專利名稱：復(fù)制缺陷型抗ev71和ca16病毒雙價疫苗的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及疫苗制備技術(shù)領(lǐng)域，特別是一種復(fù)制缺陷型抗EV71和CA16病毒雙價疫苗的制備方法。本發(fā)明是基于腸道病毒EV71-HB0803株的研究成果，該毒株由中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏(地址中國，武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，武漢市武昌區(qū)八一路四9號， 430072)，保藏日期是2010年9月30日，保藏號是CCTCC NO :V201020。
背景技術(shù)：
腸道病毒71 型(Enterovirus 71，EV71)和柯薩奇病毒 A16 (Coxsakievirus A16, CA16)為手足口病(hand-foot-mouth disease, HFMD)最主要的病原體，屬于小 RNA 病毒科，腸道病毒屬成員。EV71病毒CA16病毒在嬰幼兒中引起手足口病的大范圍暴發(fā)流行，并可引起心肌炎、肺水腫、無菌性腦膜腦炎等并發(fā)癥，病情發(fā)展快即可導(dǎo)致死亡，而EV71 更是被稱之為脊髓灰質(zhì)炎病毒之后最重要的神經(jīng)病毒。衛(wèi)生部2010年11月統(tǒng)計結(jié)果顯示，全國丙類傳染病發(fā)病中，手足口病高達79591例，死亡20例，在丙類傳染病中高居第二位。我國自2007年以來日手足口病的多次大面積爆發(fā)，使得手足口病毒疫苗研發(fā)顯得尤為迫切。EV71和CA16在手足口病例中多以混合感染的形式出現(xiàn)，也使雙價疫苗的需求呼之欲出。EV71屬于腸病毒屬，其遺傳物質(zhì)為單一正股RNA。EV71基因組分為結(jié)構(gòu)基因Pl和非結(jié)構(gòu)基因P2P3。其結(jié)構(gòu)蛋白Pl翻譯形成的多聚蛋白在非結(jié)構(gòu)基因表達的2A、3CD蛋白酶作用下切割成VP1、VP3、VP0。病毒在形態(tài)發(fā)生過程中必須專一性的選擇正確的基因組RNA 并將之包裹入外殼蛋白質(zhì)(Capsid)中，才能順利形成成熟的病毒顆粒并離開宿主細胞。， 提有證據(jù)證明病毒的形成需要2CATPase與VP3蛋白質(zhì)間專一性的結(jié)合。本發(fā)明將Pl結(jié)構(gòu)基因整合到vero細胞中，形成可穩(wěn)定表達Pl多聚蛋白的細胞系。再將以CA16病毒VPl替換掉Pl的重組型EV71復(fù)制子，通過轉(zhuǎn)染的方式導(dǎo)入該細胞系。重組型復(fù)制子表達的2々、30)蛋白酶切割細胞表達的？1，形成￥ 1、￥ 2、￥ 3、￥ 4，再通過2C與VP3的相互作用，包裝重組型復(fù)制子形成復(fù)制缺陷型病毒。該復(fù)制缺陷型病毒在此細胞系中可迅速復(fù)制，因而可大量快熟在此細胞中生產(chǎn)。由于缺失結(jié)構(gòu)基因，在正常細胞中無法復(fù)制，但EV71病毒顆粒和所表達CA16病毒VPl可作為抗原，引起機體產(chǎn)生抗體，從而同時抗EV71和CA16。我國目前尚無有效的EV71病毒疫苗，已經(jīng)申請的EV71病毒疫苗研發(fā)的專利技術(shù)僅1項?，F(xiàn)有的EV71病毒疫苗包括減毒活疫苗、滅活疫苗、VLP疫苗、重組蛋白疫苗和DNA 疫苗多處于實驗階段，無法滿足臨床需求，且具有以下缺陷(1)上述所有疫苗均為單價疫苗；(2)減毒活疫苗仍然可以存活，有可能發(fā)生回復(fù)突變，再次變異為強毒株并引起疾病， 經(jīng)動物實驗證實，減毒活疫苗可在神經(jīng)細胞中檢測到其存在，具有潛在的危險；(3)滅活疫苗需大量擴增病毒、純化并完全滅活，操作復(fù)雜，且滅活過程可能降低其免疫原性；(4) VLP 疫苗需大量表達結(jié)構(gòu)蛋白，VLP的形成依賴于蛋白的自組裝，效率較低且可能弓I入表達系統(tǒng)的其他蛋白；(5)重組蛋白疫苗需大量表達純化病毒結(jié)構(gòu)蛋白，DNA疫苗需大量獲取病毒cDNA，操作復(fù)雜，代價較大。本發(fā)明所述基于Pl蛋白穩(wěn)定表達細胞系和EV71-CA16病毒VPl 重組型復(fù)制子的疫苗制備方法，具有明顯的優(yōu)勢，比如安全性高、制備速度快、同時抗EV71 和CA16、制備簡便穩(wěn)定，適用于大規(guī)模生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是為克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種基于穩(wěn)定表達細胞系與重組型復(fù)制子的、安全性高、方便快速制備的復(fù)制缺陷型抗EV71和CA16雙價疫苗的制備方法。本發(fā)明解決其技術(shù)問題采用以下的技術(shù)方案
