專利名稱：：具有更高水平Botrytis抗性的番茄植物的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及植物育種和分子生物學。更特別地，本發(fā)明涉及檢測與番茄^^yfec/mm"抗性相關的數(shù)量性狀基因座(QTL)的方法，涉及產生So^yto抗性番茄植物的方法，涉及由此獲得的B^o^s抗性番茄植物及其部分。
背景技術：
：Bo^yfe"'"erea是具有非常廣泛宿主范圍的死體營養(yǎng)型(necro加phic)病原真菌，包括至少235種可能的宿主。由于其廣泛的宿主范圍及由于其影響經濟學重要的植物，因此及c/"w"是許多商業(yè)作物面臨的主要問題。在農作物中，真菌通常是指Botrytis。番茄CSo/a做m(yco;em'cwm，先前稱作Z^co/era/cow^cw/e"^w)也易感5o^yto，該真菌通常影響番茄植物的莖、葉和果實。在加溫溫室中，莖上Bo7to感染發(fā)生特別常見。^^yfe主動地殺死感染的細胞，導致軟腐病、疫病、葉斑病、猝倒病和莖癌(stemcancers)。感染的葉變得由分生孢子梗和分生孢子覆蓋，隨后倒伏和枯萎。該真菌從患病的葉生長進莖，并產生長度從幾毫米至幾厘米的干枯的淡褐色病斑。病斑也可以在莖上的剪枝疤痕處形成。莖病斑也可以由灰霉菌覆蓋。在一些情況中，所述感染包繞莖并殺死植物。番茄植物的衰老組織與較幼小的組織相比通常對于6Wo;to的侵襲更易感。為了預防溫室中生長的番茄發(fā)生Sofo;to，必須嚴密調節(jié)溫度和相對濕度。進一步重要的是提供水分而不要使葉片變濕。對于田野中生長的植物，應該應用良好的排水和雜草防除技術。此外，植物的營養(yǎng)水平必須保持高水平。然而，這些預防措施不能充分防止在感染情況中發(fā)生相當大的產量損失。在溫室和田野生長的番茄中控制So^y似的殺真菌劑是可獲得的。一些殺真菌劑的例子包括DowicideA⑧和百菌清殺菌齊lJ(chlorothalonil)，其也可以在收獲后應用于番茄果實。然而，已知Botrytis對于一些常用的殺真菌劑已經產生抗性。另外，殺真菌劑的應用從經濟學和環(huán)境的觀點上均是不希望的。目前需要呈現(xiàn)^^7他抗性的商業(yè)番茄品種。在一些野生型番茄物種中己經發(fā)現(xiàn)對于Bo^to的部分抗性(Egashiraetal.2000;Nicotetal.2002;Urbasch1986)。然而這些植物不產生商業(yè)番茄。WO02/085105描述了51./z^rac/zm'to基因組染色體10上的遺傳區(qū)域，據(jù)信其參與^^少^部分抗性。將這個遺傳物質通過漸滲作用栽培番茄品種中顯示出提供對Bo^y^有部分抗性的栽培番茄植物。然而，迄今為止針對提供番茄^^^^抗性的育種技術僅取得有限的成功。目前對于這些不良結果的原因還不清楚。一方面，也許是由于對于^^yfe抗性的遺傳基礎和遺傳性的了解不足所致。另一方面，也許是由于對于育種獲得的番茄植物中Bo^yto抗性水平的評價缺少合適的生物學測定方法所致。所述了解和方法的缺乏也使得在野生品種和后代植物中選擇包含參與SWo;to抗性的基因的植物變得復雜。在先前的研究中，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)番茄中^^7似抗性是多基因遺傳的，這也許部分解釋了培育抗性植物結果不良的原因。本發(fā)明的目的是改良育種的成功性，提供S^^yto抗性的商業(yè)番茄品種。本發(fā)明的另一目的是在商業(yè)番茄品種中提供另外的和/或改良的^^_yto抗性。本發(fā)明的再一目的是提供野生型番茄的基因組中另外的遺傳物質，其與這種植物中的So/0;to抗性相關。這種另外的遺傳物質可用于擴大產生栽培番茄的5Wo;to抗性品種的基礎。發(fā)明概述本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在S./z"6rac^^M基因組中，遺傳物質存在于先前未經鑒別為參與So^yto抗性的許多染色體上。事實上，本發(fā)明人已經成功地鑒別了番茄近緣野生型品系即So/朋ww/7^rac/^'^LYC4/78基因組中的數(shù)量性狀基因座(QTL)。這些另外的QTL通過使用漸滲作用品系發(fā)現(xiàn)。本發(fā)明人隨后通過將這些抗性野生型(供體)番茄品系的植物與非抗性受體番茄植物雜交而能產生^o;船抗性番茄植物。這些植物與迄今為止產生的任何栽培番茄相比呈現(xiàn)更高水平的抗性。現(xiàn)有技術的改良在于另外篩選標準的可用性，通過這些標準可以監(jiān)測和指導育種?？梢赃x擇這樣的抗性野生型So/""wm/^6rac/za//^與易感的栽培番茄的雜交后代植物，其具有與野生型品種中S^o;fe抗性有關的一或多個、或者甚至所有基因組區(qū)域。作為結果，提供了產生番茄植物的方法，通過這種方法可以更好地控制所需的遺傳成分。本發(fā)明方法的優(yōu)勢是在遺傳學意義上，可以產生類似于更接近期望性狀的野生型品種的后代。因此，栽培番茄植物中抗性性狀可以更穩(wěn)定地導入其中，即可以提供評價哪些基因組區(qū)域可以更易于漸滲而哪些難以轉移進入后代植物、哪些基因組區(qū)域是必需的、哪些基因組區(qū)域是協(xié)作性的、及哪些基因組區(qū)域可用于進一步改良栽培番茄部分抗性品系中的抗性水平。通過評價各種漸滲作用品系中So/^y他抗性水平，其中每個品系都具有與供體植物的分子標記的存在相關的來自S./2^rac/zm'toLYC4/78的特異性基因組漸滲，本發(fā)明人能鑒別與抗性野生型番茄品系中Bo^7fe抗性相關的另外的QTL，并從而確定基因組中賦予多重抗性的DNA序列的位置。在下文的描述中，與番茄中SW7fe抗性相關的數(shù)量性狀基因座(QTL)將簡稱為Bo^y^抗性QTL或者Bo^yto抗性相關QTL。在野生型番茄品系S./2a^oc/wtes中發(fā)現(xiàn)了關于5個新的5c^yfe抗性QTL。一個QTL位于染色體4上，先前將其鑒別為具有SWo^s抗性相關的QTL。然而現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)這個染色體上先前鑒別的與所述抗性相關的區(qū)域事實上含有兩個單獨的QTL。另外的QTL在染色體6、9、11和12上鑒別。所述新的QTL均與反映植物降低最初感染建立的能力的數(shù)量參數(shù)相關聯(lián)，該數(shù)量參數(shù)在后文稱作發(fā)病率(DI)參數(shù)，以及與反映植物減緩感染進展的能力的數(shù)量參數(shù)相關聯(lián)，該數(shù)量參數(shù)在后文稱作病斑生長OLesionGrowth,LG)速度參數(shù)。同樣，如現(xiàn)有
技術領域：
所報道，染色體10上QTL的存在不能通過所用方法證實。所有目前檢測的QTL可通過評價BCsSi或BCsS2(回交5，自交一次或兩次)后代中疾病抗性而證實，所述的后代中所研究的QTL是分離的。本發(fā)明第一方面涉及產生^^0^'s抗性番茄植物的方法，所述方法包括10如下步驟a)提供So^y^抗性供體番茄植物，優(yōu)選S./za6rac/^Yes種的So/o^fe抗性植物，更優(yōu)選&/wZ)rac/^'feyLYC4/78品系的Bo^yto抗性植物；b)將所述供體植物的核酸轉移至一或多個BW7他易感受體番茄植物中，優(yōu)選X/ycc^whm種植物中，其中所述轉移導致來自供體植物的遺傳物質被導入所述一或多個易感受體植物的相應基因組區(qū)域中；c)從所述受體番茄植物(或者用所述受體番茄植物獲得的回交植物的另外的自交植物，即在所述轉移后獲得的重組植物)中選擇植物，所選擇的植物在基因組內包含衍生自Bo^yfe抗性供體番茄植物的至少一個So^y^抗性QTL，其中所述選擇包括檢測所述受體番茄植物的染色體4、6、9、11和/或12上與所述至少一個Bo/o;他抗性QTL連鎖的遺傳標記；-其中所述植物的染色體4上所述QTL的位置由包含S./za6rac/za^s的染色體4上的或者6*./少co/^^/wm的染色體4上的、更優(yōu)選由&Zw6rac/z(2/tesLYC4/78的染色體4上的或者&/ycopeAs/cwmcv.Moneymaker的染色體4上的遺傳標記CT50、C2Atlg74970、P14M49-283e、P14M48-74e、P14M50-67e、CT1739和P14M50-85h的基因組區(qū)域指示。在優(yōu)選的實施方案中，所述植物的染色體6上所述QTL的位置由包含51./^6rac/^'tes的染色體6上的或6*./ycopera/cwm的染色體6上的、更優(yōu)選51./za6rac/zm'wLYC4/78的染色體6上的或S./yco/em'cwmcv.Moneymaker的染色體6上的遺傳標記P22M50-188h、P14M48-521e、P15M48-386h、P18M51-199h、P18M51陽103h、P22M50-103e、P18M51-388e、P15M48-395e、P22M50-124e、P14M48-160e和P22M50-513h的基因組區(qū)域指示。在其它優(yōu)選的實施方案中，所述植物的染色體9上所述QTL的位置由包含S./za6rac/w/tey的染色體9上的或51./ycopea/cMm的染色體9上的、更優(yōu)選&/zWrac/w"^LYC4/78的染色體9上的或5".fyco;era/cwmcv.Moneymaker的染色體9上的遺傳標記P18M50-141、P14M49-240、TG254、TG223、TGIO、P18M50-134h、P14M49-243h、P18M50-599、P14M60-222h、P22M51-417h、P14M50-174h、P14M60-157h、P14M60-107h、P15M48陽138h、P14M48畫113h、Tm2a、P18M51-146h、P14M48-282h禾QP14M50-276h的基因組區(qū)域指示。在其它優(yōu)選的實施方案中，所述植物的染色體11上所述QTL的位置由包含S.kz6rac/7a/tes的染色體11上的或5".(yco/em'cww的染色體11上的、更優(yōu)選<S./za6rac/za^sLYC4/78的染色體11上的或S.(ycoperaicMwcv.Moneymaker的染色體11上的遺傳標記P14M60-215e、P14M61-173h、P14M50-307h、TG47、P14M50隱29xCD、P18M51畫358h、P18M50-27xCD、P18M51-136h、P22M50-488h、TG393、P14M61-396h、P22M51陽235h和P22M51-174e的基因組區(qū)域指示。在另外其它優(yōu)選的實施方案中，所述植物的染色體12上所述QTL的位置由包含S.的染色體12上的或S./，印era/cMm的染色體12上的、更優(yōu)選S./7fl6rac/za/feyLYC4/78的染色體12上的或S.cv.Moneymaker的染色體12上的遺傳標記CT19、TG68、P14M48-411e、P18M50-244h、P18M50-273h、P14M61-420h、P14M61-406h、P14M61-223h、P14M60-193h、P22M51-314h、TG565、P14M48-172h、P22M50-321e、P14M60-219e、P14M48-153h、P22M50-97h、TG296、P22M50-131h和P22M51-135h的基因組區(qū)域、優(yōu)選由包含遺傳標記P14M61-420h、P14M61-楊h、P14M61陽223h、P14M60-193h、P22M51-314h、TG565、P14M48-172h、P22M50-321e、P14M60-2X9e、P14M48陽153h、P22M50-97h、TG296和P22M50-131h的基因組區(qū)域指示。包含至少一個S0^7to抗性QTL或者其賦予抗性的部分的核酸的轉移可以通過將所述S0Z7to抗性供體番茄植物與^^7^易感受體番茄植物雜交產生后代植物而非常合適地進行。因此優(yōu)選的選擇方法包括所述漸滲DNA的標記輔助選擇(MAS)(見例如Tanksleyetal.1998)，其中在后代植物中檢測到與所述QTL連鎖的一或多個標記。MAS可例如通過從所述后代植物中分離遺傳物質并且通過分子技術確定其中一或多個供體植物標記的存在而進行?；蛘?，可以使用分子標記檢測方法而不預先分離遺傳物質。任選地，除了標記檢測之外，可以對^)/^他抗性進行表型檢測，以選擇合適的植物。因此，非常合適的檢測是如本文所述的數(shù)量生物測定法，從而確定如發(fā)病率和/或病斑生長速度這12些參數(shù)。來自i5o^y^抗性QTL的至少一個標記的存在組合抗性表型的存在的確定證實提供了包含至少一個QTL或者其賦予So^yto抗性的部分的核酸從供體植物成功轉移至受體植物的證據(jù)。在產生Bo^yfe抗性番茄植物的方法的另一個實施方案中，核酸轉移的證實可以通過轉基因方法(例如通過轉化)、原生質體融合、雙單倍體技術或者通過胚胎拯救技術而可以非常合適地進行。在產生^^y^抗性番茄植物的方法的優(yōu)選實施方案中，所述供體植物是6V/awwm/z^rac/za/toLYC4/78，并且轉移至受體植物中的核酸優(yōu)選包含至少一個Jo/^^抗性QTL，所述QTL選自與So&_yfe抗性相關的Solanumhab腦haitesLYC4/78染色體4、6、9、11禾口/或12上的QTL或者其賦予^^j&抗性的部分。在產生^3/0;&抗性番茄植物的方法的另一個優(yōu)選實施方案中，所述方法包括將所述So/zj^抗性供體番茄植物與Soo^s易感受體番茄植物雜交以產生第一代后代植物；從所述第一代后代植物中選擇在基因組內包含從所述供體番茄植物漸滲作用的核酸的植物，其中所述漸滲作用的核酸包含至少一個本發(fā)明的6o^;to抗性QTL，優(yōu)選兩個、更優(yōu)選兩個以上的QTL，或者其賦予Bo^T他抗性的部分；將所述選擇的后代植物與合適的商業(yè)番茄品系雜交以產生第二代后代植物；從所述第二代后代植物中選擇在基因組內包含從所述第一代后代番茄植物中漸滲作用的核酸，其中所述漸滲作用的核酸包含至少一個本發(fā)明的fio&y他抗性QTL，優(yōu)選兩個或兩個以上的QTL，或者其賦予^^7to抗性的部分，任選地產生進一步的后代植物。所提及的漸滲作用后代植物中的優(yōu)選兩個、更優(yōu)選兩個以上的^^7他抗性QTL可以是針對發(fā)病率的QTL、針對病斑生長速度的QTL，或者這些類型的組合。在最優(yōu)選的實施方案中，步驟c)包括選擇在基因組內包含至少4個So—fe抗性QTL的植物，所述QTL選自與Soo^抗性相關的5b/a冊m/zaZ)rac/^fey、優(yōu)選LYC4/78品系的染色體1、2、4、6、9、11和12上的QTL。另一方面，本發(fā)明涉及通過本發(fā)明方法可獲得的SWo;to抗性番茄植物13或者其部分。本發(fā)明進一步涉及番茄So^;to抗性QTL，其中所述QTL選自與丑o^yfe抗性相關的5Wa"wm/7^rac/^fey、優(yōu)選LYC4/78品系的染色體1、2、4、6、9、11和12上的QTL。這些QTL位于先前不與Bo^y他抗性相關的基因組上的位置。關于這些QTL的詳情在下文詳細描述。由這些QTL指示的基因組位置上存在的等位基因是本發(fā)明的一方面。本發(fā)明的QTL可以是包含所述QTL或者其賦予抗性的部分的分離的、優(yōu)選雙鏈核酸序列形式。非常合適地，例如可分離自合適供體植物染色體的核酸序列的大小可以表示所述染色體上的遺傳距離1-100cM，優(yōu)選10-50cM。所述核酸可包含至少50個、更優(yōu)選至少500個、甚至更優(yōu)選至少1000個、更優(yōu)選至少5000個堿基對。包含本發(fā)明的QTL或其賦予抗性部分的一或多個核酸序列繼而可以包含于核酸構建體中，所述構建體可進一步包含位于所述一或多個核酸序列側翼的區(qū)域，這些區(qū)域能整合進合適的載體中以將所述一或多個核酸序列轉移進合適的S0/7fe易感受體番茄植物中。所述載體可進一步包含合適的啟動子區(qū)域或其它調節(jié)序列。所述QTL也可以是存在于番茄植物基因組中的形式。本發(fā)明的QTL優(yōu)選包含與^)^vfe抗性相關的至少一個標記，優(yōu)選兩個、更優(yōu)選三個、更優(yōu)選四個、更優(yōu)選四個以上的標記，所述標記選自表1-5列出的與所述QTL連鎖的標記。本發(fā)明另一方面涉及檢測So^yto抗性QTL的方法，所述方法包括檢測疑似Boo^抗性番茄植物的染色體4、6、9、11禾B/或12上的Bof^他抗性QTL連鎖的至少一個標記，-其中所述QTL在所述植物的染色體4上的位置由包含S./w^rac/w/fes的染色體4上的或S./少copem'cwm的染色體4、更優(yōu)選的6*./z(36rac/7a/tesLYC4/78的染色體4上的或S./少co;era/cwmcv.Moneymaker的染色體4上的遺傳標記CT50、C2Atlg74970、P14M49-283e、P14M48-74e、P14M50-67e、CT1739和P14M50-85h的基因組區(qū)域指示。在檢測本發(fā)明QTL的方法的一個優(yōu)選實施方案中，所述QTL在所述植物的染色體6上的位置由包含S./7^rac/zates的染色體6上的或X/yco;eM/cMm的染色體6上的、更優(yōu)選的5"./w^rac/wzfesLYC4/78的染色體146上的或&/jcope^/c"wcv.Moneymaker的染色體6上的遺傳標記P22M50-188h、P14M48-521e、P15M48-386h、P18M51-199h、P18M51-103h、P22M50隱103e、P18M51-388e、P15M48-395e、P22M50-124e、P14M48-160e和P22M50-513h的基因組區(qū)域指示。在檢測本發(fā)明QTL的方法的另一個優(yōu)選實施方案中，所述QTL在所述植物的染色體9上的位置由包含&/z^rac/za/fey的染色體9上的或&/jcopem'a^的染色體9上的、更優(yōu)選的5*./z^rac/za/tesLYC4/78的染色體9上的或&(ycopers7'cwmcv.Moneymaker的染色體9上的遺傳標記P18M50-141、P14M49陽240、TG254、TG223、TGIO、P18M50-134h、P14M49-243h、P18M50-599、P14M60隱222h、P22M51陽417h、P14M50-174h、P14M60隱157h、P14M60-107h、P15M48-138h、P14M48-113h、Tm2a、P18M51-146h、P14M48-282h和P14M50-276h的基因組區(qū)域指示。在檢測本發(fā)明QTL的方法的再一個優(yōu)選實施方案中，所述QTL在所述植物的染色體11上的位置由包含S./2^rac/^'tey的染色體11上的或5*.(yco;em'c"m的染色體11上的、更優(yōu)選的S./w6rac/za/tesLYC4/78的染色體11上的或6*.fyco/7erw'cwmcv.Moneymaker的染色體11上的遺傳標記P14M60-215e、P14M61-173h、P14M50-307h、TG47、P14M50-29xCD、P18M51陽358h、P18M50-27xCD、P18M51-136h、P22M50-488h、TG393、P14M61-396h、P22M51-235h和P22M51-174e的基因組區(qū)域指示。在檢測本發(fā)明QTL的方法的又一個優(yōu)選實施方案中，所述QTL在所述植物的染色體12上的位置由包含5"./w&oc/z"/^的染色體12上的或S./_yco;eM/cMm的染色體12上的、更優(yōu)選的5"./w6rac/^'fesLYC4/78的染色體12上的或S./_yco/em'cMWcv.Moneymaker的染色體12上的遺傳標記CT19、TG68、P14M48-411e、P18M50-244h、P18M50-273h、P14M61-420h、P14M61-406h、P14M61-223h、P14M60-193h、P22M51-314h、TG565、P14M48-172h、P22M50-321e、P14M60-219e、P14M48-153h、P22M50-97h、TG296、P22M50-131h禾口P22M51-135h的基因組區(qū)域、優(yōu)選包含6"./zWrac/w"^的染色體12上的或S.(yco/era/ow2的染色體12上的、更優(yōu)選的XZzaZ)rac/za/tesLYC4/78的染色體12上的或S.(ycopew/cwmcv.15Moneymaker的染色體12上的遺傳標記P14M61-420h、P14M61-406h、P14M61-223h、P14M60-193h、P22M51-314h、TG565、P14M48-172h、P22M50-321e、P14M60-219e、P14M48-153h、P22M50-97h、TG296和P22M50-131h的基因組區(qū)域指示。