專利名稱：一株對(duì)井崗霉素水劑具有較高抗性的蠟狀芽孢桿菌及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株對(duì)井R霉素水劑有較高抗性的蠟狀芽孢桿菌及其與井R霉素水劑混合防治水稻等植物的紋枯病的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
隨著社會(huì)的進(jìn)步和人們生活水平的提高，對(duì)無(wú)污染和無(wú)公害食品的要求日益高漲，因此開展了各種無(wú)公害防治植物病蟲害的研究，研究的重點(diǎn)即為生物農(nóng)藥。與傳統(tǒng)的化學(xué)農(nóng)藥相比，生物農(nóng)藥具有對(duì)人畜和非靶標(biāo)生物安全，環(huán)境兼容性好，不易產(chǎn)生抗性，易于保護(hù)生物多樣性，來(lái)源廣等優(yōu)點(diǎn)。因此，高效生物農(nóng)藥的開發(fā)應(yīng)用對(duì)人類健康，環(huán)境保護(hù)和農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展都有極其重大的意義。井岡霉素(jingangmycin)是上海市農(nóng)藥研究所20世紀(jì)70年代開發(fā)的一種農(nóng)用抗生素，是一種典型的生物農(nóng)藥，在我國(guó)被大量用于水稻紋枯病、稻曲病、小麥紋枯病等真菌病害的防治。30多年來(lái)使用經(jīng)久不衰，年防治面積達(dá)2億多畝，為我國(guó)水稻的高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)做出了重要的貢獻(xiàn)，為目前農(nóng)村中無(wú)法替代的優(yōu)良藥劑。然而由于價(jià)格低廉等因素，農(nóng)民經(jīng)常擅自擴(kuò)大使用劑量和使用次數(shù)，盡管至今未發(fā)現(xiàn)抗藥性，但這對(duì)于稻米安全、生態(tài)環(huán)境和人畜構(gòu)成潛在危害。蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)，又稱蠟樣芽孢桿菌、蠟質(zhì)芽孢桿菌，是一種革蘭氏陽(yáng)性桿菌，可產(chǎn)生抗菌物質(zhì)，抑制有害微生物的繁殖；還可以降解土壤中的磷、鉀等營(yíng)養(yǎng)成分，改善生態(tài)環(huán)境。植物上的蠟狀芽孢桿菌還可以改善植物營(yíng)養(yǎng)，刺激植物生長(zhǎng)和防治發(fā)生植物病害，因而可以促進(jìn)植物的生長(zhǎng)，提高產(chǎn)量。另外，蠟狀芽孢桿菌還能產(chǎn)生多種生物活性物質(zhì)。因此，蠟狀芽孢桿菌在植物病害防治中得到了較為廣泛的應(yīng)用。目前已有多個(gè)單位對(duì)蠟狀芽孢桿菌進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)其對(duì)很多致病菌具有拮抗性能。文獻(xiàn)“蠟質(zhì)芽孢桿菌R2防治水稻紋枯病研究”(植物病理學(xué)報(bào)，1993，23 O) :101-105)發(fā)現(xiàn)蠟質(zhì)芽孢桿菌R2對(duì)水稻紋枯菌菌絲生長(zhǎng)有抑制作用，并且可以對(duì)水稻生長(zhǎng)發(fā)育有一定促進(jìn)作用。文獻(xiàn) “一株芽孢桿菌的初步分離鑒定與拮抗性試驗(yàn)”(西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)， 2004. 32(7) :93-96)，推測(cè)蠟狀芽孢桿菌具有較廣的抗菌譜，對(duì)試驗(yàn)中的大多數(shù)病原菌具有較好的拮抗能力。