專利名稱：草甘膦耐受性甜菜的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及草甘膦耐受性甜菜植株，植物材料和種子。
背景技術(shù)：
甜菜(Beta vulgaris)在許多國家中被作為商業(yè)農(nóng)作物而栽種，其總產(chǎn)量超過 240百萬公噸。N-(膦酰基甲基)甘氨酸(通常被稱為草甘膦(Glyphosat))是一種廣譜除草劑， 由于其高效，具有生物可降解性和對動物與人類的低毒性故被廣泛使用。草甘膦抑制莽草酸途徑，該途徑導(dǎo)致包括氨基酸類和維生素類的芳香化合物的合成。具體而言，草甘膦通過抑制酶5-烯醇丙酮酰-3-磷酸基莽草酸合酶(EPSP合酶或EPSPQ，抑制磷酸烯醇丙酮酸和 3-磷酸基莽草酸反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)?-烯醇丙酮酰-3-磷酸基莽草酸。當(dāng)用草甘膦處理常規(guī)植物的時候，植物不能產(chǎn)生生長和生存所需的芳香族氨基酸(例如苯丙氨酸和酪氨酸)。EPSPS 存在于所有植物，細(xì)菌，和真菌中。它不存在于不能自身合成芳香族氨基酸的動物中。因為芳香族氨基酸的生物合成途徑不存在于哺乳動物、禽類或水生生命形式中，故即使草甘膦對這些有機體存在任何毒性，其毒性也是很少量的。EPSPS酶天然地存在于植物和微生物來源的食物中。草甘膦是除草劑(諸如美國Monsanto公司生產(chǎn)的 Roundup )中
的有效成分。典型地，其以水溶性鹽諸如銨鹽、烷基胺鹽、堿金屬鹽或三甲基锍 (trimethylsulfonium)鹽進行配制。最通常的制劑之一是草甘膦的異丙胺鹽，其是
Roundup 除草劑中使用的形式。已經(jīng)證明通過在植物的基因組中插入產(chǎn)生草甘膦耐受性EPSP合酶(例如來自農(nóng)桿菌屬樣品(Agrobacterium sp.)菌株CP4AcO的CP4-EPSPS)的能力可以生產(chǎn)草甘膦耐受性植物。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，將編碼草甘膦耐受性EPSPS (例如CP4-EPSPQ的基因?qū)胫参锏幕蚪M中可以生產(chǎn)草甘膦耐受性甜菜植株。WO 99/23232中已經(jīng)公開了所述甜菜植株，其表達(dá)CP4-EPSPS。然而，由采用CP4-EPSPS基因以該方式轉(zhuǎn)化的細(xì)胞所生長的甜菜植株，在其性狀上存在很大差異，這是由于如下事實，即基因被插入在植物基因組中的隨機位置上。特定轉(zhuǎn)基因插入至染色體上特定位置通常被稱為“事件(event)”。術(shù)語“事件” 也用來區(qū)分遺傳工程化農(nóng)作物品種。合乎需要的事件是非常稀少的。由于轉(zhuǎn)基因被插入到具有生長重要性的植物基因中，導(dǎo)致基因斷裂和不表達(dá)，或轉(zhuǎn)基因插入到不能使轉(zhuǎn)基因表達(dá)或使其表達(dá)非常低的染色體部分中，因此絕大多數(shù)的事件是會被廢棄的。因為這個原因， 為了識別特征在于導(dǎo)入基因充分表達(dá)的事件，就需要篩選大量的事件。這個過程非常費時而且成本高昂，而且其絕非可以保證能夠發(fā)現(xiàn)具有滿意性質(zhì)的植株。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的目的是提供甜菜植株，其表現(xiàn)出對抗草甘膦的高水平耐受性，但不具有在其他重要農(nóng)學(xué)性質(zhì)諸如生長、產(chǎn)量、品質(zhì)、病原抗性等方面上的缺點。根據(jù)本發(fā)明的草甘膦耐受性甜菜植株的特征在于a)甜菜植株獲自保藏于NCIMB，Aberdeen(蘇格蘭，英國)，保藏號為NCIMB 41158 或NCIMB 41159的種子，和/或b)采用含有SEQ ID NO :1核苷酸序列的第一引物和含有SEQ IDNO 2核苷酸序列的第二引物，使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，可從所述甜菜植株、其部分或其種子的基因組DNA中擴增630-700bp，優(yōu)選664bp的DNA片段，和/或c)采用含有SEQ ID NO 3核苷酸序列的第一引物和含有SEQ IDNO 4核苷酸序列的第二引物，使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，可從所述甜菜植株、其部分或其種子的基因組DNA中擴增3500-3900bp，優(yōu)選3706bp的DNA片段，和/或d)采用含有SEQ ID NO 7核苷酸序列的第一引物和含有SEQ IDNO 8核苷酸序列的第二引物，使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，可從所述甜菜植株、其部分或其種子的基因組DNA中擴增270-300bp，優(yōu)選288bp的DNA片段，和/或e)采用含有SEQ ID NO 9核苷酸序列的第一引物和含有SEQ IDNO 10核苷酸序列的第二引物，使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，可從所述甜菜植株、其部分或其種子的基因組DNA中擴增710-790bp，優(yōu)選751bp的DNA片段，和/或f)采用含有SEQ ID NO 14核苷酸序列的第一引物和含有SEQ IDNO 16核苷酸序列的第二引物，使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，可從所述甜菜植株的基因組DNA中擴增990-1100bp， 優(yōu)選1042bp的DNA片段。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是用于擴增核酸分子的眾所周知的標(biāo)準(zhǔn)方法(參見，例如 US 4，683，202)。根據(jù)本發(fā)明的甜菜植株(以下稱為“事件H7-1”)表現(xiàn)出對草甘膦除草劑高度耐受。此外，事件H7-1的生長性狀和其他重要農(nóng)學(xué)性質(zhì)未受轉(zhuǎn)化過程影響。事件H7-1表達(dá)高水平的農(nóng)桿菌-CP4-EPSPS-基因，該基因被穩(wěn)定地?fù)饺胫参锘蚪M中，且其為植物提供草甘膦耐受性。植物通過采用二元載體PV-BVGT08的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化技術(shù)進行制備。該載體在左和右邊界區(qū)(“Border”區(qū))之間包含下列序列編碼區(qū)，其由來自擬南芥EPSPS 的葉綠體轉(zhuǎn)運肽編碼序列(稱為ctp》組成，該編碼序列與CP4-EPSPS編碼序列結(jié)合，且處于玄參花葉病毒啟動子(PFMV)和來自豌豆的E9-3’轉(zhuǎn)錄終止序列的調(diào)控下。在本發(fā)明優(yōu)選實施方案中，37(^bp、664bpJ8m3p、751bp和1042bp DNA片段分別顯示出與 SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :13、SEQ IDNO 11、SEQ ID NO 12 或 SEQ ID NO 17 的核苷酸序列至少95%，優(yōu)選至少99%，更優(yōu)選至少99. 9%的同一性。例如，95%同一性意指特定序列95%的核苷酸與對比序列相同。為此目的，序列可采用BLAST程序(例如可獲自 http://www. ncbi. nlm. nih. gov/blast/bl2seq/bl2. html)進行排列和對比。最優(yōu)選地， 3706bp DNA片段含有SEQ ID NO :6的核苷酸序列，664bp DNA片段含有SEQ ID N0:13的核苷酸序列，288bp DNA片段含有SEQ ID NO :11的核苷酸序列，751bp DNA片段含有SEQ IDNO 12的核苷酸序列，和/或1042bp DNA片段含有SEQ IDNO 17的核苷酸序列。本發(fā)明還涉及保藏于NCIMB，Aberdeen (蘇格蘭，英國)，保藏號為NCIMB 41158或 NCIMB 41159的種子。所述種子可被用于獲得草甘膦耐受性的甜菜植株。種子可被鋸開且成長的植物將具有草甘膦耐受性。本發(fā)明還涉及草甘膦耐受性的甜菜植株的細(xì)胞、組織或部分。