本發(fā)明提供的復(fù)制缺陷型抗EV71和CA16病毒雙價疫苗的制備方法，包括構(gòu)建EV71P1 多聚蛋白穩(wěn)定表達細胞系、構(gòu)建以CA16VP1基因替代EV71P1基因的EV71病毒全長cDNA 克隆、轉(zhuǎn)染Pl穩(wěn)定表達細胞系獲取復(fù)制缺陷型病毒和復(fù)制缺陷型病毒的檢測的步驟，具體是
1.構(gòu)建EV71P1多聚蛋白穩(wěn)定表達細胞系
(1)重組慢病毒載體質(zhì)粒構(gòu)建
以引物 Pl-SalI-Kozak-F 和 Pl-NotI-R 對 EV71-HB0803 株(保藏號CCTCC NO V201020)全長cDNA克隆為模板進行PCR，酶切后連接到MLV逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pFB-neo上， 得到插入Pl的載體pFB-neo-Pl，
Pl-SalI-Kozak-F CTCCCGTCGACCCACCATGGGCTCCCAGGTCTCCACACA, Pl-NotI-R :CTCCCGCGGCCGC TTAGAGCGTAGTGATTGCCGTTC,
(2)假病毒包裝
以pFB-neo-Pl和編碼VSVG蛋白的pLP/VSVG質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染用于包裝MLV假病毒的 GP2-293細胞，獲得假病毒，
(3)vero細胞G418最適篩選濃度的確定
以梯度稀釋法確定vero細胞對G418最低敏感濃度，最低敏感濃度+100ug/ml即為抑制濃度，
(4)假病毒感染vero細胞及G418篩選陽性細胞單克隆
假病毒感染24h后加入含有篩選濃度G418的培養(yǎng)基，獲得抗性細胞后繼續(xù)以G418篩選單克??；篩選3輪后在G418培養(yǎng)基中生長較快、長勢良好的克隆，鑒定其Pl多聚蛋白表達情況，
(5)EV71Pl多聚蛋白穩(wěn)定表達細胞系的PCR及Wfestern blot檢測鑒定
提取細胞核酸和蛋白，分別用RT-PCR和Western Blot方法檢測核酸水平和蛋白水平 Pl多聚蛋白的表達。2.獲取重組CA16VP1基因的復(fù)制缺陷型病毒
(1)EV71全長cDNA克隆的構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄PCR獲取全長cDNA后克隆到pGEM-T easy載體上的T7啟動子下游，得到EV71全長cDNA克隆pEV71，
(2)重組柯薩奇病毒CA16VP1基因質(zhì)粒構(gòu)建
提取大腸桿菌DH5 α /pT-CA16VPl (保藏號CCTCC NO :M2010376)中的質(zhì)粒 pT-CA16VPl，PCR獲得CA16VP1基因，并用CA16的VPl基因替換EV71全長cDNA克隆pEV71上的Pl區(qū)，
(3)獲得復(fù)制缺陷型病毒
帶有CA16 VPl的EV71重組子質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)錄后轉(zhuǎn)染Pl穩(wěn)定表達細胞系，收取上清中的缺陷型病毒，
(4)復(fù)制缺陷型病毒擴大培養(yǎng)
以獲得的缺陷型病毒感染Pl穩(wěn)定表達細胞系，獲得大量的子代復(fù)制缺陷型病毒， 經(jīng)過上述步驟，得到可用于制備抗EV71和CA16病毒雙價疫苗的復(fù)制缺陷型病毒。在假病毒包裝過程中，將GP2-293細胞于37°C、體積濃度為5%0)2細胞培養(yǎng)箱中， 以DMEM+10%FBS培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。本發(fā)明采用以下方法對GP2-293細胞進行培養(yǎng)轉(zhuǎn)染前一天，將每皿5X106個細胞的密度接種于IOcm細胞培養(yǎng)皿中；待細胞培養(yǎng)至70%-80%時，將培養(yǎng)基更換為新鮮的 DMEM+10%FBS培養(yǎng)基；Ih后，將5ugpFB-neo_Pl和2. 5ugpLP/VSVG共轉(zhuǎn)染用于包裝MLV假病毒的GP2-293細胞，轉(zhuǎn)染6-8 h后將培養(yǎng)基更換為DMEM+2%FBS ；24h后觀察收取上清，加入新鮮培養(yǎng)基，48h后再次收取細胞上清；兩次上清合并后離心，除去細胞碎片，以0. 45 μ m孔徑濾器過濾，獲得整合有Pl基因的MLV假病毒。在共轉(zhuǎn)染GP2-293細胞過程中，所采用的轉(zhuǎn)染試劑為磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑。本發(fā)明通過RT-PCR獲得EV71病毒全長cDNA，并克隆到pGEM_T easy載體上的T7 啟動子下游，得到EV71-HB0803株全長cDNA克隆pEV71。所述CA16VP1基因是通過提取大腸桿菌DH5 α /pT_CA16VPl (保藏號CCTCC NO M2010376)中的質(zhì)粒PT-CA16VP1，然后進行PCR獲得。本發(fā)明以overlap-PCR的方法用CA16的VPl基因替換EV71-HB0803株全長cDNA 克隆PEV71上的Pl區(qū)，引物為
