專利名稱：一種發(fā)酵生產(chǎn)l-苯丙氨酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種發(fā)酵生產(chǎn)L-苯丙氨酸的方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
苯丙氨酸(WienylalanindJPD，L-α -氨基-β -苯基丙酸，有外消旋DL-型、 L-型和D-型三種，其中具有生物活性的光學(xué)異構(gòu)體為L-苯丙氨酸(L-Phenylalanine， L-Phe)(圖1)。L-Phe作為人和動(dòng)物體內(nèi)不能合成的8種必需氨基酸之一，是高甜度低熱量的新型甜味劑阿斯巴甜的重要組成部分，在食品、飼料添加劑以及醫(yī)藥等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用。大腸桿菌(E. coli)作為生產(chǎn)L-Phe的主要菌株，其胞內(nèi)L-Phe生物合成途徑如圖2所示。其中，由磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和4-磷酸赤蘚糖(E4P)在3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖酸7-磷酸合成酶(DAHP synthases, DS)的催化下縮合生成3_脫氧-D-阿拉伯庚酮糖酸7-磷酸(DAHP)的反應(yīng)為第一個(gè)限速反應(yīng)。第二和第三個(gè)限速反應(yīng)分別為由分支酸在分支酸變位酶(Chorismate mutase, CM)的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)轭A(yù)苯酸，繼而在預(yù)苯酸脫水酶(Pr印henate dehydratase, PDT)的作用下脫水、脫羧后形成PPA。PEP和E4P作為兩個(gè)重要的限制性底物，它們的供應(yīng)量決定著中心代謝流的碳源能否有效地導(dǎo)向DAHP的合成， 從而為芳香族氨基酸的合成提供充足的前體物質(zhì)。而PEP作為一個(gè)多酶競(jìng)爭性底物，PTS 消耗至少50%的PEP，丙酮酸激酶(Pyruvate kinase, PYK)和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 (Phosphoenolpyruvate carboxylase,PPC)利用約 32% 的 PEP，只有 3% 的 PEP 用于芳香族氨基酸的合成。因此，通過敲除Ρ (可有效提高DAHP的產(chǎn)率系數(shù)，從而調(diào)節(jié)PEP在芳香族氨基酸合成中的的供應(yīng)量，提高L-Phe的產(chǎn)量。溫度作為發(fā)酵過程的重要因素之一，影響與生長代謝相關(guān)酶類的催化反應(yīng)速率及穩(wěn)定性，從而調(diào)節(jié)微生物的生長和代謝產(chǎn)物的合成。采用適宜的培養(yǎng)溫度有望改善PI突變菌株生產(chǎn)L-Phe的能力。另外，由于生產(chǎn)L-Phe的質(zhì)粒pAP_B03是一個(gè)溫度誘導(dǎo)型質(zhì)粒， 誘導(dǎo)溫度與參與L-Phe生物合成的關(guān)鍵酶DS和CM-PDT的表達(dá)有著密切的聯(lián)系，而同時(shí)，關(guān)鍵酶的活性在不同的溫度下表現(xiàn)出不同的穩(wěn)定性，即溫度既影響關(guān)鍵酶的表達(dá)，又影響著酶的活力和穩(wěn)定性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種發(fā)酵生產(chǎn)L-苯丙氨酸的方法。本發(fā)明技術(shù)方案為以丙酮酸激酶基因pykA缺失型的大腸桿菌為生產(chǎn)菌株，在誘導(dǎo)階段，以36-40°C的溫度進(jìn)行誘導(dǎo)合成L-苯丙氨酸。特別地，當(dāng)菌體干重(DCW)達(dá)到9. 5g/L，以36-40°C的溫度進(jìn)行誘導(dǎo)直至發(fā)酵結(jié)
束ο所述丙酮酸激酶基因pykA缺失型的大腸桿菌BR-42 ApykA (pAP-B03)是在L-苯丙氨酸生產(chǎn)菌株E. coli BR-42(pAP-B03)(保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC M 2010008，詳見專利申請(qǐng)201010124215. 6)的基礎(chǔ)上敲除了丙酮酸激酶基因pykA。培養(yǎng)基成分種子培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10，氯化鈉10，酵母粉5，pH調(diào)至7. 2;接種前加入卡那霉素至40mg/L。