專利名稱：伊氏錐蟲與路氏錐蟲二重pcr檢測試劑盒及制備方法
技術領域：
本發(fā)明公開一種伊氏錐蟲與路氏錐蟲二重PCR檢測試劑盒，用于伊氏錐蟲與路氏錐蟲快速PCR檢測，本發(fā)明還提供了該試劑盒的制備方法，屬于寄生蟲檢測技術領域。
背景技術：
錐蟲(Trypanosoma)是哺乳動物血液中的一種常見鞭毛蟲，是一類具有廣泛宿主的人畜共患寄生原蟲，流行于亞非拉美各大洲。在不同洲流行種類也有所不同，在亞洲及我國主要流行伊氏錐蟲(Trypanosoma evansi)和路氏錐蟲(Trypanosoma lewisi)。伊氏錐蟲傳播途徑主要經(jīng)吸血昆蟲機械性傳播和胎盤感染。在畜牧養(yǎng)殖業(yè)中可引起家畜的伊氏錐蟲病，造成家畜日漸消瘦，甚至死亡。Joshi等報道印度有感染人的病例。此外，路氏錐蟲在世界各地嚙齒動物的感染也較為普遍，主要寄生在褐鼠體內，自然條件下通過媒介蚤傳播， 國外已有人體感染病例報道，2007年有報道泰國確診病例為路氏錐蟲感染；印度也有類似報道。有調查報道我國東北部地區(qū)人群中路氏錐蟲抗體陽性，人群中可能存在亞臨床或誤診病例，目前給我國畜牧業(yè)和公共衛(wèi)生也帶來了新的威脅。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供一種伊氏錐蟲與路氏錐蟲二重PCR檢測試劑盒，可用于伊氏錐蟲與路氏錐蟲的同時快速鑒別和檢測。本發(fā)明進一步提供了上述試劑盒的制備方法。本發(fā)明的多種重要水源性人獸共患原蟲同時檢測試劑盒，包括以下部分 (1)樣本裂解液與DNA提取試劑
樣本裂解液NaCl、Tris-HCl, EDTA、SDS和蛋白酶K的混合溶液；其中，濃度配比為 NaCl IOOmM, Tris-HCKpH 7. 5) 20Mm、EDTA 25 Mm、SDS 2% (w/v)和蛋白酶 K 0. 1 μ g/ μ 1 ； DNA提取試劑為酚氯仿異戊醇(24:25:1)。(2)PCR反應液含反應終濃度各100_300μΜ的4種dNTPs，反應終濃度各 IO-IOOpmol/μ 1的引物，1.5-4. 5mM的Mg2+濃度；DNA聚合酶，滅菌蒸餾水。(3) 二重 PCR 引物
伊氏錐蟲引物TE-a與TE-s，路氏錐蟲引物TL-a與TL_s ； (4)陽性對照陽性對照為伊氏錐蟲DNA和路氏錐蟲DNA。(5)陰性對照取滅菌蒸餾水為陰性對照樣本。本發(fā)明的試劑盒可以含有瓊脂糖Agarose (99. 0%)、溴酚藍點樣緩沖液(5U/μ L) 和Taq酶(5U/ μ L)，溴化乙錠(10 μ g/ μ L)；還可以含有PCR反應管。本發(fā)明所述試劑盒的制備方法，包括以下步驟 (1)樣本裂解液與DNA提取試劑
樣本裂解液將NaCl、Tris-HCl、EDTA、SDS和蛋白酶K制成混合溶液；其中，濃度配比為NaCl IOOmM, Tris-HCl(pH 7. 5) 20Mm、EDTA 25 Mm、SDS 2% (w/v)和蛋白酶 K 0. 1 μ g/μl；
DNA提取試劑為酚氯仿異戊醇(25:Μ: 1)。(2) 二重 PCR 引物
在GeneBank上比對選取伊氏錐蟲和路氏錐蟲特異診斷基因，分別Roht 1.2 VSG基因和18S rRNA基因。伊氏錐蟲(擴增片段大小為482bp) TE-a 5'CGGGTCGTCTGCTAAAGT3'
TE-s 5'GCCCGCAGTTGCCTAT3' 路氏錐蟲(擴增片段大小為^lbp) TL-a 5'GAGCTCAAGCGGCAGGTTA3' TL-s 5' TGCGCGAGAAGAGAGGACT 3'