再一方面，本發(fā)明涉及S./FopeM/cwm種的So^yto抗性植物或其部分，在基因組內包含至少一個QTL或其賦予So/o;泡抗性的部分，其中所述QTL選自與5c^o;fe抗性相關的6b/朋wm/w6rac/2a/fey、優(yōu)選LYC4/78品系的染色體4、6、9、11和12上的QTL，其中所述QTL在所述植物的染色體4上的位置由包含包含《S./w6rac/w/to的染色體4上的或5".(ycc^m'cww的染色體4上的、更優(yōu)選的5"./7a6rac/za/feyLYC4/78的染色體4上的或S.(ycopera/cwmcv.Moneymaker的染色體4上的遺傳標記CT50、C2Atlg74970、P14M49陽283e、P14M48-74e、P14M50-67e、CT1739和P14M50-85h的基因組區(qū)域指示，其中所述QTL或者其賦予So/^y船抗性的部分不是在其天然遺傳背景中，且其中所述植物任選進一步包含與So^yto抗性相關的一或多個另外的QTL或其賦予Bo^to抗性的部分，所述QTL選自5b/amw7/^6rac/z(2"es、優(yōu)選&/a"Mm/^6rac/^/fes品系LYC4/78的染色體1、2禾口/或4上的QTL，其中所述植物染色體4上所述另外的QTL的位置由包含5*./za6rac/2a"M的染色體4上的或《S./yeoperw'cwm的染色體4上的、更優(yōu)選S./za6rac/7fl/tesLYC4/78的染色體4上的或S./yeopera/cwwcv.Moneymaker的染色體4上的遺傳標記P18M51-169.5e、P18M51-305.4h、P14M60-262.9e、P14M61-292.7h、TG609、P14M48隱345e、P14M48畫177e和P18M50-147e的基因組區(qū)域指示。另一方面，本發(fā)明涉及產生So^yfe抗性近交系番茄植物的方法。所述方法包括如下步驟根據(jù)上述本發(fā)明方法產生^^7to抗性番茄植物，自交所述植物，使得自所述自交的植物的種子生長為新的植物；從所述新植物中鑒別呈現(xiàn)BWO;似抗性并具有商業(yè)上期望特性的植物，重復自交和選擇步驟，直至產生呈現(xiàn)抗性并具有商業(yè)上期望特性的近交系番茄植物。產生抗性近交系番茄植物的方法可進一步包括選擇呈現(xiàn)BW7&抗性并具有商業(yè)上期望特性的純合近交系番茄植物的另外步驟。16另一方面，本發(fā)明涉及通過本發(fā)明的方法可獲得的So^^to抗性近交系番茄植物或其部分。另一方面，本發(fā)明涉及呈現(xiàn)^^7to抗性的雜交番茄植物或其部分，其中所述雜交番茄植物可通過將通過本發(fā)明方法可獲得的So^y^抗性近交系番茄植物與呈現(xiàn)商業(yè)上期望特性的近交系番茄植物雜交而獲得。本發(fā)明進一步涉及本發(fā)明番茄植物的可再生細胞的組織培養(yǎng)物。在這種組織培養(yǎng)的一個優(yōu)選實施方案中，已經自組織中分離的細胞或所述細胞的原生質體選自葉、花粉、胚(embryo)、根、根尖、花藥、花、果實、莖和種子。本發(fā)明進一步涉及選自表1-5列出的標記在檢測本發(fā)明^^7to抗性QTL和/或在檢測^W"他抗性番茄植物中的應用。本發(fā)明方法中使用的So^yfe抗性供體番茄植物優(yōu)選選自Aycopera'co"c6(ZS7yb^mg、Z/_ycc|p6^s/cowc/zeesmawz'/、i^ycopg^s/cowc/h'/6mx￡、Z^ycopg^s/cowc/zm/e/e酉f、Z/_ycopera/cow(ycopera/cwm，Z/_ycopers7'co"/2a6rac/20/tes、Z^coperw'co"http://mp/"e〃zyb//MW,5V/a"w附(ycoperw'co/cfes，更"[尤選野生型番燕用作供體植物。特別優(yōu)選的供體植物是6b/am/m/z^rac/za/^，尤其是5b/aw扁/7a6rac/za/feyLYC4/78。本發(fā)明方法中使用的^"to易感受體番茄植物優(yōu)選是5b/am/m(yco/e^/cwm種植物，更優(yōu)選是具有商業(yè)上希望的特性的S./_yco/erw'CMm栽培種，或者另一種商業(yè)番茄品系。附圖簡述圖1示出了源自S./7^rac/z^toLYC4/78的及czV^rea抗性數(shù)量性狀基因座(QTL)的位置及代表染色體4的連鎖圖(推定的QTL位置以黑色部分示出)。圖位置以cM表示。該數(shù)據(jù)可以推定鑒別兩個單獨的QTL，一個以標記TG62為中心分布(見實施例l)并在實施例4中的IL4-1中鑒別，另一個與其分開，不包括標記TG62而是以標記P14M49-283e為中心分布，在實施例4中的IL4-3中鑒別。在染色體4上檢測到的QTL既降低病斑生長速度也降低發(fā)病率。AFLP標記的代碼在表1中詳述。本發(fā)明圖中說明的與QTL相關的所有標記可單獨以及組合用作標記。圖2示出了源自S./z^rac/^'fesLYC4/78的5.c/"erea抗性數(shù)量性狀基因座(QTL)的位置及代表染色體6的連鎖圖(推定的QTL位置以黑色部分示出)。在染色體6的QTL既降低病斑生長速度也降低發(fā)病率。圖3示出了源自S./za6rac/zmfesLYC4/78的及"'werea抗性數(shù)量性狀基因座(QTL)的位置及代表染色體9的連鎖圖(推定的QTL位置以黑色部分示出)。在染色體9上的QTL既降低病斑生長速度也降低發(fā)病率。該圖進一步示出了IL品系11-2和12-3的染色體9上的漸滲作用。圖4示出了源自S./w6rac/2a"MLYC4/78的及c/"e^a抗性數(shù)量性狀基因座(QTL)的位置及代表染色體11的連鎖圖(推定的QTL位置以黑色部分示出)。在染色體11上的QTL既降低病斑生長速度也降低發(fā)病率。所述連鎖圖代表實施例4的IL品系11-2。圖5示出了源自S./w6rac/^//esLYC4/78的5.c/werea抗性數(shù)量性狀基因座(QTL)的位置及代表染色體12的連鎖圖(推定的QTL位置以黑色部分示出)。在染色體12上的QTL既降低病斑生長速度也降低發(fā)病率。圖6示出了用于獲得如實施例4所述漸滲作用在S.(ycopwsz'CMmcv.Moneymaker遺傳背景中的S./2Wrac/7a/fesLYC4/78IL群的回交和選擇策略。圖7示出實施例4中使用的S.(yco/era/cwwcv.MoneymakerxX/^6rac/za//^LYC4/78漸滲作用品系群的基因型圖示。根據(jù)F2遺傳連鎖圖，所有染色體均以20cM節(jié)段刻度繪圖。一些區(qū)域被加入到染色體3、4、5和9的末端(CAPS標記)。來自5*./za6rac/w/tes的純合漸滲作用以黑色表示，雜合漸滲作用以斜紋模式表示(灰色)。圖8示出了源自51./7Wrac/7a/teyLYC4/78的5.c/"e"a抗性數(shù)量性狀基因座(QTL)的位置及代表染色體1、2和4的連鎖圖，并示出本申請中描述的QTL為QTL-lh、QTL-2h和QTL-4hA。發(fā)明詳述定義如本文所用，術語"^o/o^s"是指灰葡萄孢菌(5o&少toc/wewa義也稱作灰色霉菌或灰色斑，是在番茄的莖、葉和果實上常見的疾病。一般認為植物病原性真菌Sc/er加'm'o"/era^n^具有與及c/"ewa相似的感染機制(Prinsetal.,2000)。盡管番茄中<S.sc/era"on/m感染的經濟學重要性遠遠低于S."'wwm感染，但是這兩種真菌均分泌一系列蛋白酶、植物細胞壁降解酶、毒素以及草酸。已知這些因素中的一些在這兩種真菌感染中起作用。結果，據(jù)信賦予Botrytis抗性的機制和基因在提供抗S."/m^'or謂感染中同樣有效。因此，當文中提及"5^^yto抗性"時，這種抗性應理解為包括對于5Wera"m'aceae科任何真菌的抗性，優(yōu)選對于&w/era/Zon/w禾卩及"'werea的抗性，更優(yōu)選對于及"Veraa的抗性。如本文所用，術語"等位基因"是指基因的任一或多種可選形式，所有這些等位基因均涉及至少一種性狀或特性。在二倍體細胞或生物體中，給定基因的兩個等位基因占據(jù)一對同源染色體的相應基因座。由于本發(fā)明涉及QTL，即可包含一或多個基因而且也可包含調節(jié)序列的基因組區(qū)域，因此在一些情況中更精確地稱作"單元型"(即染色體節(jié)段的等位基因)代替"等位基因"然而，在這些情況中，術語"等位基因"應理解為包含術語"單元型"。如本文所用，"基因"是指由占據(jù)染色體上特定位置的DNA序列組成的遺傳單位，其含有生物體中特定特性或性狀的遺傳信息。如本文所用，"基因座"是指給定基因占據(jù)的給定物種染色體上的位置。如本文所用，術語"雜合"是指當不同的等位基因位于同源染色體的相應基因座上時的遺傳情形。如本文所用，術語"純合"是指當相同等位基因位于同源染色體上相應基因座時的遺傳情形。如本文所用，術語"雜種"是指兩個遺傳不相似的個體之間雜交的任何后代，包括但不限于兩個近交系之間的雜交。如本文所用，術語"近交系"是指基本純合的個體或品系。在本申請中，"重組事件"是指減數(shù)分裂交換。19如本文所用，術語"漸滲作用"是指通過雜交使得一個物種、品種或栽培種的基因移動至另一物種、品種或栽培種的基因組中的天然和人工過程。該過程可任選通過與回歸親本回交而完成。如本文所用，"遺傳工程化"、"轉化"和"遺傳修飾"是指將分離及克隆的基因轉移至另一生物體的DNA、通常為染色體DNA或基因組中。如本文所用，術語"分子標記"是指觀測核酸序列特征中的差異的方法中使用的標識物。這種標識物的例子是限制片段長度多態(tài)性(RFLP)標記、擴增片段長度多態(tài)性(AFLP)標記、單核苷酸多態(tài)性標記(SNP)、微衛(wèi)星標記(例如SSR)、序列特征性擴增區(qū)(SCAR)標記、酶切擴增多態(tài)性序列(CAPS)標記或者同工酶標記或者本文所述定義特定遺傳和染色體位置的這些標記的組合。術語"抗性"涵蓋了對于感染的部分和完全抗性。Boo;他易感的番茄植物可以是對于Bo^y似感染的無抗性或者低水平抗性。如本文所用，術語"植物的部分"是指番茄植物的部分，包括單細胞和細胞組織培養(yǎng)物，如從中可以再生番茄植物的植物中完整的植物細胞、細胞叢和組織培養(yǎng)物。植物的部分的例子包括但不限于來自花粉、胚珠、葉、胚、根、根尖、花粉囊、花、果實、莖和種子的單細胞和組織；以及花粉、胚珠、葉、胚、根、根尖、花粉囊、花、果實、莖、幼芽和種子；以及花粉、胚珠、葉、胚、根、根尖、花粉囊、花、果實、莖、幼芽、根莖、種子、原生質體、愈傷組織等。如本文所用，術語"群"是指共有共同的遺傳變異的植物的遺傳異質隹A朱no如本文所用，術語"番茄"是指已知在Z;yc印eM/""屬名稱下的任何植物、品系或群，包括但不限于i^ycopera/cowcerawybme、Z^ycopera/co"escw/ewZM附卩I見在禾爾{乍5b/aww附/少co/e^s/cwm)、丄ycoperw'co"/w>sm^w、Z^coperw'co"卩/，/"6〃一//應或者5b/""謂/少copera'co/cfes。最近提議Z^ycopera/cowescw/ew似w的學名為5b/am/w/_ycopera/cwm。相似地，野生物禾中白勺名稱可以改變。丄，/ew"e〃W已經變?yōu)?b/awww;e"we〃W，丄./n>ra/ww可為S./za6rac/za/fes，丄.perwv/a"ww可以分為5".W_perwWa/wm'禾口》S.'Ca〃e乂owcfe//i^y/^s^X/erwv/aww附禾口S,corwe/z'cwMW/en',//./xarv^/7orw附可為S."eon'ch7，丄.c/zm/e/en^h7可為》S.c/zm/e/evraAi/，丄.c/n7ewse可為》S.c/w7e"se，丄.c/2ee纖朋/ae可為》S.c/zee纖am'ae或5".g"—及丄.可為5*.//，/"函/。//調(SolanaceaGenomeNetwork(2005)SpoonerandKnapp;http:〃www.sgn.comell.edu/help/about/solanumnomenclature.html)。尤為指出的是S./w&oc/^'tes可以被認為是具有多毛果實的番茄物種，而S./yc印ea/c"m是具有無毛果實的番茄物種。如本文所用，術語"品種"或"栽培種"是指一組相似的植物，通過結構或遺傳特征和/或性能而可以與相同物種內其它品種相區(qū)分。如本文所用，術語"QTL"具有本領域公認的含義。術語"與番茄中及"'"w"抗性相關的QTL"以及較短的術語"^"to抗性QTL"是指位于番茄特定染色體上與編碼So^y他抗性的至少一個基因相關的區(qū)域或者至少調節(jié)區(qū)域，即控制參與So^yto抗性的一或多個基因表達的染色體區(qū)域。所述基因的表型表達可以例如是觀測到病斑生長速度降低和/或發(fā)病率降低。QTL可例如包含其產物賦予遺傳抗性的一或多個基因?；蛘?，QTL可例如包含其產物影響植物基因組中其它基因座上的基因表達、從而賦予So^y船抗性的基因或序列。本發(fā)明的QTL可以通過使用一或多個分子基因組標記標示其在各自的野生番茄基因座中的遺傳位置而限定。隨之，一或多個標記標明特異基因座?；蜃g的距離通常通過相同基因座上基因座之間的互換頻率而測量。兩個基因座的距離越遠，則它們之間更可能發(fā)生互換。反之，如果兩個基因座較近，則它們之間不太可能發(fā)生互換。通常，一厘摩(cM)等于基因座(標記)之間1%重組。當QTL可以由多個標記標示時，端點標記之間的遺傳距離以QTL的大小標示。如本文所用，術語易感受體番茄植物"是指接受得自包含50^y他抗性QTL的供體番茄植物的DNA的番茄植物。所述"So"fe易感受體番茄植物"可以包含或者不包含一或多個Bo^yfe抗性QTL，在這種情況中該術語表示接受另外的QTL。如本文所用，術語"天然遺傳背景"是指QTL的原始遺傳背景。這種背景可例如是抗性番茄的基因組。例如，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的QTL在&/am/m/za6rac/^^LYC4/78的染色體4、6、9、11和12的特定位置上。例如，ZaZ)rac/za/fesLYC4/78代表5b/awwm/za6rac/7a/tesLYC4/78的染色體4、6、9、11禾n12上QTL的天然遺傳背景。同樣，So/朋wm/w6rac/z"/tesLYC4/78代表所述QTL的天然遺傳背景。相反，包括將包含所述QTL或其賦予抗性的部分的DNA從5b/"/^w/^Zwc/w/fesLYC4/78的染色體4轉移至另一番茄物種、特別是S.(ycoj^M/wm的染色體上相同位置的方法將導致QTL或者其賦予所述抗性的部分不在其天然遺傳背景中。如本文所用，術語"發(fā)病率"是作為參數(shù)，反映植物降低感染的建立的能力，可例如通過確定當與感染因子接觸時實現(xiàn)成功感染而確定。術語"病斑生長速度"或者"病斑生長"在本文用作參數(shù)，反應植物減緩或降低感染進展的能力，可例如通過確定擴大的病斑生長速度而確定。術語"定量確定"在本文是指以包括測量、特別是關于量和數(shù)的測量進行確定或評定。關于嚴重性程度和表示更大、更多、更少或者等于或增加或降低量級的確定不包含在術語"定量確定"中，該術語最后是指確定絕對值的客觀計數(shù)機制的存在。因此"定量確定發(fā)病率和/或病斑生長速度"優(yōu)選包括確定植物與感染因子之間所有潛在感染性接觸導致可測量的病斑的百分比(以評定發(fā)病率)，和/或確定在適合真菌生長條件下所述病斑的直徑、周長、表面積或體積隨著時間的增加(以評定病斑生長速度)。術語"標準實施條件"、"標準溫室條件"和"標準條件"是指為了疾病抗性表型鑒定而作為標準的植物生長或保溫的光、濕度、溫度等條件。例如對于溫室而言，這個條件是指16小時光照/天，15-25°C。更通常地，該術語是指標準和參考生長條件8-24小時光周期(光合作用光合光量子通量(PPF)為50-lOOOpmolm—2s")，優(yōu)選光周期為16小時光照和8小時黑暗，氣溫為大約19"C/白天及15。C/夜間，水汽壓為大約4.4gm—3，相應于相對濕度(RH)為大約60%-85%，600-700ppmC02和大氣02濃度以及大氣壓(通常為1008hPa)。水和營養(yǎng)物質可以在莖附近點滴給予，或者以噴霧或薄霧形式給予。標準的生物測定實驗條件如莖病斑長度測定、發(fā)病率和病斑生長22速度測量等在下文實施例中進一步闡述。更詳細地，平均莖病斑長度測定如實施例3.10和3.11所述進行。番茄中So^rfe抗性相關的OTL的鑒別已知野生型番茄物種提供了疾病和有害物抗性性狀的合適來源，且已經證實了野生型番茄物種的葉中及"'"erea部分抗性的存在(Urbasch,1986)。過去有兩個因素妨礙番茄中及"'"ewa抗性的培育。首先是商業(yè)培育的品系中的交叉部分抗性限制了成功。其次，缺乏鑒別和定位與賦予抗性相關的遺傳物質的可靠及可再現(xiàn)的疾病測定方法。例如，Urbasch(Urbasch,1986)使用菌絲體感染葉，使用為真菌提供過量營養(yǎng)物質的瓊脂塞(plugs)，其明顯影響感染過程。其它研究人員使用主觀的植物疾病指數(shù)，不適于鑒別數(shù)量性狀基因座(QTL)所需的數(shù)量分析。相對充分地進行了實驗室條件下5b/a"wmfyco/eAy/cMm中Sofr;;fec/"e"a感染的研究(例如Benitoetal.,1998)。懸滴接種葉并隨后在中等溫度(15-2(TC)保溫導致接種體部位壞死病斑的快速(感染后16-24小時(hpi))發(fā)生與發(fā)展。在此點感染暫時受限大約48小時。從此，一定比例的病斑(通常為5-10%)開始擴大。稱作"擴大的病斑"的這些生長物伴隨真菌生物量的增加并導致在隨后的48小時內全部小葉的定植。本發(fā)明人先前發(fā)現(xiàn)當使用測量抗性的生物測定方法時，可以鑒別番茄中與5W7似抗性相關的特異QTL，其中感染進展速度和/或當與感染因子接觸時實現(xiàn)感染成功的比率是對番茄植物的部分、優(yōu)選對于分離部分、更優(yōu)選對于莖節(jié)段進行定量測量的。另外，可以使用實施例4所述檢測方法，其中研究完整植物的抗性，且其中莖是經機械損傷的，將5c^y他接種體應用于損傷處在使用漸滲作用品系時，每個品系含有S./_ycope"/cMmcv.Moneymaker背景中S./z^rac/za/tesLYC4/78基因組的特異漸滲作用節(jié)段，令人驚奇地，本發(fā)明人能揭示S./z^rac/^'tesLYC4/78中與So^yfe抗性相關的另外的QTL。因此，本發(fā)明提供了一種產生^^yfe抗性的栽培番茄植物的方法，所述方法包括-產生一系列栽培番茄的漸滲作用品系，其中每個漸滲作用品系含有來自5o"to抗性野生型番茄、優(yōu)選/zWrac/^toLYC4/78的特異基因組漸滲作用(染色體區(qū)域)，該系列一起覆蓋了所述抗性野生型番茄的基因組；-通過進行測量每個所述個體漸滲作用品系植物中抗性的定量生物測定法鑒別每個個體漸滲作用品系植物中的Bo^yfe抗性相關的QTL，優(yōu)選通過測量發(fā)病率和/或病斑生長速度，并確定使觀測到的So^y^抗性與所述漸滲作用品系中染色體標記的存在連鎖的遺傳連鎖圖，并將所述連鎖圖上與增強的抗性(例如降低的發(fā)病率和/或降低的病斑生長速度)連鎖的連續(xù)標記指定給數(shù)量性狀基因座；-使用含有與Bo/o^抗性相關的QTL的漸滲作用品系生產他抗性栽培番茄植物，或者使用在疑似SWo;fe抗性番茄植物的標記輔助選擇中鑒別的QTL標記信息。令人驚奇地發(fā)現(xiàn)在So^yfe抗性番茄植物的基因組中存在多個So^y他抗性QTL，而現(xiàn)有
技術領域：
