專利名稱：抗感染中藥成分的篩選方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及對抗感染中藥成分的篩選方法。
背景技術：
免疫系統(tǒng)的基本功能是識別外源抗原并誘導機體產生一系列反應清除外源致病性物質，以保持機體的穩(wěn)定。機體對病毒和細菌的初次免疫應答一般認為是非特異性的，然而TLR的發(fā)現徹底改變了這ー看法。美國免疫學家Janeway等將天然免疫細胞所識別的主要革E分子稱之為病原相關的分子模式(Pathogen associated molecular patterns,PAMPs), PAMPs是眾多微生物共有的ー種保守的模式分子，廣泛存在于病原體細胞表面，如內毒素、膚聚糖、鞭毛蛋白、雙鏈RNA以及酵母細胞壁上的甘露糖等，識別PAMPs的受體稱為模式識別受體(Pattern recognition receptors, PRRs)。Toll樣受體(Toll-like recptors, TLRs)是一類重要的模式識別受體(PRRs),Toll樣受體廣泛存在于昆蟲、脊椎動物和植物中，通過識別病原微生物特定的病原相關分子模(PAMPs)，啟動天然免疫應答，構成機體抵抗病原微生物入侵的第一道防線。至今，共發(fā)現了 11種人TLRs和13種小鼠TLRs，它們分別選擇性識別各種不同的PAMPs，井介導激活核因子 kappa B (nuclear factor-kappa B, NF- k B)和 MARKS 等信號通路。Toll 樣受體特異性結合自身配體后，通過MyD88(髓樣分化因子)依賴性或非依賴性途徑(TRIF)激活下游一系列蛋白級聯反應，誘導相應的白細胞介素(IL)、腫瘤壞死因子(TNF)以及干擾素(IFN)等因子的合成與釋放，啟動機體抗感染免疫反應。因此，TLRs不僅構成機體抗感染免疫的“第一道防線”，在啟動早期天然免疫應答中起重要作用，更成為聯系天然免疫和獲得性免疫的“橋梁”，對獲得性免疫的發(fā)生和發(fā)生類型具有重要的調控作用。如上所述，Toll樣受體在機體抗感染防御反應中的地位至關重要，而現有的研究表明，許多中藥可通過多種途徑或環(huán)節(jié)提高機體抗感染免疫力。由此推測中藥提高機體免疫系統(tǒng)對病原體的識別和殺傷能力，以及誘導、調節(jié)更有效的免疫防御反應，與Toll樣受體及其相關的信號分子密切相關，二者之間必然存在著天然的聯系。研究抗感染中藥對Toll樣受體活性及其下游信號分子的影響，評價Toll樣受體作為篩選抗感染中藥的靶標分子的應用價值，并建立以Toll樣受體為靶標的篩選抗感染中藥的細胞模型。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供ー種抗感染中藥成分的篩選方法。本發(fā)明所提供的技術解決方案是本發(fā)明的篩選方法是(I)首先選取具有抗病毒、細菌、增強免疫活性的中藥，將其用DMSO溶解，其儲存液終濃度為20mg/ml。(2)試驗用細胞的準備將試驗用Ana-I小老鼠巨噬細胞株，RAW264. 7小老鼠巨噬 細胞白血病細胞株，293T人胚腎細胞株分別用含10% FBS的1640和DMEM培養(yǎng)基(100U/ml青霉素、鏈霉素)，37°C，5% CO2，培養(yǎng)箱培養(yǎng)，2-3天細胞處于對數生長期時傳代培養(yǎng)。(3)Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)及其下游信號分子基因的調取選擇Toll樣受體分子和Toll樣受體的下游分子MyD88和TRIF以及IL_6、TNF_ a和INF- ^作為待檢分子，井分別對其部分基因序列進行了引物的設計、合成與鑒定，為Real-Time PCR做準備。(4)MTT藥物毒性試驗Ana _l細胞鋪95孔板，IO4個細胞/孔(200ul)，試驗設中藥感染組，DMSO陰性對照組,調零組,姆組設6個感染劑量梯度(即80ug/ml,60ug/ml,40ug/ml，20ug/ml，10ug/ml，5ug/ml)，每個梯度設3個重復，待藥物感染細胞24小時后，每孔加入5mg/ml的MTT20ul，于37°C反應4小時后，每孔加入150ul的DMSO溶解活細胞與MTT反應后產生的紫色結晶，于振蕩10分鐘待結晶完全溶解后選擇570nm波長，在酶聯免疫監(jiān)測儀上測定各孔光吸收值，得出藥物濃度對細胞的抑制率，確定中藥感染細胞的最佳劑量。