專利名稱：大青楊轉(zhuǎn)基因體系建立及其轉(zhuǎn)基因植株的擴繁方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因體系建立及其轉(zhuǎn)基因植株的擴繁方法。
背景技術(shù)：
大青楊(Populus ussuriensis kom.)又名又稱憨大楊、哈達楊，主要分布于黑龍江、吉林省，俄羅斯(遠東地區(qū))，朝鮮。是中國東北林區(qū)特有的鄉(xiāng)土樹種，木材輕軟，材質(zhì)潔白、致密、耐朽力強，是造紙及膠合板材極好的原料。大青楊的造林地多為土壤干旱瘠薄、地力衰退嚴重的退耕還林地，致使大青楊造林成活率低，林木生長周期長，采用常規(guī)育種技術(shù)進行新品種選育所需時間長、見效慢。在以往的大青楊研究主要集中在種源試驗、種子播種、航天育種、多倍體育種等常規(guī)育種，隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的飛速發(fā)展，利用農(nóng)桿菌介導法轉(zhuǎn)基因大青楊尚未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供大青楊轉(zhuǎn)基因體系建立及其轉(zhuǎn)基因植株的擴繁方法。大青楊轉(zhuǎn)基因體系建立的方法按以下步驟實現(xiàn)一、將一年生大青楊葉片和莖段在超凈工作臺內(nèi)用體積濃度為70%的酒精浸泡30s lmin，滅菌水沖洗2 3遍，然后轉(zhuǎn)入質(zhì)量濃度為1 %的NaClO溶液中消毒10 20min，滅菌水沖洗3 5遍，再接種到含0. 5mg/ L6-芐氨基嘌呤、0. lmg/L萘乙酸、20g/L蔗糖和5g/L瓊脂的V2MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)一個月，獲得組培苗；二、挑取一個含有LbDREB基因的工程菌的單菌落接種到20ml的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)至菌液的OD6c 值為0. 5 1. 0，然后用移液槍吸3 5ml的菌液至離心管中，以12000r/min 的轉(zhuǎn)速離心lmin，棄上清后加入等體積的1/2MS培養(yǎng)基并混勻，獲得侵染液，然后倒入培養(yǎng)皿中，再取組培苗的形態(tài)學上端的第二、第三葉片和形態(tài)學上端的三個莖節(jié)置于培養(yǎng)皿中， 將葉片邊緣切去后切成0. 5X0. 5cm的塊，并在葉脈處橫切2 3刀，莖節(jié)切去兩邊，侵染 30min后取出葉片和莖節(jié)接種到含0. 5mg/L 6-芐氨基嘌呤、0. lmg/L萘乙酸、20g/L蔗糖和 5g/L瓊脂的1/2MS培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)2天，然后用滅菌水沖洗3 5遍，再放入含200mg/L頭孢霉素的1/2MS培養(yǎng)基中，置于128r/min搖床上搖20 30min，取出后用滅過菌的濾紙吸干，即完成葉片和莖節(jié)的脫菌；三、脫菌后葉片和莖節(jié)接種到含50mg/L卡那霉素、200mg/L頭孢霉素、0. 5mg/ L 6-芐氨基嘌呤、0. lmg/L萘乙酸、20g/L蔗糖和5g/L瓊脂的1/2MS培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)至愈傷組織或不定芽形成，然后移至光下并在溫度為25°C、濕度為70%、光照強度為 40 μ mol · m_2 · 每天光照16h的條件下培養(yǎng)1 2個月，獲得抗性芽；四、將抗性芽接種到含0. lmg/L 6_芐氨基嘌呤、0. lmg/L萘乙酸、20g/L蔗糖和5g/ L瓊脂的1/2MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)至抗性芽高于3cm，然后轉(zhuǎn)接于含20g/L蔗糖和5g/L瓊脂的 