本發(fā)明另一方面是草甘膦耐受性甜菜植株的鑒定方法，其特征在于，該方法包含以下步驟a)采用含有SEQ ID NO :1核苷酸序列的第一引物和含有SEQ IDNO 2核苷酸序列的第二引物，使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，從所述甜菜植株、其部分或其種子的基因組DNA中擴增 630-700bp，優(yōu)選664bp的DNA片段，和/或b)采用含有SEQ ID NO 3核苷酸序列的第一引物和含有SEQ IDNO 4核苷酸序列的第二引物，使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，從所述甜菜植株、其部分或其種子的基因組DNA中擴增 ;3500-3900bp，優(yōu)選 3706bp 的 DNA 片段，和 / 或c)采用含有SEQ ID NO 7核苷酸序列的第一引物和含有SEQ IDNO 8核苷酸序列的第二引物，使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，從所述甜菜植株、其部分或其種子的基因組DNA中擴增 270-300bp，優(yōu)選288bp的DNA片段，和/或d)采用含有SEQ ID NO 9核苷酸序列的第一引物和含有SEQ IDNO 10核苷酸序列的第二引物，使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，從所述甜菜植株、其部分或其種子的基因組DNA中擴增710-790bp，優(yōu)選751bp的DNA片段，和/或e)采用含有SEQ ID NO 14核苷酸序列的第一引物和含有SEQ IDNO 16核苷酸序列的第二引物，使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，從所述甜菜植株的基因組DNA中擴增990-1100bp，優(yōu)選1042bp的DNA片段。該方法提供了采用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)方法對轉(zhuǎn)基因草甘膦耐受性甜菜植株的檢測。本發(fā)明還涉及用于鑒定轉(zhuǎn)基因草甘膦耐受性甜菜植株或其細(xì)胞、組織或部分的試劑盒。試劑盒包括至少一個引物對，該引物對含有用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的第一引物和第二引物，其可以特異地識別事件H7-1，其細(xì)胞、組織或部分。優(yōu)選地，第一引物含有SEQ ID NO :1 或 SEQ ID NO :7 或 SEQ IDNO :9 或 SEQ ID NO: 14的核苷酸序列，第二引物優(yōu)選含有SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :8或SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO 16的核苷酸序列。根據(jù)本發(fā)明進一步的實施方案，第一引物和第二引物各識別形成SEQ ID NO 5核苷酸序列的部分的核苷酸序列。
本發(fā)明的Sugar beet 3S0057 5043 MKl，已經(jīng)于2003年2月17日保藏于國立工業(yè)和海洋微生物保藏有限公司(英國)，德國艾恩貝克，并且保藏編號為NCIMB 41158。本發(fā)明的Sugar beet 3S00575046 MK1，已經(jīng)于2003年2月17日保藏于國立工業(yè)和海洋微生物保藏有限公司(英國)，德國艾恩貝克，并且保藏編號為NCIMB 41159。


下列附圖用于說明本發(fā)明。其顯示了 圖1 二元載體和PV-BVGT08的圖譜
圖2通過PCR分析鑒定H7-1。分析來自18個植物的DNA樣品。陰性對照=來自非轉(zhuǎn)化甜菜的DNA ；陽性對照=來自H7-1原始轉(zhuǎn)化體的DNA。圖3通過多重PCR和在轉(zhuǎn)基因事件H7-1和非轉(zhuǎn)基因植株之間的區(qū)別來鑒定事件 H7-1。分析來自M個植物的DNA探針。圖4pFMV-ctp2-CP4-EPSPS-E9-3’ -插入片段，其具有限制性內(nèi)切酶HindIII、 XbaI、ClaI、PstI 和 BamHI 的剪切位點。圖5事件H7-1的插入片段/拷貝數(shù)分析。采用PstI、Hindlll、Xbal、ClaI和 BamHI (泳道3_7)酶切10 μ g H7-1基因組DNA，用于Southern印跡分析。用BamHI酶切作為陰性對照的未轉(zhuǎn)化基因組DNA(泳道8)。用BamHI酶切作為陽性對照的質(zhì)粒PV-BVGT08。 泳道2和9表示分子量標(biāo)準(zhǔn)。印跡采用32P-標(biāo)記的CP4-EPSPS編碼區(qū)作為探針。該探針是涵蓋堿基對447-1055的CP4-EPSPS基因的內(nèi)部序列。圖6事件H7-1的Southern印跡分析，用來評估ctp2-CP4_EPSPS編碼區(qū)的完整性。 用XbaI和HindIII/BamHI酶切10 μ g與PV-BVGT08混合的H7-1基因組DNA，非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?DNA和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ誅NA。印跡采用標(biāo)記的CP4-EPSPS-PCR片段作為探針。圖7事件H7-1的Southern印跡分析，用來評估啟動子區(qū)完整性。用Hindlll， XbaI和Mcl/Xhol酶切10 μ g與PV-BVGT08混和的H7-1基因組DNA，非轉(zhuǎn)基因?qū)φ誅NA和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ誅NA0印跡采用32P-標(biāo)記的啟動子片段(Hindlll) ( = PV-BVGT08序列，Bp 7972-8583)或完整的啟動子-ctp2-CP4-EPSPS-E9_3，-盒(PmeI/XhoI) ( = PV-BVGT08 序列，Bp 7935-2389)作為探針。圖8事件H7-1的Southern印跡分析，用來評估多腺苷酸化(Poly-Α-)區(qū)域完整性。用 EcoRI/PstI, Xbal, HindIII 和 PstI 酶切 10 μ g 與 PV-BVGT08 混和的 H7-1 基因組 DNA,非轉(zhuǎn)基因?qū)φ誅NA和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ誅NA。印跡采用標(biāo)記的Poly-A-片段(BamHI/ XhoI) ( = PV-BVGT08 序列，Bp 1702-2389)作為探針。圖9作為評估事件H7-1中“主鏈”載體DNA缺失的探針使用的片段。圖10事件H7-1的Southern印跡分析，用來評估事件H7_l中“主鏈"DNA的缺失。 用)(bal酶切10 μ g與PV-BVGT08混和的H7-1基因組DNA，非轉(zhuǎn)基因?qū)φ誅NA和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ誅NA。印跡采用包含PV-BVGT08(探針1-4)的整個“主鏈”的標(biāo)記片段作為探針。圖IlPCR片段與左邊界區(qū)(left border, LB)上PV-BVGT08序列之間的對比。圖12PCR片段與右邊界區(qū)(right border, RB)上PV-BVGT08序列之間的對比。圖13插入片段右接頭外的基因組DNA的分析。將大約50ng的H7-1基因組DNA、非轉(zhuǎn)基因?qū)φ誅NA或水用于PCR反應(yīng)，PCR采用Pl (其中兩個引物位于插入片段外)和P3 (其中一個引物位于插入片段內(nèi)，而另一引物位于插入片段外)的引物組合。圖14插入片段左接頭外的基因組DNA的分析。將大約50ng的H7-1基因組DNA、非轉(zhuǎn)基因?qū)φ誅NA和水用于PCR反應(yīng)，PCR采用P2 (其中兩個引物位于插入片段外)和P4 (其中一個引物位于插入片段內(nèi)，而另一引物位于插入片段外)的引物組合。圖15H7-1種子批的子代圖譜。圖16事件H7-1的Southern印跡分析，用來評估插入的DNA是否被穩(wěn)定地整合至基因組內(nèi)。用BamHI，)(bal和HindIII酶切10 μ gH7_l基因組DNA(最初的轉(zhuǎn)化體 H7-1-1995和三個子代，H7-1-1996至1998)和來自不同來源的非轉(zhuǎn)基因?qū)φ誅NA。印跡用PV-BVGT08 ( = Bp 447-1555)的標(biāo)記 CP4-EPSPS 探針進行檢測。