(5)Real-Time PCR檢測中藥對Toll樣受體分子在mRNA水平上的影響初篩中藥，通過Real-Time PCR檢測中藥對Toll樣受體分子在mRNA水平上的影響、Real-Time PCR檢測中藥對Toll樣受體分子下游分子MyD88和TRIF在mRNA水平上的影響、Real-Time PCR檢測中藥對IL-6、TNF_a和INF-P等細胞因子的影響、Western Blot檢測Toll樣受體蛋白的表達，篩選出經該中藥刺激后具有高表達的中藥品種。(6)利用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)測定中藥刺激Toll樣受體后對其下游NF-KB和INF =Real-Time PCR檢測中藥對Toll樣受體分子下游分子MyD88和TRIF在mRNA水平上的影響；Real-Time PCR檢測中藥對IL_6、TNF-a和INF-P等細胞因子的影響！WesternBlot檢測Toll樣受體蛋白的表達。(7)報告基因轉錄活性檢測，驗證mTLR9介導的信號通路對下游轉錄因子NF-k B轉錄活性的影響。本發(fā)明的有益效果對中醫(yī)藥現代化具有重要的理論價值，有助于抗感染中藥的篩選開發(fā)中藥新藥產品，為進一歩研究mTLR9的信號轉導的分子機制及其介導的生物學功能奠定了基礎。
實施例(I)選取具有抗病毒、細菌、增強免疫活性的中藥，如甘草次酸、淫羊藿苷、黃苓苷、苦參堿、穿心蓮內酯，分別用DMSO溶解，其儲存液終濃度為20mg/ml。(2)試驗用細胞的準備將試驗用Ana-I小老鼠巨噬細胞株，RAW264. 7小老鼠巨噬細胞白血病細胞株，293T人胚腎細胞株(均來自中科院上海細胞生物研究所細胞庫)分別用含10% FBS的1640和DMEM培養(yǎng)基(100U/ml青霉素、鏈霉素)，37°C，5 % CO2，培養(yǎng)箱培養(yǎng)，2-3天細胞處于對數生長期時傳代培養(yǎng)。(3)Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)及其下游信號分子基因的調取選擇Toll樣受體(TLR2、3、4、7、9)共計5個Toll樣受體分子和Toll樣受體的下游分子MyD88和TRIF以及IL-6、TNF-a和INF-0作為待檢分子，井分別對其部分基因序列進行了引物的設計、合成與鑒定，為Real-Time PCR做準備。(4)MTT藥物毒性試驗Ana-l細胞鋪95孔板，IO4個細胞/孔(200ul)，試驗設中藥感染組，DMSO陰性對照組,調零組,姆組設6個感染劑量梯度(即80ug/ml,60ug/ml,40ug/ml，20ug/ml，lOug/ml，5ug/ml)，每個梯度設3個重復，待藥物感染細胞24小時后，每孔加入5mg/ml的MTT20ul，于37°C反應4小時后，每孔加入150ul的DMSO溶解活細胞與MTT反應后產生的紫色結晶，于振蕩10分鐘待結晶完全溶解后選擇570nm波長，在酶聯免疫監(jiān)測儀上測定各孔光吸收值，得出藥物濃度對細胞的抑制率，確定中藥感染細胞的最佳劑量。(5)Real-Time PCR檢測中藥對Toll樣受體分子在mRNA水平上的影響初篩中藥，通過Real-Time PCR檢測中藥對Toll樣受體分子在mRNA水平上的影響、Real-Time PCR檢測中藥對Toll樣受體分子下游分子MyD88和TRIF在mRNA水平上的影響、Real-Time PCR檢測中藥對IL-6、TNF_a和INF-P等細胞因子的影響、Western Blot檢測Toll樣受體蛋白的表達，篩選出經該中藥刺激后具有高表達的中藥品種。(6)利用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)測定中藥刺激Toll樣受體后對其下游NF-KB和INF =Real-Time PCR檢測中藥對Toll樣受體分子下游分子MyD88和TRIF在mRNA水平上的影響；Real-Time PCR檢測中藥對IL_6、TNF-a和INF-P等細胞因子的影響！WesternBlot檢測Toll樣受體蛋白的表達。(7)報告基因轉錄活性檢測，驗證mTLR9介導的信號通路對下游轉錄因子NF- k B轉錄活性的影響。經以上篩選結果顯示，甘草次酸、淫羊藿苷能夠明顯提高MyD88和TRIF的mRNA的 水平，顯著提高IL-6的mRNA的水平。