(3)PCR反應液，含反應終濃度各100-300μ M的4種dNTPs，反應終濃度各IO-IOOpmol/ μ 1的引物，1. 5-4. 5mM的Mg2+濃度；DNA聚合酶，滅菌雙蒸水；
(4)陽性對照為伊氏錐蟲DNA和路氏錐蟲DNA，比較PCR產物以及監(jiān)測PCR操作過程是否正確；
(5)陰性對照取滅菌蒸餾水為陰性對照樣本，目的在排除反應液中的核酸污染和操作過程中的假陽性問題。本發(fā)明的積極效果在于利用二重PCR特異性檢測方法，根據(jù)伊氏錐蟲和路氏錐蟲種特異基因序列設計引物，通過優(yōu)化PCR反應體系和條件來提高其敏感性，擴增產物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后觀察結果。本發(fā)明可同時對伊氏錐蟲和路氏錐蟲進行快速準確的檢測與鑒別，具有簡單方便、靈敏度高、特異性強等特點。


圖1為本發(fā)明二重PCR特異性驗證圖2為本發(fā)明二重PCR檢測伊氏錐蟲靈敏度圖； 圖3為本發(fā)明二重PCR檢測路氏錐蟲靈敏度圖。
具體實施例方式為了便于理解本發(fā)明，特例舉以下實施例。其作用被理解為是對本發(fā)明的闡釋而非對本發(fā)明的任何形式的限制。實施例1
1、二重PCR鑒別檢測試劑盒的引物設計根據(jù)選取的特異基因利用生物軟件設計二重PCR引物如下 伊氏錐蟲
TE-a 5'CGGGTCGTCTGCTAAAGT3' TE-s 5'GCCCGCAGTTGCCTAT3' 路氏錐蟲
TL-a 5'GAGCTCAAGCGGCAGGTTA3' TL-s 5' TGCGCGAGAAGAGAGGACT 3'以上兩對引物在同一體系中(二重PCR反應體系)能同時擴增檢測出伊氏錐蟲和路氏錐蟲特異基因片斷，能夠實現(xiàn)同時檢測和鑒別伊氏錐蟲與路氏錐蟲的目的。、樣本裂解液與DNA提取試劑的配制
按照下列濃度配比 NaCl IOOmM, Tris-HCl(pH 7. 5) 20Mm、EDTA 25 Mm、SDS 2% (w/v) 和蛋白酶K O.lyg/μ 進行混合，制備樣本裂解液；DNA提取試劑體積比為25:24: 1的酚氯仿異戊醇。、PCR反應液的配制
含反應終濃度各100-300μΜ的4種dNTPs，反應終濃度各IO-IOOpmol/μ 1的引物， 1. 5-4. 5mM的Mg2+濃度；DNA聚合酶，滅菌雙蒸水；
4、對照
陽性對照為伊氏錐蟲DNA和路氏錐蟲DNA ；陰性對照為滅菌雙蒸水；
5、反應體系優(yōu)化
二對引物各自濃度的優(yōu)化設置引物在體系的終濃度梯度為0.5μΜ、1μΜ、1.5μΜ、 2 μ Μ、2. 5 μ Μ、3 μ Μ，用此區(qū)間的引物嘗試都得到相應的擴增，其中當引物量為IOpmol (引物的貯存濃度為20ρπιΟ1/μ L，取0. 5μ L)終濃度為0. 5 pmol/yL時效果最佳。二對引物各自退火溫度的優(yōu)化設置引物的退火溫度分別為47°C、50°C、53°C、 55 °C、57 °C、59 °C、61V、63 °C，在梯度PCR儀上進行擴增，結果在55 °C時兩引物都有最優(yōu)化的擴增。此外，本發(fā)明的試劑盒還可以含有瓊脂糖(Agarose)、溴酚藍點樣緩沖液和Taq 酶，其濃度優(yōu)選為溴化乙錠IOyg/μ L ；溴酚藍點樣緩沖液和Taq酶5U/yL。還可以含有 PCR反應管。實驗例1、二重PCR鑒別檢測方法特異性實驗
取1 ng日本血吸蟲、杜氏利氏曼原蟲與瑟氏泰勒蟲作為陰性模板按照該PCR反應體系和擴增條件擴增，驗證其特異性。結果顯示對照樣本均無擴增，符合屬特異檢測標準，圖1。實驗例2
二重PCR鑒別檢測方法敏感性實驗