具體實施例方式參照以下實施例(僅以例舉說明的方式)進一步解釋本發(fā)明。以下是所使用的縮寫的列表大約 V攝氏度bidest雙蒸無菌水bp堿基對CTAB溴化十六烷基三甲基銨DNA脫氧核糖核酸E. coli大腸桿菌EDTA乙二胺四乙酸Fig.圖h小時HCl鹽酸kb千堿基對kg公斤M，mM，摩爾，毫摩爾min分鐘Na2HP04/NaH2P04 磷酸鈉NaCl氯化鈉NaOH氫氧化鈉nt核苷酸PCR聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)Pmol皮摩爾RNase核糖核酸核酸酶rpm每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)RRRoundup Ready RT室溫SDS十二烷基硫酸鈉sec秒SEVAG氯仿異戊醇 Q4 1)SSC標(biāo)準(zhǔn)枸椽酸鹽鹽水TE三-EDTA 緩沖液TRIS三(羥甲基)氨基甲烷實施例1 事件H7-1的鑒定甜菜(Beta vulgaris)基因型3S0057已在遺傳上進行修飾以便表達(dá)CP4-5-烯醇-丙酮酰-莽草酸-3-磷酸鹽合酶或CP4-EPSPS，其提供了對除草劑草甘膦的耐受性， 且也可被用作可選擇的標(biāo)記。該轉(zhuǎn)基因品系通過采用二元載體PV-BVGT08的根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化技術(shù)來制備。用于甜菜轉(zhuǎn)化的載體的T-DNA在左和右邊界區(qū)之間包含以下序列編碼區(qū)，其由來自擬南芥EPSPS的葉綠體轉(zhuǎn)運肽編碼序列(稱為ctp》組成，該編碼序列與CP4-EPSPS編碼序列結(jié)合，且處于35S玄參花葉病毒啟動子(pFMV)和來自豌豆的 rbcS-E9-基因的3’轉(zhuǎn)錄終止序列的調(diào)控下。采用以下方法I. DNA 提取方法1 收集新鮮葉子或其它組織(20_100mg在1. 5ml反應(yīng)管中)，加入400 μ 1提取緩沖液(如下)。用小研杵研碎組織。將混合物渦旋5秒，然后在室溫下孵育30分鐘至60分鐘。 隨后以13，OOOrpm實施離心步驟1分鐘。將包含DNA的上清液注入新1. 5ml反應(yīng)管內(nèi)，與 120 μ 1異丙醇混合?；旌衔镌谑覝叵路跤?分鐘。加入乙醇后形成DNA沉淀。13，OOOrpm 離心5分鐘后，緩慢傾出乙醇。使樣品風(fēng)干。將片狀沉淀物再溶于400 μ 1 H2O或TE緩沖液(如下)中。提取緩沖液(IOOml)
20 ml 5 ml Sml 2.5 ml 67.5 mlTE緩沖液IOmM Tris-HCl (pH 8.0)ImM EDTA。方法2 在1. 5ml Eppendorf管內(nèi)收集新鮮植物材料QO-lOOmg)，加入500 μ 1 CTAB緩沖液(65°C )(如下)?；旌衔镌?5°C孵育1-1. 5小時，隨后離心5秒。加入5 μ 1 RNase A(10mg/ml)?；旌衔镌?7°C孵育30分鐘，隨后離心5秒。加入200 μ 1 SEVAG?；旌喜⒃?13，OOOrpm離心10分鐘后，將上清液轉(zhuǎn)移到新的1. 5ml反應(yīng)管中。1體積異丙醇(約400 μ 1) 與上清液小心混合。之后13，OOOrpm離心10分鐘。加入600 μ 1 70%醇。通過反轉(zhuǎn)管數(shù)次來洗滌片狀沉淀物?；旌衔镌僖淮卧?3，OOOrpm離心2分鐘。小心地傾出乙醇。將管在干凈的紙上倒置并引流。樣品風(fēng)干15分鐘。片狀沉淀物再溶于50 μ IH2O中(如下)。CTAB 緩沖液
1 M Tris ( pH 7.5 ) 5 M NaCl 0.5 M EDTA 20% SDS H2O
12
SEVAG 氯仿異戊醇04RNase-緩沖液
1.4 M
20 mM 100 mM
2% ( w/v)1)
NaCl EDTA Tris-HCl CTAB


IOmM Tris,15mM NaCl，ρΗ7·5 RNase A
IOmg RNase/ml RNase-緩沖液
(5ml bidest+50mg RNase A，等份于1. 5ml反應(yīng)管中，100°C煮沸反應(yīng)管30分鐘， 在-20°C貯存)通常使用方法1。用這種方法可每天提取大量DNA樣品而且DNA的品質(zhì)是可接受的。當(dāng)葉子材料較老或如果存在DNA品質(zhì)問題的時候使用方法2。方法2較為復(fù)雜，需要更多時間，且所得DNA產(chǎn)量較低，但其具有較高的品質(zhì)。通常，不進行DNA定量，通常在PCR反應(yīng)中使用0. 5_1 μ 1提取的DNA溶液。II. PCR 反應(yīng):對于PCR反應(yīng)，制備緩沖液+dNTP的IOx緩沖液混合物。步驟如下
母液體積IOxPCR反應(yīng)最終濃度
緩沖液濃度
1 MTris-HCl,pH 8,3 100μ 0,1 M10 miΛ Trie-i1 MKCl500μ 0,5 M50 ml4 KCl100mM dATP20μι2 mM0,2 rηΜ dATP100mM dCTP20μι2 mM0,2 rηΜ dCTP100mM dTTP20μι2 mM0,2 ιηΜ dTTP100mM dGTP20μ 2 mM0,2 ΓIiM dGTP100mM MgCl2150Ml15 mM1,5 rCiM MgClaHPLC-水170μι共計1000 μ
PCR 反應(yīng)(25 μ 1)DNA0.5 μ
引物 11 μ ( 20 pmol)
引物 21 μ ( 20 pmol)
Taq 聚合酶 10.2 μ (1 U,獲自 Oncor Appligene
S.A.，Heidelberg,德國)
緩沖液10 χ濃度2.5 μ
水18.8 μ III.通過 PCR 鑒定 H7-1通過采用事件特異引物的PCR實行H7-1的鑒定上游引物(SEQID NO :1)H7-207U30 5' TTA ATT TTT GCA GGC GAT GGTGGC TGT TAT 3'下游引物(SEQID NO 2)H7-841L30 5' CAT ACG CAT TAG TGA GTG GGC TGT CAG GAC 3'上游引物位于插入片段之外，是甜菜基因組DNA的一部分。下游引物位于插入的 CP4-EPSPS 基因內(nèi)。PCR 條件
94°C4 min步驟195°C30 sec步驟2a55°C30 sec步驟2b72°C2 min步驟2c72°C5 min步驟34°C過夜步驟4反應(yīng)結(jié)束重復(fù)步驟加-c ；34次。預(yù)期的PCR產(chǎn)物是664bp的DNA片段(SEQ ID N0:13，見圖2)。IV.通過多重PCR鑒定H7-1對于非轉(zhuǎn)基因植株和轉(zhuǎn)基因植株(無論是純合的或是雜合的)的辨別，使用三種不同的引物實施多重PCR。使用下列引物H72(SEQ ID NO 14) 5' GCTCTGACACAACCGGTAAATGCATTGGCC 3‘H7S2(SEQ ID NO 15) 5' GACCCATAGTTTGATTTTAAGCACGACATG 3‘H7R2(SEQ ID NO 16) 5' GCAGATTCTGCTAACTTGCGCCATCGGAG 3‘PCR 條件940C 2 min步驟ι94°C 1 sec步驟 2a60°C 45 sec步驟2b72°C 90 sec步驟2c72°C 5 min步驟34°C 過夜步驟4反應(yīng)結(jié)束步驟加-c重復(fù)；34次。非轉(zhuǎn)基因植株僅顯現(xiàn)一段約350bp的PCR片段。純合的轉(zhuǎn)基因植株顯現(xiàn)一段約 1. 042kb的片段。雜合的植物顯現(xiàn)兩個片段(見圖3)。實施例2 事件H7-1的特征化實施分子分析來對H7-1中存在的整合的DNA進行特征化。具體而言，測定插入片段數(shù)目(甜菜基因組內(nèi)整合位點的數(shù)目)，拷貝數(shù)(一個基因座內(nèi)DNA片段的數(shù)目)，插入的編碼區(qū)的完整性及其調(diào)控元件，PFMV啟動子和E9-3’轉(zhuǎn)錄終止序列，用于轉(zhuǎn)化的載體 “主鏈”序列的缺失和插入片段的穩(wěn)定遺傳性。此外，鑒定側(cè)接于DNA插入片段的序列。通過使用Southern印跡，PCR和反向PCR技術(shù)對甜菜轉(zhuǎn)化事件H7-1的插入的DNA 進行特征描述。其中包括陽性對照和陰性對照(PV-BVGT08，非轉(zhuǎn)基因植株DNA)，并且用與試樣(H7-1)同樣的方法處理。從1997年種植的事件H7-1植物批號74903H中分離DNA。還從1995年原始轉(zhuǎn)化體 H7-1/3S0057( = 6401VH)和 1996年，1997年和 1998年生產(chǎn)的三個其它子代(H7-1/64801H， H7-1/74922H 和 H7-1/83002S)中分離 DNA。非轉(zhuǎn)基因甜菜品系3S0057作為對照。此外，甜菜品系5R7150,8K1180和6S0085 用作陰性對照。該品系是用于培育傳統(tǒng)的甜菜的普通非轉(zhuǎn)基因品系。參照物與用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒PV-BVGT08相對應(yīng)。將質(zhì)粒DNA和來自對照甜菜品系的 DNA混合在一起，用限制性內(nèi)切酶酶切，并與試樣平行在瓊脂糖凝膠上進行電泳分離。質(zhì)?？勺鳛轭A(yù)期片段的分子量標(biāo)記并可作為陽性雜交對照。以代表低于1拷貝的分析元件的濃度，將質(zhì)粒DNA與基因組植物DNA混合，以便證實Southern印跡法的敏感性( 10 μ g基因組 DNA 和 28pg PV-BVGT08-DNA)。使用分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物 RA0UL (0NC0R/Appligene， 貨號#160673)估測分子大小。DNA 分離用研缽和研杵將來自事件H7-1的批號74903H的植物組織(l_3g濕重)在液氮中磨為細(xì)粉。粉末轉(zhuǎn)移到50ml Oakridge管，然后加入7. 5ml預(yù)熱(60°C )的CTAB緩沖液 (2% CTAB, IOOmM Tris-HCl, 20mM EDTA ρΗ 8. 0，1· 4M NaCl 和 0. 2%巰基乙醇)。采用間歇攪拌將樣品在65°C孵育大約30分鐘。