蠟狀芽孢桿菌作為抗菌制劑已開始應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，基于它對(duì)水稻立枯絲核菌(Miizoctonia solani)的拮抗作用，多用于水稻紋枯病的防治。為克服井R霉素在應(yīng)用上的局限和降低潛在威脅，近年來(lái)國(guó)內(nèi)相繼開發(fā)了井岡霉素與生防芽孢桿菌混配的系列農(nóng)藥產(chǎn)品，井R霉素與蠟狀芽孢桿菌復(fù)配劑就是其中一種。 在諸多大田研究中，井R霉素與蠟狀芽孢桿菌復(fù)配劑的防效表現(xiàn)為增效。文獻(xiàn)“12. 5%井岡霉素 蠟質(zhì)芽孢桿菌防治水稻紋枯病的試驗(yàn)”(湖北植保，2009，113 C3) :45)，文獻(xiàn)“10%井岡霉素 蠟質(zhì)芽孢桿菌防治稻曲病試驗(yàn)”(湖北植保，2009，113C3) :46)，文獻(xiàn)“10%井 蠟芽菌懸浮劑防治水稻紋枯病試驗(yàn)初報(bào)”(中國(guó)稻米，2009，4 :67-68)，文獻(xiàn)“井 蠟芽40%可濕性粉劑防治水稻紋枯病和稻曲病藥效試驗(yàn)”(安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)，2008，1M21) :169-170)都報(bào)道，井R霉素 蠟狀芽孢桿菌對(duì)水稻紋枯病的防效十分顯著，均高于30%苯醚甲環(huán)唑 丙環(huán)唑(愛苗)，且增產(chǎn)效果明顯，表明宜于在水稻上進(jìn)行推廣應(yīng)用。目前市場(chǎng)上已經(jīng)有井R霉素 蠟芽復(fù)配粉劑，商品名為紋枯清，如浙江省桐廬匯豐生物化工有限公司、江蘇省蘇科農(nóng)化有限責(zé)任公司、安徽省合肥福瑞德生物化工廠等均有相應(yīng)產(chǎn)品生產(chǎn)和銷售，并且在水稻紋枯病和稻曲病的防治中起到很好的作用，創(chuàng)造出較大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)價(jià)值。而這些復(fù)配農(nóng)藥屬于粉劑，生產(chǎn)和施用過(guò)程操作復(fù)雜，成本較高。如果將蠟狀芽孢桿菌直接與井R霉素水劑復(fù)配，就可以降低生產(chǎn)成本，而且方便使用，提高農(nóng)藥效用。然而，文獻(xiàn)“井R霉素對(duì)混劑中拮抗細(xì)菌B-M23-R和稻株上土著細(xì)菌群體數(shù)量的影響”(植物保護(hù)學(xué)報(bào).2007，34 (6) =657-658)，文獻(xiàn)“井R霉素對(duì)土壤可培微生物的生態(tài)效應(yīng)”(農(nóng)藥，2006,45(11) :771-774)等研究均報(bào)道井R霉素能降低與之混配的生防細(xì)菌及土著細(xì)菌的種群數(shù)量。因此，在使用井R霉素時(shí)，提高生防菌的存活種群數(shù)量而增加生防效果，成為當(dāng)前迫切需要解決的一個(gè)問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一株對(duì)井R霉素水劑有較高抗性的蠟狀芽孢桿菌及其與井岡霉素水劑混合防治水稻等植物的紋枯病的應(yīng)用，該蠟狀芽孢桿菌在井R霉素水劑中存活率高，且與井R霉素水劑能夠協(xié)同抑制水稻立枯絲核菌，復(fù)配農(nóng)藥的生產(chǎn)、運(yùn)輸、保存和使用方便，降低生產(chǎn)成本，使農(nóng)民受益，從而提高經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)WR-12，保藏于北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3 號(hào)中國(guó)微生物菌種管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)CGMCC NO. 4195，保藏日期2010 年9月25日。