專利名稱：一種用于hPPARγ配體藥物篩選細(xì)胞模型的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于hPPAR γ配體藥物篩選細(xì)胞模型的方法。
背景技術(shù)：
W ±1 M ^ # ^ S W Y (peroxisome proliferator activated receptors, PPAR γ )屬于II型核受體超家族成員，除了具有誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞分化成熟和調(diào)控多種脂肪因子基因表達(dá)的功能外，還在抑制炎癥反應(yīng)，抗肝纖維化作用，抗動脈粥樣硬化， 誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化或凋亡，抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移及血管生成，改善心功能，保護(hù)腎臟，降血脂和降血壓，保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)等方面發(fā)揮重要的作用，有望成為治療高血脂、肥胖、高血壓、動脈粥樣硬化、糖尿病及惡性腫瘤等疾病的新靶點(diǎn)。在沒有PPARY配體存在的情況下，細(xì)胞漿內(nèi)的hPPARY能與維甲酸類受體 (RXRa)形成異二聚體，并招募共抑制蛋白復(fù)合體與其結(jié)合，進(jìn)而抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄，在 hPPAR γ配體與hPPARY結(jié)合后，此異二聚體釋放共抑制因子，并募集多種共激活因子與其結(jié)合，并進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，與靶基因啟動子上游的過氧化物酶體增殖物反應(yīng)元件(peroxisome proliferator response element, PPRE)結(jié)合,啟動靶基因的轉(zhuǎn)錄。目前用于藥物篩選的方法如蛋白質(zhì)芯片、極化熒光、高內(nèi)涵篩選、模式生物等均存在各種弊端，如蛋白質(zhì)芯片在如何提高反應(yīng)特異性及降低成本等方面還有待改進(jìn)，尤其是該法所得結(jié)果無法反映篩選劑的生物學(xué)活性；極化熒光由于某些熒光素半衰期較短，其標(biāo)記物質(zhì)起始極化值太高而在應(yīng)用中受限，而且在標(biāo)記的物質(zhì)分子量較大時(shí)，極化值容易達(dá)到平臺期，從而影響實(shí)驗(yàn)的精確性；高內(nèi)涵篩選還處于發(fā)展階段，仍存在諸多待解決的問題，如常用的熒光蛋白靈敏度還有待提高，高內(nèi)涵藥物篩選通量也有待增加等；模式生物的篩選通量還有待提高等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是，提供一種用于hPPAR γ配體藥物篩選細(xì)胞模型的方法，以克服蛋白質(zhì)芯片無法反映篩選劑的生物學(xué)活性、極化熒光由于某些熒光素半衰期較短、其標(biāo)記物質(zhì)起始極化值太高而在應(yīng)用中受限等其他藥物篩選方法存在的不足。為了解決所述的技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案它包括以下步驟
第一，用含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10% FBS的HG-DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，選擇其生長旺盛的時(shí)期，按8Χ IO4/孔的密度種M孔板；
第二，待細(xì)胞匯集至90 95%時(shí)，采用Lipofectamine 2000將重組質(zhì)粒 phPPAR Y-IRES2-EGFP、報(bào)告質(zhì)粒 ptk-PPREX 3_luc 和內(nèi)部對照質(zhì)粒 pRL-CMV 按 100:50:1 (0. 5μ g:0. 25μ g:0. 005 μ g)的比例共轉(zhuǎn)染239T細(xì)胞，并同時(shí)設(shè)立空載體pIRES2-EGFP對照組；轉(zhuǎn)染36h后檢測轉(zhuǎn)染效率和綠色熒光蛋白GFP的表達(dá)情況；