在樣品中加入等體積(8ml)的RT氯仿異戊醇 (24 lv/v)混合物。將混懸液反轉(zhuǎn)混和，然后離心(10min,9000rpm)使兩相分離。水相轉(zhuǎn)移到新50ml Oakridge管，然后加入5 ml異丙醇使DNA沉淀。離心Qmin，9000rpm)得到片狀沉淀的DNA并棄去上清液。沉淀的DNA用76%乙醇和IOmM乙酸銨的洗滌溶液孵育大約20分鐘。在離心分離和傾析上清液后，真空干燥DNA并將其再溶于TE中，pH 8. 04°C過夜。作為可選方法，通過獲自Qiagen(DUsseldorf，德國，貨號#68163)的DNeasy Plant Maxi Kit分離DNA。根據(jù)廠商說明實施DNA分離。作為其它的可選方法，通過獲自Qiagen(DUSSeldorf，德國，貨號#69103)的 DNeasy Plant Mini Kits分離DNA。根據(jù)廠商說明實施DNA分離。DNA定量和限制件內(nèi)切酶酶切采用 LKB Biochrom UV/可視分光光度計(Amersham Pharmacia, Freiburg, 德國)實施DNA定量，或可選地，在瓊脂糖凝膠電泳后通過用RFLPscan程序 (MWG-Biotech, Ebersberg,德國)掃描 DNA，完成 DNA 定量。采用獲自 Gibco/Life ^Technologies (Karlsruhe，德國)(貨號 #10496-016)的High DNA Mass Ladder 作為校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)。限制性內(nèi)切酶購自 Boehringer Mannheim (Mannheim,德國)、Stratagene (Amsterdam, Niederlande)或New England Biolabs (Frankfurt，德國)并且根據(jù)廠商手冊進行使用。DNA探針制備從E. coli培養(yǎng)物中分離PV-BVGT08DNA。通過采用相應(yīng)限制性內(nèi)切酶酶切，然后用瓊脂糖凝膠電泳或聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)分離，制備與CP4-EPSPS編碼區(qū)，35S啟動子， E9-3’ -poly-A-區(qū)，35S-ctp2-CP4-EPSPS-E9-3’ -盒和“主鏈”區(qū)同源的探針模板。產(chǎn)物用 BIO 101 (La Jolla, CA)的 Gene Clean II 試齊[J盒純化。采用 Amersham—Pharmacia Biotech Europe (Freiburg,德國)的 Megaprime DNA 標(biāo)記系統(tǒng)實施用 ％P_dCTP 或 32P_dATP 對探針 (25pg)的標(biāo)記。Southern 印跡分析限制性內(nèi)切酶處理的DNA的樣品用瓊脂糖凝膠電泳在 35伏特分離 15小時。 凝膠成像后，在0. 25M HCl-溶液中浸泡凝膠15分鐘使DNA脫嘌呤，凝膠在0. 5M NaOH, 1. 5M NaCl的變性溶液中持續(xù)輕柔攪拌孵育30分鐘使DNA變性，最后通過在若干體積的2M NaCl 和IM Tris-HCl，pH 5. 5的溶液中浸泡2小時使DNA中和。采用獲自Stratagene的Pressure Blotter,根據(jù)廠商手冊，將獲自瓊脂糖凝膠的DNA轉(zhuǎn)移至Hybond-N 尼龍膜(Amersham Pharmacia Biotech Europe，F(xiàn)reiburg，德國)。在將濾器置于 2xSSPE (20xSSPE :3. 6MNaCl, 20mM EDTA，0. 2M NaH2P04/Na2HP04pH7. 4)中浸泡 I5 分鐘后，通過紫外線 CTransilluminator Pharmacia, Freiburg，德國)照射1分鐘以及在真空干燥箱中80°C烘烤1小時從而將 DNA固定于膜上。在50%甲酰胺，5xSSC，0. 月桂酰肌氨酸，0.02% SDS和2%封閉劑 (Boehringer Mannheim，德國，貨號#1096176)的水溶液中將印跡預(yù)雜交4小時。與放射標(biāo)記的探針的雜交在新鮮的預(yù)雜交溶液中于42°C經(jīng)過16-18小時而完成。在雜交后，膜在 2xSSC中于42 °C洗滌5分鐘，在hSSC，l% SDS中于65 °C洗滌20分鐘，然后在0. 2xSSC, 0.1% SDS中于68°C洗滌15分鐘，洗兩次。通過采用Biomax-MS 膠片連同Kodak Biomax MS 增感屏對印跡曝光從而獲得印跡的放射自顯影圖像。側(cè)翼5，和3，基因組序列的鑒定采用反向PCR技術(shù)鑒定轉(zhuǎn)基因-和植株基因組DNA之間的接頭。按照上面描述純化基因組DNA。大約Iy g的DNA在分離的反應(yīng)中被限制性核酸酶TaqI、AluI, NdeIII或 RsaI酶切。使用T4-連接酶將酶切的DNA片段再過夜連接，然后進行PCR反應(yīng)。使用獲自 NBI (National Biosciences, Inc. , Plymouth, Michigan)的引物分析軟件 OUGO 獲得多種反引物組合。該反向PCR擴增產(chǎn)生的片段用凝膠電泳分離，從凝膠上切取，然后采用Gene Clean II 試劑盒純化。使用來自 hvitrogen(Groningen，Niederlande)的TOPOtmTA cloning 試
劑盒將純化的片段克隆至載體pCR 2. 1。將插入片段提交給MWG-Biotech (m^ersberg， 德國)進行測序。用 Mac Molly Tetra DNA 分析軟件(SoftGene GmbH，Bochold，德國)
實施對所得序列數(shù)據(jù)的分析。PCR 分析采用DNAeasy Plant Mini 試劑盒(Qiagen，Diisseldorf，德國)，根據(jù)廠商說明，制備基因組DNA。將大約50ng的基因組DNA用于PCR。反應(yīng)設(shè)置為95°C 30秒，55°C 30秒， 和72°C 2分鐘進行35個循環(huán)。在PTC200循環(huán)儀(Biozym，Oldendorf，德國)中完成PCR。 通過瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物。1.插入片段數(shù)量對H7-1評估插入片段數(shù)量，轉(zhuǎn)基因DNA進入甜菜基因組的整合位點數(shù)量。為了測定插入片段數(shù)量，用限制性內(nèi)切酶HindIIIJbaI和BamHI酶切基因組DNA。作為陰性對照的來自未轉(zhuǎn)化的對照植物的DNA(表示相同遺傳背景)用Hind III酶切。采用轉(zhuǎn)化載體 DNA (PV-BVGT08)作為陽性對照。XbaI和BamHI在PV-BVGT08中僅剪切一次且不在使用的標(biāo)記CP4-EPSPS探針內(nèi)剪切(見圖4)。HindIII在PV-BVGT08中剪切三次，但所有三個位置均位于探針的外面且在同側(cè)上，5’ (相對于探針)。因此，各酶會釋放出單個DNA片段，該片段可與CP4-EPSPS探針雜交，并可包含插入的DNA和鄰近的基因組植物DNA的部分。檢測到的片段數(shù)量表明在事件中存在的插入片段的數(shù)量。結(jié)果如圖5所示。分別使用酶HindIII JbaI或BamHI酶切后，僅發(fā)現(xiàn)單個雜交片段。來自HindIII 消化(泳道4)的5. 2kb片段，來自^CbaI消化(泳道5)的41Λ片段和來自BamHI消化(泳道7)的大約111Λ片段顯示出轉(zhuǎn)化體H7-1表現(xiàn)單個整合事件(圖4)。泳道1中的強信號表示線性化PV-BVGT08質(zhì)粒。其它的微弱信號涉及少量未經(jīng)酶切的PV-BVGT08或涉及非特異性背景雜交信號。2.拷貝數(shù)理論上，一個整合位點可由大于一個拷貝的插入的DNA組成。但是由于前述限制性分析的片段大小，故上述情況是不可能的。如果H7-1中存在大于一個拷貝的插入的DNA， 則其它的片段則會被檢測到。這也可通過用限制性內(nèi)切酶I3StI酶切進行證實。I^stI在左和右邊界序列中剪切兩次。限制性酶切部位之一位于CP4-EPSPS編碼區(qū)內(nèi)，因此在酶切后， 可以預(yù)期兩個與CP4-EPSPS探針雜交的片段。預(yù)期片段之一與約1. 2kb的內(nèi)部片段相對應(yīng)。 第二個片段應(yīng)是邊界片段。而且，如果存在大于一個拷貝，其它的片段應(yīng)該是可檢測的。但是結(jié)果顯示I3StI按預(yù)期的那樣剪切DNA。檢測到1. 2kb的內(nèi)部片段和僅一個約4. 9kb的其它片段(圖5:泳道3，圖4)。用ClaI剪切DNA作為附加的內(nèi)部對照(圖5 泳道6，圖4)。與預(yù)期中一樣，2. 4kb 的單個片段雜交，這是因為ClaI在所用的CP4- EPSPS片段的左手側(cè)和右手側(cè)外部剪切兩次。這一結(jié)果也是整合的DNA片段完整性的證明并且與以下給出的結(jié)果一致。
