瀉、促進(jìn)生長(zhǎng)的作用，因此在我國利用氧化鋅來配制仔豬飼料，尤其是生產(chǎn)斷奶仔豬飼料的廠家很多。因此選育出耐高鋅的發(fā)酵乳桿菌也是必要的。3 小結(jié)通過本試驗(yàn)獲得76株來源于仔豬胃腸道粘膜，對(duì)消化道內(nèi)環(huán)境有一定抵抗能力的乳酸桿菌菌株，這為以后的選種工作打下了基礎(chǔ)。(三)發(fā)酵乳桿菌的益生特性選育1. 1發(fā)酵乳桿菌代謝產(chǎn)物抑制大腸桿菌能力的選育大腸桿菌(K88、K99和987P)購自中國獸藥監(jiān)察所。Κ88在中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心的保藏號(hào)為CMCC44742，K99在中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心的保藏號(hào)為CMCC44820， 987P在中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心的保藏號(hào)為CMCC44317。乳酸桿菌76株耐酸、耐膽鹽、耐高銅、耐高鋅的腸乳酸桿菌。培養(yǎng)基麥康凱(MacConkay)培養(yǎng)基(購自北京天壇生物制品般份有限公司)。在Hungates管里加MRS肉湯(蛋白胨，IOg ；牛肉浸膏，IOg ；酵母浸粉，5g ；磷酸氫二鉀，2g ；枸椽酸二銨，2g ；葡萄糖，20g ；七水硫酸鎂，0. 58g ；四水硫酸錳，0. 25g ；醋酸鈉， 5g ；蒸餾水，IOOOmL)約15mL，充二氧化碳，制成無菌厭氧MRS肉湯。每個(gè)管中分別接種從健康仔豬胃腸道分離到的76株抗逆性強(qiáng)的腸乳酸桿菌，乳酸桿菌經(jīng)1 培養(yǎng)后按接種于肉湯中，在37°C培養(yǎng)箱里培養(yǎng)24h后，置4°C冰箱保存?zhèn)溆?。抑制大腸桿菌試驗(yàn)制作麥康凱培養(yǎng)基，加熱溶解后在121°C高壓滅菌15min后， 無菌傾倒平皿。用記號(hào)筆在平皿底部劃線將平皿分成三個(gè)平行的區(qū)域，每個(gè)區(qū)域用接種棒劃線接種大腸桿菌培養(yǎng)液G.0X108CFU/mL)于培養(yǎng)基表面，然后在距平皿中線約3cm的地方挖一寬為0. 5cm的溝，溝與接種劃線垂直，用熱接種棒補(bǔ)底，如圖2所示。分別用不同的乳酸桿菌培養(yǎng)物將溝填滿(不能溢出)，置普通培養(yǎng)箱37°C培養(yǎng)1 后，觀察出現(xiàn)大腸桿菌菌落的位置，大腸桿菌的菌落為紅色，測(cè)定離小溝最近的大腸桿菌菌落與小溝的距離。每個(gè)乳酸桿菌作兩個(gè)平行樣，以平均值表示結(jié)果。1. 2乳酸桿菌與大腸桿菌混合培養(yǎng)抑制作用選育
9
大腸桿菌(K88、K99和987Ρ)來源與1. 1節(jié)同。乳酸桿菌16株腸代謝產(chǎn)物對(duì)大腸桿菌具有較強(qiáng)抑制作用的乳酸桿菌。大腸桿菌的檢測(cè)培養(yǎng)基麥康凱(MacConkay)培養(yǎng)基與1. 1節(jié)同。乳酸桿菌接種于厭氧無菌MRS肉湯中，37°C培養(yǎng)24h后，置4°C冰箱保存?zhèn)溆谩?. 2. 1不同濃度乳酸桿菌對(duì)大腸桿菌的抑制隨機(jī)選擇一株乳酸桿菌，取5mL培養(yǎng)物(8. 2X109CFU/mL)分別與5、10、15mL營養(yǎng)肉湯混合，制成3個(gè)含不同乳酸桿菌培養(yǎng)物濃度的營養(yǎng)肉湯，接種大腸桿菌，接種量為培養(yǎng)液的5%，置37°C，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4、8和1 后，分別用無菌注射器取出培養(yǎng)液，培養(yǎng)液經(jīng)梯度稀釋成10_2 10_5后，每個(gè)稀釋度作4個(gè)平行樣，取0. 