中的方法導致在染色體l、2、4和IO上試驗性地鑒別QTL。此外，通過使用本發(fā)明的方法發(fā)現(xiàn)的QTL位于先前未與番茄植物Bo^y^抗性相關聯(lián)的染色體上，即使在使用相似的遺傳背景時也如此(WO02/085105)。因此，本發(fā)明的方法提供了關于IL可以導致對番茄中抗性的遺傳起源的更詳細的研究，且可以鑒別參與先前未鑒別的這種抗性的染色體物質。本發(fā)明的檢測與番茄So"to抗性相關的數(shù)量性狀基因座(QTL)的方法，除了鑒別或定位數(shù)量性狀基因座(QTL)之外，還需要(部分)番茄植物的可用性。這種植物可以通過本領域已知的任何方式及通過使用確定所述植物中所述(部分)抗性的存在的任何方法提供。提供(部分)Sor;;to抗性番茄植物(其在本發(fā)明的方法中進一步作為供體植物)使得可以為所述植物的至少一個染色體、但優(yōu)選所有染色體確定或提供染色體標記，優(yōu)選AFLP、CAPS禾口/或SCAR標記，最優(yōu)選CAPS禾口/或SCAR標記。通過確定全長的所述染色體的染色體標記集合，可以有效標記所述染色體的各個位置。這種方法為本領域所熟知，例如在下文詳細描述的方法。本發(fā)明的檢測與番茄5^o;^抗性相關的數(shù)量性狀基因座(QTL)的方法可包括測量植物^^yfe抗性的步驟。為此，將植物與感染量的So^fe接觸。這個量在檢測的植物之間及真菌之間可以變化。通常所述真菌的大約1-10至大約500-5000分生孢子的量是足夠的。測量抗性可包括定量確定植物中發(fā)病率和/或病斑生長速度。將植物與感染量的^^Jto接觸及定量確定所述抗性的步驟優(yōu)選作為抗性生物測定的一部分進行，如本文所述對莖節(jié)段或葉進行的抗性生物測定，優(yōu)選如實施例4所述對莖、更優(yōu)選對整個植物進行的抗性生物測定。本領域技術人員將理解可以對下文所述的這些測定進行變化。對莖節(jié)段進行的抗性生物測定可以如下所述進行首先，種植后代植物的種子并生長為合適的高度為大約50cm的秧苗/植物。去除植物上部5-10cm及下部5-10cm的莖，剩余的30cm可以切割為5-6cm的相等節(jié)段。所述莖節(jié)段優(yōu)選垂直置于網格中，莖基底部置于濕的濾紙上。在接種之前，為莖節(jié)段適當噴水以保證接種體等同分布于創(chuàng)傷表面。然后每個莖節(jié)段接種S.c^er^分生孢子懸浮液。將適量接種體施加于每個莖節(jié)段的頂部，例如一滴大約5)al，包含大約106個分生孢子/1111。然后將所述莖節(jié)段在合適的大約16'C溫度、優(yōu)選在黑暗中、及優(yōu)選高濕度(例如100。/。RH)條件下保溫。感染進展情況可以通過測量在接種Verniercaliper之后不同時間間隔的腐爛癥狀的最大進展而定量確定。在感染后一些合適的時間間隔(hpi)，例如96、120和144小時，以定量的方式檢查莖的病斑形成情況(發(fā)病率)和病斑生長情況。非常合適的參數(shù)包括測量病斑的大小，例如通過使用卡尺測量。為了校正由于季節(jié)或植物栽培導致的變化，生物測定的定量測量可以與易感對照品系或參考品系中的相應測量相關聯(lián)。發(fā)病率可以適當?shù)赝ㄟ^用擴大的病斑總數(shù)除以懸滴接種總數(shù)而確定。然后用特定基因型上擴大病斑的比例除以在對照或參考基因型中觀測到的擴大病斑的比例，以百分比表示?；蛘呋蛘吡硗?，病斑生長速度可以通過計算在適當時間例如24小時期間病斑大小(例如mm)的增加而確定。定量分析中可刪除未擴大的病斑的數(shù)據(jù)。然后用獲得的病斑生長速度除以在對照或參考基因型中觀測到的病斑生長速度，以百分比表示或者以絕對數(shù)值例如毫米(mm)表示?；蛘撸梢酝ㄟ^如下所述葉感染生物測定法篩選植物首先，種植番茄種子并使其生長成秧苗/植物。對于每個植物，可以從主莖切下一或兩片葉，將其移至預濕的種花泡沬(floristfoam)中。然后將該種花泡沫置于含有自來水的皮氏培養(yǎng)皿中，隨后置于含有濕濾紙的噴霧濕潤的容器中。包含及c/^r^分生孢子的合適接種體可以通過本領域已知的方法制備，例如Benitoetal.，1998所述方法。然后將5."力w^分生孢子懸浮液懸滴于復葉的上表面上進行接種，適當例如6-10滴，每滴2^1。然后將容器密閉，在合適的15-2(TC溫度之間、優(yōu)選于黑暗中及優(yōu)選在高濕度條件下保溫所述葉。在一些合適的時間間隔，例如96、120和144hpi，以如上針對莖生物測定所述的定量方式檢査所述葉的發(fā)病率和病斑生長情況。本發(fā)明的檢測番茄中與^^t似抗性相關的數(shù)量性狀基因座(QTL)的方法包括確定遺傳連鎖圖并將所述連鎖圖上與增強的抗性相關聯(lián)的連續(xù)標記指定給數(shù)量性狀基因座的步驟，所述連鎖圖將觀測到的抗性與供體番茄植物的染色體標記在IL受體植物中的存在聯(lián)系在一起。將觀測到的抗性與供體番茄植物的染色體標記在IL受體植物中的存在聯(lián)系在一起的遺傳連鎖圖可以通過本領域已知的任何方法確定。技術人員已知鑒別與抗性數(shù)量性狀基因座(QTL)相關的分子標記并將這些標記作圖為遺傳連鎖圖的方法(見例如Baietal.,2003;Fooladetal.,2002;vanHeusdenetal.，1999)。Bo^fe抗性表型與標記基因型之間的關聯(lián)可以通過使用軟件包如JoinMap⑧和MapQTL(見實施例)或者可以進行方差分析的任何標準統(tǒng)計學軟件包進行。分子標記可用于構建遺傳連鎖圖及鑒別J5o/^似抗性數(shù)量性狀基因座(QTL)。合適類型的分子標記和獲得其的方法在下文詳細描述。分子標記和OTL分子標記用于觀測核酸序列中的差異。這種觀測由于DNA-DNA雜交技術(RFLP)和減由于使用聚合酶鏈反應技術(例如STS、微衛(wèi)星、AFLP)而可行。兩個親本基因型之間的所有差異基于這些親本基因型的雜交而在作圖群(例如Bd，F(xiàn)2;見圖2)中分離?？梢员容^不同標記的分離并可以計算重組頻率。不同染色體上分子標記的重組頻率通常為50%。在位于相同染色體上的分子標記之間，重組頻率依賴于標記之間的距離。低重組頻率相應于染色體上標記之間的距離較短。對比所有的重組頻率將導致染色體上分子標記的最合理的順序。這種最合理的順序可以在連鎖圖中描述(Paterson1996)。所述連鎖圖上與降低的發(fā)病率和/或降低的病斑生長速度相關的一組相鄰或連續(xù)的標記定位QTL的位置。當鑒別了QTL時，所述QTL作用(抗性)可例如通過評定針對QTL分離的BC2S,后代中的So^yto抗性而證實。Bo^yfe抗性的評定可以適當?shù)赝ㄟ^使用本文所述的莖或葉生物測定法進行。通過使用本發(fā)明方法可獲得的番茄^^y^抗性QTL是本發(fā)明的一方面。這種QTL的特性是，當存在于植物中時所述植物與感染量的^^r^材料接觸時它們指示降低的發(fā)病率和/或降低的病斑生長速度，所述材料可以任何形式如分生孢子或菌絲體形式提供。本發(fā)明還涉及番茄中的Bo"^抗性QTL，其中所述QTL選自與Bo^yto抗性相關的So/am/wAa^oc/^fesLYC4/78染色體4、6、9、11和12上的QTL。這些QTL可以通過表1-5中列出的標記更清晰地闡述或說明。在這些表中，QTL所在的基因組區(qū)域由列出的AFLP標記表示。本發(fā)明的QTL包含與賦予番茄植物中(部分)So^y他發(fā)病率和/或降低的So/o;fe病斑生長速度相關的DNA形式的遺傳信息。所述遺傳信息可例如包含基因或調節(jié)元件。表1:在<S.(yc(pens/c讓cv.Moneymaker與》S,/za6rac/2a/fesLYC4/78雜交后代的染色體4上發(fā)現(xiàn)的QTL及相關的定量抗性信息。易感的S.Z^copens/cm柳cv.Moneymaker植物示出平均病斑生長速度為4.6mm/天，平均發(fā)病率為73±6.4%(見表8和9)。27<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>表3:在/少cope^c謂cv.Moneymaker與6"./2a6rac/7a^LYC4/78雜交后代的染色體9上發(fā)現(xiàn)的QTL及相關的定量抗性信息。易感的XI^cc^erafcwwcv.Moneymaker植物示出平均病斑生長速度為4.6mm/天，平均發(fā)病率為73±6.4%。見表1備注。<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>'TG254:見表22;2TG223:見表23;3TG10:見表17;4Tm2a:見表18或者Sorbir,O.T.etal.(2000)。表4:在&/ycopem'c誦cv,Moneymaker與5"./7a6rac/^/toLYC4/78雜交后代的染色體11上發(fā)現(xiàn)的QTL及相關的定量抗性信息。易感的&Z^co/era/c"wcv.Moneymaker植物示出平均病斑生長速度為4.6mm/天，平均發(fā)病率為73±6.4%。見表1備注。標記物"染色體病斑生長速度2發(fā)病率2(mm/夭)(%)QTL-llhPMM60-215eP14M61.173hP14M50-307hTG47PUM50-29xCDP18M51-338hP18M50-27xCDP18M51-136hP22M50-488hTG393Pl德l-396hP22M31-23&hP22M51-174e113'234±6,4TG47:見表24;2TG393:見表25。表5:在6*.(yco/em'c訓cv.Moneymaker與6*./^rac/za/toLYC4/78雜交后代的染色體12上發(fā)現(xiàn)的QTL及相關的定量抗性信息。易感的X丄少co;e"/cwmcv.Moneymaker植物示出平均病斑生長速度為4.6mm/天，平均發(fā)病率為73±6.4%。見表1備注。QTL標記物〖*染色體病斑生長速度2發(fā)病率2(mmy夭)QTL-12hCT19122,324±8.6TG68P14M格411eP18M50-244hP18M50-273hP14M61-420hPl德l-406hPUM61扁223hP14M60-193hP22M51-314hTG565P14M48-172hP22M50-321eP固60-219eP14M48-153hP22M50-97hTG2郎P22M5(M31hP22M51-133hCT19:見表26;2TG68:見表27;TG565:見表28;TG296:見表29。最可靠地，QTL-4hA所在基因組區(qū)域位于標記P18M51-156h與C2_Atlg74970之間(表14)，如圖1所示。因此，位于該區(qū)域內的任何標記以及基于可公開獲得的信息而已知位于該區(qū)域內的任何標記均可用于評定植物基因組中QTL的存在，所述可公開獲得的信息例如共有圖譜Tomato-EXPEN1992(Tanksleyetal，1992)、Tomato畫EXHIR1997(BemacchiandTanksley,1997)、Tomato-EXPEN2000(Fultonetal,2002)或者30Tomato-EXPIMP2001(GrandilloandTanksley，1996;Tanksleyetal.1996,Doganlaretal.2002)。最可靠地，QTL-4hB所在的基因組區(qū)域位于標記CT50(表13)與P14M50-85h之間，如圖1所示。因此，位于該區(qū)域內的任何標記以及基于可公開獲得的信息而已知位于該區(qū)域內的任何標記均可用于評定植物基因組中QTL的存在。最可靠地，QTL-6h所在的基因組區(qū)域位于標記P22M50-188h與P22M50-513h之間，如圖2所示。因此，位于該區(qū)域內的任何標記以及基于可公開獲得的信息而已知位于該區(qū)域內的任何標記均可用于評定植物基因組中QTL的存在.最可靠地，QTL-9h所在的基因組區(qū)域位于標記P18M50-141與P14M50-276h之間，如圖3所示。因此，位于該區(qū)域內的任何標記以及基于可公開獲得的信息而已知位于該區(qū)域內的任何標記均可用于評定植物基因組中QTL的存在。最可靠地，QTL-llh所在的基因組區(qū)域位于標記P14M60-215e與P22M51-174e之間，如圖4所示。因此，位于該區(qū)域內的任何標記以及基于可公開獲得的信息而已知位于該區(qū)域內的任何標記均可用于評定植物基因組中QTL的存在。最可靠地，QTL-12h所在的基因組區(qū)域位于標記P14M61-420h與P22M50-131h之間，如圖5所示。因此，位于該區(qū)域內的任何標記以及基于可公開獲得的信息而已知位于該區(qū)域內的任何標記均可用于評定植物基因組中QTL的存在。優(yōu)選地，本發(fā)明的QTL包含與所述QTL相關的表1-5列出的至少一個標記。因為與賦予^^y^抗性相關的QTL的核酸序列可以僅是本發(fā)明鑒別的全部QTL的部分，因此標記僅表示遺傳區(qū)域的連鎖遺傳或者在這個遺傳區(qū)域中不存在觀測到的重組。因此，需要指出的是表l-5列出的標記表示特定&/fl"Mm品系的基因組中本發(fā)明的QTL所位于的染色體區(qū)域，且這些標記不必限定QTL的邊界或結構。因此，包含必需的賦予抗性的核酸序列的QTL部分可以小于針對特定QTL列出的連續(xù)標記。這個部分在本文稱作QTL的"賦予抗性的部分"。結果是QTL的賦予抗性的部分不必包含任何所述列出的標記。其它標記也可以用于表示各個QTL，只要這種標記與QTL遺傳連鎖即可，本領域技術人員可發(fā)現(xiàn)或使用與本發(fā)明的那些QTL類似的QTL，但是其中不存在表1-5列出的且表明與所述QTL連鎖的一或多個標記。番茄中的^^_y&抗性QTL的賦予萬o^y他抗性部分可以通過使用分子標記技術鑒別，例如使用表1-5列出的與所述QTL連鎖的一或多個標記進行，優(yōu)選組合抗性生物測定法進行。不包含本發(fā)明QTL的^^;;^賦予抗性的部分的番茄植物對于So/^fe感染相對易感。本發(fā)明提供的標記可以非常適用于檢測疑似5W^y他抗性番茄植物中本發(fā)明的一或多個QTL的存在，且因此可用于包括So^j^抗性番茄植物的標記輔助育種和選擇方法中。優(yōu)選地，檢測本發(fā)明的QTL的存在是使用表1-5列出的與所述QTL連鎖的至少一個標記進行。本發(fā)明另一方面因此涉及檢測So^y^抗性QTL存在的方法，包括檢測疑似i5o^他抗性番茄植物中所述QTL的核酸序列的存在情況，其存在可以通過使用所述標記檢測。本發(fā)明QTL的核酸序列可以通過本領域技術人員己知的方法確定。例如，包含所述QTL或其賦予抗性的部分的核酸序列可以分離自5w^yto抗性供體植物，通過使所述植物基因組片段化及選擇具有表示所述QTL的一或多個標記的那些片段而進行。隨后或者可供選擇地，表示所述QTL的標記序列(或其部分)可以用作(PCR)擴增產物，以從得自所述植物的基因組核酸樣品或者基因組片段中擴增包含所述QTL的核酸序列。然后可以純化擴增的序列以獲得分離的QTL。所述QTL的核苷酸序列和/或包含于其中的任何其它標記可以通過標準測序方法獲得。本發(fā)明因此還涉及包含本發(fā)明QTL或其賦予J5c^t^抗性的部分的分離的核酸序列(優(yōu)選DNA)。因此，指出本文所述各個QTL位置的標記可用于從番茄中鑒別、分離和純化編碼5o^yto抗性的一或多個基因。本發(fā)明QTL的核苷酸序列也可以例如通過如下方式而分辨確定與所述QTL相關的一或多個標記的核苷酸序列，設計所述標記序列的內在引物，隨后用于進一步確定所述標記序列外面的QTL序列。例如，表l-5列出的標記AFLP的核苷酸序列可以通過如下方式獲得從用于確定植物棊因組中所述標記存在情況的電泳凝膠中分離所述標記，并通過例如本領域熟知的雙脫氧鏈終止方法確定所述標記的核苷酸序列。在檢測疑似^^7^抗性番茄植物中QTL存在情況的這種方法的實施方案中，所述方法也可以包括如下步驟提供能在嚴格雜交條件下與所述QTL連鎖的標記、優(yōu)選選自與所述QTL連鎖的表1-5列出的標記的核酸序列雜交的寡核苷酸或者多核苷酸，將所述寡核苷酸或多核苷酸與疑似5W/7他抗性番茄植物的基因組核酸雜交，并確定所述寡核苷酸或多核苷酸與所述基因組核酸的特異性雜交的存在情況。優(yōu)選所述方法是針對得自所述疑似S^O;fe抗性番茄植物的核酸樣品進行，但是也可以應用原位雜交方法。或者，在更優(yōu)選的實施方案中，技術人員一旦確定了QTL的核苷酸序列，則可以設計能在嚴格雜交條件下與所述QTL的核酸序列雜交的特異性雜交探針或寡核苷酸，并且可以使用這種雜交探針檢測疑似^^7fe抗性番茄植物中本發(fā)明QTL的存在情況。短語"嚴格雜交條件"是指在這個條件下探針或多核苷酸將典型地與核酸的復雜混合物中的靶序列雜交，而基本上不與其它序列雜交。嚴格條件是序列依賴性的，且在不同環(huán)境中是不同的。較長的序列在較高溫度特異性雜交。關于核酸雜交的指導見Tijssen(Thijssen，1993)所述。通常地，嚴格條件是在指定離子濃度pH條件下選擇低于特異序列熱解鏈點(Tm)大約5-l(TC的溫度。所述Tm是在此溫度下(指定離子濃度、pH及核酸濃度)，與耙位互補的50%的探針平衡雜交靶序列(當耙序列過量存在時，在Tm，50%的探針處于平衡狀態(tài)占用)。嚴格條件是如下那些條件鹽濃度低于大約1.0M鈉離子，典型為大約0.01-1.0M鈉離子濃度(或者其它鹽)，pH7.0-8.3，對于短探針(例如10-50個核苷酸)的溫度為至少大約30。C，對于長探針(例如50個核苷酸以上)的溫度為至少大約60°C。嚴格條件也可以通過加入去穩(wěn)定劑如甲酰胺而實現(xiàn)。對于選擇性或特異性雜交而言，陽性信號至少為2倍背景、優(yōu)選10倍背景雜交。嚴格雜交條件的例子通常是:50%甲酰胺、5XSSC及1。/。SDS，在42。C保溫；或者5XSSC、1%SDS，在65。C保溫；在65t:于0.2XSSC和0.1。/()SDS中洗滌。對于PCR而言，大約36。C的溫度典型是低嚴格擴增條件，但是退火溫度根據(jù)引物長度可以在大約32'C至48'C之間變化。關于確定雜交參數(shù)的其它指導在眾多的參考文獻中提供，例如CurrentProtocolsinMolecularBiology,eds.Ausubel,etal.1995)。本文所用"核酸"或"寡核苷酸"或"多核苷酸"或其合乎文法的同意義用語是指共價連接在一起的至少兩個核苷酸。寡核苷酸的長度典型為大約7、8、9、10、12、15、18、20、25、30、40、50或者直至大約100個核苷酸。核酸和多核苷酸是任何長度、包括更長長度的核苷酸聚合物，例如200、300、500、1000、2000、3000、5000、7000、10000個等核苷酸。本發(fā)明的核酸通常含有磷酸二酯鍵，但是在一些情況中包括可具有替代主鏈(altematebackbone)的核酸類似物，包括例如氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或者O-甲基氨基磷酸酯鍵(見Eckstein,1991)，及肽核酸主鏈和鍵?？梢允褂锰烊话l(fā)生的核酸的混合物和類似物。特別優(yōu)選的寡核苷酸類似物是肽核酸(PNA)。通過轉基因方法產生So^vfe抗性番茄植物根據(jù)本發(fā)明的另一方面，包含至少一個本發(fā)明QTL或其賦予Bo^yto抗性的部分的核酸(優(yōu)選DNA)序列可用于產生So^y^抗性番茄植物。在這方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的QTL或其賦予抗性的部分在產生抗性番茄植物中的應用，這種應用包括在Sc^y^易感受體番茄植物中導入包含所述QTL的核酸序列。按照規(guī)定，所述核酸序列可衍生自合適的抗性供體番茄植物。能提供包含至少一個前文所述QTL或其賦予抗性的部分的核酸序列的兩種合適的5c^y^抗性供體番茄植物是5*./z"6rac/zm'feyLYC4/78。呈現(xiàn)Bo化yfe抗性且包含編碼S0^7他抗性的一或多個基因的其它相關番茄植物也可以用作So^;to抗性供體植物，因為本發(fā)明描述了怎樣鑒別這些材料。也可以檢測其它番茄種的S^O^'s抗性'瞎況，包手舌iB不限于丄ycopera/co"cerawybr柳e、Z^coperw'co"c/zees附a""、丄，o/em'co"脅虛謂、Z^coperw'co"/arW6wwm、Z^eoj9員/co"/e朋e〃z7、一旦在合適的供體番茄植物中鑒別，則可以通過任何可用方法將包含本發(fā)明So/o;^抗性QTL或其賦予5o化少fe抗性的部分的核酸序列移至合適的受體植物中。例如，所述核酸序列可以通過使So^yto抗性供體番茄植物與易感受體番茄植物雜交(即通過漸滲作用)、通過轉化、通過原生質體融合、通過雙單倍體技術或者通過胚胎拯救技術或者通過任何其它核酸轉移系統(tǒng)進行轉移，任選隨后選擇包含所述QTL及呈現(xiàn)So/o;to抗性的后代植物。對于轉基因方法，包含本發(fā)明BWo^'s抗性QTL或其賦予So^yto抗性的部分的核酸序列可以通過本領域熟知的方法分離自所述供體植物，由此分離的核酸序列可以通過轉基因方法移至受體植物中，例如利用載體、于配子中、或者于任何其它合適的轉移元件如用所述核酸序列包被的彈性粒子中轉移。植物轉化通常包括構建在植物細胞中起作用的表達載體。在本發(fā)明中，這種載體具有包含本發(fā)明^^7to抗性QTL或其賦予Bo/o;他抗性部分的核酸序列，該載體可包含在調節(jié)元件如啟動子控制下或者與其可操縱地連接的5o^y&抗性賦予基因。所述表達載體可含有一或多個這樣可操縱地連接的基因/調節(jié)元件組合，只要這種組合中含有的至少一個基因編碼So^y^抗性即可。所述載體可以是質粒形式，可以單獨應用或者與其它質粒組合應用，通過使用本領域已知的轉化方法如農桿菌轉化系統(tǒng)以提供^^7^抗性轉基因植物。表達載體可包括與調節(jié)元件(如啟動子)可操縱地連接的至少一個標記基因，使得含有所述標記的轉化的細胞通過陰性選擇(通過抑制不含有選擇標記的細胞生長)回收，或者通過陽性選擇(通過篩選由所述標記基因編碼的產物)回收。本領域已知進行植物轉化的許多常用的選擇標記基因，包括例如編碼代謝解毒酶(一種選擇性化學試劑，可以是抗生素或除草劑)的基因，或者編碼對于抑制劑不敏感的改變靶位(alteredtarget)的基因。