primer-1 ATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGC，
primer-2 TCATATCTGCAATGGGATCCCCCATCGCTTCGTGTTCAGCAGTAT, primer-3 :ATACTGCTGAACACGAAGCGATGGGGGATCCCATTGCAGATATGA， primer-4 :TTCCCGAGCGTAGTGATTGCCAACGTTGTTATCTTGTCTC ΤΑ, primer-5 TAGAGACAAGATAACAACGTTGGCAATCACTACGCTCGGGAA， primer-6 :GTTCCGATACCACGGTGTC。所述Primer-1 和 primer-2、primer-5 和 primer-6 分別以 EV71 全長 cDNA 克隆pEV71為模板進行PCR，Primer-3和primer-4以pT_CA16VPl質(zhì)粒為模板PCR ；片段以膠回收試劑盒純化后按1:1:1比例混合，以I^rimer-I和primer-6為上下游引物進行 overlap-PCR,得至Ij overlap-PCR 產(chǎn)物。所述overlap-PCR產(chǎn)物兩端帶有的SnaBI和Mil單酶切位點，將產(chǎn)物片段和EV71 全長cDNA克隆pEV71分別酶切后加入T4DNA連接酶連接；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)換DH5 α感受態(tài)細胞，挑單克隆接菌培養(yǎng)，并以質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，經(jīng)irwitrogen公司測序檢測無誤。本發(fā)明制備的復(fù)制缺陷型病毒，可以采用以下方法進行檢測
(1)復(fù)制缺陷型病毒滴度測定
以復(fù)制缺陷型感染Pi穩(wěn)定表達細胞系，取時間點收病毒，有限連續(xù)稀釋測定滴度；
(2)復(fù)制缺陷型病毒的檢測將濃縮的的復(fù)制缺陷型病毒制備樣品，電鏡觀察。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下的主要優(yōu)點
(1)操作簡便，所需時間短，以少量復(fù)制缺陷型病毒感染穩(wěn)定表達Pi細胞系到產(chǎn)生下一代復(fù)制缺陷型病毒只需Mh。(2)復(fù)制缺陷性疫苗不能復(fù)制，安全性高；
(3)產(chǎn)量大，產(chǎn)生的復(fù)制缺陷病毒滴度高達IO6到IO8；
(4)直接從細胞上清收取復(fù)制缺陷病毒作為疫苗，雜質(zhì)少，便于純化。


圖1為EV71P1基因PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖。圖2為Pl穩(wěn)定表達細胞系PCR鑒定瓊脂糖凝膠電泳圖。圖3為Pl穩(wěn)定表達細胞系western blot鑒定Pl蛋白表達。圖4為EV71HB0803株全長cDNA逆轉(zhuǎn)錄PCR產(chǎn)物電泳圖。圖5為復(fù)制缺陷型病毒滴度測定。圖6為復(fù)制缺陷型病毒電鏡圖。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明做進一步描述。1. EV71P1多聚蛋白穩(wěn)定表達細胞系的構(gòu)建 (1)重組質(zhì)粒構(gòu)建
根據(jù)EV71病毒EV71-HB0803株(CCTCC保藏號V201020)基因組Pl基因序列設(shè)計一對引物