權利要求
1.ー種抗感染中藥成分的篩選方法，其特征在于篩選方法包括以下步驟 (1)選取具有抗病毒、細菌、增強免疫活性的中藥； (2)試驗用細胞的準備； (3)Toll樣受體(Toll-likereceptors, TLRs)及其下游信號分子基因的調取； (4)MTT藥物毒性試驗； (5)Real-Time PCR檢測中藥對Toll樣受體分子在mRNA水平上的影響； (6)Real-Time PCR檢測中藥對Toll樣受體分子下游分子MyD88和TRIF在mRNA水平上的影響； (7)Real-Time PCR檢測中藥對IL_6、TNF-a和INF-^等細胞因子的影響； (8)WesternBlot檢測Toll樣受體蛋白的表達； (9)報告基因轉錄活性檢測。
2.根據權利要求I所述的抗感染中藥成分的篩選方法，其特征在于首先選取具有抗病毒、細菌、增強免疫活性的中藥，將其用DMSO溶解，其儲存液終濃度為20mg/ml。
3.根據權利要求I所述的抗感染中藥成分的篩選方法，其特征在于試驗用細胞的準備，將試驗用Ana-I小老鼠巨噬細胞株，RAW264. 7小老鼠巨噬細胞白血病細胞株，293T人胚腎細胞株分別用含10% FBS的1640和DMEM培養(yǎng)基(100U/ml青霉素、鏈霉素)，37°C，5 %CO2,培養(yǎng)箱培養(yǎng)，2-3天細胞處于對數生長期時傳代培養(yǎng)。
4.根據權利要求I所述的抗感染中藥成分的篩選方法，其特征在于選擇Toll樣受體分子和Toll樣受體的下游分子MyD88和TRIF以及IL_6、TNF_ a和INF- ^作為待檢分子，井分別對其部分基因序列進行了引物的設計、合成與鑒定，為Real-Time PCR做準備。
5.根據權利要求I所述的抗感染中藥成分的篩選方法，其特征在于MTT藥物毒性試驗，Ana-I細胞鋪95孔板，IO4個細胞/孔(200ul)，試驗設中藥感染組，DMSO陰性對照組，調零組，姆組設 6 個感染劑量梯度(即 80ug/ml,60ug/ml,40ug/ml,20ug/ml, 10ug/ml,5ug/ml)，每個梯度設3個重復，待藥物感染細胞24小時后，每孔加入5mg/ml的MTT20ul，于37°C反應4小時后，每孔加入150ul的DMSO溶解活細胞與MTT反應后產生的紫色結晶，于振蕩10分鐘待結晶完全溶解后選擇570nm波長，在酶聯免疫監(jiān)測儀上測定各孔光吸收值，得出藥物濃度對細胞的抑制率，確定中藥感染細胞的最佳劑量。
6.根據權利要求I所述的抗感染中藥成分的篩選方法，其特征在于初篩中藥，通過Real-Time PCR檢測中藥對Toll樣受體分子在mRNA水平上的影響、Real-Time PCR檢測中藥對Toll樣受體分子下游分子MyD88和TRIF在mRNA水平上的影響、Real-Time PCR檢測中藥對IL-6、TNF_a和INF-0等細胞因子的影響、Western Blot檢測Toll樣受體蛋白的表達，篩選出經該中藥刺激后具有高表達的中藥品種。
7.根據權利要求I所述的抗感染中藥成分的篩選方法，其特征在于利用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)測定中藥刺激Toll樣受體后對其下游NF-KB和INF報告基因轉錄活性的影響。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及對抗感染中藥成分的篩選方法。本發(fā)明的篩選方法是選取具有抗病毒、細菌、增強免疫活性的中藥，試驗用細胞的準備，Toll樣受體及其下游信號分子基因的調取，MTT藥物毒性試驗，Real-TimePCR檢測中藥對Toll樣受體分子在mRNA水平上的影響，報告基因轉錄活性檢測，驗證mTLR9介導的信號通路對下游轉錄因子NF-κB轉錄活性的影響。本發(fā)明的有益效果對中醫(yī)藥現代化具有重要的理論價值，有助于抗感染中藥的篩選開發(fā)中藥新藥產品，為進一步研究mTLR9的信號轉導的分子機制及其介導的生物學功能奠定了基礎。
文檔編號C12Q1/02GK102653782SQ201110048040
公開日2012年9月5日 申請日期2011年3月1日 優(yōu)先權日2011年3月1日
發(fā)明者史子學, 彭麗娜, 徐永莉, 李力, 沈陽, 繆劍華, 袁經權, 谷穎樂, 邱亞峰, 邵東華, 馬志永 申請人:廣西壯族自治區(qū)藥用植物園