質(zhì)粒PV-BVGT08 (PV-BVGT08 = 8590bp)與 CP4-EPSPS 片段的雜交產(chǎn)生 8. 6kb 信號 (圖5，泳道1)，如所預(yù)期的那樣。第二條較小的非常微弱的帶是由于PV-BVGT08的不完全限制性。概括而言，試驗顯示出轉(zhuǎn)化的甜菜品系H7-1含有在植物基因組中的PV-BVGT08的 T-DNA單拷貝整合。3.編碼區(qū)的完整件通過用酶HindIII 酶切 P-FMV，HindIII 加 BamHI 酶切 ctp2_CP4_EPSPS 和 EcoRI 加I^stI酶切E9-3’ -非翻譯區(qū)來測定具有各個元件的CP4-EPSPS基因盒的完整性(就各元件而言，為P-FMV啟動子，ctp2-CP4-EPSPS編碼區(qū)和E9-3’ -非翻譯區(qū)))。采用McI加 XhoI酶切P-FMV-ctp2-CP4-EPSPS區(qū)域和E9-3’ -區(qū)域來實施附加試驗。采用相同的酶酶切與非轉(zhuǎn)基因甜菜DNA混合的質(zhì)粒DNA和單獨的非轉(zhuǎn)基因甜菜DNA，分別作為陽性對照和陰性對照。這些酶在預(yù)期的DNA插入片段內(nèi)，在左和右T-DNA邊界之間，剪切(見質(zhì)粒圖譜， 圖1中)，所以，如果相應(yīng)元件是完整的，則H7-1DNA和PV-BVGT08DNA中的雜交片段大小應(yīng)相同。用XbaI酶切DNA作為另外的對照。XbaI在啟動子和ctp2-CP4_EPSPS編碼區(qū)之間剪切一次。因此，可以預(yù)期含有PV-BVGT08 DNA的8. 6kb片段，而在H7-1的情況下為與 PV-BVGT08片段相比在大小上不同的邊界片段。結(jié)果如圖6，7和8所示。圖6 用HindIII和BamHI的酶切釋放出CP4-EPSPS基因，用PCR產(chǎn)生的CP4-EPSPS 片段探測印跡。陰性對照(泳道6)未顯示任何雜交帶。來自事件H7-1的基因組DNA和與非轉(zhuǎn)基因DNA混和的質(zhì)粒PV-BVGT08兩者都產(chǎn)生大約1. 7kb片段，這與預(yù)期大小相符。用 XbaI的酶切產(chǎn)生預(yù)期的線性化PV-BVGT08的8. 6kb片段。對于事件H7-1，酶切產(chǎn)生大約 4. Okb的邊界片段(同樣參見圖4和5)。同樣，陰性對照未顯示任何信號。圖7 用HindIII的酶切釋放出玄參花葉病毒啟動子，用PCR產(chǎn)生的啟動子片段探測印跡。陰性對照(泳道5)未顯示任何雜交信號。來自事件H7-1的基因組DNA和與非轉(zhuǎn)基因DNA混和的質(zhì)粒PV- BVGT08兩者都產(chǎn)生大小約0. 6kb的雜交片段。該片段符合啟動子的預(yù)期大小(泳道4和6)。用)(bal的酶切產(chǎn)生預(yù)期的線性化PV-BVGT08的8. 6kb片段和來自事件H7_l的大約1. 3kb大小的左邊界片段(泳道1和3)。該1. 3kb片段也是對事件H7-1僅包含轉(zhuǎn)基因的單拷貝的附加證明。同樣，陰性對照(泳道2)未顯示任何信號。用SacIAhoI的酶切釋放出啟動子聯(lián)同CP4-EPSPS編碼區(qū)和poly-A_區(qū)。與完整的啟動子-ctp2-CP4-EPSPS-多腺苷酸化信號盒(PmelAhoI片段)雜交產(chǎn)生預(yù)期的2. 3kb 啟動子-ctp2-CP4-EPSPS和0. 7kb多腺苷酸化信號片段，此兩者均含有與非轉(zhuǎn)基因DNA混和的PV-BVGT08 DNA和H7-1的基因組DNA (泳道9和11)。圖8 用I^stI和EcoRI的酶切釋放出E9_3’多腺苷酸化信號，用多腺苷酸化信號片段探測印跡。陰性對照(泳道幻未顯示任何雜交帶。與非轉(zhuǎn)基因DNA混合的質(zhì)粒PV-BVGT08 和來自事件H7-1的基因組DNA兩者都產(chǎn)生大約0.61Λ大小的片段，這與預(yù)期大小相符。用 XbaI的酶切產(chǎn)生預(yù)期的線性化PV-BVGT08的8. 6kb片段和含有事件H7-1的大約4. Okb大小的邊界片段。
用I^stI的酶切釋放出E9-3’多腺苷酸化信號聯(lián)同0. 5kb的CP4-EPSPS編碼區(qū)的 3，部分。產(chǎn)生的1.21Λ片段可按預(yù)期的用基因組H7-1DNA和PV-BVGT08 DNA進行檢測。用HindIII的酶切得到線性化PV-BVGT08減去啟動子片段的8. Okb片段(泳道 13)和含有H7-1的5. 2kb邊界片段(泳道11)。來自HindIII酶切的單個5. 2kb片段和來自)(bal酶切的單個4. Okb片段也是對事件H7-1僅包含一個拷貝插入的DNA的附加證明。 同樣，陰性對照未顯示任何信號。概括而言，印跡結(jié)果證明了，轉(zhuǎn)化的DNA的所有元件是完整的，且事件H7-1包含單個完整的CTP2-CP4-EPSPS編碼區(qū)和其調(diào)控元件，pFMV啟動子和E9-3’轉(zhuǎn)錄終止序列。4.用于檢測“主鏈”片段的分析Ti-質(zhì)?！爸麈湣眳^(qū)的定義是與左和右邊界序列接界的T-DNA的外部區(qū)域，其由用于細(xì)菌復(fù)制和細(xì)菌選擇的起始基因和選擇基因組成，而且其在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化時，通常不被轉(zhuǎn)移至植物基因組。為了確定在事件H7-1中不存在“主鏈”載體DNA，用限制性內(nèi)切酶)(bal酶切來自H7-1的基因組DNA，來自未轉(zhuǎn)化對照的基因組DNA，和與PV-BVGT08 DNA 混和的來自H7-1的基因組DNA，然后用三個重疊的由PCR產(chǎn)生的探針進行檢測，所述探針包括完整主鏈序列。第四個探針具有在一個片段中的完整“主鏈”。所用探針表示“主鏈”序列(見圖9):1 :bp 2730-53702 :bp 5278-64193 :bp 6302-78514 :bp 2730-7851圖10顯示Southern印跡分析的結(jié)果。泳道6，10，14和18 用完整“主鏈”的“主鏈”片段探測酶切的H7-1的基因組DNA，其未顯示任何雜交帶。僅泳道4，8，12，16和20 與 PV-BVGT08 DNA混和的H7-1的基因組DNA顯示8. 6kb的帶，如預(yù)期的那樣。條帶表示線性化PV-BVGT08 DNA。泳道2和4 :H7-1基因組DNA和與PV-BVGT08混和且與CP4-EPSPS片段雜交的H7-1 基因組DNA顯示出雜交信號。泳道2中41Λ的帶表示右邊界片段，泳道4的兩條帶也表示 4. Okb長的右邊界片段和8. 6kb大小的線性化PV-BVGT08質(zhì)粒。兩條帶具有相同的強度。 這清楚地顯示出加入的PV-BVGT08 DNA的濃度與H7-1DNA中CP4-EPSPS元件的濃度相當(dāng)。 使用的質(zhì)粒DNA的濃度等于0. 5拷貝。如果H7-1基因組中存在整合的“主鏈”序列，則可檢測到明顯的信號。這些結(jié)果證明了 H7-1不包含任何用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒的可檢測“主鏈”序列。該結(jié)果也得到5’和3’基因組側(cè)翼區(qū)分析數(shù)據(jù)的支持(如下)。5.側(cè)翼5，和3，基因組序列的鑒定農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化通常導(dǎo)致左和右邊界之間的所有序列整合至植物基因組中。整合質(zhì)粒DNA的5’和3’末端應(yīng)分別位于左或右邊界序列內(nèi)或與之鄰近。因此可用反向PCR 技術(shù)識別該區(qū)域。對克隆的PCR產(chǎn)物測序，然后將序列數(shù)據(jù)與PV-BVGT08序列比較。圖11顯示來自克隆的反向PCR片段的序列(D1U.RPT)(=基因組H7-1，上游序列) 的排列，該序列通過用于左邊界區(qū)域分析的引物獲得，與PV-BVGT08序列(下游序列)的比對。兩序列的比較顯示同源性恰在邊界序列內(nèi)終止。