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖20，(NH4)2SO4 5，KH2PO4 3，MgSO4 · 7H20 3，NaCl 1， Na-Citrate 1. 5，CaCl2 ·2Η20 0· 015，F(xiàn)eSO4 ·7Η20 0· 1125，維生素 B1-HClO. 075，L-Tyr 0.3， 蛋白胨4，酵母粉2，微量元素營養(yǎng)液(TES) 1. 5mL/L，卡那霉素0. 04，pH調(diào)至6. 8。TES (g/L) =Al2(SO4)3 · 18H20 2. 0，CoSO4 · 7H20 0. 75，CuSO4 · 5H20 2. 5，H3BO3O. 5， MnSO4 · 7H20 24，Na2MoO4 · 2H20 3. 0，NiSO4 · 6H20 2. 5，ZnSO4 · 7H20 15。培養(yǎng)方法三角搖瓶中的種子培養(yǎng)方法接種量10%，溫度37°C，搖床轉(zhuǎn)速200r/min。3L發(fā)酵罐中的發(fā)酵培養(yǎng)方法初始裝液量為1. 35L，接種量為10%，溶氧水平通過與攪拌轉(zhuǎn)速自動(dòng)級(jí)聯(lián)控制為30%，通氣量為1. 5vvm，初始溫度為33°C，當(dāng)DCW達(dá)到9. 5g/L 左右時(shí)，以36-40°C的溫度進(jìn)行誘導(dǎo)直至發(fā)酵結(jié)束。發(fā)酵過程中初始糖耗至5g/L時(shí)開始流加700g/L的葡萄糖溶液，每池取樣測(cè)定殘?zhí)?，控制發(fā)酵過程中的糖濃度為5士3g/L至發(fā)酵結(jié)束。通過30% (ν/ν)磷酸及(ν/ν) 氨水將pH維持在6. 8 士 0. 3。所述控制發(fā)酵過程中糖濃度的方法為通過每池測(cè)定實(shí)際殘?zhí)菨舛?，通過調(diào)節(jié)葡萄糖溶液流加速率控制殘?zhí)菨舛仍? 士 3g/L范圍內(nèi)。殘?zhí)堑臏y(cè)定方法取發(fā)酵上清液，稀釋一百倍后，使用葡萄糖-谷氨酸鹽分析儀 SBA-40C測(cè)定殘?zhí)?。?xì)胞干重(DCW)的測(cè)定方法為取一定量的菌懸液置于IOmL容量瓶中，加去離子水定容，搖勻，用722型可見分光光度計(jì)，于eiOnm處比色測(cè)OD值，利用細(xì)胞干重標(biāo)準(zhǔn)曲線
算得細(xì)胞干重。L-苯丙氨酸濃度的測(cè)定方法采用氨基酸常用測(cè)定方法，高效液相色譜(HPLC)柱前衍生化方法進(jìn)行測(cè)定(Rapid, accurate, sensitive, and reproducible HPLC analysis of amino acids. Henderson,J. W,Ricker,R. D. ,Bidlingmeyer,B. A. ,Woodward,C. ,Agilent Technologies, USA,2000)。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于1)改善了菌體在發(fā)酵后期的生長，提高了其合成L-苯丙氨酸的能力；2)提高了質(zhì)粒的穩(wěn)定性，減輕了發(fā)酵后期關(guān)鍵酶活的下降趨勢(shì)，使L-Phe生產(chǎn)過程得到加強(qiáng)，提高了 L-Phe對(duì)葡萄糖底物的的率系數(shù)；3)減少了發(fā)酵周期，提高了生產(chǎn)強(qiáng)度。


圖1，L-Phe的契線式圖2，E. coli中L-Phe合成途徑及調(diào)控方式圖3，丙酮酸激酶基因pykA缺失型的大腸桿菌的構(gòu)建流程圖
具體實(shí)施例方式實(shí)施例一丙酮酸激酶基因pykA缺失型的大腸桿菌的構(gòu)建方法參照Datsenko和Warmer 白勺方^去(Datsenko KA, Wanner BL. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2000,97 6640-6645)，敲除L-Phe生產(chǎn)菌Ε. co 1 i BR-42的pykA基因以構(gòu)建pykA單基因缺失菌株E. coli BR_42ApykA。附圖3為丙酮酸激酶基因pykA缺失型的大腸桿菌的構(gòu)建框架圖。其中，E. coli BR-42保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC M 2010008 ； E.coli JW1843-1 購自美國耶魯大學(xué)菌種保藏中心(http://cgsc.biology.yale.edu/)； 質(zhì)粒PKD46和pCP20為商品化大腸桿菌質(zhì)粒。根據(jù)NCBI上菌株E. coli W3110的pykA基因上下游序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物。