3mL稀釋液，用“L”棒均勻涂布于麥康凱瓊脂平板上，置于37°C，普通培養(yǎng)箱培養(yǎng)18h，取菌落數(shù)在50 150個(gè)的平皿計(jì)數(shù)，以平均值表示結(jié)果，計(jì)算每毫升培養(yǎng)液中大腸桿菌的數(shù)量。1. 2. 2含1/4乳酸桿菌的營養(yǎng)肉湯中乳酸桿菌與大腸桿菌的數(shù)量關(guān)系取5mL乳酸桿菌培養(yǎng)物(108CFU/mL)與15mL營養(yǎng)肉湯混合，接種24h大腸桿菌培養(yǎng)物，接種量為培養(yǎng)液的10% (107CFU/mL)，起始混合液中乳酸桿菌的數(shù)量為大腸桿菌的10 倍，用0. IN NaOH溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)液的pH為7.0，置37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后，分別用無菌注射器取出培養(yǎng)液，培養(yǎng)液經(jīng)梯度稀釋至10_5，ΙΟ"6,10_7后，取0. 3mL稀釋液用“L”棒均勻涂布于 MRS瓊脂培養(yǎng)基上，每個(gè)梯度的培養(yǎng)液作3個(gè)平行樣，MRS瓊脂培養(yǎng)基(pH5.4)置37°C、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)18h，取菌落數(shù)在50 150個(gè)的平皿計(jì)數(shù)，以平均值表示乳酸桿菌的數(shù)量，計(jì)算每毫升培養(yǎng)液中乳酸桿菌的數(shù)量。培養(yǎng)24h后直接用無菌注射器取ImL培養(yǎng)液經(jīng)梯度稀釋至10_2后，取0. :3mL稀釋液置于麥康凱瓊脂上，用“L”棒均勻涂布，每個(gè)管做3個(gè)平行樣， 將平板置于37°C，普通培養(yǎng)箱培養(yǎng)18h，計(jì)算每個(gè)平板的大腸桿菌菌落數(shù)，以平均值表示結(jié)^ ο2結(jié)果與討論2. 1乳酸桿菌代謝產(chǎn)物抑制大腸桿菌的選育乳酸桿菌代謝產(chǎn)物抑制大腸桿菌的效果以離小溝最近的大腸桿菌菌落與小溝的距離為指標(biāo)，距離越大，說明抑菌效果越好。本試驗(yàn)所采用的平皿挖溝法是對(duì)經(jīng)典的平皿挖孔法的改進(jìn)，基本原理是放置在溝中的抗菌物質(zhì)能滲透過瓊脂來抑制大腸桿菌，隨著離溝距離的增大，能滲透過去的抗菌物質(zhì)的濃度就越小。大腸桿菌菌落與小溝的距離越大，說明乳酸桿菌代謝產(chǎn)物所含抗菌物質(zhì)的抑菌能力越強(qiáng)。用平皿挖溝法在同一平皿可以同時(shí)測(cè)定乳酸桿菌代謝產(chǎn)物對(duì)3株大腸桿菌的抑制作用，而用平皿挖孔法在同一平皿只能測(cè)定對(duì)一株大腸桿菌的抑制作用。16株腸乳酸桿菌的抑菌距離在0. 7 3. Icm之間，進(jìn)一步研究它們與大腸桿菌混合培養(yǎng)的數(shù)量關(guān)系。2. 2乳酸桿菌與大腸桿菌體外培養(yǎng)的數(shù)量關(guān)系2. 2. 1不同比例乳酸桿菌培養(yǎng)物與大腸桿菌在混合培養(yǎng)條件下的數(shù)量關(guān)系結(jié)果見表1。表1營養(yǎng)肉湯中含不同比例乳酸桿菌培養(yǎng)液對(duì)大腸桿菌的抑制作用(單位CFU/ mL)
權(quán)利要求
1.發(fā)酵乳桿菌(LactcAacillusfermentum) HAFI5007，在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的登記入冊(cè)編號(hào)為CGMCC No. 4648。
2.一種發(fā)酵乳桿菌菌劑，其特征在于所述菌劑的活性成分為權(quán)利要求1所述的發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)HAFI5007。