圖12顯示來自克隆的反向PCR片段的序列(B3UNI. RPT)(=基因組H7_l，上游序列)的排列，該序列通過用于右邊界區(qū)域分析的引物獲得，與PV-BVGT08序列(下游序列) 的比對。兩序列的比較顯示同源性在邊界序列前18個核苷酸已經(jīng)停止。總的來說，這清楚地顯示出，Ti-質(zhì)粒PV-BVGT08的左和右邊界之間的序列被正確地整合。序列在邊界之內(nèi)或緊接邊界之前停止。這些數(shù)據(jù)支持“主鏈”分析的結(jié)果，即沒有邊界區(qū)之外的“主鏈”序列被整合至H7-1基因組內(nèi)。為確定甜菜事件H7-1中插入片段的右和左側(cè)上側(cè)翼序列是否為完整的植物基因組序列，采用引物組合Pl，P2，P3和P4實施反向PCR分析。引物組合Pl和P2的引物位于插入片段外。如果位于事件H7-1中的插入片段基因座的DNA與未轉(zhuǎn)化對照的DNA相同，則PCR將產(chǎn)生兩個PCR片段，該片段表示來自兩個引物組合的合成。引物組合P3和P4的引物按如下方式設(shè)計，即使得各引物之一位于CP4-EPSPS 插入片段內(nèi)而另一引物位于插入片段外(在植物基因組DNA內(nèi))。由此PCR應(yīng)僅產(chǎn)生來自事件H7-1的DNA的片段。來自反向PCR技術(shù)的序列數(shù)據(jù)聯(lián)合來自PV-BVGT08載體的數(shù)據(jù)，可產(chǎn)生包含H7_l 插入片段(PV-BVGT08序列)，右和左接頭區(qū)和其它甜菜基因組DNA(SEQ ID NO :5)的序列。對于鑒別轉(zhuǎn)基因至植物基因組DNA接頭(事件特異性的鑒別)和對于插入片段左和右側(cè)的基因組DNA區(qū)域，使用以下引物組合Pl組合(用于分析右邊界區(qū)外基因組DNA的引物，SEQ IDNO 18, SEQ ID NO 19)上游引物5'CGG TAA ATG CAT TGG CCT TTG TT下游引物5'CAC CCA GAT CCC AAT AAA ACC GTA AT預(yù)期PCR 產(chǎn)物 MlbpP2組合(用于分析左邊界區(qū)外基因組DNA的引物，SEQ ID NO 20, SEQ ID NO 21)上游引物5'AAA TGG TTG TAG ATA AAT AAG GAA ATC A下游引物5'ACA TGT TTG AGC ACT CTT CTT GT預(yù)期PCR 產(chǎn)物 377bpP3組合(用于分析轉(zhuǎn)基因至植物基因組DNA接頭的引物，SEQ IDNO :7,SEQ ID NO: 8)上游引物5'ATG CAT TGG CCT TTG TTT TTG AT下游引物5'TGT CGT TTC CCG CCT TCA G預(yù)期PCR 產(chǎn)物 288bp (SEQ ID NO 11)P4組合(用于分析轉(zhuǎn)基因至植物基因組DNA接頭的引物，SEQ IDNO :9,SEQ ID NO: 10)上游引物5'CGC TGC GGA CAT CTA CAT TTT TGA AT下游引物5'AGT TAA CTT TCC ACT TAT CGG GGC ACT G預(yù)期PCR 產(chǎn)物 75 Ibp (SEQ ID NO 12)采用事件H7-1DNA和來自非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参锏腄NA的PCR試驗(采用引物組合 P3，其具有位于H7-1插入片段內(nèi)部的一個引物)可產(chǎn)生僅含事件H7-1DNA的片段。相反， 采用引物組合Pl (與插入片段外部序列同源)的PCR試驗可產(chǎn)生同時含有事件H7-1和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ誅NA的片段。這些結(jié)果見圖13。
該結(jié)果表明緊接插入片段右接頭的序列存在于轉(zhuǎn)基因事件H7-1DNA中和來自非轉(zhuǎn)基因植株的DNA中?？梢缘贸鋈缦陆Y(jié)論，即事件H7-1插入片段外的該DNA是非轉(zhuǎn)基因基因組DNA。采用事件H7-1DNA和來自非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参锏腄NA，以及使用引物組合P4 (其含有一個位于CP4-EPSPS插入片段內(nèi)的引物)所實施的PCR試驗產(chǎn)生僅含事件H7-1DNA的片段。相反，使用引物組合P2(與插入片段外部序列同源)的PCR試驗產(chǎn)生同時含有有事件 H7-1的DNA和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ誅NA的片段。(圖14)。該結(jié)果表明緊接插入片段左接頭的序列存在于轉(zhuǎn)基因事件H7-1的DNA中和來自非轉(zhuǎn)基因植株的DNA中?？梢缘贸鋈缦陆Y(jié)論，即事件H7-1外的DNA是非轉(zhuǎn)基因基因組DNA。概括而言，可以描述如下，即甜菜事件H7-1插入片段外部的序列與非轉(zhuǎn)基因植株中存在的序列相同。可以得出如下結(jié)論，這些序列是用于轉(zhuǎn)化的親本品系和其它常規(guī)甜菜品系中存在的植物基因組序列。6.子代穩(wěn)定件為了證明整合DNA的穩(wěn)定性，將原始轉(zhuǎn)化事件H7-1和通過與非轉(zhuǎn)基甜菜品系自花傳粉得到的該品系的三個子代(64801H，74922H和83002S;見圖1 進行比較。最初轉(zhuǎn)化品系和子代產(chǎn)于1995年，1996年，1997年和1998年。四個不同的非轉(zhuǎn)基因甜菜品系(3S0057，5R7150，8K1180，6S0085)作為對照進行分析。分別用)(bal，HindIII和BamHI酶切所有DNA，然后與標(biāo)記的CP4-EPSPS片段雜交。 為了證明T-DNA被穩(wěn)定地整合至植物基因組中，采用相同限制性內(nèi)切酶酶切的H7-1子代的所有泳道應(yīng)表現(xiàn)為準(zhǔn)確相同大小的條帶。來自H7-1子代的DNA泳道3_6顯示出預(yù)期片段用BamHI酶切的DNA為大約111Λ 的條帶，用)(bal酶切產(chǎn)生4. Okb的片段而HindIII限制性酶切產(chǎn)生5. 2kb的條帶。來自相同限制性酶切但來自不同年份的所有條帶在其大小上相同。所有非轉(zhuǎn)基因品系未顯示任何信號(圖16)。這些結(jié)果證明了引入的序列被穩(wěn)定地整合至基因組DNA中并被穩(wěn)定地遺傳。
序列記錄-自由文本
SEQ ID 5
<223>:用側(cè)翼3'-和5'-序列插入的DNA
SEQ ID 6
<223>=PCR--產(chǎn)物
SEQ ID :11
<223> =PCR--產(chǎn)物
SEQ ID 12
<223>=PCR--產(chǎn)物
SEQ ID 13
<223>=PCR--產(chǎn)物
SEQID 17
<223>=PCR--產(chǎn)物
權(quán)利要求
1.草甘膦耐受性甜菜植株細(xì)胞，其特征在于a)甜菜植株獲自保藏于NCIMB，Aberdeen，蘇格蘭，英國，保藏號為NCIMB41158或 NCIMB 41159的種子，和/或b)采用含有SEQID NO :1核苷酸序列的第一引物和含有SEQID NO :2核苷酸序列的第二引物，使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，可從所述甜菜植株、其部分或其種子的基因組DNA中擴增 630-700bp的DNA片段，和/或c)采用含有SEQID NO :3核苷酸序列的第一引物和含有SEQID NO :4核苷酸序列的第二引物，使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，可從所述甜菜植株、其部分或其種子的基因組DNA中擴增 3500-3900bp 的 DNA 片段，和 / 或d)采用含有SEQID NO :7核苷酸序列的第一引物和含有SEQID NO :8核苷酸序列的第二引物，使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，可從所述甜菜植株、其部分或其種子的基因組DNA中擴增 270-300bp的DNA片段，和/或e)采用含有SEQID NO :9核苷酸序列的第一引物和含有SEQID N0:10核苷酸序列的第二引物，使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，可從所述甜菜植株、其部分或其種子的基因組DNA中擴增 710-790bp的DNA片段，和/或f)采用含有SEQID NO: 14核苷酸序列的第一引物和含有SEQ ID NO 16核苷酸序列的第二引物，使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，可從所述甜菜植株的基因組DNA中擴增990-1100bp的 DNA片段。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的草甘膦耐受性甜菜植株細(xì)胞，其特征在于，在b)中，可從所述甜菜植株、其部分或其種子的基因組DNA中擴增664bp的DNA片段。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的草甘膦耐受性甜菜植株細(xì)胞，其特征在于，在c)中，可從所述甜菜植株、其部分或其種子的基因組DNA中擴增3706bp的DNA片段。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的草甘膦耐受性甜菜植株細(xì)胞，其特征在于，在d)中，可從所述甜菜植株、其部分或其種子的基因組DNA中擴增^Sbp的DNA片段。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的草甘膦耐受性甜菜植株細(xì)胞，其特征在于，在e)中，可從所述甜菜植株、其部分或其種子的基因組DNA中擴增751bp的DNA片段。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的草甘膦耐受性甜菜植株細(xì)胞，其特征在于，在f)中，可從所述甜菜植株的基因組DNA中擴增1042bp的DNA片段。