第三，hPPAR γ特異性配體陽性藥物羅格列酮干預(yù)J93T細(xì)胞培養(yǎng)和質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染同第一、二方法；不同之處是轉(zhuǎn)染14 h后，更換新鮮的含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10% FBS的HG-DMEM培養(yǎng)基，將不同濃度的陽性藥物羅格列酮加入到各自的轉(zhuǎn)染培養(yǎng)體系中，藥物濃度設(shè)置為1%。 DMSO, 1(T8 mol/L、1(Γ7 mol/L、1(Γ6 mol/L、1(Γ5 mol/L 和 1(Γ4 mol/L,作為量-效分析研究(羅格列酮是用DMSO溶解為0. 1 mol/L的母液，用時(shí)稀釋使用，因10_4 mol/L干預(yù)組DMSO的體積分?jǐn)?shù)為1%。，故設(shè)1%。DMSO為對照組);同時(shí)采用10_5 mol/L濃度羅格列酮，加入到各自的轉(zhuǎn)染培養(yǎng)體系中，并于8 h、16 h、24 h、36 h和48 h進(jìn)行時(shí)-效分析；
第四，對上述共轉(zhuǎn)染239T細(xì)胞反應(yīng)體系更換干預(yù)藥物，采用PPARa特異性配體 WY14643，用以檢測、確定人工模擬hPPARY信號通路的細(xì)胞模型反應(yīng)特異性；
第五，采用相同濃度序列的全反式維甲酸代替PPARy陽性藥物羅格列酮，對上述3反應(yīng)體系進(jìn)行干預(yù)，以了解上述體系是否可通過全反式維甲酸激動。所述的第三至第五步驟均采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測法分別檢測螢火蟲熒光素酶發(fā)光值(F)和內(nèi)部對照海腎熒光素酶發(fā)光值(R)，根據(jù)酶比值(F/R值)所得數(shù)值分析該模型的可行性。第二步驟中的重組質(zhì)粒phPPARY-IRES2-EGFP、報(bào)告質(zhì)粒ptk-PPREX 3_luc和內(nèi)部對照質(zhì)粒 pRL-CMV 的比例為 0. 5 μ g: 0. 25 μ g:0. 005 μ g。本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)為結(jié)果顯示該細(xì)胞模型具有良好的量-效、時(shí)-效反應(yīng)曲線及反應(yīng)特異性；與其他藥物篩選方法相比，本發(fā)明具有成本低、反應(yīng)靈敏、特異性好等優(yōu)點(diǎn)，是真正意義上的生物活性篩選新體系，另外，該模型可通過F/R值繪制的趨勢線比較不同藥物之間的半數(shù)有效濃度(EC50 )。


圖1為細(xì)胞轉(zhuǎn)染PhPPAR γ-IRES2-EGFP重組質(zhì)粒后GFP表達(dá)情況(X200) 及流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染效率結(jié)果，細(xì)胞轉(zhuǎn)染PhPPAR y -IRES2-EGFP質(zhì)粒36h后GFP表達(dá)情況；
圖2為與圖IA相應(yīng)的相差圖像；
圖3為細(xì)胞轉(zhuǎn)染phPPAR γ-IRES2-EGFP重組質(zhì)粒后GFP表達(dá)情況(X 200)及流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染效率結(jié)果，其中對照組GFP陽性率；
圖4為細(xì)胞轉(zhuǎn)染phPPAR y -IRES2-EGFP重組質(zhì)粒后GFP表達(dá)情況(X 200)及流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染效率結(jié)果，其中PhPPAR y -IRES2-EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組GFP陽性率；
圖5為轉(zhuǎn)染的細(xì)胞陽性藥物羅格列酮干預(yù)后熒光素酶發(fā)光比值(F/R值)，不同濃度梯度羅格列酮干預(yù)24h后檢測F/R值，顯示量-效關(guān)系；
圖6為轉(zhuǎn)染的四31~細(xì)胞陽性藥物羅格列酮干預(yù)后熒光素酶發(fā)光比值(F/R值)， 10_5mol/L羅格列酮干預(yù)不同時(shí)間點(diǎn)檢測F/R值，顯示時(shí)-效關(guān)系；
