專(zhuān)利名稱(chēng)：用基因工程技術(shù)制備唾液酸的制作方法
用基因工程技術(shù)制備唾液酸本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)制備唾液酸，具體為用唾液酸的重組酶法生產(chǎn)エ藝，利用多酶工程菌技術(shù)和多酶ー步催化技術(shù)來(lái)生產(chǎn)唾液酸。唾液酸(Sialic Acid)是神經(jīng)氨酸衍生物的通用名，學(xué)名叫作“N-こ?；窠?jīng)酸”，是ー種天然存在的碳水化合物，通常以低聚糖，糖脂或者糖蛋白的形式存在。唾液酸及以唾液酸為母體的藥物在國(guó)外已應(yīng)用于臨床，其最重要的生理作用是(I)用于抑制流感及其它的傳染性病毒。(2)可用于神經(jīng)性疾病、炎癥、腫瘤。(3)可用于治療Alzheimer型老年癡呆癥。唾液酸具有抗病毒及抗細(xì)菌感染、提高免疫力、中和毒素及抗炎、保護(hù)呼吸系統(tǒng)的功能，是燕窩的主要成分，在國(guó)外已開(kāi)發(fā)成為預(yù)防治療呼吸道病毒感染和流感的新型藥物，因此唾液酸及其衍生物非常有潛力成為預(yù)防和治療傳染性病毒的新型藥物，并象阿斯 匹林、青霉素等普藥ー樣生命力長(zhǎng)久不衰。據(jù)報(bào)道，唾液酸的國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)年需求量超過(guò)100噸，近期全球市場(chǎng)份額在5億元人民幣以上。目前該產(chǎn)品國(guó)外已廣泛應(yīng)用，國(guó)內(nèi)處于起步階段，有著遠(yuǎn)大的市場(chǎng)前景和巨大的市場(chǎng)潛力，經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益顯著。本發(fā)明成功構(gòu)建了高效制備唾液酸的工程菌株，發(fā)明了重組酶法生產(chǎn)エ藝。此方法大大簡(jiǎn)化了生產(chǎn)エ藝流程，降低了生產(chǎn)成本，有利于進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化放大生產(chǎn)。同時(shí)，利用固定化多酶工程菌技術(shù)為基礎(chǔ)，以唾液酸為原料生產(chǎn)唾液酸系列衍生物的技術(shù)已經(jīng)在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模上得到實(shí)現(xiàn)。該創(chuàng)新技術(shù)還為以后繼續(xù)開(kāi)發(fā)唾液酸系列衍生物新產(chǎn)品和擴(kuò)大唾液酸在生物技術(shù)領(lǐng)域的應(yīng)用提供技術(shù)支持和建立技術(shù)平臺(tái)。本發(fā)明采用酸水解方法將結(jié)合狀態(tài)的唾液酸變成游離狀態(tài)，游離狀態(tài)的唾液酸與間苯ニ酚反應(yīng)生成有色化合物，再用有機(jī)酸萃取后，測(cè)定唾液酸含量。本發(fā)明的原理通過(guò)亞克隆的方法將催化唾液酸合成的兩個(gè)關(guān)鍵酶ー異構(gòu)化酶和唾液酸醛縮酶構(gòu)建在同一表達(dá)質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)化入同一大腸桿菌宿主菌內(nèi)，通過(guò)發(fā)酵表達(dá)兩個(gè)重組酶，離心收集菌體，將菌體固定化，用固定化菌體中的多重組酶來(lái)催化葡萄糖胺和丙酮酸完成合成反應(yīng)，得到唾液酸。本發(fā)明的目的我們發(fā)明的唾液酸重組酶法生產(chǎn)エ藝，大大筒化了生產(chǎn)エ藝流程，降低了生產(chǎn)成本，有利于進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化放大生產(chǎn)。唾液酸的生產(chǎn)方法有天然提取法、發(fā)酵法、化學(xué)合成法(含酶促合成法)。但由于天然提取法、發(fā)酵法成本高，收率低，難以大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化。目前國(guó)際上主要采用化學(xué)酶促合成法生產(chǎn)唾液酸，但步驟煩瑣，純化困難，產(chǎn)率低，原材料消耗大，尤其是使用的唾液酸醛縮酶需購(gòu)買(mǎi)但價(jià)格昂貴，致使生產(chǎn)成本居高不下。