本發(fā)明所述的蠟狀芽孢桿菌WR-12按照以下步驟篩選從浙江省桐廬縣附近的稻田中采集土壤樣品一分離鑒定一NTG誘變處理一井岡霉素水劑中長(zhǎng)期放置一分離鑒定一搖瓶發(fā)酵選育一分離鑒定一梯度平板選育一分離鑒定 —獲得抗性菌株。不斷增加培養(yǎng)基中所含井R霉素水劑的量，搖瓶發(fā)酵選育與梯度平板選育交替重復(fù)進(jìn)行。通過(guò)多輪自然選育，最終獲得了井R霉素水劑抗性菌株蠟狀芽孢桿菌 (Bacillus cereus)WR-12。本發(fā)明所述的蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)WR-12的篩選按照以下步驟進(jìn)行(1)菌種分離將從浙江省桐廬縣附近的稻田中采集的土壤樣品用無(wú)菌生理鹽水制成懸液，于 70°C水浴加熱lOmin，采用平板涂布活菌分離法，涂布于牛肉膏蛋白胨固體平板，30°C培養(yǎng) 24h觀察。挑取白色蠟質(zhì)狀單菌落于MYP鑒定平板劃線分離，30°C培養(yǎng)Mh，觀察，挑取乳白色蠟質(zhì)狀并帶有暈圈的單菌落接種于牛肉膏蛋白胨固體斜面，30°C培養(yǎng)12h，獲得菌體命名為蠟狀芽孢桿菌(Bacillus CereUS)WR;所述的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配制方法為牛肉膏3g、蛋白胨5g、NaCl 5g、瓊脂20g，加熱煮沸，加水至IOOOmL, il pH至7. 0，121°C滅菌 20min ；所述的MYP鑒定培養(yǎng)基配制方法為為制備50%卵黃液取鮮雞蛋，用硬刷將蛋殼徹底洗凈，浙干，放于75%酒精溶液中浸泡lh，以無(wú)菌操作取出卵黃，加入等量生理鹽水，混合后備用；取甘露醇卵黃多粘菌素瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基44g，加蒸餾水900mL，加熱溶解后分裝每瓶90mL，121°C滅菌20min，冷卻55 °C左右，每瓶加入50%卵黃液5mL和多粘菌素B硫酸鹽10000IU，混勻后倒平板。(2)誘變育種以N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍(NTG)作為誘變劑，對(duì)蠟狀芽孢桿菌WR進(jìn)行化學(xué)誘變，致死率為86 %。對(duì)經(jīng)過(guò)誘變的菌株通過(guò)平板涂布活菌分離法分離鑒定，命名為蠟狀芽孢桿菌WR-I。(3)菌種選育1)靜置選育將蠟狀芽孢桿菌WR-I斜面制成菌懸液，發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵液離心棄上清液，加入井R霉素水劑搖勻，室溫放置一年。分離鑒定，命名為蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)WR-2。2)搖瓶選育將蠟狀芽孢桿菌WR-2菌種接種到含有井R霉素水劑的培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)，計(jì)量芽孢數(shù)，篩選井R霉素水劑高抗性菌株，再次接種到含有不同濃度井R霉素水劑的培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)，計(jì)量芽孢存活率，篩選高濃度井R霉素水劑高抗性菌株，轉(zhuǎn)接斜面培養(yǎng)，不斷增加培養(yǎng)基中所含井R霉素水劑的量，搖瓶發(fā)酵選育與梯度平板選育交替選育，循環(huán)數(shù)次，鑒定，獲得井R霉素水劑高抗性蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus) WR-12，保藏菌種。本發(fā)明所述蠟狀芽孢桿菌芽孢計(jì)數(shù)取0.5mL蠟狀芽孢桿菌發(fā)酵液(或蠟狀芽孢桿菌井岡霉素水劑放置液)加入 4. 5mL無(wú)菌水中稀釋10倍混勻，70°C水浴lOmin，繼續(xù)稀釋至相應(yīng)梯度；選取合適梯度稀釋液，取100 μ L涂布于牛肉膏蛋白胨平板，3個(gè)平行，30°C培養(yǎng)20h計(jì)菌落數(shù)。本發(fā)明所述蠟狀芽孢桿菌芽孢存活率，按公式(1)計(jì)算