本領域已知一些陽性選擇方法，如甘露糖選擇法?；蛘?，可以使用無標記的轉化方法獲得無所述標記基因的植物，該技術為本領域所已知。一種將表達載體導入植物中的方法基于農桿菌的天然轉化系統(tǒng)(見例如35Horschetal,，1985)。A/wwe/a"'era和AW2&0ge"M是遺傳轉化植物細胞的植物病原性土壤細菌。A^me/ac/em的Ti質粒和Ar/n'zogew^的Ri質粒具有與植物的遺傳轉化相關的基因(見例如Kado，1991)。將表達載體導入植物組織中的方法包括用^gra^"en'wm^we/ac/era直接感染植物細胞或者與植物細胞共栽培(Horschetal.,1985)。關于農桿菌載體系統(tǒng)和農桿菌介導的基因轉移方法的描述見GmberandCrosby,1993及Moloneyetal.,1989所述。也見于美國專利No.5，591，616所述。關于植物表達載體和報道基因及轉化方案的一般描述及關于農桿菌載體系統(tǒng)和農桿菌介導的基因轉移方法的描述可見于GruberandCrosby,1993所述。培養(yǎng)植物組織的一般方法見例如Mikietal.,1993及Phillips,etal.,1988所述。關于分子克隆技術及合適的表達載體的正確參考手冊是SambrookandRussell(2001)。另一種將表達載體導入植物中的方法是基于基因槍介導的轉化方法，其中DNA在基因槍的表面上被運載。使用微粒導入(biolistic)裝置以300-600m/s速度促進粒子轟擊而將所述表達載體導入植物組織中，這個速度足以穿透植物細胞壁和細胞膜(見Sanfordetal.，1987，1993;Sanford，1988,1990;Kleinetal.，1988,1992)。將DNA導入植物中的另一種方法是通過耙細胞超聲法(見Zhangetal.，1991)?；蛘?，可以使用脂質體或原生質球融合體將表達載體導入植物中(見例如Deshayesetal,1985禾卩Christouetal,1987)。也已經報道了使用CaCl2沉淀法、聚乙烯醇或聚-L-鳥氨酸將DNA直接吸收進原生質體中(見例如Hainetal.1985和Draperetal.，1982)。原生質體和全細胞及組織的電穿孔法也已經描述(D，Halluinetal.,1992和Laursenetal，1994)。在番茄靶組織轉化后，上述選擇標記基因的表達使得可以優(yōu)先選擇轉化的細胞、組織和/或植物，使用本領域熟知的再生和選擇方法進行。表1-5列出的標記也可以用于該目的?？有韵闱阎瞚L在產生Bo/^yto抗性番茄植物的另一個實施方案中，可以使用原生質體融合法將核酸從供體植物轉移至受體植物。原生質體融合是誘導的或自發(fā)的聯(lián)合，如兩或多個原生質體(其細胞壁通過酶處理除去的細胞)之間的體細胞雜交，產生雙核或多核細胞。融合的細胞甚至可以利用天然不能種間雜交(interbreed)的植物物種獲得，將融合細胞經組織培養(yǎng)為呈現(xiàn)希望性狀組合的雜交植物。更特異地，第一個原生質體可以得自呈現(xiàn)^o/o;to感染抗性的番茄植物或者其它植物品系。例如，可以使用來自S./7^rac/zdtesLYC4/78的原生質體。第二個原生質體可以得自另一番茄或其它植物品種，優(yōu)選包含商業(yè)上希望的性狀的番茄品系，所述性狀例如但不限于是疾病抗性、昆蟲抗性、貴重果實特性等。然后使用本領域已知的傳統(tǒng)原生質體融合程序融合所述原生質體。或者，可以應用胚胎拯救技術將包含本發(fā)明一或多個QTL的核酸從供體植物轉移至受體植物。胚胎拯救技術可以用作從植物不能產生存活種子的雜種中分離胚的技術。在這種情況中，將受精的植物子房或不成熟種子經組織培養(yǎng)產生新植物(Pierik,1999)。本發(fā)明還涉及產生^^T&抗性番茄植物的方法，包括如下步驟根據(jù)上文所述檢測供體番茄植物中與及"'"wea抗性相關的數(shù)量性狀基因座(QTL)的存在情況，并將包含至少一個由此檢測的QTL或其賦予So/o^s抗性的部分的核酸序列從所述供體植物中轉移至^^yfe易感的受體番茄植物中。所述核酸序列的轉移可以通過本文所述的任何方法進行。這種方法的一個優(yōu)選實施方案包括通過植物雜交而將所述核酸序列經漸滲作用方式從So^;to抗性供體番茄植物轉移至易感受體番茄植物中。這種轉移因此可以通過使用傳統(tǒng)育種技術而適當實現(xiàn)。優(yōu)選通過使用標記輔助育種法(MAS)將QTL經漸滲作用方式轉移至商業(yè)番茄品種中。標記輔助的育種法或者標記輔助的選擇法包括使用一或多個分子標記以鑒別和選擇含有編碼希望性狀的一或多個基因的那些后代植物。在這種情況中，這種鑒別和選擇基于本發(fā)明QTL或與其相關的標記的選擇。MAS也可以用于產生具有感興趣的QTL的近等基因系(NIL)，可以更詳細地研究每個QTL作用，且也是產生回交自交系(BIL群的有效方法(見例如Nesbittetal.,2001;vanBerlooetal.,2001)。根據(jù)這個優(yōu)選的實施方案產生的番茄植物可以有利地從受體植物中獲得其大多數(shù)性狀，并從供體植物中獲得Sc^7to抗37性。由于&"力WM抗性是多基因遺傳的，因此優(yōu)選通過合適的轉移方法將至少兩個、優(yōu)選三個QTL或其賦予So^jfe抗性的部分插入一個受體植物中，即多個QTL堆積(stacking)在受體植物的基因組中。據(jù)信本發(fā)明的兩或多個QTL的堆積可導致j5W7to抗性增強。正如本領域技術人員所易于理解的，所述堆積可以通過任何方法實現(xiàn)，例如通過用包含多個本發(fā)明QTL的核酸構建體轉化植物而實現(xiàn)?；蛘?，雜交的每個親本植物中可存在至少一個QTL，由此在所得雜種中包含至少兩個QTL。通過這些抗性性狀的堆積，可以獲得高度抗性的植物。這種植物是本發(fā)明特別優(yōu)選的實施方案。如上文所簡要論述，傳統(tǒng)育種技術可用于將編碼^^少to抗性的核酸序列經漸滲作用方式轉移至^o/^to易感受體番茄植物中。在稱作譜系育種的一種方法中，將呈現(xiàn)So^7似抗性且包含編碼SW7to抗性的核酸序列的供體番茄植物與優(yōu)選呈現(xiàn)商業(yè)希望特性的So^yfe易感的受體番茄植物雜交，所述商業(yè)特性例如但不限于是疾病抗性、昆蟲抗性、貴重果實特性等。然后將所得植物群(代表Fi雜種)自交和結實(F2種子)。然后篩選從&種子生長成的F2植物的5oo;to抗性。所述群可以通過許多不同方式篩選。首先，可以使用傳統(tǒng)疾病篩選方式篩選群。這種疾病篩選法為本領域所已知。優(yōu)選使用定量莖或葉感染生物測定法，優(yōu)選使用如上文及實施例中詳細描述的本發(fā)明方法中使用的莖生物測定法。其次，可以使用一或多個前述分子標記進行標記輔助選擇法，以鑒別包含編碼So^yfe抗性的核苷酸序列的那些后代。也可以使用上文所述檢測QTL存在的其它方法。同樣，標記輔助選擇法也可以用于證實得自定量生物測定法的結果，并因此可以組合使用一些方法。So^rfe抗性番茄植物和種子本發(fā)明的So^yto抗性番茄植物特征在于具有高水平抗性。這是指高于在易感對照植物中觀測到的抗性水平。事實上，本發(fā)明的植物的抗性水平高于目前己知的任何商業(yè)番茄品種(即具有商業(yè)希望特性的品種)的抗性水平。當通過生物測定法測量時，本發(fā)明的植物對于^^7&""w"的易感性比易感對照植物低至少3倍。例如實施例3.10和3.11所述在標準實施條件下，在3周內測量通過生物測定法測量得自成熟植物中So/o;to"'"ew"感染的莖病斑的平均長度。典型地，使用標準實施條件在基于這種特性設計的確定抗性的抗性生物測定中，本發(fā)明的植物的抗性水平導致接種3周后成熟植物中Bo^ytoc/"e/ra病斑的平均莖病斑長度小于3.2cm。更典型地，本發(fā)明的植物示出平均莖病斑長度低于2.9cm。本發(fā)明的一些植物甚至示出平均莖病斑長度為2.0cm?？紤]到表示病斑長度的數(shù)字包括2cm的接種創(chuàng)傷部位，因此可以推斷在本發(fā)明植物中觀測到高水平抗性，甚至在一些QTL情況中觀測到完全抗性。對比之下，在相同條件下易感對照植物示出平均莖病斑長度為大約3.6cm至大約6.0cm，平均4.85cm(見表7)。也作為對照，WO02/085105所述含有部分So^yto抗性的QTL-10的5*./^6rac/w/toLA1777，在相同條件下示出平均莖病斑長度為大約4.3cm。總之，在上述抗性生物測定中，本發(fā)明的植物與易感對照植物相比示出凈莖病斑長度通常低大約30%(0.9/2.85X100%)，與部分抗性/w6rac/7a/^LA1777的凈長度相比低大約40%(0.9/2.3X100%)。因此，當通過生物測定測量時，本發(fā)明的植物與易感對照植物相比其So&ytod"e^fl易感性低3倍，或者是對照易感植物的1/3水平。相反，如本文所述及通過生物測定確定本發(fā)明的植物的抗性比易感對照植物的抗性高3倍。對于QTL-1，觀測到完全抗性。易感對照植物是指對于^^ytoc/"ea感染示出正常易感性或者無抗性的植物。易感對照植物的例子是雜交植物5b/朋層/少co/era/c扁cv."Moneyberg"(DeRuiterSeedsR&DBV，Bergschenhoek，TheNetherlands)。通過本發(fā)明的方法可獲得的抗性番茄植物或其部分也是本發(fā)明的一部分。本發(fā)明的另一部分涉及^o^;to抗性番茄植物或其部分，在基因組內包含至少一個QTL或其賦予萬W^to抗性的部分，所述QTL選自So/a"ww/z"6rac/za/tesLYC4〃8的染色體4、6、9、11和12上與抗性相關的QTL，其中所述QTL或其賦予So^yto抗性的部分不在其天然遺傳背景中。本發(fā)明的So^y^抗性番茄植物可以是任何遺傳類型，如近交體、雜種、單倍體、二倍體、單性結實或轉基因的。另外，本發(fā)明的植物對于39抗性性狀可以是雜合或純合的，優(yōu)選純合的。盡管本發(fā)明的Q1X以及通過bfm的方法可獲得的那些QTL以及其賦予S^7to抗性的部分可以轉移至任何植物中以提供Bo^7泡抗性植物，但是本發(fā)明的方法和植物優(yōu)選針對5b/aw<3C￡a￡禾斗、更優(yōu)選番燕o除了如本發(fā)明鑒別的與^^y^抗性相關的6b/a"wm/z^rac/w/tesLYC4/78染色體4(QTL-4hB)、6、9、11和12上的QTL之外，本發(fā)明的植物可任選進一步包含一或多個&/z"6rac/w/tey衍生的QTL，所述QTL經鑒別是QTL-lh、QTL-2h和QTL-4hA，在共同未決申請PCT/NL2005/000762和EP1652930A(歐洲專利申請04077931.6)中詳細描述，所述文獻在此并入作參考。本發(fā)明所述QTL或者PCT/NL2005/000762所述QTL的QTL組合將增強具有這種組合物的植物的疾病抗性。然而，每個QTL還攜帶來自原種S./7^rac/zmYw的遺傳背景信息，這意味著在后代中具有太多的這種背景信息，將不能獲得具有希望的最佳農業(yè)特性的植物?？梢允褂醚h(huán)選擇和回交、自交和/或二倍體或者用于產生親本系的任何其它技術產生近交系5Wo;他抗性番茄植物。在選擇和回交方法中，可以通過將回歸親本與第一個供體植物(其與回歸親本不同，在本文稱作"非回歸親本")雜交而將SWo;fe抗性以漸滲作用方式轉移至耙受體植物(稱作回歸親本)中。所述回歸親本是對于^^Jto無抗性或者低水平抗性的植物，且具有商業(yè)希望的特性，例如但不限于疾病抗性、昆蟲抗性、貴重果實特性等。所述非回歸親本呈現(xiàn)^^7他抗性，且包含編碼So^yto抗性的核酸序列。所述非回歸親本可以是與所述回歸親本雜交可育的任何植物品種或者近交系。將得自回歸親本與非回歸親本雜交的后代與回歸親本回交。然后篩選所得植物群?？梢酝ㄟ^眾多不同方式篩選所述群。例如，可以使用前文所述的莖定量生物測定法篩選群。選擇呈現(xiàn)SW7to抗性表型、包含編碼So^yto抗性的必需核酸序列、且具有商業(yè)希望的特性的F,雜種，自交及選擇多個世代以使得番茄植物越來越成為近交系。這種持續(xù)自交和選擇的程序可以進行兩至五或更多個世代。這種育種和選擇的結果是產生與5Wo;fe抗性相關基因以及與商業(yè)感興趣的性狀相關的其它基因遺傳同源的品系。代替使用表型病理學篩選的生物測定法，可以使用一或多個前述分子標記、雜交探針或多核苷酸進行MAS，以鑒別包含編碼^^7^抗性的核酸序列的那些后代?；蛘?，MAS可用于證實得自定量生物測定的結果。一旦產生合適的選擇結果，則重復進行所述程序。將與回歸親本回交及針對6W7to抗性進行選擇的程序重復大約5或更多個世代。得自這個程序的后代對于編碼^^T^抗性的一或多個基因是雜合的。然后將最后的回交世代自交以提供S^o;他抗性純合的純育種后代。所述抗性番茄近交系可以用于另外的雜交中，產生5t^yto抗性雜交植物。例如，本發(fā)明的第一個^^rto抗性近交系番茄植物可以與具有商業(yè)希望性狀的第二個近交系番茄植物雜交，所述性狀例如但不限于是疾病抗性、昆蟲抗性、希望的果實特性等。所述第二個番茄近交系可以是抗性的或不是So^yfe抗性的。本發(fā)明的另一方面涉及產生可以生長為萬o^yto抗性番茄植物的種子的方法。在一個實施方案中，所述方法包括如下步驟提供本發(fā)明的Sc^7fe抗性番茄植物，將所述Bo^to抗性植物與5b/朋ww/_yco/erw'CMm植物雜交，收集得自所述雜交的種子，當種植該種子時產生BW7他抗性番茄植物。在另一個實施方案中，所述方法包括如下步驟提供本發(fā)明的5Wo;fe抗性番茄植物，將所述5。^y他抗性植物與》Sb/mwm(ycopem'cwm植物雜交，收集得自所述雜交的種子，使所述種子再生為植物，通過本文所述任何方法選擇SW/^to抗性植物，將選擇的植物自交足夠數(shù)目的世代以獲得賦予植物So^yto抗性的等位基因被固定的植物，將由此產生的植物與具有希望的表型性狀的61.(vco;ww'cMm植物回交足夠數(shù)目的世代，獲得^W^fe抗性的且具有希望的表型性狀的S./F，e^/cwm植物，從得自最后一次回交的植物中產生的種子，當種植該種子時產生So^yto抗性番茄植物。下文提供了例證本發(fā)明而無限制本發(fā)明之意的實施例。實施例^"盧樹i:鑒^/^o^y他c/we"a-拔絲/《關g7X游_^法41本實施例介紹了評價野生型番茄基因型集合中So^y"抗性的定量生物測定法。在野生型番茄物種中己經報道了對5W7他c/wewa的部分抗性，但是這些報道在很大程度上是描述性和定性的。部分抗性基因型的鑒別提供了通過漸滲作用方式將抗性轉移至商業(yè)育種品系中以獲得具有易于處理的抗性水平的品系的前景?？稍偕摹⒖陀^的定量測定的可利用性以及具有遺傳決定的(部分)灰霉菌抗性的基因型的鑒別開啟了在栽培的番茄品種中培育抗性的方式。本實施例描述了定量疾病測定法。該測定法應用于葉(葉接種測定)和莖節(jié)段(莖接種測定)。檢測了疾病易感性的兩個參數(shù)。測量的第一個參數(shù)是發(fā)病率(DI)，即導致病斑擴大的接種比例。如果在特定宿主基因型上最初的及"'"e^"病斑(部分)不擴大是該植物的遺傳性狀，則這種性狀是重要的，因為其直接限制作物中病灶的數(shù)目。測量的第二個參數(shù)是24小時內病斑生長速度(病斑生長，LG)。從最初的接種處傳播的病斑看起來勻速(mm/天)傳播，直至病斑達到葉的邊緣或莖節(jié)段的底部。本發(fā)明測定方法能量化凡感染的發(fā)生(發(fā)病率)和發(fā)展(病斑生長)，獲得兩組定量的性狀數(shù)據(jù)。該測定方法用于篩選番茄種的集合(以下也稱為"集(accession)")中抗性的存在。澄激檢測的植物基因型列于表6。表6:檢測的茄屬植物(&/朋畫)基因型列表42編號來源"3種具體說明/品種葉薑頃參考文獻w78/1604t)RSKeckse咖tiTorpeY82/2577PRSFuturiaYY33/2896嚴SBiruincaY89/3695DESXS.i(ycopersiaimvar.cerasiformeYDRSY39/3862t)RSOlomouckeY,063DRSL4034Y隨311DRSSeed8thip2YYDRSGbnr90124YY薩WUPPWSSG1.1290冊LoPBYVVULoPBYYG1.1558WULoPbYG1.1560WTJLoPBYYG1,160LYYG1.1615而LoPBY〖Z.2向隨2KYfUi'basch'1986)LA.716S.,penneffiYLA.2157TGRC乙.perwi;她誰YTGRCYLyc.4/78③IPKYY(Urbasch,1986)ri60/79(3)[PK乙.gZcmdi4oswmY(Urbasch,1986)T5挑/81〈紛匯PKY(Urtmsch,l娜)'DRS:DeRuiterSeeds,Bergschenhoek,荷蘭；WUPPW:PlantkundigProefcentrumWageningen,WageningenUniversity,Wageningen,荷蘭；LoPB:LaboratoryofPlantBreeding,WageningenUniversity,Wageningen,荷蘭；MPIZK:MaxPlanckInstitutfurZuchtungsforschunganKultuipflanze,Koln,德國；TGRC:TomatoGeneticsResourceCenter,UniversityofCaliforniaatDavis,DavisCA，USA;IPK:InstitutfurPflanzengenetikundKulturpflanzenforschung,Gatersleben,德國。2Y表示在特定測定中檢測的基因型，S表示作為易感參考對照的基因型。(3)在c/"ewa抗性之前公開的。將植物在最低溫度為15t的溫室中的12cm罐的盆栽土中生長。從10月至3月應用人工鈉燈(16小時/天)。在發(fā)芽后5-7天，加入10mlFeNaEDTA溶液(3.5g/l)，隨后3天加入10ml微量營養(yǎng)素溶液(0.286g/1H3B03;0.1558g/1MnS04-H20;0.008g/1Cu04-H20;0.022g/1ZnS04;0,00196(NH4)6Mo7024.4H20)。在發(fā)芽后開始兩周內，每周加入5ml的Hoagland溶液(5mMCa(N03)2;5mMKN03;2mMMgS04;lmMKH2P04)。".麵定根據(jù)Benito(1998)所述，從5.c/"we"菌株B05.10中制備接種體。對于每個植物，用鋒利的刀片從主干分離完全伸展的一或兩片復葉并轉移至預濕的種花泡沫中。將所述種花泡沫置于含有自來水的皮氏培養(yǎng)皿中，隨后置于經噴霧增濕的含有濕濾紙的容器中。然后將所述復葉接種A的分生孢子懸浮液，小心地將共6-10滴的接種體(2)ul)滴于葉的上表面上。基本如Benitoetal,1998所述，用經噴霧濕潤的蓋子密閉該容器，在15°〇于黑暗處在100%RH下保溫。適當?shù)?，一個復葉分裂為四個小葉，每個小葉接種10滴2^1含有2000個分生孢子的接種體。在幾天內監(jiān)測強烈擴大的病斑(發(fā)病率)和病斑生長速度。為了校正由于季節(jié)或植物栽培導致的變化，使每個實驗中的特定基因型的發(fā)病率與在相同實驗中檢測的Moneymaker的發(fā)病率相關。使用卡尺在96、120和144hpi測量病斑大小。發(fā)病率通過將擴大病斑總數(shù)除以懸滴接種總數(shù)而確定。病斑生長速度通過計算24小時內病斑大小(mm)的增加而確定。未擴大的病斑數(shù)據(jù)從定量分析中刪除。".吝,標靴糊如下所述進行莖測定去除高度為大約50cm的植物的上方5-10cm和下方5-10cm的莖，將剩余的30cm莖切成5-6cm等長節(jié)段。將每個節(jié)段垂直置于網格中，莖底部置于濕濾紙上。在接種之前，用自來水噴霧莖節(jié)段以保證接種體相同分布于創(chuàng)傷表面。如葉測定所述制備接種體。將含有大約106個分生孢子/1111的一滴5pl接種體應用于每個莖節(jié)段的頂部。在15±2"C溫度于黑暗處在100%相對濕度下保溫。感染進展通過在接種后各個時間點用游標卡尺測量最大腐爛癥狀而確定。對于每個基因型，計算感染的莖的百分比。發(fā)病率通過將具有擴大的病斑的莖節(jié)段總數(shù)除以接種的莖節(jié)段總數(shù)而確定。病斑生長速度通過計算24小時內病斑大小的增加而確定，非擴大病斑的數(shù)據(jù)從分析中刪除。7.5.錄菜針對每個基因型，確定幾天內在離體葉感染實驗中的發(fā)病率和病斑生長，通常在感染后2-4天進行。在這些實驗中，作為參考的51./ycoj^rw'cwmcv.Moneymaker中的發(fā)病率在15-78%之間波動。除了基因型82/2577和83/2896(均為S.^o尸m'c謂禾中)之外，檢測的基因型在所有的實驗中均示出低于Moneymaker的發(fā)病率。