技術(shù)方案工程菌種構(gòu)建一種子液制備一發(fā)酵和誘導(dǎo)表達(dá)一離心菌體收集一洗滌菌體一多催化酶體的固定化一催化葡萄糖胺和丙酮酸在合適條件下生成唾液酸一提純、冷凍干燥一唾液酸純品一產(chǎn)品質(zhì)量檢測(cè)最佳實(shí)施例1、發(fā)酵エ藝從培養(yǎng)基的組成、PH值的影響、攪拌轉(zhuǎn)速和培養(yǎng)時(shí)間四個(gè)方面對(duì)唾液酸基因工程菌培養(yǎng)條件進(jìn)行了研究。通過(guò)對(duì)唾液酸基因工程菌培養(yǎng)條件的研究篩選，確定山梨醇為最佳碳源，氯化銨作無(wú)機(jī)氮源，再進(jìn)行培養(yǎng)條件的正交實(shí)驗(yàn)，獲得最佳培養(yǎng)基為山梨醇2. 5%，氯化銨0. 5%，磷酸氫ニ鉀90mmol/L，胰蛋白胨I. 5%，硫酸鎂0. 04%,PH 7.8。通過(guò)研究不同PH值對(duì)唾液酸基因工程菌發(fā)酵過(guò)程中菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)唾液酸的影響得出，發(fā)酵初期PH自然下降時(shí)有利于菌體生長(zhǎng)，菌體生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期較長(zhǎng)，最大菌體干重可達(dá)6. 9g/L ;發(fā)酵中后期PH控制在6. 4時(shí)有利于唾液酸的延續(xù)合成。通過(guò)比較不同攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)菌體分批發(fā)酵生產(chǎn)唾液酸過(guò)程的影響，根據(jù)發(fā)酵前、后期菌體細(xì)胞比生長(zhǎng)速率和唾液酸比合成速率達(dá)到最大值所需攪拌轉(zhuǎn)速的不同，提出了兩階段攪拌轉(zhuǎn)速控制策略發(fā)酵前期(0_5h)控制攪拌轉(zhuǎn)速500r/min,發(fā)酵中后期控制攪拌轉(zhuǎn)速700r/min。通過(guò)對(duì)產(chǎn)唾液酸菌株大腸桿菌培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行研究得出在250ml的搖瓶中，裝液量為40ml，起始PH值為7. 8，轉(zhuǎn)速250r/min，37°C恒溫培養(yǎng)5h，其唾液酸產(chǎn)量可達(dá)1001ug/mL ;而如果培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)至6. 5h，可使唾液酸的產(chǎn)量提高到1500ug/mL。2.提取エ藝從洗脫劑種類(lèi)、洗脫劑濃度、上柱液濃度、上柱流量、起始PH等方面對(duì)唾液酸的提取エ藝進(jìn)行了研究。通過(guò)對(duì)不同洗脫劑對(duì)エ藝影響的研究對(duì)比，確定NaCl為最佳洗脫劑，并在NaCl系列濃度下進(jìn)行洗脫發(fā)現(xiàn)，在濃度為0. 15M時(shí)得到比較好的提取結(jié)果。通過(guò)運(yùn)用不同上柱清液濃度、不同上柱流量和不同洗脫流速，在用0. 15MNaCl洗脫條件下，對(duì)獲得的結(jié)果進(jìn)行比較，得出最佳的エ藝為上柱清液濃度8000ug/mL，上柱流量(Sv)為 0. 6 (柱體積/小時(shí))，洗脫流速為I. 0 (柱體積/小時(shí))。通過(guò)比較不同上柱起始PH對(duì)純化的影響，得出在PH4. 5時(shí)能夠獲得最好的結(jié)果。綜合上述得出在上柱清液濃度8000ug/mL，上柱流量(Sv)為0. 6 (柱體積/小吋)，上柱起始PH4. 5，洗脫流速為I. 0 (柱體積/小吋)，用NaCl為洗脫劑且濃度在0. 15M的條件下能得到比較好的洗脫效果，獲得的唾液酸性質(zhì)穩(wěn)定，純度在95%以上。測(cè)定方法本法系用酸水解方法將結(jié)合狀態(tài)的唾液酸變成游離狀態(tài)，游離狀態(tài)的唾液酸與間苯ニ酚反應(yīng)生成有色化合物，再用有機(jī)酸萃取后，測(cè)定唾液酸含量。唾液酸對(duì)照品溶液(200 u g/ml)的制備精密稱(chēng)取唾液酸對(duì)照品10. 52mg(l y g唾液酸相當(dāng)于3. 24nmol)，置IOml量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，混勻，即為唾液酸貯備液(lmg/ml)，按一次使用量分裝，-70°C貯存,有效期I年。僅可凍融I次。4°C保存使用期為2周。精密量取唾液酸貯備液1ml，置5ml量瓶中，加水至刻度，即為每Iml含200 y g的唾液酸對(duì)照品溶液，用前配制。