3.權(quán)利要求1所述的發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)HAFI5007或權(quán)利要求2 所述的菌劑在制備下述任一產(chǎn)品中的應(yīng)用1)清除動(dòng)物自由基的產(chǎn)品；2)緩解動(dòng)物氧化應(yīng)激的產(chǎn)品；3)增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體抗氧化能力的產(chǎn)品；4)制備調(diào)解動(dòng)物腸內(nèi)微生態(tài)平衡的產(chǎn)品；5)增強(qiáng)動(dòng)物腸道黏膜屏障的產(chǎn)品；6)調(diào)節(jié)動(dòng)物粘膜免疫功能的產(chǎn)品；7)促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)的產(chǎn)品。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述自由基為下述三種自由基中的至少一種輕基自由基、超氧陰離子自由基和1，I" 二苯基苦基苯胼自由基；所述緩解動(dòng)物氧化應(yīng)激體現(xiàn)為下述1)-3)中至少一種1)提高動(dòng)物肌肉、肝臟和/或血漿中抗氧化酶的活性；2)降低動(dòng)物丙二醛的含量；幻增強(qiáng)動(dòng)物抑制自由基產(chǎn)生的能力；所述增強(qiáng)動(dòng)物腸道黏膜屏障體現(xiàn)為改善動(dòng)物腸道菌群組成和/或促進(jìn)動(dòng)物腸道粘液蛋白的表達(dá)；所述調(diào)節(jié)動(dòng)物粘膜免疫功能體現(xiàn)為下述1)-3)中至少一種1)增加動(dòng)物外周血T淋巴細(xì)胞⑶4+淋巴細(xì)胞亞群的比例；2)促進(jìn)回腸中TNF-α基因的表達(dá)；3)促進(jìn)回腸中IFN-γ 基因的表達(dá)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述腸道粘液蛋白為MUC2。
6.根據(jù)權(quán)利要求3-5中任一所述的應(yīng)用，其特征在于所述動(dòng)物為豬。
7.含有權(quán)利要求1所述發(fā)酵乳桿菌(LactcAacillusfermentum) HAFI5007或權(quán)利要求 2所述菌劑的動(dòng)物飼料。
8.權(quán)利要求1所述發(fā)酵乳桿菌(LactcAacillusfermentum) HAFI5007或權(quán)利要求2所述菌劑在制備大腸桿菌抑制劑中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于所述大腸桿菌抑制劑中的大腸桿菌為大腸桿菌K88、大腸桿菌K99或大腸桿菌987P。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株發(fā)酵乳桿菌及其應(yīng)用。該發(fā)酵乳桿菌為L(zhǎng)actobacillus fermentumHAFI5007，2011年3月11日在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏中心登記入冊(cè)編號(hào)CGMCC No.4648。本發(fā)明的發(fā)酵乳桿菌主要作為動(dòng)物的飼料添加劑，提高豬營養(yǎng)物質(zhì)消化率，改善胃腸道微生物菌系組成、腸道粘液蛋白表達(dá)以及腸道粘膜免疫功能，改善機(jī)體的抗氧化防御系統(tǒng)，緩解氧化應(yīng)激造成的氧化損傷，改善提高豬的生產(chǎn)性能。
文檔編號(hào)A61P31/04GK102226157SQ20111011657
公開日2011年10月26日 申請(qǐng)日期2011年5月6日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月6日
發(fā)明者丁修良, 宋青龍, 張海燕, 譙仕彥 申請(qǐng)人:北京龍科方舟生物工程技術(shù)中心