Πιa = — 100 公式⑴
flo公式⑴中a為芽孢存活率(％ )， 為放置前芽孢懸液的菌落平均數(shù)(CFU/mL)， H1為放置數(shù)天后芽孢懸液的菌落平均數(shù)(CFU/mL)。本發(fā)明所述的蠟狀芽孢桿菌WR-12菌株的特性1)菌株細(xì)胞形態(tài)所述的蠟狀芽孢桿菌WR-12細(xì)胞形態(tài)為桿狀，長(zhǎng)3. O 5. 1 μ m、寬1. 2 2. O μ m， 有鞭毛，能運(yùn)動(dòng)；有芽孢，芽孢柱形，中生或近中生；革蘭氏染色陽(yáng)性；在牛肉膏蛋白胨瓊脂平板培養(yǎng)基上，30°C培養(yǎng)Mh，可形成圓形或近圓形菌落，直徑5 7mm，白色，似融蠟狀，不透明，表面較粗糙，扁平，不規(guī)則；所述蠟狀芽孢桿菌WR-12生化實(shí)驗(yàn)兼性好氧，生長(zhǎng)溫度范圍20 45°C，4°C生長(zhǎng)緩慢或不生長(zhǎng)，50°C時(shí)不生長(zhǎng)，最適生長(zhǎng)溫度；在乳糖培養(yǎng)基中不產(chǎn)酸，也不產(chǎn)氣，過(guò)氧化氫酶陽(yáng)性，吲哚實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性，可使淀粉、明膠水解；V. P.和M.R.試驗(yàn)陰性；可以利用D-木糖、D-鼠李糖、可溶性淀粉，葡萄糖為唯一碳源生長(zhǎng)，不能利用蔗糖、 乳糖、半乳糖，麥芽糖為唯一碳源生長(zhǎng)；能利用L-精氨酸、L-纈氨酸、丙氨酸、酪氨酸，L-脯氨酸為唯一氮源生長(zhǎng)，不能利用NaN03、(NH4)2HPO4, L-谷氨酸為唯一氮源生長(zhǎng)。菌種的保藏斜面菌種放4°C冰箱短暫保存或制成凍干粉長(zhǎng)期保存。本發(fā)明所述的蠟狀芽孢桿菌WR-12在防治水稻紋枯病中的應(yīng)用。
所述蠟狀芽孢桿菌WR-12對(duì)井R霉素水劑具有較高的抗性，可以利用其芽孢與井岡霉素水劑混合制成復(fù)配農(nóng)藥，用于防治水稻紋枯病。所述的應(yīng)用是將蠟狀芽孢桿菌WR-12接種到適用于芽孢桿菌的培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，將發(fā)酵液離心分離獲得蠟狀芽孢桿菌WR-12菌體細(xì)胞，將蠟狀芽孢桿菌WR-12菌體細(xì)胞與3% 5%井R霉素水劑混合，制成復(fù)配農(nóng)藥用于抑制水稻紋枯菌以防治水稻紋枯病，所述的蠟狀芽孢桿菌WR-12菌體以細(xì)胞數(shù)計(jì)為IO8 IOltl個(gè)/mL 3% 5%井岡霉素水劑。所述的蠟狀芽孢桿菌WR-12在防治水稻紋枯病中的應(yīng)用，所述的蠟狀芽孢桿菌 WR-12菌體細(xì)胞按如下方法制得(1)斜面培養(yǎng)將蠟狀芽孢桿菌WR-12菌種接種到斜面培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)1 獲得菌體斜面；所述斜面培養(yǎng)基終濃度組成為牛肉膏3g/L、蛋白胨5g/L、NaCl 5g/L、瓊脂20g/ L,溶劑為水，調(diào)pH至7. 