圖7為兩種不同濃度藥物干預(yù)hPPARY轉(zhuǎn)染的細(xì)胞M h后熒光素酶發(fā)光比值(F/ R值)比較，對照組和phPPAR y -IRES2-EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組分別用WY14643和羅格列酮干預(yù)； 圖8為兩種不同濃度藥物干預(yù)hPPARY轉(zhuǎn)染的細(xì)胞M h后熒光素酶發(fā)光比值(F/ R值)比較，對照組和phPPAR y -IRES2-EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組分別用羅格列酮和全反式維甲酸干預(yù)。
具體實(shí)施方式
具體實(shí)施例方式實(shí)施以下步驟
第一，用含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10% FBS的HG-DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，選擇其生長旺盛的時(shí)期，按8Χ IO4/孔的密度種M孔板；
第二，待細(xì)胞匯集至90 95%時(shí)，采用Lipofectamine 2000將重組質(zhì)粒 phPPAR Y-IRES2-EGFP、報(bào)告質(zhì)粒 ptk-PPREX 3_luc 和內(nèi)部對照質(zhì)粒 pRL-CMV 按 100:50:1 (0. 5μ g:0. 25μ g:0. 005 μ g)的比例共轉(zhuǎn)染239T細(xì)胞，并同時(shí)設(shè)立空載體pIRES2-EGFP對照組；轉(zhuǎn)染36h后檢測轉(zhuǎn)染效率和綠色熒光蛋白GFP的表達(dá)情況；
第三，hPPARy特異性配體陽性藥物羅格列酮干預(yù)J93T細(xì)胞培養(yǎng)和質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染同第一、二方法；不同之處是轉(zhuǎn)染14 h后，更換新鮮的含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10% FBS的HG-DMEM培養(yǎng)基，將不同濃度的陽性藥物羅格列酮加入到各自的轉(zhuǎn)染培養(yǎng)體系中，藥物濃度設(shè)置為1%。 DMSOUO"8 mol/L、l(T7 mol/L、l(T6 mol/L、l(T5 mol/L和 1(Γ4 mol/L，作為量-效分析研究(羅格列酮是用DMSO溶解為0. 1 mol/L的母液，用時(shí)稀釋使用，因10_4 mol/L干預(yù)組DMSO的體積分?jǐn)?shù)為1%。，故設(shè)1%。DMSO為對照組)；同時(shí)采用10_5 mol/L濃度羅格列酮，加入到各自的轉(zhuǎn)染培養(yǎng)體系中，并于8 h、16 h、24 h、36 h和48 h進(jìn)行時(shí)-效分析；
第四，對上述共轉(zhuǎn)染239T細(xì)胞反應(yīng)體系更換干預(yù)藥物，采用PPARa特異性配體 WY14643，用以檢測、確定人工模擬hPPARy信號通路的細(xì)胞模型反應(yīng)特異性；
第五，采用相同濃度序列的全反式維甲酸代替PPARy陽性藥物羅格列酮，對上述3反應(yīng)體系進(jìn)行干預(yù)，以了解上述體系是否可通過全反式維甲酸激動。步驟3飛均采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測法分別檢測螢火蟲熒光素酶發(fā)光值(F) 和內(nèi)部對照海腎熒光素酶發(fā)光值(R)，根據(jù)酶比值(F/R值)所得數(shù)值分析該模型的可行性。
權(quán)利要求
1.一種用于hPPAR γ配體藥物篩選細(xì)胞模型的方法，其特征在于它包括以下步驟 第一，用含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10% FBS的HG-DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，選擇其生長旺盛的時(shí)期，按8Χ IO4/孔的密度種M孔板；第二，待細(xì)胞匯集至90 95%時(shí)，采用Lipofectamine 2000將重組質(zhì)粒 phPPAR Y-IRES2-EGFP、報(bào)告質(zhì)粒 ptk-PPREX 3_luc 和內(nèi)部對照質(zhì)粒 pRL-CMV 按 100:50:1 的比例共轉(zhuǎn)染239T細(xì)胞，并同時(shí)設(shè)立空載體pIRES2-EGFP對照組；轉(zhuǎn)染36h后檢測轉(zhuǎn)染效率和綠色熒光蛋白GFP的表達(dá)情況；第三，hPPARy特異性配體陽性藥物羅格列酮干預(yù)J93T細(xì)胞培養(yǎng)和質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染同第一、二方法；轉(zhuǎn)染14 h后，更換新鮮的含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10% FBS的HG-DMEM培養(yǎng)基，將不同濃度的陽性藥物羅格列酮加入到各自的轉(zhuǎn)染培養(yǎng)體系中，藥物濃度設(shè)置為1%。