1/2MS培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)，再挑選根系發(fā)達的植株移栽到栽培基質(zhì)中，澆透水并覆蓋塑料膜，在溫度為25°C、濕度為70%、光照強度為40 IOOymol · πΓ2 · s—1、每天光照16h的條件下培養(yǎng)6天后去掉覆蓋的塑料膜，獲得再生植株；五、取再生植株的葉片，用CTAB法提取基因組DNA，以含LbDRra基因的質(zhì)粒DNA做陽性對照，未轉(zhuǎn)化植株DNA及ddH20做陰性對照，進行PCR擴增，選取陽性的大青楊轉(zhuǎn)基因再生植株，再用改良SDS法提取陽性的大青楊轉(zhuǎn)基因再生植株的RNA，進行RT-PCR檢測，選取陽性的大青楊轉(zhuǎn)基因再生植株，即完成大青楊轉(zhuǎn)基因體系建立。大青楊轉(zhuǎn)基因植株的擴繁方法按以下步驟實現(xiàn)一、大青楊轉(zhuǎn)基因體系建立所獲得的大青楊轉(zhuǎn)基因再生植株，取其根、莖段和葉片接種到含0.5mg/L 6-芐氨基嘌呤、 0. lmg/L萘乙酸、20g/L蔗糖和5g/L瓊脂的1/2MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)一個月，獲得組培苗；二、分別取組培苗的根、莖段和葉片，用CTAB法提取基因組DNA，以含LbDREB基因的質(zhì)粒DNA做陽性對照，未轉(zhuǎn)化植株DNA及ddH20做陰性對照，進行PCR擴增，選取陽性的根、莖段和葉片；三、重復操作步驟一和步驟二 2次，即完成大青楊轉(zhuǎn)基因植株的擴繁。本發(fā)明大青楊轉(zhuǎn)基因體系建立的方法，可實現(xiàn)轉(zhuǎn)基因大青楊的快速培育，為大青楊優(yōu)良品種的開發(fā)奠定基礎(chǔ)，從而培育出速生、豐產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆的大青楊新種質(zhì)，使該樹種的生態(tài)效益、經(jīng)濟效益和社會效益得到迅速、充分發(fā)揮。本發(fā)明大青楊轉(zhuǎn)基因植株的擴繁方法，產(chǎn)生的后代遺傳穩(wěn)定性好，對于實現(xiàn)大青楊轉(zhuǎn)基因苗木的大規(guī)模、短周期、高繁殖率、低成本的工廠化生產(chǎn)和該樹種的轉(zhuǎn)基因植株田間試驗和推廣工作具有重要意義。


圖1為具體實施方式
九中PCR擴增的電泳圖，其中M表示DNA Marker DL2000, H 表示水對照，N表示陰性對照，P表示陽性對照，泳道1-13表示轉(zhuǎn)基因植株Al、A2、A3、A4、 A5、A6、A7、A8、A9、A10、B5、E3和B6 ；圖2為具體實施方式
九中RT-PCR檢測的電泳圖，其中 M表示DNA Marker DL2000，H表示水對照，N表示陰性對照，P表示陽性對照，泳道1_7表示轉(zhuǎn)基因植株 A1、B1、C1、D1、E1、E2 和 E3。
具體實施例方式具體實施方式
一本實施方式大青楊轉(zhuǎn)基因體系建立的方法按以下步驟實現(xiàn) 一、將一年生大青楊葉片和莖段在超凈工作臺內(nèi)用體積濃度為70%的酒精浸泡30s Imin,滅菌水沖洗2 3遍，然后轉(zhuǎn)入質(zhì)量濃度為1 %的NaClO溶液中消毒10 20min，滅菌水沖洗3 5遍，再接種到含0. 5mg/L 6-芐氨基嘌呤、0. lmg/L萘乙酸、20g/L蔗糖和5g/ L瓊脂的1/2MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)一個月，獲得組培苗；二、挑取一個含有LbDREB基因的工程菌的單菌落接種到20ml的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)至菌液的OD6c 值為0. 