基因型G1.1556、Gl.1560和Gl.1601在三個獨立實驗中均示出較低發(fā)病率，范圍是0-21%。統(tǒng)計學分析表明基因型78/1604、91/4311、96/4326、G1.1556、GI.1558、G1.1560、G1.1601、LA716和LYC4/78中發(fā)病率顯著低于對照品系&/ycc^era/cw附cv.Moneymaker(p<0.05)。然而，在周與周之間存在很大差異，在離體葉測定中觀測到的一些差異實際上不是非常明顯的(robust)，因為實驗/周之間的發(fā)病率有波動(15-78%)。在這些抗性基因型中(發(fā)病率明顯低于參考的Moneymaker),成功擴大的病斑通常以與在Moneymaker中相似的速度擴大(例如96/4326、G1.1560、LA716)。未發(fā)現(xiàn)相反情況無一基因型展示發(fā)病率與Moneymaker類似，而病斑生長速度低于Moneymaker。在大多數(shù)基因型中，24小時以上(48-72hpi)病斑生長速度與Moneymaker處于相同范圍。5個品系(91/4311、160/79、G1.1556、G1.1601和LYC4/78)示出較緩慢的病斑生長速度，在統(tǒng)計學上與5*.(ycopew/cMmcv.Moneymaker具有顯著差異。在不同季節(jié)進行的實驗之間莖節(jié)段感染測定法看起來比葉測定法在再現(xiàn)性方面更明顯。即使莖節(jié)段數(shù)據(jù)點的數(shù)目(5-8個節(jié)段/植物)明顯小于葉測定法(每個復葉40個接種滴，每個植物可以檢測一或兩個葉)，但是實驗變化性通常低于莖節(jié)段測定法。莖測定中對照基因型/>^/^*訓cv.Moneymaker的發(fā)病率范圍是52-95%。將相同實驗/周條件下的17個基因型中的發(fā)病率與對照品系《S.fycope"/cwmcv.Moneymake的發(fā)病率進行對比。大多數(shù)基因型示出發(fā)病率與對照品系Moneymaker處于相似范圍。基因型G1.1556(29%和41%)和G1.1560(28%和7%)示出發(fā)病率降低。僅G1.1560與對照具有統(tǒng)計學顯著差異(p0.05)。莖測定中對照基因型51./少co/era/cwwcv.Moneymaker的病斑生長速度范圍是5.4-9.2mm/天。許多基因型的病斑生長速度與對照處于相似范圍內。然而，在品系89/3793、G1.1601、LYC4/78、T566-81中，病斑生長速度與對照cv.Moneymaker具有統(tǒng)計學顯著差異(pO.Ol)。許多基因型在莖節(jié)段測定中被認為是部分抗性的，因此對生長于暖房內Rockwool⑧上的完整植物進行定性測定。目的是評價在實驗室條件下在莖節(jié)段中看起來是抗性的基因型在半商業(yè)性栽培系統(tǒng)中是否確實比對照品系更具抗性。將植物以隨機順序生長于Rockwool⑧中，暖房室內裝有在孢子形成點嚴重感染及c/"w^的柑橘類果實。該暖房室內通過每天用自來水噴霧兩次地面而保持高濕度，關門關窗。以有序的間隔對所有植物進行修剪創(chuàng)口，隨時監(jiān)測灰霉菌的發(fā)生。經鑒別許多野生型番茄品系顯示這兩個參數(shù)均明顯降低，因此提供了將兩個潛在的獨立的部分抗性機制經漸滲作用方式導入51.fya^w'cwm中的潛在來源。實施例3:在禾中間番茄群體(S.lycopersicumcvMoneymakerXS,habrochaites品系LYC4/78)中作圖Bo^rfec/w^ga部分抗性在這個實施例中，呈現(xiàn)了源自S./^6rac/w/toLYC4/78的賦予及c/wewa部分抗性的兩個QTL基因座。通過在分別針對兩個QTL基因座之一分離的兩個BC2S!群體中評定&c/^wa抗性水平而對結果進行證實。3丄潛激#辨5b/a""w/za6rac/w/tesLYC4/78(后文稱作LYC4/78)的種子得自位于德國Gatersleben的遺傳學與栽培植物研究所(InstituteforPlantGeneticsandCropPlantResearch)的基因庫。5b/a/w附(yco/ers/cM附cv.Moneymaker(后文稱作Moneymaker)的禾中子得自荷蘭BergschenhoekDeRuiterSeedsR&DBV的種子庫。在Moneymaker與LYC4/78之間進行種間雜交，產生F,種子。將所述F,種子生長成為Fi植物。播種得自一個F,植物自交的F2種子，獲得174個個體的F2群。通過用Moneymaker作為回歸和雌性親本進行兩次回交，產生59個個體的BC2(回交2)群。使用MAS選擇含有兩個鑒別的QTL之一的BC2、BC3和BC4基因型，一些BC2經自交產生BC2S!種子(見圖2)。生長兩個BC2St群，一個是針對發(fā)病率QTL分離的60個BC2S,個體，另一個是針對病斑生長QTL分離的47個BC2Si個體。根據(jù)Benito(1998)所述從及c/"ewa菌株B05.10中制備接種體。如實施例l所述進行莖測定。3.3.ZWJ分蓐及標記分析使用StewardandVia(1993)所述的基于十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)的方案，從兩個(向上巻曲的)幼葉中分離基因組DNA，針對使用lmlmicronic管(MicronicBV,Lelystad，TheNetherlands)高通量DNA分離進行調節(jié)，使用Retsch300mm搖瓶(RetschBV,Ochten,TheNetherlands)以最大速度研磨(grounded)。對F2、BC2、BC3、BQ和BC^Si群進行AFLP分析(Vosetal.,1995)，AFLP片段在LI-COR4200DNA測序儀上分辨，基本如Myburg(Myburgetal.2001)發(fā)表的方法進行。選擇性尸W引物用IRD700或IRD800熒光標記進行標記。使用AFLP-QuantarPro軟件包(KeygeneBV，Wageningen,TheNetherlands)評價AFLP凝膠圖像。使用如下10個引物組合和接頭序列進行基因型鑒定P14M48、P14M49、P14M50、P14M60、P14M61、P15M48、P18M50、P18M51、P22M50和P22M51，如Baietal.(2003)所述。在不同的^^7他測定之間觀測到發(fā)病率變化(見實施例1，如前述)。因此，對得自MoneymakerXLYC4/78之間雜交的F2群的174個個體中的172個體進行7個單獨的連續(xù)莖疾病測定。這樣對于幾乎每個F2基因型均產生了至少5個單獨的疾病生物測定評價結果。在每個個體疾病生物測定中，6個莖節(jié)段有助于計算病斑生長情況。F2群的平均發(fā)病率和病斑生長數(shù)值示出正常分布(數(shù)據(jù)未示出)。Moneymaker的平均發(fā)病率是59%，病斑生長速度為9.2mm/天。F2群中平均發(fā)病率范圍是10%-97%，平均為48%。病斑生長速度范圍是3.3mm-11.5mm/天，平均為7.8mm/天。每個個體實驗的平均發(fā)病率范圍是31%-73%，而平均病斑生長速度范圍是6.2-7.9mm/天(數(shù)據(jù)未示出)。如果至少感染6個莖之一，則可以僅計算病斑生長速度。因此，提示病斑生長的基因型的數(shù)目增加可以觀測到較高的發(fā)病率。例如，在較低的平均發(fā)病率(31%)的情況中，僅52%的基因型是提示病斑生長的基因型。分報記腐/鏈徵厫針對得自Moneymaker與LYC4〃8雜交的F2群(r^l74)計算遺傳連鎖圖。使用10個引物組合在F2群(n二174)中獲得218個擴增片段長度多態(tài)性(AFLP)標記。共69個標記(31.7%)可易于共顯性評價，因此可以計算整合的F2遺傳連鎖圖。對BC2、BC3和BC2Si基因型進行的標記分析使得可以添加另外145個AFLP標記。在這145個另外AFLP標記中共102個標記由于F2凝膠的復雜性而先前未進行評價。全部的遺傳連鎖圖由14個連鎖群的315個AFLP標記組成，總長度為958cM。由于物種內的共遷移AFLP標記通常是等位基因特異性的，因此使用與其它AFLP連鎖圖共線性分配染色體的連鎖群。一些Moneymaker特異性AFLP標記通常與公布的遺傳連鎖圖(Haanstraetal.1999;Baietal.2003)—樣，因此一些連鎖群可以分配給染色體，包括具有鑒別的QTL的連鎖群。為了改良QTL間隔中的連鎖圖，基于公布的S.lycopersicumXL.pennellii連鎖圖(Tanksleyetal.1992;Haanstraetal.1999)，在這些區(qū)域中可以加入診斷性CAPS標記。丄6.遂徵分析與g7X/，凰分析標記數(shù)據(jù)，并如3.5節(jié)所述計算遺傳連鎖圖。F2連鎖圖總長度為958cM，這低于遺傳長度范圍是1200-1400cM的其它公布的種間丄ycopea/co"連鎖圖(Fooladetal.2002;Haanstraetal.1999;Tanksleyetal.1992)。另外的AFLP標記使用得自回交系和BC2S!群的AFLP標記數(shù)據(jù)進行評價。盡管46%以上的標記置于連鎖圖上，但是該遺傳連鎖圖的長度未增加。原因是所用數(shù)據(jù)得自一些小亞家族，因此無計算遺傳距離的信息，但是通過目測繪圖的基因型可以估計位置(VanBerloo,1999)。丄7.R,^游^7Z/，房使用表型數(shù)據(jù)和標記數(shù)據(jù)通過區(qū)間作圖(IM，見3.5節(jié)所述)鑒別QTL。IM應用于得自個體重復的數(shù)據(jù)及應用于重復的平均值。發(fā)病率在F2群中針對平均發(fā)病率低于50%的那些個體疾病測試和得自所有疾病檢測的平均數(shù)據(jù)進行發(fā)病率區(qū)間作圖。所有測試的平均數(shù)據(jù)在區(qū)間作圖程序中提供了針對發(fā)病率的單顯著QTL(對于基因組規(guī)模置信度水平PO.05的優(yōu)勢對數(shù)(LOD)得分必須高于3.4)。這個QTL的LOD分值為4.5，解釋了13%的總表型變化。賦予抗性的等位基因源自抗性親本LYC4/78。在所有4種情況中，每個個體實驗的QTL作圖給出相同QTL區(qū)。在每個單獨的實驗中，偶爾觀測到其它"小QTL"。病斑生長病斑生長可以在高發(fā)病率的那些疾病測試中測量。對于QTL作圖，使用全部7個疾病測試的平均值，針對5.病斑生長的一個QTL經鑒別高于閾值(對于P0.05的基因組規(guī)模置信度水平，LOD為3.4)。這個QTL的LOD分值為4.2，解釋了12%的總表型變化。陽性作用源自抗性親本LYC4/78。示出了進行多個疾病測試的必要性，因為在僅一個單重復中，發(fā)現(xiàn)LOD譜高于閾值。病斑生長QTL在染色體1上發(fā)現(xiàn)(QTL-lh)，發(fā)病率QTL在染色體2上發(fā)現(xiàn)(QTL-2h)。這些QTL以及以QTL4hA表示的QTL是共同未決申請PCT/NL2005/000762的主題。493，&在生激#/定中&實071將MoneymakerXLYC4〃8雜交的F,植物與Moneymaker回交兩次，使用AFLP標記篩選59個后代植物的兩個經鑒別的QTL區(qū)域(QTL-lh和QTL-2h)的存在情況。選擇對于所述兩個經鑒別的QTL之一是雜合的植物，自交獲得兩個BC2S,群。用每個BC2S,基因型進行共4個疾病生物測定。用SPSS分析這兩個BC2S,亞群的數(shù)據(jù)，示出病斑生長正態(tài)分布，但是觀測一些亞類發(fā)病率非正態(tài)分布。使用在3.3節(jié)中針對F2群描述的相同10個引物組合對所有BC2S,植物確定AFLP基因型。針對病斑生長基因座分離的群中平均病斑生長速度為5.3mm/天，在其它群中平均病斑生長速度為6.3mm/天。無一植物具有與抗性親本LYC4/78—樣低的病斑生長速度。然而，對于發(fā)病率而言，觀測到比抗性親本LYC4/78發(fā)病率低的植物。這兩種BC2Si群的平均發(fā)病率相等(57-59%)。每個QTL的陽性作用在BC2S,群中證實。發(fā)病率QTL使感染機會降低了17%(46%親本變化)，病斑生長QTL使真菌生長速度降低了1.3mm/天(33%親本變化)。僅一部分變化可以用這兩個QTL的作用解釋。鑒別了一些另外的(小)QTL基因座。在分析得自F2和BC2S,棊因型的疾病測試數(shù)據(jù)期間，鑒別了一個主要的發(fā)病率QTL(QTL-2h)。除了這個QTL之外，還鑒別了其它"推定的"發(fā)病率QTL基因座。使用這個信息，選擇系數(shù)對F2數(shù)據(jù)集進行限制性"多QTL作圖"(MQM)程序。在這個分析中，鑒別了一個另外的"小"發(fā)病率QTL基因座(QTL-4hA)。當其分值低于LQD為3.4的顯著閾值時，認為QTL是"小"QTL。然而，認為該作用是真實的QTL作用。QTL-4hA位于染色體4上，降低發(fā)病率。D疾嫁粼定與07X/貪愿游茲論已經證實測量及"'ww^抗性的生物測定是一種有價值的工具。然而，仍有大量未知的變異看起來影響感染過程的進展。這種大量非遺傳性變異可以通過使用標準化程序及通過進行許多獨立重復而可以最小化。所述變異可以是每周溫室條件變化引起的(晝長，日照時間和溫度)，導致莖的生理條件不同。同樣，真菌接種體的制備中的微小變化也可以在感染進程的變化中起作用。另一觀測結果是疾病的發(fā)展也可以受放置所述莖的培養(yǎng)盤的小氣候影響。10個不同的實驗盤用于BC2S,生物測定。使用統(tǒng)計學分析抵償實驗之間和實驗內的變化。最高平均發(fā)病率實驗為測量病斑生長提供最多的信息，而中等發(fā)病率實驗提供較多的信息。發(fā)病率和病斑生長是獨立的性狀，因為在這兩個性狀之間可以觀測到無線性相關。番茄中S.抗性數(shù)量性狀基因座在F2中鑒別。這些鑒別的QTL在BC2S,群中證實，分別解釋了46%和33%的親本發(fā)病率和病斑生長變化。這些結果提示在原始的F2作圖群中不是所有的賦予及抗性的QTL均被檢測到。在這兩個BC2Si群中，發(fā)現(xiàn)抗性水平高于抗性親本LYC4/78的植物。這是存在在BC2S,群中分離的另外抗性基因座的指征。另外的抗性分離是令人驚奇的，因為可能預期兩個BC2S,群的大部分基因組對于Moneymaker是純合的。j.川在蘊皇姿伴7^F實各個Q7X游/，賴使用圖2所述的方法將含有上述任一QTL的植物置于<S.^op巾/c謂背景中。將BC2S2品系置于溫室土壤中，在荷蘭標準實施條件下生長。3個月后，通過將含有的瓊脂置于主莖的創(chuàng)口處接種植物。隨后使用Parafilm⑧封閉創(chuàng)口。接種3周后，測量莖的病斑長度(cm)(見下文詳述)。結果列于表7中。顯然，含有病斑生長QTL的品系示出病斑大小顯著減小。表7;接種3周后，51./7a6rac/zmY^品系LYC4/78和S./2a6rac/w/^LA1777成熟植物中5o"船病斑的平均莖病斑長度51品系重復平均莖病斑長度St*dev.背棄評論/QTL(cm)214,2UGT易感對照21b3,60,9GT易感對照223,00,0Durintha部分抗性對照22b5,02,9Durintha部分抗性對照235,63,0Tradiro相對易感對照23b6,03,3Tradiro相對易感對照263,20,8BChirs3QTL-2h26b2,60,9BChirs3QTL-2h26c2,61,3BChirs3QTL"2h26d3,22,2BChirs3QTL-2h28a2,60,5BChirs5QTL-lh28b2,00,0BChirs5QTL-lh-28-狄糾28■d2,0o,oBChirs5QTL-lh3734,30,6LA1777W002/085105的含有QTL-10的來源373f4,30,2LA1777W002/085105的含有QTL-10的來源3744,80,6BCchrs10來自S.lycopersicumXLA1777的漸滲系374f4，50,0BCchrs10來自S.lycopersicumXLA1777的漸滲系3754,20,3BCchrs10來自S.lycopersicumXLA1777的漸滲系375f4,20,2BCchrs10來自S.lycopersicumXLA1777的漸滲系3764,30,3BCchrs10來自S.lycopersicumXLA1777的漸滲系376f5,00,7BCcbrs10來自S.IvcopersicumXLA1777的漸港系3774,20,3BCchrs10來自S.lycopersicumXLA1777的漸滲系377f4,30,2BCchrs10來自S.lycopersicumXLA1777的漸滲系3784,80,2BCchrs10來自S.lyc叩ersicumXLA1777的漸滲系378f4,60,4BCchrs10來自S.lycopersicumXLA1777的漸滲系6862,0o'oparvlQTX-3p+QTL-4p68f2,00,0parvlQTL-3p+QTL-4p782,00,0parv2QTL-9p+QTL-4p78f2,00,0parv2Q化-9p+QTL-4p***)a、b、c和d是重復，每個重復代表5個植物；e和f是重復，每個重復代表3個植物；GT是具有TMV抗性的Moneyberg;Durintha是根據(jù)栽培而具有部分抗性的雜種；Tradiro是雜種，根據(jù)栽培而易感5ofryto;BChirs表示得自5".Zw6roc/^toLYC4/78漸滲作用的回交系；LA1777是野生型品系S./7fl6rac/a/^LA1777;BCchrs10表示得自S.Zw6rac/2a/toLA1777的在染色體10上具有漸滲作用的回交系；parv表示得自S.neorickii漸滲作用的品系。3.".在染經沐川/z"Z^c/;a/teyZ^C〃7S071腐f游So^rfe貧絲^T乎瀉一7^./^^oc/^fey丄j777707X腐f游拔絲歡乎將含有本文所述6*.Zw6rac/^/teyLYC4/78QTL的植物中的抗性水平與來源于WO02/085105的在染色體10上含有部分歷o^;^抗性QTL的S.habrochaitesLA1777抗性水平進行了對比，以及與衍生自其中的在染色體10上具有漸滲作用的漸滲作用品系的抗性水平進行了對比。52將植物品系置于溫室土壤中，在荷蘭標準實施條件下生長。3個月后，通過將含有So^y他的0.5cmXO.5cm瓊脂盤置于在主莖上2cm長度的垂直莖創(chuàng)口處接種植物。隨后用Parafilm⑧封閉創(chuàng)口。接種3周后，從病斑的上方至病斑的下方測量莖病斑長度(由于真菌生長而成斑點狀脫色的組織長度，cm)。結果示于表7。觀測到含有來自S./w6rac/w/tesLYC4/78的QTL的品系示出與來源于LA1777和IL-品系相比較高水平的5o^yto抗性。前一品系示出莖上病斑生長較少，因此呈現(xiàn)比衍生自LA1777的品系更高水平的So^y他抗性(見表7)。在已經記錄的2.0cm的病斑長度處，僅可以測量到原始的創(chuàng)口，觀測到無真菌生長跡象，這表明高水平的抗性。因此，2cm的莖病斑長度表示無凈生長。實方包例4:在禾中間番茹群CS1./vcopens7'c"mcvMoneymakerXX/za^oc/za/fey.品系LYC4/78)中Bo/rfec/"grga部分抗性作圖目U百為了建立更有效的育種程序，包括選擇具有適當遺傳組成的候選親本植物，必需具有表示在至少一個候選親本植物中存在所述遺傳組成的可支配的一或多個遺傳標記。這個程序包括將選擇的植物雜交及進行所謂的標記輔助選擇(MAS)，有效地將有利的親本等位基因從供體轉移至受體群，并保證育種不再依賴于重合(coincidence)，且在開發(fā)成本方面更經濟。S.">^^抗性在野生型品系&/朋"附/7^rac/za/toLYC4/78中鑒別(Urbasch，1986;實施例1)。為了研究這種抗性的遺傳學，對S./ycopem'c畫cv.Moneymaker與&/z^rac/zmfeyLYC4/78之間雜交獲得的F2(r^l74)群作圖(見實施例3)。最初，在F2作圖研究中鑒別了兩個5.c/"ea抗性QTL(如上述QTL-lh和QTL-2h)。隨后在分離的BC^后代中檢測到第三個QTL(QTL-4hA)，這是其作用僅在沒有QTL-2h的情況下才可觀測到的QTL。使用2-wayANOVA分析，在F2數(shù)據(jù)集中鑒別這兩個QTL之間的顯著上位效應。一些基因型類型表現(xiàn)為低頻率，因此需要對&群檢測QTL相互作用(Tanksley1993)。在我們的F2群中，3個植物是對于QTL-lh和QTL-2h純合的5"./yco;^y/c"w，而12個植物是對這二者純合的X/7^rae/za/tes。使用2-wayANOVA，在這兩個基因座之間檢測到顯著的相互作用。對每個類型的平均觀測結果進行分析示出當QTL2是純合S./^rae/^'to時，沒有QTL-4hA的另外作用。在種間分離的F2群中的QTL作圖的一個缺點是表型的廣泛變化，其易于模擬具有最小作用的QTL。另一缺點是不能重復檢測，因為每個F2植物均是唯一基因型的?