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項的草甘膦耐受性甜菜植株細(xì)胞，其特征在于，所述 3706bp DNA片段含有SEQ ID NO 6核苷酸序列或表現(xiàn)出與SEQ ID NO 6核苷酸序列至少 95%的同一性。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的草甘膦耐受性甜菜植株細(xì)胞，其特征在于，所述3706bpDNA片段表現(xiàn)出與SEQ ID NO :6核苷酸序列至少99%的同一性。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的草甘膦耐受性甜菜植株細(xì)胞，其特征在于，所述3706bpDNA片段表現(xiàn)出與SEQ ID NO :6核苷酸序列至少99. 9%的同一性。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項的草甘膦耐受性甜菜植株細(xì)胞，其特征在于，所述 664bp DNA片段含有SEQ ID NO 13核苷酸序列或表現(xiàn)出與SEQ ID NO :13核苷酸序列至少 95%的同一性。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的草甘膦耐受性甜菜植株細(xì)胞，其特征在于，所述664bpDNA片段表現(xiàn)出與SEQ ID NO :13核苷酸序列至少99%的同一性。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的草甘膦耐受性甜菜植株細(xì)胞，其特征在于，所述664bpDNA片段表現(xiàn)出與SEQ ID NO :13核苷酸序列至少99. 9%的同一性。
13.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項的草甘膦耐受性甜菜植株細(xì)胞，其特征在于，所述 288bp DNA片段含有SEQ ID NO :11核苷酸序列或表現(xiàn)出與SEQ ID NO :11核苷酸序列至少 95%的同一性。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的草甘膦耐受性甜菜植株細(xì)胞，其特征在于，所述^SbpDNA片段表現(xiàn)出與SEQ ID NO :11核苷酸序列至少99%的同一性。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的草甘膦耐受性甜菜植株細(xì)胞，其特征在于，所述^SbpDNA片段表現(xiàn)出與SEQ ID NO :11核苷酸序列至少99. 9%的同一性。
16.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項的草甘膦耐受性甜菜植株細(xì)胞，其特征在于，所述 751bp DNA片段含有SEQ ID NO 12核苷酸序列或表現(xiàn)出與SEQ ID NO :12核苷酸序列至少 95%的同一性。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的草甘膦耐受性甜菜植株細(xì)胞，其特征在于，所述751bpDNA片段表現(xiàn)出與SEQ ID NO :12核苷酸序列至少99%的同一性。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的草甘膦耐受性甜菜植株細(xì)胞，其特征在于，所述751bpDNA片段表現(xiàn)出與SEQ ID NO :12核苷酸序列至少99. 9%的同一性。
19.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項的草甘膦耐受性甜菜植株細(xì)胞，其特征在于，所述 1042bp DNA片段含有SEQ ID NO 17核苷酸序列或表現(xiàn)出與SEQ ID NO 17核苷酸序列至少95%的同一性。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的草甘膦耐受性甜菜植株細(xì)胞，其特征在于，所述1042bpDNA片段表現(xiàn)出與SEQ ID NO :17核苷酸序列至少99%的同一性。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的草甘膦耐受性甜菜植株細(xì)胞，其特征在于，所述1042bpDNA片段表現(xiàn)出與SEQ ID NO :17核苷酸序列至少99. 9%的同一性。
22.來自根據(jù)權(quán)利要求1-19之任一項的植株細(xì)胞的組織。
23.草甘膦耐受性甜菜植株的鑒定方法，其特征在于，該方法包含以下步驟a)采用含有SEQID NO :1核苷酸序列的第一引物和含有SEQID NO :2核苷酸序列的第二引物，使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，從所述甜菜植株、其部分或其種子的基因組DNA中擴增 630-700bp的DNA片段，和/或b)采用含有SEQID NO :3核苷酸序列的第一引物和含有SEQID NO :4核苷酸序列的第二引物，使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，從所述甜菜植株、其部分或其種子的基因組DNA中擴增 3500-3900bp 的 DNA 片段，和 / 或c)采用含有SEQID NO :7核苷酸序列的第一引物和含有SEQID NO :8核苷酸序列的第二引物，使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，從所述甜菜植株、其部分或其種子的基因組DNA中擴增 270-300bp的DNA片段，和/或d)采用含有SEQID NO :9核苷酸序列的第一引物和含有SEQID NO :10核苷酸序列的第二引物，使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，從所述甜菜植株、其部分或其種子的基因組DNA中擴增 710-790bp的DNA片段，和/或e)采用含有SEQID NO: 14核苷酸序列的第一引物和含有SEQ ID N0:16核苷酸序列的第二引物，使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，從所述甜菜植株的基因組DNA中擴增990-1100bp的DNA 片段。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的草甘膦耐受性甜菜植株的鑒定方法，其特征在于，在a)中，從所述甜菜植株、其部分或其種子的基因組DNA中擴增664bp的DNA片段。
25.根據(jù)權(quán)利要求23的草甘膦耐受性甜菜植株的鑒定方法，其特征在于，在b)中，從所述甜菜植株、其部分或其種子的基因組DNA中擴增3706bp的DNA片段。
26.根據(jù)權(quán)利要求23的草甘膦耐受性甜菜植株的鑒定方法，其特征在于，在c)中，從所述甜菜植株、其部分或其種子的基因組DNA中擴增^Sbp的DNA片段。
27.根據(jù)權(quán)利要求23的草甘膦耐受性甜菜植株的鑒定方法，其特征在于，在d)中，從所述甜菜植株、其部分或其種子的基因組DNA中擴增751bp的DNA片段。
28.根據(jù)權(quán)利要求23的草甘膦耐受性甜菜植株的鑒定方法，其特征在于，在e)中，從所述甜菜植株的基因組DNA中擴增1042bp的DNA片段。
29.用于鑒定轉(zhuǎn)基因草甘膦耐受性甜菜植株、其細(xì)胞、組織或部分的試劑盒，其包含至少一個引物對，所述引物對含有用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的第一引物和第二引物，其中第一引物識別摻入至所述植株基因組的外源DNA內(nèi)的序列，第二引物識別所述DNA的3’或5’側(cè)翼區(qū)內(nèi)的序列，由此所述植株是根據(jù)權(quán)利要求1-19之任一項的植株。
30.用于鑒定轉(zhuǎn)基因草甘膦耐受性甜菜植株、其細(xì)胞、組織或部分的試劑盒，其包含至少一個引物對，所述引物對含有用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的第一引物和第二引物，其中第一引物識別摻入至所述植株基因組的外源DNA內(nèi)的序列，第二引物識別所述DNA的3’或5’側(cè)翼區(qū)內(nèi)的序列，其特征在于a)第一引物含有SEQID NO :1核苷酸序列和第二引物含有SEQ ID NO :2核苷酸序列， 和/或b)第一引物含有SEQID NO :7核苷酸序列和第二引物含有SEQ ID NO :8核苷酸序列， 和/或c)第一引物含有SEQID NO :9核苷酸序列和第二引物含有SEQ ID N0:10核苷酸序列， 和/或d)第一引物含有SEQID NO 14核苷酸序列和第二引物含有SEQ ID NO 16核苷酸序列。
31.根據(jù)權(quán)利要求四或30的試劑盒，其特征在于，第一引物和第二引物識別形成SEQ ID NO :5核苷酸序列的部分的核苷酸序列。