5 1. 0，然后用移液槍吸3 5ml的菌液至離心管中，以12000r/min 的轉(zhuǎn)速離心lmin，棄上清后加入等體積的1/2MS培養(yǎng)基并混勻，獲得侵染液，然后倒入培養(yǎng)皿中，再取組培苗的形態(tài)學上端的第二、第三葉片和形態(tài)學上端的三個莖節(jié)置于培養(yǎng)皿中， 將葉片邊緣切去后切成0. 5X0. 5cm的塊，并在葉脈處橫切2 3刀，莖節(jié)切去兩邊，侵染 30min后取出葉片和莖節(jié)接種到含0. 5mg/L 6-芐氨基嘌呤、0. lmg/L萘乙酸、20g/L蔗糖和 5g/L瓊脂的1/2MS培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)2天，然后用滅菌水沖洗3 5遍，再放入含200mg/L頭孢霉素的1/2MS培養(yǎng)基中，置于128r/min搖床上搖20 30min，取出后用滅過菌的濾紙吸干，即完成葉片和莖節(jié)的脫菌；三、脫菌后葉片和莖節(jié)接種到含50mg/L卡那霉素、200mg/L頭孢霉素、0. 5mg/ L 6-芐氨基嘌呤、0. lmg/L萘乙酸、20g/L蔗糖和5g/L瓊脂的1/2MS培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)至愈傷組織或不定芽形成，然后移至光下并在溫度為25°C、濕度為70%、光照強度為 40 μ mol · m_2 · 每天光照16h的條件下培養(yǎng)1 2個月，獲得抗性芽；四、將抗性芽接種到含0. lmg/L 6_芐氨基嘌呤、0. lmg/L萘乙酸、20g/L蔗糖和5g/ L瓊脂的1/2MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)至抗性芽高于3cm，然后轉(zhuǎn)接于含20g/L蔗糖和5g/L瓊脂的 1/2MS培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)，再挑選根系發(fā)達的植株移栽到栽培基質(zhì)中，澆透水并覆蓋塑料膜，在溫度為25°C、濕度為70%、光照強度為40 IOOymol · πΓ2 · s—1、每天光照16h的條件下培養(yǎng)6天后去掉覆蓋的塑料膜，獲得再生植株；五、取再生植株的葉片，用CTAB法提取基因組DNA，以含LbDRra基因的質(zhì)粒DNA做陽性對照，未轉(zhuǎn)化植株DNA及ddH20做陰性對照，進行PCR擴增，選取陽性的大青楊轉(zhuǎn)基因再生植株，再用改良SDS法提取陽性的大青楊轉(zhuǎn)基因再生植株的RNA，進行RT-PCR檢測，選取陽性的大青楊轉(zhuǎn)基因再生植株，即完成大青楊轉(zhuǎn)基因體系建立。本實施方式中1/2MS培養(yǎng)基即MS培養(yǎng)基中大量元素濃度減半，成分如表1所示。表 權(quán)利要求
1.大青楊轉(zhuǎn)基因體系建立的方法，其特征在于大青楊轉(zhuǎn)基因體系建立的方法按以下步驟實現(xiàn)一、將一年生大青楊葉片和莖段在超凈工作臺內(nèi)用體積濃度為70%的酒精浸泡30s lmin，滅菌水沖洗2 3遍，然后轉(zhuǎn)入質(zhì)量濃度為的NaClO溶液中消毒10 20min，滅菌水沖洗3 5遍，再接種到含0. 5mg/L 6-芐氨基嘌呤、0. lmg/L萘乙酸、20g/L 蔗糖和5g/L瓊脂的1/2MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)一個月，獲得組培苗；二、挑取一個含有LbDREB基因的工程菌的單菌落接種到20ml的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)至菌液的OD6tltl值為0. 5 1. 