上游引物(AU)5' -AATTGTAGCGACGGAGACG-3‘下游引物(AD)5' -GATTTATGATGGCAAGACG-3‘實(shí)施例二培養(yǎng)基組成詳見發(fā)明內(nèi)容部分。三角搖瓶中的種子培養(yǎng)方法接種量10%，溫度37°C，搖床轉(zhuǎn)速200r/min。3L發(fā)酵罐中的發(fā)酵培養(yǎng)方法初始裝液量為1. 35L，接種量為10%，溶氧水平通過與攪拌轉(zhuǎn)速自動(dòng)級(jí)聯(lián)控制為30%，通氣量為1. 5vvm，初始溫度為33°C，當(dāng)DCW達(dá)到9. 5g/L 左右時(shí)，以38°C的溫度進(jìn)行誘導(dǎo)直至發(fā)酵結(jié)束。當(dāng)培養(yǎng)基中葡萄糖濃度消耗至5g/L時(shí)向發(fā)酵罐中流加700g/L的葡萄糖溶液維持其濃度在5 士 3g/L，發(fā)酵過程中通過流加30% (ν/ν) 磷酸及(ν/ν)氨水將ρΗ維持在6. 8 士 0. 3。當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行到24h左右時(shí)，菌體濃度出現(xiàn)下降的趨勢(shì)；在發(fā)酵后期，有質(zhì)粒丟失的現(xiàn)象，發(fā)酵結(jié)束時(shí)，約5%的重組大腸桿菌丟失了質(zhì)粒，這影響著胞內(nèi)合成L-苯丙氨酸的關(guān)鍵酶的表達(dá)水平；通過檢測(cè)整個(gè)發(fā)酵過程中胞內(nèi)關(guān)鍵酶DS、CM和PDT的酶活變化，發(fā)現(xiàn)3種酶隨著發(fā)酵的進(jìn)行都呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。發(fā)酵后期菌體濃度的下降、質(zhì)粒的丟失以及關(guān)鍵酶活的降低都制約著L-苯丙氨酸的合成效率。結(jié)果見表1。實(shí)施例三3L發(fā)酵罐中的發(fā)酵培養(yǎng)方法初始裝液量為1. 35L，接種量為10%，溶氧水平通過與攪拌轉(zhuǎn)速自動(dòng)級(jí)聯(lián)控制為30%，通氣量為1.5vvm，初始溫度為33°C，當(dāng)DCW達(dá)到9. 5g/ L左右時(shí)，以40°C的溫度進(jìn)行誘導(dǎo)直至發(fā)酵結(jié)束。當(dāng)初始糖耗完至5g/L以內(nèi)時(shí)開始流加 700g/L的葡萄糖溶液，每池取樣測(cè)定殘?zhí)?，控制發(fā)酵過程中的糖濃度為5士3g/L至發(fā)酵結(jié)束，通過30% (ν/ν)磷酸及(ν/ν)氨水將ρΗ維持在6. 8 士 0.3。與對(duì)照相似，當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行到20h左右時(shí)，菌體濃度出現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)。在發(fā)酵后期質(zhì)粒丟失較對(duì)照嚴(yán)重，發(fā)酵結(jié)束時(shí)，約8%的重組大腸桿菌丟失了質(zhì)粒，這影響著胞內(nèi)合成L-苯丙氨酸的關(guān)鍵酶的表達(dá)水平；整個(gè)發(fā)酵過程中胞內(nèi)關(guān)鍵酶DS、CM和PDT的酶活都呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。發(fā)酵后期菌體濃度的下降、質(zhì)粒的丟失以及關(guān)鍵酶活的降低都制約著L-苯丙氨酸的合成效率。結(jié)果見表1。實(shí)施例四3L發(fā)酵罐中的發(fā)酵培養(yǎng)方法初始裝液量為1. 35L，接種量為10%，溶氧水平通過與攪拌轉(zhuǎn)速自動(dòng)級(jí)聯(lián)控制為30%，通氣量為1.5vvm，初始溫度為33°C，當(dāng)DCW達(dá)到9. 5g/ L左右時(shí)，以36°C的溫度進(jìn)行誘導(dǎo)直至發(fā)酵結(jié)束。當(dāng)初始糖耗完至5g/L以內(nèi)時(shí)開始流加 700g/L的葡萄糖溶液，每池取樣測(cè)定殘?zhí)?，控制發(fā)酵過程中的糖濃度為5士3g/L至發(fā)酵結(jié)束，通過30% (ν/ν)磷酸及(ν/ν)氨水將ρΗ維持在6. 8 士 0.3。與對(duì)照不同的是，以36°C進(jìn)行誘導(dǎo)時(shí)，菌體生長得到了改善，在整個(gè)誘導(dǎo)發(fā)酵過程中，菌體濃度基本維持在18g/L左右，高于38°C和40°C誘導(dǎo)時(shí)的菌體濃度；在發(fā)酵后期幾乎無質(zhì)粒丟失現(xiàn)象；而整個(gè)發(fā)酵過程中胞內(nèi)關(guān)鍵酶DS、CM和PDT的酶活也呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，但在發(fā)酵的前期，酶活水平均低于其他兩個(gè)溫度下的酶活，這可能與誘導(dǎo)強(qiáng)度有關(guān)。