0，121°C滅菌20min,備用；(2)種子培養(yǎng)從菌體斜面取一接種環(huán)菌體轉(zhuǎn)接到種子培養(yǎng)基中，搖床轉(zhuǎn)速200r/ min，3(TC培養(yǎng)Mh，獲得種子液；所述的種子培養(yǎng)基終濃度組成為牛肉膏3g/L，蛋白胨5g/ L, NaCl 5g/L，溶劑為水，調(diào)pH至7. 0，121°C滅菌20min，備用；(3)發(fā)酵培養(yǎng)取種子液以體積分?jǐn)?shù)1 2%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基，搖床轉(zhuǎn)速200r/min，30°C培養(yǎng)18 30h，將發(fā)酵液離心獲得菌體細(xì)胞；所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的終濃度組成為牛肉膏3g/L、蛋白胨5g/L、NaCl 5g/L、溶劑為水，調(diào)pH至7. 0，121°C滅菌20min，備用。一種利用蠟狀芽孢桿菌WR-12制成的復(fù)配農(nóng)藥優(yōu)選為將蠟狀芽孢桿菌WR-12菌體細(xì)胞與5%井R霉素水劑混勻，制得蠟狀芽孢桿菌WR-12菌體以細(xì)胞數(shù)計(jì)為IO8 IOltl個(gè) /mL5%井岡霉素水劑。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在本發(fā)明提供了一種新菌種蠟狀芽孢桿菌WR-12，該蠟狀芽孢桿菌WR-12對(duì)井R霉素水劑有較高的抗性，在井R霉素水劑中存活率高，且與井R霉素水劑能夠協(xié)同抑制水稻立枯絲核菌，復(fù)配農(nóng)藥的生產(chǎn)、運(yùn)輸、保存和使用方便，降低生產(chǎn)成本，使農(nóng)民受益，從而提高經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。


圖1蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus) WR菌落形態(tài)圖1中的A、圖1中的B為蠟質(zhì)芽孢桿菌WR形成的白色蠟質(zhì)狀單菌落；圖1中的C為蠟質(zhì)芽孢桿菌在MYP鑒定培養(yǎng)基上形成的微粉紅色菌落；圖1中的D為蠟質(zhì)芽孢桿菌WR周圍產(chǎn)生的卵磷脂酶沉淀環(huán)；圖2蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)WR顯微鏡照片圖2中的A為培養(yǎng)14h的芽孢染色；圖2中的B為培養(yǎng)22h的芽孢染色；圖2中的C為培養(yǎng)30h的芽孢染色；圖2中的D為培養(yǎng)12h的革蘭氏染色；圖3蠟狀芽孢桿菌WR-12與蠟狀芽孢桿菌WR芽孢存活率比較；圖4蠟狀芽孢桿菌WR-12與蠟狀芽孢桿菌WR抗井岡霉素水劑比較；圖4中的A為蠟狀芽孢桿菌WR抗性，圖4中的B為蠟狀芽孢桿菌WR-12抗性；圖5蠟狀芽孢桿菌WR-12與井岡霉素水劑協(xié)同抑菌作用圖5中的A為蠟狀芽孢桿菌WR-12組，圖5中的B為空白對(duì)照組。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此本發(fā)明實(shí)施例所用的培養(yǎng)基如下(1)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配制牛肉膏3g、蛋白胨5g、NaCl 5g、瓊脂20g，加熱煮沸，加水至IOOOmL,調(diào)pH至7. 