32.—種制備權(quán)利要求1至6中任一項的草甘膦耐受性甜菜植株細(xì)胞的方法，其特征在于該方法包括將農(nóng)桿菌-CP4-EPSPS-基因穩(wěn)定地?fù)饺胫参锘蚪M中，并且所述細(xì)胞通過采用二元載體PV-BVGT08的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化技術(shù)進行制備，其中所述載體在左和右邊界區(qū)之間包含下列序列編碼區(qū)，其由來自擬南芥EPSPS的葉綠體轉(zhuǎn)運肽編碼序列(稱為 ctp2)組成，該編碼序列與CP4-EPSPS編碼序列結(jié)合，且處于玄參花葉病毒啟動子(pFMV)和來自豌豆的E9-3’轉(zhuǎn)錄終止序列的調(diào)控下。
33.一種制備權(quán)利要求22的植株細(xì)胞的組織的方法，其特征在于該方法包括將農(nóng)桿菌-CP4-EPSPS-基因穩(wěn)定地?fù)饺胫参锘蚪M中，并且所述組織通過采用二元載體 PV-BVGT08的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化技術(shù)進行制備，其中所述載體在左和右邊界區(qū)之間包含下列序列編碼區(qū)，其由來自擬南芥EPSPS的葉綠體轉(zhuǎn)運肽編碼序列(稱為ctp》組成，該編碼序列與CP4-EPSPS編碼序列結(jié)合，且處于玄參花葉病毒啟動子(pFMV)和來自豌豆的 E9-3’轉(zhuǎn)錄終止序列的調(diào)控下。
34.一種制備草甘膦耐受性甜菜植株的方法，其中所述植物的特征在于a)甜菜植株獲自保藏于NCIMB，Aberdeen，蘇格蘭，英國，保藏號為NCIMB41158或 NCIMB 41159的種子，和/或b)采用含有SEQID NO :1核苷酸序列的第一引物和含有SEQ IDNO :2核苷酸序列的第二引物，使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，可從所述甜菜植株、其部分或其種子的基因組DNA中擴增 630-700bp的DNA片段，和/或c)采用含有SEQID NO :3核苷酸序列的第一引物和含有SEQ IDNO :4核苷酸序列的第二引物，使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，可從所述甜菜植株、其部分或其種子的基因組DNA中擴增 3500-3900bp 的 DNA 片段，和 / 或d)采用含有SEQID NO :7核苷酸序列的第一引物和含有SEQ IDNO :8核苷酸序列的第二引物，使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，可從所述甜菜植株、其部分或其種子的基因組DNA中擴增 270-300bp的DNA片段，和/或e)采用含有SEQID NO :9核苷酸序列的第一引物和含有SEQ IDNO :10核苷酸序列的第二引物，使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，可從所述甜菜植株、其部分或其種子的基因組DNA中擴增 710-790bp的DNA片段，和/或f)采用含有SEQID NO :14核苷酸序列的第一引物和含有SEQID N0:16核苷酸序列的第二引物，使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，可從所述甜菜植株、其部分或其種子的基因組DNA中擴增 990-1 IOObp 的 DNA 片段，其特征在于，該方法包括將農(nóng)桿菌-CP4-EPSPS-基因穩(wěn)定地?fù)饺胫参锘蚪M中，并且所述植株通過采用二元載體PV-BVGT08的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化技術(shù)進行制備，其中所述載體在左和右邊界區(qū)之間包含下列序列編碼區(qū)，其由來自擬南芥EPSPS的葉綠體轉(zhuǎn)運肽編碼序列(稱為ctp2)組成，該編碼序列與CP4-EPSPS編碼序列結(jié)合，且處于玄參花葉病毒啟動子(pFMV)和來自豌豆的E9-3’轉(zhuǎn)錄終止序列的調(diào)控下。
35.根據(jù)權(quán)利要求34的方法，其特征在于，在b)中，可從所述甜菜植株、其部分或其種子的基因組DNA中擴增664bp的DNA片段。
36.根據(jù)權(quán)利要求34的方法，其特征在于，在c)中，可從所述甜菜植株、其部分或其種子的基因組DNA中擴增3706bp的DNA片段。
37.根據(jù)權(quán)利要求34的方法，其特征在于，在d)中，可從所述甜菜植株、其部分或其種子的基因組DNA中擴增的DNA片段。
38.根據(jù)權(quán)利要求34的方法，其特征在于，在e)中，可從所述甜菜植株、其部分或其種子的基因組DNA中擴增751bp的DNA片段。
39.根據(jù)權(quán)利要求34的方法，其特征在于，在f)中，可從所述甜菜植株、其部分或其種子的基因組DNA中擴增1042bp的DNA片段。
40.一種制備草甘膦耐受性甜菜植株的種子的方法，其中所述植物的特征在于a)甜菜植株獲自保藏于NCIMB，Aberdeen，蘇格蘭，英國，保藏號為NCIMB41158或 NCIMB 41159的種子，和/或b)采用含有SEQID NO :1核苷酸序列的第一引物和含有SEQ IDNO :2核苷酸序列的第二引物，使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，可從所述甜菜植株、其部分或其種子的基因組DNA中擴增 630-700bp的DNA片段，和/或c)采用含有SEQID NO :3核苷酸序列的第一引物和含有SEQ IDNO :4核苷酸序列的第二引物，使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，可從所述甜菜植株、其部分或其種子的基因組DNA中擴增 3500-3900bp 的 DNA 片段，和 / 或d)采用含有SEQID NO :7核苷酸序列的第一引物和含有SEQ IDNO :8核苷酸序列的第二引物，使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，可從所述甜菜植株、其部分或其種子的基因組DNA中擴增 270-300bp的DNA片段，和/或e)采用含有SEQID NO :9核苷酸序列的第一引物和含有SEQ IDNO :10核苷酸序列的第二引物，使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，可從所述甜菜植株、其部分或其種子的基因組DNA中擴增 710-790bp的DNA片段，和/或f)采用含有SEQID NO :14核苷酸序列的第一引物和含有SEQID N0:16核苷酸序列的第二引物，使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，可從所述甜菜植株、其部分或其種子的基因組DNA中擴增 990-1 IOObp 的 DNA 片段，其特征在于，該方法包括將農(nóng)桿菌-CP4-EPSPS-基因穩(wěn)定地?fù)饺胫参锘蚪M中，并且所述種子通過采用二元載體PV-BVGT08的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化技術(shù)進行制備，其中所述載體在左和右邊界區(qū)之間包含下列序列編碼區(qū)，其由來自擬南芥EPSPS的葉綠體轉(zhuǎn)運肽編碼序列(稱為ctp2)組成，該編碼序列與CP4-EPSPS編碼序列結(jié)合，且處于玄參花葉病毒啟動子(pFMV)和來自豌豆的E9-3’轉(zhuǎn)錄終止序列的調(diào)控下。
41.根據(jù)權(quán)利要求40的方法，其特征在于，在b)中，可從所述甜菜植株、其部分或其種子的基因組DNA中擴增664bp的DNA片段。
42.根據(jù)權(quán)利要求40的方法，其特征在于，在c)中，可從所述甜菜植株、其部分或其種子的基因組DNA中擴增3706bp的DNA片段。
43.根據(jù)權(quán)利要求40的方法，其特征在于，在d)中，可從所述甜菜植株、其部分或其種子的基因組DNA中擴增的DNA片段。
44.根據(jù)權(quán)利要求40的方法，其特征在于，在e)中，可從所述甜菜植株、其部分或其種子的基因組DNA中擴增751bp的DNA片段。
45.根據(jù)權(quán)利要求40的方法，其特征在于，在f)中，可從所述甜菜植株、其部分或其種子的基因組DNA中擴增1042bp的DNA片段。
全文摘要
本發(fā)明涉及草甘膦耐受性甜菜。本發(fā)明涉及草甘膦耐受性甜菜植株，植株材料和種子。本發(fā)明的目標(biāo)是制備轉(zhuǎn)基因甜菜植株的事件，所述甜菜植株具有對草甘膦的高度耐受性并且保持在生長，產(chǎn)量，品質(zhì)和病原抗性等方面的其他重要農(nóng)學(xué)性質(zhì)。
文檔編號C12N15/82GK102391988SQ20111007450
公開日2012年3月28日 申請日期2004年2月17日 優(yōu)先權(quán)日2003年2月20日
發(fā)明者A·羅克, E·紹爾布雷, J·克勞斯, R·內(nèi)爾斯, R·延森 申請人:Kws薩特股份公司