0，然后用移液槍吸3 5ml的菌液至離心管中，以12000r/min 的轉(zhuǎn)速離心lmin，棄上清后加入等體積的1/2MS培養(yǎng)基并混勻，獲得侵染液，然后倒入培養(yǎng)皿中，再取組培苗的形態(tài)學上端的第二、第三葉片和形態(tài)學上端的三個莖節(jié)置于培養(yǎng)皿中， 將葉片邊緣切去后切成0. 5X0. 5cm的塊，并在葉脈處橫切2 3刀，莖節(jié)切去兩邊，侵染 30min后取出葉片和莖節(jié)接種到含0. 5mg/L 6-芐氨基嘌呤、0. lmg/L萘乙酸、20g/L蔗糖和 5g/L瓊脂的1/2MS培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)2天，然后用滅菌水沖洗3 5遍，再放入含200mg/L頭孢霉素的1/2MS培養(yǎng)基中，置于128r/min搖床上搖20 30min，取出后用滅過菌的濾紙吸干，即完成葉片和莖節(jié)的脫菌；三、脫菌后葉片和莖節(jié)接種到含50mg/L卡那霉素、200mg/L頭孢霉素、0.5mg/L 6-芐氨基嘌呤、0. lmg/L萘乙酸、20g/L蔗糖和5g/L瓊脂的1/2MS培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)至愈傷組織或不定芽形成，然后移至光下并在溫度為25°C、濕度為70%、光照強度為40μπιΟ1 · πΓ2 · s—1、每天光照16h的條件下培養(yǎng)1 2個月，獲得抗性芽；四、將抗性芽接種到含0.lmg/L 6-芐氨基嘌呤、0. lmg/L萘乙酸、20g/L蔗糖和5g/L瓊脂的1/2MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)至抗性芽高于3cm，然后轉(zhuǎn)接于含20g/L蔗糖和5g/L瓊脂的1/2MS 培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)，再挑選根系發(fā)達的植株移栽到栽培基質(zhì)中，澆透水并覆蓋塑料膜， 在溫度為25°C、濕度為70%、光照強度為40 100 μ mol · πΓ2 · s—1、每天光照16h的條件下培養(yǎng)6天后去掉覆蓋的塑料膜，獲得再生植株；五、取再生植株的葉片，用CTAB法提取基因組DNA，以含LbDREB基因的質(zhì)粒DNA做陽性對照，未轉(zhuǎn)化植株DNA及ddH20做陰性對照，進行PCR擴增，選取陽性的大青楊轉(zhuǎn)基因再生植株，再用改良SDS法提取陽性的大青楊轉(zhuǎn)基因再生植株的RNA，進行RT-PCR檢測，選取陽性的大青楊轉(zhuǎn)基因再生植株，即完成大青楊轉(zhuǎn)基因體系建立。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大青楊轉(zhuǎn)基因體系建立的方法，其特征在于步驟一中將一年生大青楊葉片和莖段在超凈工作臺內(nèi)用體積濃度為70%的酒精浸泡40s，滅菌水沖洗2遍， 然后轉(zhuǎn)入質(zhì)量濃度為的Naao溶液中消毒15min，滅菌水沖洗4遍。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大青楊轉(zhuǎn)基因體系建立的方法，其特征在于步驟一中接種是將莖段直接放在培養(yǎng)基表面上；將葉片背面朝下放到培養(yǎng)基上。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大青楊轉(zhuǎn)基因體系建立的方法，其特征在于步驟四中栽培基質(zhì)按體積份數(shù)比由1份滅菌的沙子和3份滅菌的泥土組成。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大青楊轉(zhuǎn)基因體系建立的方法，其特征在于步驟五中PCR擴增采用20 μ L反應(yīng)體系，由下列成分組成成分用量模板基因組DNAlμL·10 Um上游引物DrDL1 μL 5'- ATGGCTACAGCTATTGATATTTAC-3‘·10 Um下游引物DrDR1 μL 5'- TCAATCGATCTCCATAGACGG -3'·10 X擴增緩沖液2|iL·2.5mM dNTP 混合液1.6|iL·5υ/μ1 Taq DNA 聚合酶0.4|iLddH20\3μLPCR條件為94°C預變性3min，94°C變性30s，58°C退火30s，72°C延伸lmin，共35個循環(huán)，再72°C延伸7min，4°C保溫。