0，121°C滅菌20min，備用；(》MYP鑒定培養(yǎng)基的配制制備50%卵黃液取鮮雞蛋，用硬刷將蛋殼徹底洗凈，浙干，放于75%酒精溶液中浸泡lh，以無(wú)菌操作取出卵黃，加入等量生理鹽水，混合后備用；取甘露醇卵黃多粘菌素瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基44g，加蒸餾水900mL，加熱溶解后分裝，每瓶90mL，121°C滅菌20min，冷卻55 °C左右，每瓶加入50%卵黃液5mL和多粘菌素B硫酸鹽 10000IU，混勻后倒平板；(3)斜面培養(yǎng)基的配制同牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配制；(4)種子培養(yǎng)基的配制牛肉膏3g、蛋白胨5g、NaCl 5g、加水至lOOOmL，調(diào)pH至 7. 0，121°C 滅菌 20min，備用；(5)發(fā)酵培養(yǎng)基的配制牛肉膏3g、蛋白胨5g、NaCl 5g、加水至lOOOmL，調(diào)pH至 7. 0，121°C 滅菌 20min，備用。實(shí)施例1蠟狀芽孢桿菌WR-12分離鑒定(1)菌種分離從浙江省桐廬縣附近的稻田中采集土壤樣品，稱取1克，加入裝有 0.9% (m/v)無(wú)菌生理鹽水99mL的三角瓶中(裝有玻璃珠)，搖勻，制成1 %的菌懸液，于 70°C水浴加熱lOmin，采用平板涂布活菌分離法，涂布于牛肉膏蛋白胨固體平板，30°C培養(yǎng) Mh，挑取白色蠟質(zhì)狀單菌落于MYP鑒定平板劃線分離，30°C培養(yǎng)Mh，挑取乳白色蠟質(zhì)狀并帶有暈圈的單菌落接種于牛肉膏蛋白胨固體斜面，30°C培養(yǎng)12h，獲得的菌體命名為蠟狀芽孢桿菌(Bacillus CereuS)WR，其菌落形態(tài)及顯微鏡照片如圖1和圖2所示，蠟狀芽孢桿菌為好氧菌，涂布在普通牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上30°C培養(yǎng)24h可形成圓形白色蠟質(zhì)狀單菌落，質(zhì)地柔軟且稍有光澤，直徑5 7mm，如圖1中的A、圖1中的B所示；蠟狀芽孢桿菌產(chǎn)磷脂酶C，可以把卵磷脂水解為二甘油脂和膽堿磷酸酯，在MYP鑒定培養(yǎng)基上可以形成微粉紅色的菌落，如圖1中的C所示，周圍環(huán)繞產(chǎn)生卵磷脂酶沉淀環(huán)，提示該菌具有特異的卵磷脂酶活性，如圖1中的D所示，與蠟狀芽孢桿菌特性相符；取培養(yǎng)時(shí)間為12h、14h、2a!和30h的菌體，分別進(jìn)行芽孢染色，在15 X 100倍油鏡下觀察培養(yǎng)14h菌體的染色，蠟狀芽孢桿菌菌體細(xì)胞成鏈狀，形態(tài)大小相同，有少許芽孢形成，如圖2中的A所示；培養(yǎng)2 菌體的染色， 大量芽孢著生在菌體中間，呈橢圓狀，被染成綠色(孔雀綠的顏色)，菌體邊緣呈紅色(復(fù)染液番紅的顏色)，表明芽孢還未脫落，如圖2中的B所示；培養(yǎng)30h菌體的染色，大量橢圓芽孢脫落，并被染成綠色，如圖2中的C所示；培養(yǎng)1 菌體革蘭氏染色，菌體為紫色，表明為革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，圖2中的D所示。(2)誘變育種以N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍(NTG)作為誘變劑，對(duì)蠟狀芽孢桿菌WR進(jìn)行化學(xué)誘變。對(duì)經(jīng)過(guò)誘變的菌株分離鑒定，命名為蠟狀芽孢桿菌WR-1。(3)菌種選育1)靜置選育
取0. 9 %的無(wú)菌生理鹽水lmL，加入到步驟(2)培養(yǎng)14h的蠟狀芽孢桿菌WR-I斜面制成菌懸液，取100 μ L轉(zhuǎn)接于50mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，30°C、200r/min搖床培養(yǎng)48h。取發(fā)酵液5mL，7000r/min離心lOmin，棄上清液，加入5%的井岡霉素水劑5mL搖勻，室溫放置一年。分離鑒定，所得菌株命名為蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)WR-22)搖瓶選育在50mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中加入6mL 0. 