；蛘?，由一系列漸滲作用品系(IL)組成的遺傳文庫可用于作圖。在其它相同遺傳背景中，每個IL品系理想地具有源自供體物種的一個確定的染色體節(jié)段(Zamir2001)。這些品系鑒別QTL的能力提高，因為I)這些品系與對照栽培物之間的表型變化與漸滲作用的節(jié)段相關；II)每個品系均含有95%以上的回歸栽培親本基因組，微小數(shù)量作用可易于通過與回歸親本對比而鑒別；m)由野生型基因組的其它區(qū)域引起的上位效應不存在。未連鎖的陰性上位效應因此可導致新QTL的鑒別(Eshedetal.1995);IV)每個品系均是純合且能無限生長的，因此可以進行多次檢測(在多環(huán)境中)及V)由于每個品系的遺傳組成與栽培品種在很大程度上相同，因此幾乎不存在不育問題。最初開發(fā)的IL群可以追溯至1965年(Wehrhahnetal)，大多數(shù)IL群是在最近10年開發(fā)的。除了番茄之外，針對大麥(vonKorffeta1.2004)、甘藍(Ramsayetal.1996)、萵苣(Jeukenetal.2004)、瓜(Eduardoetal.2005)、水稻(Linetal.1998)和小麥(Pestsovaetal.2001)也開發(fā)了IL群。所有這些IL群均是使用標記輔助選擇法(MAS)開發(fā)的，但是使用不同策略，即不同數(shù)目的回交和近交世代以獲得IL群。另一不同之處是用于開發(fā)IL群的標記系統(tǒng)(即標記的類型)的選擇。上述4個群均使用SSR標記開發(fā)。在茄屬植物中，已經針對5W朋wwpe朋e仏7LA716(Eshedetal.1994)、>S./za^rac/za/feLA1777(Monforteetal.2000a)禾口5Wa",/yc。/e^s7'co/cfeyLA2951(Canadyetal.2005)開發(fā)了IL。這些群已經示出非常有益于鑒別數(shù)量性狀(Eshedetal.1995;Rousseauxetal.2005)、QTL精細作圖(Fridmanetal.2004;Monforteetal.2001;Monforteetal.2000b)及QTL克隆(Fraryetal.2000;Fridmanetal.2000;Kuetal.2001)。目前，在確定(determinate)生長的(ycopem'cwmE6203中存在一個&/^rac/w"esLA1777IL群(Monforteetal.2000a)。在本實施例中，我們描述了X/^rac/za/to另一個IL群的開發(fā)，如今是基于在不確定生長的栽培番茄S./少co/era/cwwcv.Moneymaker背景中來自X/2"Z)rac/^tesLYC4/78的漸滲作用；在本實施例中還描述了所述品系在鑒別凡c^e"fl抗性QTL中的應用。材料和方法覆激柳與丄艦發(fā)在S.(ycopera/c扁cv.Moneymaker(后文禾爾作SL)與6*./zaZ^rac/za/ZesLYC4/78(后文稱作SH;1978年批次的種子)之間進行種間雜交，產生F,種子。SH種子得自位于德國Gatersleben的遺傳及栽培植物研究所(InstituteforPlantGeneticsandCropPlantResearch)的基因庫。將一個植物自交獲得F2種子，與SL回交獲得Bd種子。F2種子最初用于構建遺傳連鎖圖。Bd種子用于開發(fā)IL(圖6)。使用Stewardetal.(1993)所述棊于CTAB的方案，從兩片幼葉(向上巻曲)中分離基因組DNA，針對高通量DNA分離加以調節(jié)，使用lmlmicronic管(MicronicBV，Lelystad,TheNetherlands)以及使用Retsch300mm搖瓶以最大速度研磨(RetschBV，Ochten,TheNetherlands)。對每個回交系和IL進行AFLpTM分析(Vosetal.1995)，AFLP片段在LI-COR4200DNA測序儀上分辨，基本如Myburg(2001)公布的方法進行。選擇性引物用IRD700或IRD800熒光標記進行標記。使用AFLP-QuantarPro軟件包(http:〃www.keygene-products.com)評價AFLP凝膠圖像。引物和接頭序列由Baietal(2003)描述。CAPS引物系列得自"SolanaceaeGenomicsWebsite"(te^^ffiMLMu)或者利用可得自相同來源的基因組或cDNA序列設計。S./7a6rac/2a/tey與/ycopera/cwm之間的多態(tài)性使用Brugmansetal(2003)所述的CAPS消化方案確定。用于鑒定基因型的標記序列、PCR條件和特異性限制性核酸內切酶示于表30。PCR產物通常使用2.5M瓊脂糖凝膠分離P在表31中，區(qū)分S./fc^to'c調與S./7aZwc/2"/船的不同消化產物針對在感興趣的QTL中發(fā)現(xiàn)的表30列出的每個標記被標出。膨基鵬使用軟件程序GGT(vanBerloo,1999)，獲得每個回交系和IL的圖示基因型。為了計算漸滲作用大小和基因組百分比，通過運行GGT軟件，在標記基因座側翼的半區(qū)間(half-intervals)被認為是相同的漸滲作用。缺少的標記數(shù)據(jù)從側翼的標記中估算；如果兩個側翼的標記具有相同基因型，則假定其具有同一基因型。通過兩個側翼的標記具有相反的基因型，則將該數(shù)據(jù)記錄為缺失。為了評定抗性，在針對每個IL的共11次復制中使用16個不完全隨機的模塊(block)。每個模塊含有至少兩個SE植物和一個S.(yco;ea/cwmcv.Durinta植物。Durinta是商業(yè)栽培品種，產生具有長貨架期且展示一定水平(但不是高水平)抗性的串番茄。在播種6周后，將植物移至完全土壤室(fullsoilcompartments)中，在夜間15。C/白天19°。及光照16小時/天的方案下生長。ll周后，使用菜刀在每個植物的莖上切割兩個大約15mm的創(chuàng)口。每個創(chuàng)口接種lcm2含有及c/"e"aB05.10的瓊脂栓(Benitoetal(1998))，用帶子封閉。2周后進行第二次接種。在測試期間，在傍晚時為植物給水以保持夜間濕潤氣候。在接種后第9、12和22天，使用卡尺測量疾病進展。根據(jù)如下參數(shù)描述疾病進展12天后的修正的病斑大小(LS)(即減去15mm創(chuàng)口的病斑總長度)、過度生長的病斑的百分比(DI),和病斑生長速度(LG)，病斑生長速度以在第9和12天測量的修正的病斑大小中的差異表示，以mm/天表示o,統(tǒng)^學分折使用SPSS12,0軟件包(SPSSInc，Chicago,U，S，A.)進行統(tǒng)計學分析。使用一般線性模型(GLM)程序，估算每個IL/性狀的平均值。使用Durmett檢驗(Dunnett,1955)對比測量的性狀的平均值與對照基因型SL數(shù)據(jù)，概率小于0.05則認為有顯著性。為了分析LG和LS，應用平方根變換標準化這兩個性狀的數(shù)據(jù)。使用Pearson-相關系數(shù)計算性狀之間的相關性。結果<formula>formulaseeoriginaldocumentpage57</formula>開發(fā)iS,/yco/e/"w'c謂cv.Moneymaker(SL)遺傳背景中S./7aZ)rac/2a"asLYC4/78(SH)漸滲作用品系(IL)群。將得自SL與SH雜交的一個Fi植物與SL回交(圖6)。隨后，將隨機的一組14個Bd植物與SL回交，獲得BC2后代(11=59)。對所有BC2植物鑒定基因型，并將選擇的一組植物與SL回交。這組植物是以組合的漸滲作用盡可能多地覆蓋SH基因組的方式選擇的，重組體是以每個異源染色體由三個IL代表的方式選擇。重復這個選擇和回交程序直至BCs，將主要含有一或兩個漸滲作用的31個選擇的BQ植物自交。所述31個BCsSi家族的每個家族最多12個植物自交，使用AFLP標記篩選以獲得漸滲作用純合的BCsS2后代(r^44)。再次篩選這44個IL的標記，選擇30個IL的核心組。這個核心組代表在盡可能少的IL中SH基因組的最大覆蓋度(圖7)。該核心組由15個具有單漸滲作用的IL、IO個含有兩個漸滲作用的IL、4個含有三個漸滲作用的IL和1個仍含有4個純合漸滲作用的IL組成。平均每個IL含有60cM^5.2。/。)的SH基因組，漸滲作用長度在20(1.7%)至122cM(10.6%)之間變化。本發(fā)明的IL群覆蓋原始F2連鎖圖的95%的長度。然而，我們認識到這個F2連鎖圖未完全覆蓋基因組。這可以通過對染色體3(短臂上部)、4(短臂上部)、5(長臂)和9(短臂上部)進行另外的CAPS分析而例證，其中CAPS標記揭示在基于AFLP的F2連鎖圖中無標記的漸滲作用。這些漸滲作用的大小基于高密度RFLP圖(Tanksleyetal.1992;http:〃www.sgn.comell.edu)估算。因為先前未對染色體3的上部進行篩選，因此這個區(qū)域的IL是雜合的。所選擇的對IL5-1和5-2是純合的SH的植物不能結實，因此這些品系保持在其雜合狀態(tài)。含有染色體8的短臂上部和染色體2的長臂下部的IL不存在。在染色體7和9的短臂上部的漸滲作用存在于多個IL中。針對染色體9的上部進行的選擇只有在特異于這個區(qū)域的CAPS標記開發(fā)之后才可以進行。將30個IL群在不完全隨機的模塊設計中在11次復制中生長、接種及評價疾病癥狀。該測試中包括一組正常(fairly)抗性和易感對照。在接種后第9、12和22天，測量疾病進展情況，通過如下三個參數(shù)進行評價過度生長的感染機會或發(fā)病率(DI)、修正的過度生長病斑的大小(LS)和病斑生長速度(LG)?？剐杂H本SH幾乎不出現(xiàn)任何癥狀(表8，表9)，而73。/。的SL病斑過度生長。表8:針對最抗性的IL和對照品系的LS、LG和DI的平均表型觀測結果。使用Dunnett檢驗對比每個IL/性狀的平均值(表9)與S./j;co^"/cwmcvMoneymaker(SL)的平均值，顯著性差異以*或**標示(分別代表p<0.05，pO.Ol)。<table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table>ai2天后可測量的病斑的首次觀測結果；b未確定。表9:針對LS、LG和DI估計的平均表型觀測結果。該表是針對DI淘選的。使用Dunnett檢驗對比每個IL/性狀的平均值與&〖yco/7^s/cwwcv,Moneymaker(SL)的平均值，顯著性差異以*或**標示(分別表示p<0.05，p<0.01)。Durinta68_g§_!！_2i2_!！_42±5.5**在IL群中，鑒別了疾病癥狀減少的14個IL(表9)。共12個IL示出顯著低的DI。7個IL具有顯著降低的LS，5個IL具有顯著降低的LG。IL4-1和IL1-3/3-3示出所有三個參數(shù)(DI、LG和LS)均顯著降低。在DI顯著降低的IL中，過度生長的病斑的百分比范圍是24-49。/。。LS和LG對于顯著偏離的IL而不同，分別在21-34mm和1.7-3.0mm/天之間波動。對照的&/F6^erWcwmcv.Durinta具有一定水平的抗性，其也具有顯著降低的三個參數(shù)，且7個鑒別的IL中每一個IL抗性較這個水平更高或更低。在先前的實驗中，選擇非常抗性的BC2S2基因型(DRS5，見表8和9)。這個品系含有代表18%的SH基因組的三個純合漸滲作用(圖7)。這個品系在上述檢測中是最具抗性的品系。其具有顯著降低的DI(15%)，且LS也顯著降低。與&(yco/^ra/^mcv.Durinta對比，這個品系的DI顯著降低2.8倍，示出聚合的(pyramiding)多個等位基因賦予&"'"e;^抗性的潛力。ILN校疋的病斑大小。(tmn)病斑生長Mmm/天〉過度生長病斑W)24±8.634±6.437±6.437±6.541±6.441±6.445±9.145±6.746±6.547±6.647±6.748±6.54分±6.449±6.550±6.451±9.651±6,452±6.455±6.358±6.559士6.560±6.662±6.565±6.769±6.569±6.670±6.476土6,679±6.573±4.0-3±6.415±6.91346600351363459579437396443796o23C022333343CO343233344454536544424444-44052430444404344-4-C04411-4G044464<y244小44244444444244444-444444444543rt4o^-P4-2，T^"G-^4,2-3,4,n35-2,4,4,m4,4，4,of4,4,4,4，MLH爪J44J43221_-2113129-3_-11-21123431111-59蕃微滲柳游柳當分析各個IL品系中存在的各種漸滲作用(圖7)并將其與各自的抗性作用進行對比時，如表9所示，可以推斷堆積的作用。從品系9-1、9-2、11-2和12-3可以看出，漸滲作用的堆積可起作用。例如可以推斷在品系9-2中染色體6的漸滲作用無作用，因為在品系IL6-3中相同的漸滲作用不提供抗性。同樣，在品系11-2的染色體7的漸滲作用無作用(與品系7-1和8-2對比)。存在于11-2中的兩個抗性模式(DI和LS)不是僅僅染色體11上漸滲作用的結果。這個品系中病斑大小(LS)的減小可以是由于染色體9的漸滲作用所致(與9-1中相似的漸滲作用比較)，而發(fā)病率的降低從未發(fā)現(xiàn)與單獨的9-1漸滲作用相關。因此，發(fā)病率的降低必須是由于染色體11的漸滲作用所致。因此，在品系U-2中，總抗性是多個漸滲作用的結果。相似地，與品系9-1相對比，品系12-3中過度生長的病斑的降低百分比％可以是由于在染色體12的漸滲作用所致，而修正的病斑大小的減小可以是由于染色體9的漸滲作用所致。因此，多個漸滲作用的組合存在使得抗性得以改良。/丄絲微薪之鵬關薪使用溫室生物測定，我們鑒別了含有與增加Ac/恥簡抗性相關的漸滲作用的一組IL。位于染色體2、4和6上的三個區(qū)域確切含有增加抗性的基因。其它IL含有多個漸滲作用，使得更難以查明抗性基因。IL9-2在染色體6和9上含有漸滲作用。IL9-2中染色體6上的漸滲作用與IL6-3中染色體6上的漸滲作用相似，IL6-3是與SL—樣易感的IL。因此，我們預期IL9-2的作用是由于染色體9而不是染色體6上的漸滲作用導致的。IL11-2含有比IL9-1中存在的漸滲作用小的染色體9上漸滲作用。因此，預期降低的DI是由于染色體11上的基因座導致。兩個IL1-4和12-3含有與IL9-2的染色體9漸滲作用重疊的漸滲作用。僅IL12-3比IL9-2更具抗性，提示染色體9和12上漸滲作用的組合作用。因為IL1-4和11-2與IL9-2相比非更具抗性，因此不能除外這兩個品系中的抗性是染色體9的漸滲作用的結果?？傊?，我們鑒別了與增加及cz'w置"抗性相關的位于染色體l、2、4(2X)、6、9、11和12上的漸滲作用。先前在分析這種雜交的F2和BC2S,分離群期間，已經檢測到染色體2上及染色體4上漸滲作用的作用(見實施例1-3)。鑒，基鵬飾分廖對于在漸滲作用與及"."畫抗性增加之間發(fā)現(xiàn)關聯(lián)的所有區(qū)域而言，核査原始的&數(shù)據(jù)集以發(fā)現(xiàn)為什么QTL最初缺失的可能原因。核査標記數(shù)據(jù)和QTL分析結果的偏斜度。染色體1(1:6:6)、染色體2(1:3:2)和染色體9(1:6)上的漸滲作用顯著偏離預期的1:2:1或1:3比率。對于所有這三個區(qū)域而言，均觀測到缺少純合的51./_yc0pe^/CMm等位基因。核查針對區(qū)間作圖和使用Kmskal-Wallis程序的單一標記分析的QTL分析數(shù)據(jù)，但是未發(fā)現(xiàn)關于在F2群數(shù)據(jù)集中染色體6、9、11和12上顯著QTL存在的證據(jù)。本發(fā)明中使用的標記下表提供了關于在各個連鎖圖中示出的與本發(fā)明QTL相關的各個RFLP禾PCOS-II標記的詳細信息。所述信息從位于Comell大學SOLGenomicNetwork(SGN)數(shù)據(jù)庫2005年10月7日版本中直接拷貝。表10TG609RFLP標記物RFLP信息名稱TG609插入物大小1900載體pGEM4Z剪切大小PST1藥物抗性AMP正向序列GAAAATTAAAAGATCATTAACACAGATGATGTGAATGGGCTTTTACATGCAGAGATATCAAGGATATGCCAAGTAGGCAAGCAAATTTGAATGCTCATTTACATGCAGAGATGGCTCACATGTGTGATCAAGCAACTTTTTTGATCAGCTGCTGTTGCCTGT反向序列AAGAAAATTAAAAGATCMTAACACAGATAATGTGAATGGGCTTTTACATGCAGAGATTGCAAGGATATGCCAAGTAGGCAAGCAAATGTGAATGCTCATTTACATGCAGAGATGGACCACATGTGTGATCAAGCAACTTTTTTGGTCAGCTGCTGTTGCCTGTTACTGAG62表11TG62RFLP標記物RFLP信息名稱TG62插入物大小1800載體pUC剪切大小PST1藥物抗性AMP正向序列TTCGAAGCTCAAGAAGTGTCGGTATTATCACGGCCCTCCAGATATATGGTGGACAAAACATACTAACAGATTGCAAGTT願CATMAATAGAGTTCAATTTTGGGAAAAGTTGCACGTGATTCCAGTACGAACTACTCAAAAAT■CAAGAT反向序列TCTCACAAGATATTCATGCCTAGTTGCAGTCTCTGAGATGGAAACAGAGAACAAAGACAGGAAATTGACAATTACACGGAAACAGTGTTCAGGAACTTCAGGACAAGGAGAAGCAGTAACCAATACAATGT.GTTCAAGTGACTAGATCCAAAAAGCAGTATGATCAGATGT表12TG555RFLP標記物RFLP信息名稱:TG555插入物大小:1600載體pGEM4Z剪切大小PST1藥物抗性AMP正向序列GAAATTTACGAAGGAATATTATAGACTGATTTTAAGCTTTACTTGTGTGAGGTAGACAATTGCGAGGGTCAATCTACCAATTTATGGTGAATAAGTTCTATTTGTTAGAAGTCGfiATACATTTTATTAAGGGTTCTAATTGTTGACTATGATAGCAAGCATGCCGTACTAATT反向序列TATAAAAGACCGCGGGGTGCACCAGAGAATGATAATATCTACTCACTTGAGTTGTTTGGTTTTGTCCTGCTGTGAGCATGTTCAGGACACATATATTACAACTTCACTAACAAATTGACCACTGGTCGTGTGATTTTTGGACTTAATTATTATCTCAATTCTTCCTCAAAATAGCAGTCCTTAGATTAGAAGCTGAGG表13CT50RFLP標記物RFLP信息名稱CT50插入物大小:1600整體:pBLUESC剪切大小EcoR1藥物抗性AMP正向序列ATGAGAAATGAATAATTGTCACATTCTTGTCCACATTCTACTCCAGAGAGAAAGTTGGAGATTTGAGAAAAAAGATCAAAACTTTACTCTTCTGGGGACGAAGAGTAAGTAGACAAGCTTGAAGTTTAATTTTAGTGGCACTGGTAATG反向序列CCTTCGTCGCCGGACAATAGAGGGCCGACTTTCACTCTACTCCTGTTATCAGTCCCATAGATTCTCCGGCTCCCTCAAGCCTGGATCAAGCCCTGGAAGGAATGTGATGTTATTTGCCTTGCTTTTTGTTGTTGGTTTCTTCGTCCTTTTCTCCTTCTTTGCTCTCATCCTTTGGGGTGCTAGTCGACCTC65表14C2_Atlg74970COS-II標記物作圖實驗圖番茄-EXPEN2000正向引物(5&apos;-3&apos;):TCATCATCAACTATCGTGATGCTAAG反向引物(5&apos;-3&apos;):ACGCTTGCGAGCCTTCTTGAGAC溫度55°CMf2濃度1.5mMPCR產物大小LA716:1000LA925:1000消化帶大小(usingAlul)LA716:550LA925:850作圖位置圖染色體偏移置信J番茄-EXPEN20004109.7I表15CT128RFLP信息RFLP標記物名稱:CT128插入物大小:700載體pBLUESC剪切大小EcoR1藥物抗性:AMP正向序列TTACACTGTCATCAAACGACCAGAGACTTTTGTTTACGGGGTCTGCAAGGTGGTCAGCAACATAGCAAGTCTACCGTTCTTGATCTCCCACCAGGGTAGAGTGGGTCGACAACCTCGCCCAGATGGCCAAGATGCTTTGTGCATGGACCAAGCTTGGGTTGCCCAAGTAGTCAA反向序列CCGTGAACTTGAGGTGATCCACTGCAGATGTTCGGTGAGGCTGTGTGGTTCAAGGCCGACAAAGCATCTTGGCCATCTGGGCTTGCCTTGTCGACCCACTCTACCCTGGTGGCAGCTCAAGAACGGTAGACTTGCTATGTTCTCTATGTTTGGATTCTTTGTTCAAGCTATTGTCACCGGAAAGGGTCCA表16TG599RFLP標記物RFLP信息名稱TG599插入物大小700載體pGEM4Z剪切大小PST1藥物抗性AMP正向序列TCATTTTCAGCATATAATCTGTATCATGAGAGGGTGGAACTTACATTTTCTGTTGATCGGTTGGGACTAAGATTTTTTGAAATGAGACTCCTGATGGTGTGGGAAGGCTTZVTAAAGTCCCTACTTATGAATTCTTTCATGGTTTGGTCAATTGAGAAGGATCAAGAAATCTGATGCTACTTTATCATGGGAACTT反向序列AAAGAAACCAATAGCATTGGTCAATGATGCTTGATCCTTCTCAACTGACCAAACCATGAAAGGAAATACTACCTCCTCCTTTATAAGCTCAAGGTAGCGAATACCTTTCTCMTTCTTACAAAAACAGCAAGCAAGGATCAACAGCAATACTGTCGCAA68表17TG10RFLP信息RFLP標記物名稱TG10插入物大小900載體pUG剪切大小EcoR1/Hindl藥物抗性AMP正向序列TTTCATGAGAAAATGACTGGCTATTTTCAACTTTG反向序列CTGCTCTGCCAATAATAGTTAAGCAGATCAGAAAGATTAACCATATTATCAAATAACCTAATGAGTACACTTTCCCTTACTTTACTGTTCTCAAACTGTTGGCCAAGGTGATCAGCTGCAGGGGATGAATCCACACCTTTCAGTTTGGCCAGACGAGGAGTCCAATGGGATAGAAGGACTAACTCAATGACGTATG69表18TM2aTM標記物TM信息名稱TM2A舊COSID:T0899序列C腿GCTCGANNNACCCTCACTAAAGGGAACAAAAGCTGGAGCTCCACCGCGGTGGCGGCCGCTCTAGAACTAGTGGATCCCCCGGGCTGCAGGCTCCTCCMTGAAAAGGGAATCAAGTTTGCCAAAGAAAACTAAAAAAACAAAATTATGGTCTAGTTTTCTATAGTGACAGTTTTGGATCTTTTTGGGTCAATTGTTTTTGTATCCTTTGCAAGTTTCTTGCAGCCGGAGGCTTAGATTTAGCTCTTTTGATATTATACCCAACATTTCTACAAAATAATGTATGGCAAACTGGGGGCCTATCCCATTTGCCTTAGTGTGGAGGTGTTATTCTCACATGAATCGTTTTCCAATTATGGTTAGTAGCAGACAATTGATGCAAAATGAAGAAATGTTCATGACCAAAAAAAMAAAAAAAAA作圖的位置圖番笳-EXPEN2000fTM2A)染色體偏移50.5置f曰度表19TG551RFLP標記物RFLP信息名稱TG551插入物大小:950載體pGEM4Z剪切大小PST1藥物抗性AMP正向序列CATTTCAAGGTCCATACCAAAACATTTGCTGCATTTGCAAGCTCTTGATCACCAAATTTTTTGATAAGTACAGGTTTATTTCTACATAGCTTTACCAACGACAAATATAACAAACTCAATGTTGGTTAAGGAAATTTGTCAAGTAAAGTTCAA反向序列TTATATTTGGATTTACTTATTTTATATAGGATTTCATAAACGCATGTGATC71表20T1405COS標記物COS信息名稱T1405MIPS分類1.05.01EST信息T1405自EST記錄TPTAR86TH開發(fā)Arabidopsis同源At匹配T1405相對于ArabidopsisBAGAC009243.3最佳匹配。At位置1.1490000At特性0.677Genbank蛋白擊中最佳Genbank蛋白擊中AAF17692.1評估1.5e-67畔寺性0.677描述"與beta-1,4-木糖苷酶dbjIBAA24107[擬南芥]相似"作圖位置圖染色體偏移番茄-EXPEN2000477.0072表21<table>tableseeoriginaldocumentpage73</column></row><table>表22TG254RFLP標記物RFLP信息名稱:TG254插入物大小2200載體:pGEM4Z剪切大小:PST1藥物抗性AMP正向序列TGCTTTCTTCTATATCAAACTGGGTCTATTGAAGGATATTTTATTATGGAAATTCAAAATATATCTTACATCCCCTTATCAGTAGTGCACCAAGGGTGTGACCTTCCATGTGTCCTAGCCTCTTAGGCTTGGTGGACTTTATTGATAAATTATTCATTAGAACAGTTATTAGAAATGTGGAACTGGTTGAGGTAGGCG反向序列TGGCTATCAATAGTTGGCAATATGAAAACTAAGACTTGTAACAAGGCTTTCATTTGTGACTTGAGAATAGAACCAACCGTACTGCTTTTTCTCCACAGCATCGAGCACTGCATTCATGTTTGGCAATATTTGACTGTAAAACGCCAAAAGTACCCTGGTTTCCTATCCAGTTAAGGCAACAGTAGCAGAAAATGAGTGTTGTAATGAGTCAAT番茄-EXfflR1997(S,lycopersicumTA209xS.habrochaitesLA1777類型BC1,1997)表23TG223RFLP標記物RFLP信息名稱TG223插入物大小790載體pGEM4Z剪切大小PST1藥物抗性AMP正向序列TATOAAGAAM，TGTGTAGTGTTOCCAA'TATTC:flAC節(jié):r:imG:fTCAM"GG幼TGGGATGGiTGAG;r'GAT;rCCATAGGAATAACA!T.CCT'GGAGAiTCTAGGTTTGGAC;TCCAGiTT'.,CATAAGTGT,CC.C:ATC:T.GC窗ATCT'TACMC3TTCAa'lTCAAACTTGT您GAGTGC-GCC:ATAGTAGATCCAT.GGAGAAGAAT'TAT;TGT'TCCTTAG鵬C:AG餘CAG!3SM"JT.C織.鵬CAAAT咖A,GTTCAG秘GAGJ5GACTAAATATC:TAACM"GCCCC'CTCA2LGCi"CC;AGAT,g'GTAAaGC反向序列tttccacacacaciiaammacmcttgaacacactgtaatcc.ccctc^tcatcaai^accacacaaci^ccclcttctgaacatocaaagtcgctpatccagaaagtct.l"ctoat.gc窗ttgacc譜gaot.tcci"gtcac，ccaacatg環(huán)ag窗tt'stagggaatam:tt.SaaatcagattAc;雄gatCTCAAACl"CaaGT加CTTTACC:ATC:TGGAGCTI^A卿G.GCA窗mGATATTT秘TCC-CTCTTCTG番莉-EXHIR1997(S.,lycopersicumTA209:xS.habrochaitesLA1777類型顧'l的7)表24TG47RFLP標記物RFLP信息名稱TG47插入物大小1900載體PUC剪切大小EcoR1/BamH1藥物抗性AMP正向序列T.i3CAGTTOA^TTCGi'CTTCTMCACT聰CTCTT幼GCGCATCAAGACAAC.C.GACCCAOTAGTACATT.TG.GT5"TTACCAAA.T.OTCTTC歸卿TAAATCTATTTGAC贈鄉(xiāng).TCACTCTCTMATCATAAGCTGAmc^catacccgtaaat.c;taaaacmact'CTAl3AAmGCCttac.ctcat.cattcctaggac加mttatatctCTMG.GTG.SAACAlGTTAACCCCTCCTltTGAGTaTTT.AT.ACCATCATATTTT^AAACTTCTCGTA郷TC肆TGTTTCTTTTG.G.TACTTC:TT.AG'TATA(3:C!rTGGAG:r'GGGAC;.CCMGGG(3CTCCAGT.GWrTCTAGACAftGAfti\反向序列ctt窗ttgc'tg(3aa(5acagagatttatacacaatsc饑tcttttt,tcaat歸tctttctccttac膨tgtaccttt(5acact.&gtt,t.catagacact.acttgtacmtc;tt■rTATGACACTGACTTGATGTTCjTAAGAGTGMATGTATAGACTiAllCaACAaaTAA■cagagtagaaatm^ac5Tag'gatagct:daaattgatattcaagtttlgat番茄-EXPEN2加0(S.lycopersicumLA925xS.pennelliiLA716類型表25TG幼3RFLP標記物RFLP信息名稱TG393插入物大小1200載體:pGEM4Z剪切大小PST1藥物抗性AMP正向序列.ACTGACTAAGCTG.CT&,，,奴GCC-GGMTT!rACi^TTGGTTM:鄉(xiāng)CTTG.CT.ecATCACC'TTTOCTT奴T'eTASGTC:職C:TAGGC:TGiCaACAGCCTG改T幼TMC.AG!SAAC站AGATGGTA-C'iTTAGCTATTCACTAftCAATCGTTTACCTTAAAAATGTTATTCTGTA反向序列T.GC&爆'ACCAAAGAAAC船TTG5TTATAfiiAAAAftCAATCCACAAT-CATTCTC:TATAG縱TOCGCAAAGACACTACA亇AACCTC.GTGC膽GAAGAG!3AT(3，MTAAGi^AGCTCAGIAACTTC"Ciy^AAGAAAA鄉(xiāng)GAC"C.Taa-TT.CTCMCTAGC.TTIAGOTAT.ACACTZ^AGAAa^GGMAATAAalTCCAA,AAaC恥TAATCAT、GAtTACCCCCAPCTCACACACCAC.CACTACAGCACAAAAATTAGAAAT.GTTGTATGGACCATGATCAACC:縱CAAGCACAa-GAGGAGAATAT.CATCTACT番茄-EXPEN2000(S.lyeopersicumLA925cS.peimelliiLA716類型F2.200仍Ctl9RFLP標記物RFLP信息名稱CT19插入物大小300載體pCR1000剪切大小HindM1/EcoR1藥物抗性KN正向序列反向序列GCCCC^^ACTCCTGCTGGM^TTACTGGATCT.CCACTTGCTGCGGACATTGCTTG:TG.TCTT.GMAT.TAATC.CCTT(3TACC.CATTGG:T.i3CT化CTAAAtGACCTCC"3GCAT.CCGC番笳-EXPEN2000(S.lycopersicwmxS.pennelliiLA716類型78表27RFLP信息RFLP標記物名稱TG68插入物大小1900載體:pUC剪切大小EcoR1藥物抗性AMP正向序列GGATitT.GATGAaCTlGTATCTG:TGCTTC.TA(3C'TCCK:C6A':r,TTTCCmTTAAftnTG雄ACACCTGCCTT潔ATWriTT.卿.GCi3tAAG!3ATTTTCTATGAA'G.站TA贈AT咖TGTATGT.GfAAAGC3ATGCACTAA3CATCTCG.GM_aM..i3AMTGAACTTTGGGC'T'TAAC:TCTOT.CCAAAAGT反向序列CCA加AACAATAC:GGA(5ACATAAG'AAGGAAaGAAAAGT站GC.CATGACl"AATTGGTAAT由CGGCATA!TGATACGAC策CAGTTTTGACTGTT(STC:TACAAT脂.GAfTTC秘雖CATTAi^ATCACAAGAGIACACCTCT&CTAGMTGGeT番茄-EXPEN2000(S.:lycop戰(zhàn)sicmaLA925xS.pennelliiXA716類型F2.2000)表28TG565RFLP標記物RFLP信息名稱TG565插入物大小1700載體pGEM4Z剪切大小PST1藥物抗性AMP正向序列C(3Tt:lGC.AMACAA(3破CK;AC!rTTAATCCTCTGT'l"ACCi"AAAA^CAATAGTTGTat印aaagaaaatcttacagttfgagirt&ctt'gcgaaagtag.c:cattt，.tacaccag't.tgagamccttct.gcaatclmcat'tttgmgactctttc.c't.ctgitittccc;t.a節(jié).c;tATACAACTCAaaGAAAC.AM"CAAl"TATACTTCAAATTAATT:G郎GiTC:GC.TMftAA:rG贈CCT!r.T.AGACTMCAACATCCCACMGT.CCT反向序列TCAGCAAAA窗CACACAG職GTAC歸AGTAGAGCtoG;TAGAGTAGGGAG雄■CACACAT'TTGACAGCTCAAAACCACTTTACCAATCCAAACMftAAaTCATCACATT■ATCCCTCCCT'TCTCTCCTTTCTCTATtACTCT.CAattcaagm"ct:gtccttttgaggagactt加tc:cttactatggtcttctttict'ttgat.g&tttc'ttatgtgagat&ttgmaactggaaagaagtgaraaag.ataggaggtttggtttctggggtttg'tttattttgctttacaaggGttam.gat:tggatct.tttttagtttt.ggtag番茄-EXPEN2000(S.lycopersicumLA925xS,pennelliiLA716類型F2.:,0)表29TG296RFLP標記物RFLP信息名稱TG296插入物大小1100載體pGEM4Z剪切大小PST1藥物抗性AMP正向序列TT.AG.GTTraTGTG'TGgffTCMCGTTTlTG'GTTTTGATTTTTATGTGTTTTCTTAGTtt.tot.gttct'g^'cggcata^gtagt.gatttttcagacagttt.ggtattatggagtctgatttg窗at.gc'tt!3ttltagtttcg幼ggtttttgagt.itttgatc3attcaatgttttagt';ett:.gatggtt.tttgag窗ttgat反向序列ag敏at腦aaa2iaagc站atamtc織;raat情gc:ctc脂ctc:;aact.gaataac纖totat.ca,gata鵬tagacgataaacagtgmg.gtagmgcctaac:tc.tatgac臘atot(agaccc:aaaacactaagtactattaactaattatcmmc:tag.aattci:caaaataaayvm".aacamtc;ttatcagtcacatgoacftttcatt^aacatcatgaagmgacaa加gggaag.gtcaaaa:tg(sactccarggcac.ataaga池節(jié)gaaaaatttmtcaccagatatcAat纖attatotitcttccttcattcatgaggggC;atgcac站gagac織atac;.atotttct'ccttttactttttctttc'ctgaggaagt^aaaggagcagaaagcagataga^ga番茄-EXPEN2000(S.ycopersicumLA$25xS.pennelliiLA716類型F2.2000)81表30弓|物序列，PCR產物長度以及酶，顯示對于CAPS/SCAR標記物的多態(tài)性標記物名稱抑24TG^TQ柳TQM5qi—At4g3p力0C2—A"g64670TG5(iTG585T加C2—At5g60，60TGM9Ct229T卿TG272TG62TWCT50TG44ICD3Itg318Tp35BTG60crmtG.183TG10US,CT203.CT240染色體引物序列GTATACTCAACAGAGeTTCAGAC500AAtTPTAbGCTdCAGt06tG300CTGAAGCTC八CCfT^AGGTGCGAAAT加ACTATTCCACJAtj柳qTAATTtG^AC7tCTT(iCCrTTCATTTOCTJ3GACAGGCAe亇C850TGTCATCAAACO入CCAGAGACATCATAtCTTCTCtCK^AAACCC700TGATAAATGQTiJG'GAAGA'rTJ3ACTC.200ATCAACCTOGCTCCATCtfCTATTTGTCriACAGTTATTGCTTCTTGnTC柳TGCAGA6CTGTAAfATTTAGAC柳CQ^TC化XGTTGi:AACTCMGCQAGCTCGAATTCAATTCCAAC柳C卿ATTTTAQTnTTCCOATdCtTTffTACCATGAiTGTCCOATC380GGCATTCATCATTCAACATG!CTGGAAAGCCAGACACACAGA589C八dG。GTATCAGTAGGCAGKIGdGATTTGGCTiViciqdGirA卿AACa3MAi3GCTTTTCCAAOTGGTGCAACAAATCCCGAGC1500AGTTATCATAATGGCTAGCiTCACACAaTGCTAATCAACGTTATGC500fCATCCACCGCCCACATTTCGCATGCCTGCAGAGTGGTC350ATTCGCTACCTTGAGGGCTGAATiTGGCAGGCTOAGTOTKk;.850tCCCkCCATrGTtACCAGGACCACTTCCTCACTGCTTOOAC"GC5印TAGAACTTGGCATCCdTT.GAAGCTA(iACAATTGTCACAGAAGTG卿■CAGATCATTGtJTATACAGCrGA^ATTCTAGAATGCCTrTTGTC13-:itCCCTGGCmCTGCAliiCAtCATbi3AGAGAXGCTGGAACAC4C0TTi^ITAGAGCCCAbCAGCAfcargggctgggatcotaqtaaa柳Aagcttgcgattcccataacacaaagcaatgocicaatogtj(mACACAGCA(^TTtC入GTAeiGACGATtTTOCCCCCTCTACCA3S2ACATCmTCCTtCCCTCTGC.GGAAC人GOTCAOGACAGCAT520tggctaa6tgacGaagacg入.CJ\tGeCTAGTTGCAGTGTCC410ttcAgcagcaagcaaa。atgCXcbAACAACTAGCCCTTGA535AAGC"TTCCtCCAGCTtCA0ACGGCGTATTAC6TTCAGA3S0CTAG,CACCCCAAAGGATGAGTGTCAGCATAGGCrnTCCA一COGTC^OGAAAAATGACA入TCTC卿ATt:ATGGTTGAe501ATPFCCAFAOAAATTCCAAA.CAACCCATAGAAATTGCCtn"a450TCJCTCTCTCTGTGATGGAAOCCAACTnTCCAGGTTCATTTTCTC70*>ACACCTACATGCTACTAAGOGQirCTtGGCTGAAGTJ3AAGAAAAGTA卿AXGGGdAtTGTAATATXiTGTC.CACCAGCCCCGGAAGAtTTTA3S4.GCGGTCAACTTCAGCAACTATCTAClTGtCTOCCAAGGAmC]200CCJTGCCQTTCAAGAAGAGTCATTGAAGAATC3GCGGTGAAG1USATGCCAAdriCTTGGCAAACTTi3GGAATATAGTOTAGGAAG卿.CTbGAAAGGGGAAAGACCAAGAAAATATTGTG了八GTGTTCTCt:A:7G0TCCCCCTCtTC八TCAAATTCATX3AtAT亡CACA亡CCCtGGAiB7ATGCCTCi3AAATTCAAATGGAGCGTCACTCCATACTTGGAATAA咖AGCtJTCACTCAAAATGrACeCAAAAGCTdCCGTGTCCTGtATCAACTCAT^TTCACGCtACTTTCTtAT人GAA了ATGGGAAGCGAAAi".0他GAOAGGAAGCGTAATAOO.ATCCC/uWJTACCCTCGCArrAGT850AGCCrrCTTTG丁CCCATCAGTOTTCTCTCGGCATAAAGT力3TGCTAAAACGGACCTACAA_觀寧的PRC產物長g(bp)酶55:55capsCAPS-5555SCARc"sCAPSC*SCAPSCAPSCAPSSCARfAPSCAPSCAPSCASCAPSCAPSCAPSCAPSCAPSCAPSCAPSCAPSSCARCAPSscarcapsCAPSCAPScapsCAPS，n—I聊"i卿碗緣l"加&。ID刺<table>tableseeoriginaldocumentpage83</column></row><table>參考文獻4vSubelFM，BrenjfcB，King祐oiR起，Moo^》D，$ei^m，aJG，Si^i雄J4>KU的5〗."Charr紐tP改toColsm琉o!ogy",4體，啦ti9n,^)iih討加y^4.