DMSOUO-8 mol/ L、Kr7 mol/L、Kr6 mol/L、1(Γ5 mol/L和 1(Γ4 mol/L,作為量-效分析研究；同時(shí)采用 1(T5 mol/ L濃度羅格列酮，加入到各自的轉(zhuǎn)染培養(yǎng)體系中，并于8 h、16 h、24 h、36 h和48 h進(jìn)行時(shí)-效分析；第四，對上述共轉(zhuǎn)染239T細(xì)胞反應(yīng)體系更換干預(yù)藥物，采用PPARa特異性配體 WY14643，用以檢測、確定人工模擬hPPARy信號通路的細(xì)胞模型反應(yīng)特異性；第五，采用相同濃度序列的全反式維甲酸代替PPAR γ陽性藥物羅格列酮，對上述3反應(yīng)體系進(jìn)行干預(yù)，以了解上述體系是否可通過全反式維甲酸激動。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于hPPARY配體藥物篩選細(xì)胞模型的方法，其特征在于 第三至第五步驟均采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測法分別檢測螢火蟲熒光素酶發(fā)光值和內(nèi)部對照海腎熒光素酶發(fā)光值，根據(jù)酶比值所得數(shù)值分析該模型的可行性。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于hPPARY配體藥物細(xì)胞模型的方法，其特征在于第二步驟中的重組質(zhì)粒phPPARY-IRES2-EGFP、報(bào)告質(zhì)粒ptk-PPREX3_luc和內(nèi)部對照質(zhì)粒 pRL-CMV 的比例為 0. 5μ g: 0. 25μ g:0. 005μ g。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于hPPARγ配體藥物細(xì)胞模型的方法，它包括以下步驟第一，用含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%FBS的HG-DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)293T細(xì)胞；第二，待細(xì)胞匯集至90~95%時(shí)，采用Lipofectamine2000將重組質(zhì)粒、報(bào)告質(zhì)粒和內(nèi)部對照質(zhì)粒按100:50:1的比例共轉(zhuǎn)染239T細(xì)胞，并設(shè)立空對照組；轉(zhuǎn)染36h后檢測轉(zhuǎn)染效率和綠色熒光蛋白GFP的表達(dá)情況；第三，hPPARγ特異性配體陽性藥物羅格列酮干預(yù)；第四，對上述共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞反應(yīng)體系更換干預(yù)藥物，采用PPARα特異性配體WY14643；第五，采用相同濃度序列的全反式維甲酸代替PPARγ陽性藥物羅格列酮，對上述共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞反應(yīng)體系進(jìn)行干預(yù)。本發(fā)明具有結(jié)果顯示該細(xì)胞模型具有良好的量-效、時(shí)-效反應(yīng)曲線及反應(yīng)特異性；且成本低、反應(yīng)靈敏、特異性好等優(yōu)點(diǎn)，是真正意義上的生物活性篩選新體系，另外，該模型可通過F/R值繪制的趨勢線比較不同藥物之間的半數(shù)有效濃度(EC50)。
文檔編號C12N15/85GK102229957SQ201110028679
公開日2011年11月2日 申請日期2011年1月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月27日
發(fā)明者章濤 申請人:遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院