5%無(wú)菌井岡霉素水劑，接種步驟1)所獲得的蠟狀芽孢桿菌WR-2菌懸液100ul,30。c、200r/min搖床培養(yǎng)4811，計(jì)量芽孢數(shù)，選取芽孢數(shù)較高的蠟狀芽孢桿菌平板，將其菌落影印至牛肉膏蛋白胨含井R霉素水劑不同濃度的平板，30°C培養(yǎng)Mh，計(jì)量芽孢存活率，選取蠟狀芽孢桿菌存活率最高的井岡霉素水劑濃度平板上的活菌株轉(zhuǎn)接斜面，不斷增加培養(yǎng)基中所含井R霉素水劑的量，搖瓶發(fā)酵選育與梯度平板選育交替選育，循環(huán)數(shù)次，鑒定，最終得到較高抗性菌株蠟狀芽孢桿菌 (Bacillus cereuS)WR-12，4°C冰箱暫時(shí)保存或制成凍干粉長(zhǎng)期保存。實(shí)施例2蠟狀芽孢桿菌WR-12發(fā)酵條件的確定(1)最適發(fā)酵時(shí)間的測(cè)定接種蠟狀芽孢桿菌WR-12于5瓶細(xì)菌發(fā)酵培養(yǎng)基，pH 7. 0，分別以Mh、36h、48h、 60h、7ai為發(fā)酵時(shí)間，30°C發(fā)酵培養(yǎng)，取發(fā)酵液5mL，7000r/min離心lOmin，棄上清液，加入 5%的井網(wǎng)霉素水劑5mL搖勻，室溫放置8d。以芽孢數(shù)及存活率為指標(biāo)，分析蠟狀芽孢桿菌 WR-12耐井R霉素水劑的情況，如表1所示，結(jié)果表明蠟狀芽孢桿菌WR-12的最適發(fā)酵時(shí)間為 48h。表1蠟狀芽孢桿菌WR-12最適發(fā)酵時(shí)間
權(quán)利要求
1.蠟狀芽孢桿菌(BacilluscereUS)WR-12，保藏于北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào) 中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)CGMCC NO. 4195，保藏日期2010 年9月25日。
2.如權(quán)利要求1所述的蠟狀芽孢桿菌WR-12，其特征在于所述的蠟狀芽孢桿菌WR-12 細(xì)胞形態(tài)為桿狀，長(zhǎng)3. 0 5. 1 μ m、寬1. 2 2. 0 μ m，有鞭毛，能運(yùn)動(dòng)；有芽孢，芽孢柱形， 中生或近中生；革蘭氏染色陽(yáng)性；在牛肉膏蛋白胨瓊脂平板培養(yǎng)基上，30°C培養(yǎng)Mh，可形成圓形或近圓形菌落，直徑5 7mm，白色，似融蠟狀，不透明，表面較粗糙，扁平，不規(guī)則；所述蠟狀芽孢桿菌WR-12生化實(shí)驗(yàn)兼性好氧，生長(zhǎng)溫度范圍20 45°C，4°C生長(zhǎng)緩慢或不生長(zhǎng)，50°C時(shí)不生長(zhǎng)，最適生長(zhǎng)溫度；在乳糖培養(yǎng)基中不產(chǎn)酸，也不產(chǎn)氣，過(guò)氧化氫酶陽(yáng)性，吲哚實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性，可使淀粉、明膠水解；V. P.和M.R.試驗(yàn)陰性。
3.如權(quán)利要求1所述的蠟狀芽孢桿菌WR-12在防治水稻紋枯病中的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求3所述的蠟狀芽孢桿菌WR-12在防治水稻紋枯病中的應(yīng)用，其特征在于所述的應(yīng)用是通過(guò)蠟狀芽孢桿菌WR-12對(duì)水稻紋枯菌有抑制作用來(lái)防治水稻紋枯病。