取血樣經(jīng)計數(shù)后，將每mL血液含錐蟲蟲體數(shù)1 X IO5個、1 X IO4個、1 X IO3個、1 X IO2個、 10個、1個、0. 5個濃度以PBS緩沖液稀釋，按照模板處理方法進行提取基因組，并進行PCR 擴增檢測，驗證其靈敏度。結果顯示路氏錐蟲與伊氏錐蟲二重PCR檢測方法最低檢測限可以達到1個蟲體/反應，屬高靈敏度檢測方法，符合敏感性檢測標準，見圖2-3。實驗例3
試劑盒的穩(wěn)定性和重復性實驗
陽性模板，PCR反應液可在-20°C條件下長期貯存，溶解后4°C條件4°C保存即可，應避免反復凍融。當貯存時間為30天、60天、100天、150天、200天時取出各組分，按照檢測體系檢測試劑盒穩(wěn)定性。取15份陽性樣本用此試劑盒重復試驗3次，15份PCR陰性樣本同樣重復3次。結果表明在以上各時段取出的組分在穩(wěn)定性和重復性試驗中無假陽性與假陰性結果出現(xiàn)，故此試劑盒穩(wěn)定性和重復性良好。實驗例4試劑盒的保質期試驗
將分別在4°C和-20°C貯存1個月、3個月、5個月、7個月和10個月的試劑盒取出，按照檢測體系對已知樣本進行檢測。結果表明在4°C和-20°C條件下保存達10月之久的試劑盒仍能對樣本作出準確的檢測。檢測例1
分別采集16份伊氏錐蟲感染小鼠血樣和19份路氏錐蟲感染大鼠血樣，用經(jīng)典的瑞氏染色方法作對比結合二重PCR方法對樣品進行檢測。(一)瑞氏染色法
將每個樣本以PBS稀釋3-5倍后滴片，滴加瑞氏染液使染液鋪滿血涂面，染色Imin ；以蒸餾水輕柔沖洗表面5min，晾干后置于顯微鏡下觀察鏡檢。(二)二重 PCR 檢測 1、樣本的預處理
取樣本0. 5mL，水平離心機3000g離心沉淀。2、樣本DNA的提取
(1)將上述沉淀轉移到1. 5mL離心管中，加入ImL裂解液，在液氮和65°C水浴中反復凍
融三次。(2)將凍融后的樣品加入5-6 μ 1 (20mg/mL)蛋白酶K，使其終濃度為100 μ g/mL。 混勻后在65°C水浴中浸泡lh。(3)用酚氯仿:異戊醇(24:25:1)進行抽提兩次，12000g離心十分鐘。(4)將上面的水相小心的吸取到滅菌的EP管中，注意不要吸取中層變性的蛋白層。(5)在水相中加入3M醋酸鈉(PH5. 2)60-70 μ 1，再加入2倍體積的冷乙醇在_20°C 冰箱中沉淀lh。(6)將沉淀完全的樣品在4°C冷凍離心機中12000g離心30min，棄上清后再用75%
酒精洗滌一遍。(7)棄酒精后在晾干，用TE緩沖液或是滅菌4蒸水溶解保存，待檢。3、PCR 擴增
(1)按待檢樣品數(shù)+2的PCR反應管取PCR反應液、Taq酶等，混于一管中，建立20 μ 1 體系，在渦旋器上混勻備用。(2)取陰性和陽性對照各1 μ L分別加入標記好的管中，然后取樣品各1 μ L依次加入并標記好，置于PCR儀中。(3 ) PCR擴增條件為95 °C預變性5min，95 °C變性30s，55 °C退火40s，72 °C延伸 30s，擴增30個循環(huán)，72°C最終延伸lOmin。4、PCR產物觀察
稱取瓊脂糖，配制0. 8%的瓊脂糖凝膠，按0. 5 μ g/mL加入Ε. B.，用電泳液混勻后 (0. 8%-1. 0%)在微波爐中加熱2分鐘。等膠冷卻后在加樣孔中分別加樣，IOOV電壓下電泳 10分鐘，之后在紫外燈下觀察實驗結果，如果出現(xiàn)482bp擴增條帶證明是伊氏錐蟲感染；如果出現(xiàn)^lbp擴增條帶證明是路氏錐蟲感染。(三)、瑞氏染色法和二重PCR檢測結果經(jīng)瑞氏染色法和二重PCR檢測比較，發(fā)現(xiàn)16份伊氏錐蟲血樣中瑞氏染色法檢出14例伊氏錐蟲，二重PCR法檢出16例伊氏錐蟲；19份路氏錐蟲血樣中瑞氏染色法檢出18例路氏錐蟲，二重PCR法檢出19例路氏錐蟲。同時瑞氏染色法未能對伊氏錐蟲和路氏錐蟲作出準確的鑒別，而二重PCR檢測法可對二者進行區(qū)分。