召on.白BaiYL，Hti，gCG，v站d紐fcMgi〗erDekens,，Bop&^xtaQ，？4;adiioptf(2i3購forto郵t.oj)idei^;.mil4e,wr'esisj^ee—0/.—鄉(xiāng)ifl;..Lyep-ersiconpgrviflorVi叫G1.16QicQ-l。b^ili加Withtwoj^ialitatlye.ii.oW(iefy'ijj.(iewtesist.a:nce.gene.s.it/oZ,i《cwi《w,^h&e〖n.ferac《i'07is'16:i6.9-176,BenitoEP，tenHaveA，V&ft'tKlppstet:,JW，yapK&nJAL(199$)Jfuii長alandjj'l'amt、ge站expressionduringsynchjroiii的dinfection.ofto邁ato.leave甲bySW77"sc&erec(,fc.J.H卵,尸fl^。1104:207，220.B.ern&cch.i:D，T.anksley$D.(1.的7).An.intefspeG迅c'baqkciro朋ofLiycopet.siconlycopersicumxhir.siat卿Xinkageianalysiand.aQ饑s加dy.ofsexual-cpmp.atiMUtyfactorsandfloraltraits,(e"g"es147:86.1-877.BrugmaiiSB，vander過ul對BGM，Vi卵erRGF,L組dhoutP，vaiiEcj5HJ(20Q3)Anewandversatileixiettod.fQrtjies恥cess&lco.nversicmofAFLP(TM)markersinto.simple.sin^te.l鄉(xiāng)smarfer3.JV"c続resecwrcA31;'鄉(xiāng)—9陽郷—17C&iiadyMA，MieglitsV，Chetelat(2005)AlibraryofSolaftumlyeopersicoi(i印intr,o.gy印sionlines:i;n.c必iyatedtomato,.(抓ome48:'685-697.ChristouP，Murphy.J婦，andSw&in(1.9.87)Stabletoajisformatipiiof'soybeanby..e.lectr.oporatiOnrootforpaationfeomtransformed.callus.iVoc.ATa"..Acad.Sci.USA純3鄉(xiāng)-3966..C^ucehill.GA，Do:etgeRW(1994)Empiricalthr.eshold'valuesforQuantitativetraitmapping.(5卿&cs138:963-971.t)e.shayesA，fleix,e:ra-fistrellaL，Caboche'M(1985)Jijp.osome-mediate.dtr卿formatiou.oftobacco邁esopJiyUpro力opl.asjfcsbyanEscherichiaeoli'pla卿itj.認50/.4:2731-2737.P*HalltiinK,BOnneE，BosswtM，DeBeuckeleex\M,Lee鵬ngJ(19的)Ce^4:1鄉(xiāng)掘5.DikAJ，K6ning(j，KohlJ—(1999)Evalu&tio.n.ofmicrobialantagonist'sibrbiol。gic:Slcontrolof.Bofry.Ws(C"ere.a'steminfection.incucumberandtomato.Ewr.丄刊cwiiPa組105:115-122.DoganlarS，F(xiàn)r狄yA>Kw鵬抑dTanksley幼(2002)MappingQuantitativeTr.aitLociinIpbredP.adkcfossLinesofI^copersicortjpi7^'re.eWi/。feim(t4"柳9).Oeno肌e45:1,1202,r^a-妙J，DaveyMR,Free卿pJP》Cpek4ng取C0b耳Tiplasinid'h腳plogojis的q恥加郎p昨sentintissuesfropaAgrobaetferitunpl的ftii4々幼'sformedPe似wiap:rotoplast;s'月a擬諷dC^ZP一W.23:45:1-46.8:.t)卯加tt.CW(l鄰5)Am'ultipleeo.mparie的pr.peejiuie.fo'rco卿gringseveralfere.atroentsw,ithacontrol..Ji.ymaZ.。/沐eA/rieHc諷攻o《s."caZ/1卿<^<^抓50:10加'1121.EpksteinF(ed)(l的l)，go恥cfeo似印.cmdii/ia^ojws,4iVacficq4ppr卿A.OxfordPr郎s,敗199,1.起du站doI，ArusP，Monfprte.(2005)j)eyeiop邊entof.agenomiclib,raryofnear.is順niclines(NlLs)'inmelon.(Cw加'm^mddL.)fro'邁the卿JicaccessionP.Il.6.137.5.iEgashi"H，;Kuwas,liiina.A,Ishigtjro、H，F(xiàn)ukushima.K，K砂aT，ImaixishiS(2Q00)Seteeningofwildaccessipiisiresistant.tograympldCSoir;yfivs.cwereaPers.).ir;X^ccipeWcomAc《ap一ioZo^iaepi!a咖rw饑.2'2:3.24-3加.忠shed%.iZaj31if.1)(.1994)Agenomic.library.ofXy卿e/^ccwp.e柳e戰(zhàn)iinS.Zyc9per^c她.a'toolforfiiie.mappingofgenes..E卯hytica,Dor細cht:Klu沐.erAcademicPubUsJiers.199479:17.5-179Eshe.d'Y,2amirD(199.5)Aninlxpgressioijlinepopulatipnoft;ycqperS.icoMpe/me坊iin.thecultivatedt(mato、enablestheident迅c.atiQnAnd.fi'nejn.appingpfyield-卵sociate.dQTL.&6neties.B.ethes.da,Md.:GenetiesSocietyofAmerica.Nov19951147-1162FpoladMtt，ZhangLP，K]haAAA，NinoJ4uj)，LflnGY(2002)H印tificati(wof;QTLsforearlyblight.(Atoman'aso^wi)resistanceto咖to.usingbackcro白s.populations.ofa.L:ycop《rsi,《y卿e,s.iicx二/^raiif"mcrt).ss.T7ieo:r'4ppZ,G柳e&cs104:945-958.FraryA,Dogan!幺rS，F(xiàn)r加ptonA，F(xiàn)ultwT，UWig4，Yates玩T3由leyS(2003)Finemappingofquantitativetraitlocifor.improysdfi:uit'ch3ract;eristiesfc.onlLycop.ersicQnchiiiielewsldiic]hx她os卿e.1，.(5en帥e46:235-'243PrajyA，Nes卿TC，GrandilloS，K加ap%d，CongB，I4wJ，J，EllerR，AlpertKB，TauiksteySt>(2PO0)f^2.2:aquantitativetjr汰itloe邵geytothpevolutio;nof.to叫tofadtsie.SW.肌cT^asAi'7ig:妙.20晚.g紐扭-路.'.'.:tVi4mai1E，.6站:r^:iP，t4uY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域表示，-其中所述QTL在所述植物染色體9上的位置由包含S./za^oc/za^s的染色體9上的或者/ycopeM/cwm的染色體9上的遺傳標記P18M50-141、P14M49-240、TG254、TG223、TGIO、P18M50-134h、P14M49-243h、P18M50陽599、P14M60-222h、P22M51陽417h、P14M50陽174h、P14M60-157h、P14M60-107h、P15M48-138h、P14M48誦113h、Tm2a、P18M51-146h、P14M48-282h和P14M50-276h的基因組區(qū)域表示，-其中所述QTL在所述植物染色體11上的位置由包含&/z^rac/za/tes的染色體11上的或者&/少cop^s/cwm的染色體11上的遺傳標記P14M60-215e、P14M61-173h、P14M50-307h、TG47、P14M50-29xCD、P18M51-358h、P18M50-27xCD、P18M51-136h、P22M50-488h、TG393、P14M61-396h、P22M51-235h和P22M51-174e的基因組區(qū)域表示，-其中所述QTL在所述植物染色體12上的位置由包含S./z^rac/^/tes的染色體12上的或者51.(ycope^/cwm的染色體12上的遺傳標記CT19、TG68、P14M48-411e、Pl簡0-244h、P18M50-273h、P14M61-420h、P14M61-406h、P14M61-223h、P14M60隱193h、P22M51-314h、TG565、P14M48-172h、P22M50-321e、P14M60-219e、P14M48-153h、P22M50-97h、TG296、P22M50-131h和P22M51-135h的基因組區(qū)域表示，優(yōu)選由包含5"./za6rac/^/fes的染色體12上的或者6*.fycopem'CMm的染色體12上的遺傳標記P14M61-420h、P14M61-406h、P14M61-223h、P14M60-193h、P22M51-314h、TG565、P14M48-172h、P22M50-321e、P14M60-219e、P14M48-153h、P22M50-97h、TG296和P22M50-131h的基因組區(qū)域表示。3.權利要求1或2的方法，其中所述包含至少一個Bo^yfe抗性QTL或者其賦予B^o;to抗性部分的核酸的轉移是通過將所述Bo^y^抗性供體番茄植物與So^;^易感的受體番茄植物雜交，產生由于漸滲作用而包含所述QTL的后代植物而進行，其中步驟c)是在一或多個后代植物上進行。4.權利要求1或2的方法，其中所述包含至少一個So^y他抗性QTL或者其賦予So^yto抗性部分的核酸的轉移是通過轉基因方法(例如通過轉化)，原生質體融合、雙單倍體技術或者胚胎拯救技術進行。5.權利要求l-4任一項的方法，其中步驟c)通過檢測分離自所述受體番茄植物的DNA中的所述遺傳標記而進行。6.權利要求1-5任一項的方法，其中所述步驟c)進一步包括對所述植物進行生物測定以測量所述植物中的So^y他抗性。7.權利要求l-6任一項的方法，其中步驟c)進一步包括選擇在基因組內包含至少一個So^y他抗性QTL的植物，所述QTL選自位于S./^6rac/za/feyLYC4/78的染色體1、2或4上的QTL，-其中所述QTL在所述植物染色體1上的位置由包含S./^6rac/7&te的染色體1上的或者&/ycc^e^/wm的染色體1上的遺傳標記P22M50-412h、P14M50-349h、P14M60-69h、P14M49-192h、P14M49-232h、P14M49-260e、P14M50陽503h、P薩50-124h和P14M49-114h的基因組區(qū)域表示，-其中所述QTL在所述植物染色體2上的位置由包含S./^^oc/zfl^s的染色體2上的或者51.(yco;ww'cww的染色體2上的遺傳標記P14M60-537h、P15M48-257e、P14M49-327h、P14M49-325h、P14M61-286e、P14M61-125h、P18M51-134h和CT128的基因組區(qū)域表示，及-其中所述QTL在所述植物染色體4上的位置由包含S./zWrac/zm'to的染色體2上的或者51./j;cc^era'cwm的染色體2上的遺傳標記P18M51-169.5e、P18M51-305.4h、P14M60-262.9e和P14M61-292.7h的基因組區(qū)域表示。8.權利要求l-7任一項的方法，其中步驟c)包括選擇.--在基因組內包含至少4個抗性QTL的植物，所述QTL選自如權利要求l、2和7定義的QTL組成的一組，或者-在基因組內包含至少2個So^yto抗性QTL的植物，所述QTL選自權利要求1和2定義的QTL組成的一組。9.權利要求1-8任一項的方法，其中所述方法進一步包括步驟d):將在步驟c)中選擇的所述植物與栽培的番茄品系植物雜交產生后代植物。10.可通過權利要求1-9任一項的方法獲得的So^yto抗性番茄植物或其部分。11,5".(ycopera'ci/m中的5。^y他抗性QTL，其中所述QTL選自權利要求1或2定義的與Bo^yto抗性相關的5Wam/m/7Wrac/7mtesLYC4/78的染色體4、6、9、11和12上的QTL組成的一組。12.得自包含權利要求11的QTL的S.(vcc^Wc謂種番茄植物的分離的DNA樣品。13.—種檢測So"^抗性QTL的方法，包括檢測疑似So^yfe抗性番茄植物的染色體4、6、9、11禾口/或12上與衍生自S./za6rac/w/fesLYC4/78的So/ryfe抗性QTL連鎖的至少一個遺傳標記，-其中所述QTL在所述植物的染色體4上的位置由包含5"./7^rac/7"http://^的染色體4上的或者S./yco/^w'CMm的染色體4上的遺傳標記CT50、C2Atlg74970、P14M49-283e、P14M48隱74e、P14M50-67e、CT1739和P14M50-85h的基因組區(qū)域表示，-其中所述QTL在所述植物的染色體6上的位置由包含S./w^oc/za/tes的染色體6上的或者S./ycopew'CMm的染色體6上的遺傳標記P22M50-188h、P14M48隱521e、P15M48-386h、P18M51隱199h、P18M51-103h、P22M50-103e、P18M51-388e、P15M48-395e、P22M50-124e、P14M48-160e和P22M50-513h的基因組區(qū)域表示，-其中所述QTL在所述植物的染色體9上的位置由包含5*./z^rac/za/^的染色體9上的或者S./_ycopeM/cMm的染色體9上的遺傳標記P18M50-141、P14M49-240、TG254、TG223、TGIO、P18M50-134h、P14M49-243h、P18M50隱599、P14M60-222h、P22M51-417h、P14M50-174h、P14M60陽157h、P14M60-107h、P15M48-138h、P14M48-113h、Tm2a、P18M51-146h、P14M48-282h和P14M50-276h的基因組區(qū)域表示，-其中所述QTL在所述植物的染色體11上的位置由包含51./2"6rac/z"/fey的染色體11上的或者》S./_ycopeM/cMm的染色體11上的遺傳標記P14M60陽215e、P14M61-173h、P14M50-307h、TG47、P14M50-29xCD、P18M51-358h、P18M50-27xCD、P18M51-136h、P22M50-488h、TG393、P14M61-396h、P22M51-235h和P22M51-174e的基因組區(qū)域表示，及-其中所述QTL在所述植物的染色體12上的位置由包含S./z^rac/^'b的染色體12上的或者S./^opera/cwm的染色體12上的遺傳標記CT19、TG68、P14M48-411e、P18M50畫244h、P18M50-273h、P14M61-420h、P14M61-406h、P14M61-223h、P14M60-193h、P22M51-314h、TG565、P14M48-172h、P22M50畫321e、P14M60-219e、P14M48-153h、P22M50-97h、TG296、P22M50-131h和P22M51-135h的基因組區(qū)域表示，優(yōu)選由包含S./^6rac/^fey的染色體12上的或者&/ycopera/cMm的染色體12上的遺傳標記P14M61-420h、P14M61-406h、P14M61匿223h、P14M60-193h、P22M51-314h、TG565、P14M48-172h、P22M50畫321e、P14M60陽219e、P14M48-153h、P22M50-97h、TG296和P22M50-131h的基因組區(qū)域表示。14.在基因組內包含至少一個QTL或者其賦予^^少to抗性部分的S./_yco;era/cMm種So^yfe抗性植物或其部分，其中所述QTL選自由與So^y^抗性相關的So/aMwm/2"6rac/^zfes染色體4、6、9、11和12上的QTL組成的一組，-其中所述QTL在所述植物的染色體4上的位置由包含51./2^rac/zm'to的染色體4上的或者5*./少c印erw'CMm的染色體4上的遺傳標記CT50、C2Atlg74970、P14M49-283e、P14M48-74e、P14M50-67e、CT1739和P14M50-85h的基因組區(qū)域表示，其中所述QTL或者所述QTL的賦予So^y的抗性部分不在其天然遺傳背景中，-其中所述植物任選進一步包含與5o^yto抗性相關的一或多個另外的QTL或者其賦予Sorryto抗性的部分，所述QTL選自So/a做w/^rac/za"^、優(yōu)選So/aw畫/^rac/w/to品系LYC4〃8的染色體1、2禾口/或4上的QTL，其中所述另外的QTL在所述植物的染色體4上的位置由包含S./zWrac/^'tes的染色體4上的或者S./yco/^s/cMm的染色體4、更優(yōu)選S./2a6rac/za/fesLYC4/78的染色體4上的或S.(ycope^/cwmcv.Moneymaker的染色體4上的遺傳標記P18M51-169.5e、P18M51-305.4h、P14M60-262.9e、P14M61陽292.7h、TG609、P14M48-345e、P14M48-177e和P18M50-147e的基因組區(qū)域表示。15.權利要求14的植物，其中所述QTL在染色體1、2、6、9、11禾口/或12上的位置如權利要求1、2和/或7所述。16.—種產生So^yfe抗性近交系番茄植物的方法，包括a)產生權利要求l-9任一項的&"他抗性番茄植物；b)將所述抗性番茄植物自交或者與另一番茄植物雜交產生后代番茄種子；c)使步驟b)的所述后代番茄種子生長，產生另外的^^yto抗性番茄植物；d)重復雜交和生長步驟0-7次，以產生萬W^to抗性近交系番茄植物。17.權利要求16的方法，其中步驟c)進一步包括鑒別呈現(xiàn)抗性并具有希望的商業(yè)特性的植物。18.權利要求16或17的方法，其中所述方法進一步包括選擇純合的近交系番茄植物的步驟。19.根據(jù)權利要求16-18任一項的方法可獲得的5o岬他抗性近交系番茄植物或其部分。20.呈現(xiàn)ft^y&抗性的雜交的番茄植物或其部分，其中所述雜交的番茄植物可通過將根據(jù)權利要求16-18任一項的方法可獲得的S^o;他抗性近交系番茄植物與呈現(xiàn)希望的商業(yè)特性的近交系番茄植物雜交而獲得。21.權利要求10、14、15、19或20任一項的番茄植物的可再生細胞的組織培養(yǎng)物，優(yōu)選所述可再生細胞包括分離自選自如下一組的組織的細胞或原生質體，所述的組由葉、花粉、胚、根、根尖、花藥、花、果實、莖和種子組成。22.選自表1-5列出的遺傳標記的遺傳標記在檢測Bo/o^'^抗性QTL和/或檢測抗性番茄植物中的應用。全文摘要本發(fā)明涉及檢測與番茄中Botrytiscinerea抗性相關的數(shù)量性狀基因座(QTL)的方法，包括將Botrytis抗性供體番茄植物與非抗性或者Botrytis易感的受體番茄植物雜交，將一或多個后代植物與感染量的Botrytis接觸，定量確定所述一或多個后代植物中的發(fā)病率和/或病斑生長速度，建立將觀測到的所述一或多個后代植物中發(fā)病率和/或病斑生長速度與所述供體番茄植物中染色體標記的存在聯(lián)系起來的遺傳連鎖圖，并將所述連鎖圖上與降低發(fā)病率和/或降低病斑生長速度相關的連續(xù)標記指定給QTL。文檔編號C12N15/82GK101479386SQ200780023889公開日2009年7月8日申請日期2007年4月25日優(yōu)先權日2006年4月25日發(fā)明者A·W·范赫于斯登,H·J·芬克斯,P·C·馬里斯,W·H·林德豪特申請人:德魯伊特種子研發(fā)有限公司