5.如權(quán)利要求4所述的蠟狀芽孢桿菌WR-12在防治水稻紋枯病中的應(yīng)用，其特征在于所述的應(yīng)用是將蠟狀芽孢桿菌WR-12接種到適用于芽孢桿菌的培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)， 將發(fā)酵液離心分離獲得蠟狀芽孢桿菌WR-12菌體細(xì)胞，將蠟狀芽孢桿菌WR-12菌體細(xì)胞與 3% 5%井R霉素水劑混合，制成復(fù)配農(nóng)藥用于抑制水稻紋枯菌以防治水稻紋枯病，所述的蠟狀芽孢桿菌WR-12菌體以細(xì)胞數(shù)計(jì)為IO8 IOltl個(gè)/mL3% 5%井岡霉素水劑。
6.如權(quán)利要求5所述的蠟狀芽孢桿菌WR-12在防治水稻紋枯病中的應(yīng)用，其特征在于所述的蠟狀芽孢桿菌WR-12菌體細(xì)胞按如下方法制得(1)斜面培養(yǎng)將蠟狀芽孢桿菌WR-12菌種接種到斜面培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)1 獲得菌體斜面；所述斜面培養(yǎng)基終濃度組成為牛肉膏3g/L、蛋白胨5g/L、NaCl 5g/L、瓊脂20g/L，溶劑為水，調(diào)PH至7. 0，121°C滅菌20min，備用；(2)種子培養(yǎng)從菌體斜面取一接種環(huán)菌體轉(zhuǎn)接到種子培養(yǎng)基中，搖床轉(zhuǎn)速200r/min， 30°C培養(yǎng)Mh，獲得種子液；所述的種子培養(yǎng)基終濃度組成為牛肉膏3g/L、蛋白胨5g/L、 NaCl 5g/L、溶劑為水，調(diào)pH至7. 0，121°C滅菌20min，備用；(3)發(fā)酵培養(yǎng)取種子液以體積分?jǐn)?shù)1 2%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基，搖床轉(zhuǎn)速 200r/min，3(TC培養(yǎng)18 30h，將發(fā)酵液離心獲得菌體細(xì)胞，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的終濃度組成為牛肉膏3g/L、蛋白胨5g/L、NaCl 5g/L、溶劑為水，調(diào)pH至7. 0，121°C滅菌20min,備用。
7.一種利用蠟狀芽孢桿菌WR-12制成的復(fù)配農(nóng)藥，其特征在于所述的復(fù)配農(nóng)藥為將蠟狀芽孢桿菌WR-12菌體細(xì)胞與5%井R霉素水劑混勻，制得蠟狀芽孢桿菌WR-12菌體以細(xì)胞數(shù)計(jì)為IO8 101°個(gè)/mL5%井岡霉素水劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了一株對(duì)井岡霉素水劑具有較高抗性的蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)WR-12，該菌株于2010年9月25日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，菌種保藏號(hào)為CGMCC No.4195；該蠟狀芽孢桿菌WR-12對(duì)井岡霉素水劑有較高的抗性，在井岡霉素水劑中存活率高，且與井岡霉素水劑能夠協(xié)同抑制水稻立枯絲核菌，復(fù)配農(nóng)藥的生產(chǎn)、運(yùn)輸、保存和使用方便，降低生產(chǎn)成本，使農(nóng)民受益，從而提高經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。
文檔編號(hào)C12N1/20GK102168051SQ20111002585
公開日2011年8月31日 申請(qǐng)日期2011年1月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月25日
發(fā)明者倪烈, 李忠, 胥川, 裘娟萍, 趙春田 申請(qǐng)人:浙江工業(yè)大學(xué), 浙江省桐廬匯豐生物化工有限公司