6.如權(quán)利要求1所述大青楊轉(zhuǎn)基因體系建立的方法所得大青楊轉(zhuǎn)基因植株的擴繁方法，其特征在于大青楊轉(zhuǎn)基因植株的擴繁方法按以下步驟實現(xiàn)一、大青楊轉(zhuǎn)基因體系建立所獲得的大青楊轉(zhuǎn)基因再生植株，取其根、莖段和葉片接種到含0.5mg/L 6-芐氨基嘌呤、 0. lmg/L萘乙酸、20g/L蔗糖和5g/L瓊脂的1/2MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)一個月，獲得組培苗；二、分別取組培苗的根、莖段和葉片，用CTAB法提取基因組DNA，以含LbDREB基因的質(zhì)粒DNA做陽性對照，未轉(zhuǎn)化植株DNA及ddH20做陰性對照，進行PCR擴增，選取陽性的根、莖段和葉片；三、重復操作步驟一和步驟二2次，即完成大青楊轉(zhuǎn)基因植株的擴繁。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的大青楊轉(zhuǎn)基因植株的擴繁方法，其特征在于步驟一中接種是將莖段直接放在培養(yǎng)基表面上；將葉片背面朝下放到培養(yǎng)基上。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的大青楊轉(zhuǎn)基因植株的擴繁方法，其特征在于步驟二中PCR擴增采用20 μ L反應(yīng)體系，由下列成分組成成分用量模板基因組DNAlμL·10 Um上游引物DrDL1 μL 5'- ATGGCTACAGCTATTGATATTTAC-3‘·10 Um下游引物DrDR1 μL 5'- TCAATCGATCTCCATAGACGG -3'·10 X擴增緩沖液2|iL·2.5mM dNTP 混合液1.6|iL·5υ/μ1 Taq DNA 聚合酶0.4|iLddH20\3μLPCR條件為94°C預變性3min，94°C變性30s，58°C退火30s，72°C延伸lmin，共35個循環(huán)，再72°C延伸7min，4°C保溫。
全文摘要
大青楊轉(zhuǎn)基因體系建立及其轉(zhuǎn)基因植株的擴繁方法，它涉及轉(zhuǎn)基因體系建立及其轉(zhuǎn)基因植株的擴繁方法。體系建立獲得組培苗；含有LbDREB基因的工程菌的活化及外源基因的轉(zhuǎn)化；脫菌后獲得抗性芽；抗性芽生根及移栽；再生植株進行PCR和RT-PCR檢測，選取陽性植株，即完成。擴繁大青楊轉(zhuǎn)基因體系建立所獲得的大青楊轉(zhuǎn)基因再生植株進行分化培養(yǎng)，獲得組培苗；進行PCR和RT-PCR檢測，取陽性的根、莖段和葉片；三、重復操作2次，即完成。本發(fā)明可實現(xiàn)轉(zhuǎn)基因大青楊的快速培育，為大青楊優(yōu)良品種的開發(fā)奠定基礎(chǔ)；產(chǎn)生的后代遺傳穩(wěn)定性好，對于實現(xiàn)大青楊轉(zhuǎn)基因苗木的大規(guī)模、短周期、高繁殖率和低成本的工廠化生產(chǎn)有重要意義。
文檔編號C12Q1/68GK102283111SQ20111016230
公開日2011年12月21日 申請日期2011年6月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月16日
發(fā)明者劉桂豐, 劉立輝, 周晨光, 李開隆, 李成浩, 李春燕, 杜佳, 楊靜莉, 靳春蓮 申請人:東北林業(yè)大學