測(cè)定法取供試品適量，加水稀釋至蛋白濃度約為每Iml含0. 2 0. 4mg,作為供試品溶液。按下表取唾液酸對(duì)照品溶液、水及供試品溶液于IOml玻璃試管中，混勻，每管再加入間苯ニ酚-鹽酸溶液(分別量取2%間苯ニ酚溶液2. 5ml,0. lmol/L硫酸銅溶液62. 5 ill、25%鹽酸溶液20ml，加水稀釋至25ml，混勻。試驗(yàn)前4小時(shí)內(nèi)配制)lml，加蓋，沸水煮沸30分鐘(水浴面高于液面約2cm)，取出置冰浴中3分鐘(同時(shí)振搖)后，每管加こ酸丁酯-丁醇液(取こ酸丁酯4份與丁醇I份混勻，室溫下保存，12小時(shí)內(nèi)使用)2ml，充分混勻，室溫放置10分鐘，按紫外-可見(jiàn)分光光度法，在波長(zhǎng)580nm處測(cè)定吸光度。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明采用了具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的“重組酶法エ藝”，利用重組多酶工程菌和重組多酶一歩催化技術(shù)來(lái)生產(chǎn)唾液酸。與其他生產(chǎn)方法相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)勢(shì)1.本發(fā)明采用重組酶法生產(chǎn)エ藝，エ藝簡(jiǎn)化，有利于進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。其他方法采用化學(xué)合成エ藝，エ藝復(fù)雜；2.本發(fā)明中催化劑來(lái)源是自行發(fā)酵生產(chǎn)重組酶，其他方法是購(gòu)進(jìn)商品酶；3.在純度上本發(fā)明產(chǎn)品達(dá)到>99%，而其他方法>97%;4.產(chǎn)品成本上，本發(fā)明產(chǎn)品成本較其他方法成本明顯降低。
權(quán)利要求
1.ー種用基因工程技術(shù)制備唾液酸的方法，其關(guān)鍵技術(shù)在于構(gòu)建篩選唾液酸基因工程菌株，具體為通過(guò)亞克隆的方法將催化唾液酸合成的兩個(gè)關(guān)鍵酶ー異構(gòu)化酶和唾液酸醛縮酶構(gòu)建在同一表達(dá)質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)化入同一大腸桿菌宿主菌內(nèi)，再進(jìn)行菌種篩選得到基因工程菌，用于唾液酸制備。
2.用基因工程技術(shù)制備唾液酸的エ藝，其特征在于經(jīng)過(guò)工程菌種構(gòu)建一種子液制備—發(fā)酵和誘導(dǎo)表達(dá)一離心菌體收集一洗滌菌體一多催化酶體的固定化一催化葡萄糖胺和丙酮酸在合適條件下生成唾液酸一提純、冷凍干燥一唾液酸純品一產(chǎn)品質(zhì)量檢測(cè)等步驟完成。
3.如權(quán)利2所述產(chǎn)品檢測(cè)，本法系用酸水解方法將結(jié)合狀態(tài)的唾液酸變成游離狀態(tài)，游離狀態(tài)的唾液酸與間苯ニ酚反應(yīng)生成有色化合物，再用有機(jī)酸萃取后，測(cè)定唾液酸含量。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種基因工程制備唾液酸的方法。采用重組酶法生產(chǎn)唾液酸的生產(chǎn)工藝，即通過(guò)亞克隆的方法將催化唾液酸合成的兩個(gè)關(guān)鍵酶一異構(gòu)化酶和唾液酸醛縮酶構(gòu)建在同一表達(dá)質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)化入同一大腸桿菌宿主菌內(nèi)，通過(guò)發(fā)酵表達(dá)兩個(gè)重組酶，離心收集菌體，將菌體固定化，用固定化菌體中的多重組酶來(lái)催化葡萄糖胺和丙酮酸完成合成反應(yīng)，得到唾液酸。檢測(cè)方法是用酸水解方法將結(jié)合狀態(tài)的唾液酸變成游離狀態(tài)，游離狀態(tài)的唾液酸與間苯二酚反應(yīng)生成有色化合物，再用有機(jī)酸萃取后，測(cè)定唾液酸含量。采用本發(fā)明作為唾液酸的生產(chǎn)和檢測(cè)方法，大大簡(jiǎn)化了流程和降低了成本，能使生產(chǎn)效率顯著提高。
文檔編號(hào)C12N15/63GK102649965SQ201110043268
公開(kāi)日2012年8月29日 申請(qǐng)日期2011年2月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月23日
發(fā)明者王革 申請(qǐng)人:王革