雖然發(fā)酵后期高的菌體濃度和高的質(zhì)粒穩(wěn)定性為L-苯丙氨酸的過量合成提供了保證， 但是發(fā)酵前期較低的酶活水平并不利于整個(gè)誘導(dǎo)階段的L-苯丙氨酸合成。結(jié)果見表1。實(shí)施例五3L發(fā)酵罐中的發(fā)酵培養(yǎng)方法初始裝液量為1. 35L，接種量為10%，溶氧水平通過與攪拌轉(zhuǎn)速自動(dòng)級(jí)聯(lián)控制為30%，通氣量為1.5vvm，初始溫度為33°C，當(dāng)DCW達(dá)到9. 5g/ L左右時(shí)，采用分階段溫度誘導(dǎo)策略，即13. 5-20h采用誘導(dǎo)溫度40°C，20-37h降低溫度至 38°C,38h以后的發(fā)酵采用36°C進(jìn)行誘導(dǎo)。當(dāng)初始糖耗完至5g/L以內(nèi)時(shí)開始流加700g/L 的葡萄糖溶液，每池取樣測(cè)定殘?zhí)牵刂瓢l(fā)酵過程中的糖濃度為5 士 3g/L至發(fā)酵結(jié)束，通過 30% (ν/ν)磷酸及(ν/ν)氨水將ρΗ維持在6. 8 士 0. 3。通過采用分階段溫度誘導(dǎo)策略，可以顯著改善菌體生長和合成L-苯丙氨酸的能力，質(zhì)粒的穩(wěn)定性很好的維持在95%以上，發(fā)酵前期3種關(guān)鍵酶的酶活水平均高于單一溫度誘導(dǎo)下的酶活，而發(fā)酵后期，酶活降低的趨勢(shì)有所緩解，有利于整個(gè)誘導(dǎo)階段的菌體生長和L-苯丙氨酸合成。發(fā)酵48h時(shí)，L-苯丙氨酸的產(chǎn)量達(dá)到52. 70g/L，分別比在40°C、38°C 和36°C時(shí)提高了 22. 39%、13. 77%和12.01%。L-苯丙氨酸對(duì)葡萄糖的得率和生產(chǎn)強(qiáng)度都有不同程度的提高。詳見表1。表1不同誘導(dǎo)溫度條件下E. coli BR-42ApykA(pAP-B03)發(fā)酵生產(chǎn)L-Phe的參數(shù)
比較
權(quán)利要求
1.一種發(fā)酵生產(chǎn)L-苯丙氨酸的方法，以丙酮酸激酶基因pykA缺失型的大腸桿菌為生產(chǎn)菌株，其特征在于，在誘導(dǎo)階段，以36-40°C的溫度進(jìn)行誘導(dǎo)合成L-苯丙氨酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，當(dāng)菌體干重達(dá)到9.5g/L，以36-40°C的溫度進(jìn)行誘導(dǎo)直至發(fā)酵結(jié)束。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，13.5-20h采用誘導(dǎo)溫度40°C，20-37h降低溫度至38°C，3 !以后采用36°C進(jìn)行誘導(dǎo)至發(fā)酵結(jié)束；發(fā)酵過程中初始糖耗至5g/L時(shí)開始流加700g/L的葡萄糖溶液，每池取樣測(cè)定殘?zhí)?，控制發(fā)酵過程中的糖濃度為5 士 3g/L至發(fā)酵結(jié)束，通過30% (ν/ν)磷酸及(ν/ν)氨水將ρΗ維持在6. 8 士 0.3。
全文摘要
一種發(fā)酵生產(chǎn)L-苯丙氨酸的方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及溫度誘導(dǎo)強(qiáng)化丙酮酸激酶基因pykA缺失型大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)L-苯丙氨酸。本發(fā)明在丙酮酸激酶基因pykA缺失型大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)L-Phe過程中，采用分階段溫度誘導(dǎo)策略，即13.5-20h采用誘導(dǎo)溫度40℃，20-37h降低溫度至38℃，38h以后采用36℃進(jìn)行誘導(dǎo)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于顯著改善了丙酮酸激酶基因pykA缺失型大腸桿菌生長和生產(chǎn)L-Phe的能力，提高了發(fā)酵過程中質(zhì)粒的穩(wěn)定性，改善了在發(fā)酵后期關(guān)鍵酶活下降的趨勢(shì)，提高了L-苯丙氨酸的產(chǎn)量、生產(chǎn)強(qiáng)度和對(duì)葡萄糖底物的得率系數(shù)。
文檔編號(hào)C12R1/19GK102181503SQ20111009426
公開日2011年9月14日 申請(qǐng)日期2011年4月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月15日
發(fā)明者何敏, 劉峰, 徐堃 申請(qǐng)人:江蘇漢光生物工程有限公司