權利要求
1.一種伊氏錐蟲與路氏錐蟲二重PCR檢測試劑盒，包括以下部分(1)樣本裂解液與DNA提取試劑樣本裂解液NaCl、Tris-HCl, EDTA、SDS和蛋白酶K的混合溶液；其中，濃度配比為 NaCl IOOmM, Tris-HCKpH 7. 5) 20Mm、EDTA 25 Mm、SDS 2% (w/v)和蛋白酶 K 0. 1 μ g/ μ 1 ； DNA提取試劑為酚氯仿異戊醇(24:25:1)；(2)PCR反應液含反應終濃度各100-300μ M的4種dNTPs，反應終濃度各IO-IOOpmol/ μ 1的引物，1. 5-4. 5mM的Mg2+濃度；DNA聚合酶，滅菌蒸餾水；(3)二重PCR引物 伊氏錐蟲引物TE-a與TE-s， 路氏錐蟲引物TL-a與TL-s ；(4)陽性對照陽性對照為伊氏錐蟲DNA和路氏錐蟲DNA；(5)陰性對照取滅菌蒸餾水為陰性對照樣本。
2.根據(jù)權利要求1所述的試劑盒，其特征在于還可以含有瓊脂糖(99. 0%)、溴酚藍點樣緩沖液(5U/y L)和Taq酶(5U/y L)，溴化乙錠 (lOyg/yL)；還可以含有PCR反應管。
3.權利要求1所述試劑盒的制備方法，包括以下步驟(1)樣本裂解液與DNA提取試劑樣本裂解液將NaCl、Tris-HCl、EDTA、SDS和蛋白酶K制成混合溶液；其中，濃度配比為NaCl IOOmM, Tris-HCl(pH 7. 5) 20Mm、EDTA 25 Mm、SDS 2% (w/v)和蛋白酶 K 0. 1 μ g/ μ ；DNA提取試劑為酚氯仿異戊醇(25:Μ: 1)(2)二重PCR引物在GeneBank上比對選取伊氏錐蟲和路氏錐蟲特異診斷基因，分別Roht 1.2 VSG基因和18S rRNA基因；伊氏錐蟲(擴增片段大小為482bp) TE-a 5'CGGGTCGTCTGCTAAAGT3' TE-s 5'GCCCGCAGTTGCCTAT3' 路氏錐蟲(擴增片段大小為^lbp) TL-a 5'GAGCTCAAGCGGCAGGTTA3' TL-s 5' TGCGCGAGAAGAGAGGACT 3'(3)PCR反應液，含反應終濃度各100-300μ M的4種dNTPs，反應終濃度各IO-IOOpmol/ μ 1的引物，1. 5-4. 5mM的Mg2+濃度；DNA聚合酶，滅菌雙蒸水；(4)陽性對照為伊氏錐蟲DNA和路氏錐蟲DNA，比較PCR產物以及監(jiān)測PCR操作過程是否正確；(5)陰性對照取滅菌蒸餾水為陰性對照樣本；(6)組裝試劑盒。
全文摘要
本發(fā)明公開一種伊氏錐蟲與路氏錐蟲二重PCR鑒別檢測試劑盒，用于伊氏錐蟲與路氏錐蟲快速PCR檢測，本發(fā)明還提供了該試劑盒的制備方法，利用二重PCR特異性檢測方法，根據(jù)伊氏錐蟲和路氏錐蟲種特異基因序列設計引物，通過優(yōu)化PCR反應體系和條件來提高其敏感性，擴增產物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后觀察結果。本發(fā)明可同時對伊氏錐蟲和路氏錐蟲進行快速準確的檢測與鑒別，具有簡單方便、靈敏度高、特異性強等特點。
文檔編號C12Q1/68GK102191324SQ20111009387
公開日2011年9月21日 申請日期2011年4月14日 優(yōu)先權日2011年4月14日
發(fā)明者任文陟, 宮鵬濤, 張國才, 張楠, 張西臣, 李建華, 李淑紅, 李 赫, 楊舉, 王明山, 王景林, 蘇利波 申請人:吉林大學