Pl-SalI-Kozak-F CTCCCGTCGACCCACCATGGGCTCCCAGGTCTCCACACA, Pl-NotI-R CTCCCGCGGCCGCTTAGAGCGTAGTGATTGCCGTTC， 擴增片段為W89bp。為便于PCR產(chǎn)物的克隆，上、下游引物分別添加一個Mil和NotI酶切位點。為提高表達效率，上游引物上引入了真核生物Kozak序列。該引物由hvitrogen 公司合成。以EV71-HB0803株cDNA為模板進行PCR，得到大小為2589 bp的片段(圖1)。將獲得的用DNA凝膠回收試劑盒(上海生工生物工程有限公司生產(chǎn))回收PCR產(chǎn)物。以載體 pGEM-T easy(購自promega公司)連接后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，獲得重組質(zhì)粒。經(jīng)序列測定， 說明PCR擴增獲得DNA片段為本發(fā)明需要的目的片段。用NotI和MlI分別酶切重組質(zhì)粒和慢病毒載體pFB-neo (Agilent Technology)，回收Pl片段和線性化的pFB-neo，經(jīng)iMDNA 連接酶(promega公司生產(chǎn))連接后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α。用plasmid mini kit (omega) 試劑盒提取質(zhì)粒，測序鑒定無誤，此質(zhì)粒命名為pFB-neo-Pl。(2)假病毒包裝
GP2-293細胞(clontech公司生產(chǎn))于37°C、5%0)2細胞培養(yǎng)箱中以DMEM+10%FBS培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前一天，將每皿5 X IO6個細胞的密度接種于IOcm細胞培養(yǎng)皿中。待細胞培養(yǎng)至70%-80%時，將培養(yǎng)基更換為新鮮的DMEM+10%FBS培養(yǎng)基。Ih后，將5ugpFB-neo_Pl 和2. 5ug編碼VSVG囊膜蛋白的pLP/VSVG(invitrogen公司生產(chǎn))共轉(zhuǎn)染GP2-293細胞，轉(zhuǎn)染試劑為磷酸鈣(invitrogen公司)，轉(zhuǎn)染后6_8 h將培養(yǎng)基更換為DMEM+2%FBS。24h后觀察收取上清，加入新鮮培養(yǎng)基，4 后再次收取細胞上清。兩次上清合并后離心，除去細胞碎片，以0. 45 μ m孔徑濾器過濾，即獲得整合有Pl基因的MLV假病毒。(3) vero細胞G418最適篩選濃度的確定
以梯度稀釋法確定vero細胞對G418最低敏感濃度。將vero細胞接種至12孔板中，加入不含G418的DMEM+10%FBS細胞培養(yǎng)基。24h后，吸去培養(yǎng)基，換為濃度依次為含有IOOug/ ml-700ug/mKM18的新鮮培養(yǎng)基。每2_3天以同等濃度的G418選擇培養(yǎng)基換液一次。7_14 天后觀察細胞死亡情況，發(fā)現(xiàn)300ug/ml以上濃度的G418可使細胞全部死亡。使細胞全部死亡的最低濃度+100ug/ml=G418最適篩選濃度，可得vero細胞的G418最適篩選濃度為 400ug/ml。(4)假病毒感染vero細胞及G418篩選陽性細胞單克隆
感染前一天，將vero細胞以3X IO6個細胞的密度接種于IOOmrn細胞培養(yǎng)皿中，收取未變黃的上清以0. 45nm孔徑的濾膜過濾備用。融合度達到70%假病時，假病毒以M0I=5感染 vero細胞。感染M小時后，吸去培養(yǎng)基，以PBS洗一次，加入含有400ug/ml G418 (GE公司)的DMEM+10%FBS培養(yǎng)基進行抗生素篩選?？煽吹接心退幮钥寺〕霈F(xiàn)，以胰酶消化制備細胞懸液，計數(shù)并稀釋至1個/IOul。向96孔板的每個孔中加入50ul含有400ug/ml G418的 DMEM+10%FBS，然后加入IOul細胞懸液。在顯微鏡下尋找只有一個細胞的孔，向其中加入前述收取的培養(yǎng)液上清50ul。待單克隆成片后轉(zhuǎn)入48孔板中培養(yǎng)，以同樣方法繼續(xù)篩選兩輪。將得到的細胞系western檢測Pl蛋白表達量，取表達量較高的細胞擴大培養(yǎng)后凍存。 已凍存的細胞復(fù)蘇適用時，前兩代需以含有400ug/ml G418的培養(yǎng)基培養(yǎng)。(5) EV71多聚蛋白Pl穩(wěn)定表達細胞系鑒定 1)PCR鑒定
取500ul細胞懸液，5000rpm離心IOmin沉淀細胞，加入ImlTRIZOL (invitrogen公司)， 混勻后室溫靜置5min。加入200ul氯仿，震蕩15s，靜置anin。4°C 8000g離心15min。吸取上層水相，轉(zhuǎn)移至一個新的EP管中，加入500ul異丙醇，混勻靜置10min，4°C 8000g離心 15min。沉淀以75%乙醇洗一次，4°C 7500g離心5min。吸去乙醇，室溫靜置至無可見液體， 加入60ulDEPC水。取15ul，加入lulEV71特異性引物EV71-R 5’- AGAGGGAGRTCTATCTCYCC -3’ ，
70 V水浴5min后立即置于冰上，加入IulMLV逆轉(zhuǎn)錄酶(promega公司生產(chǎn))， 2ul 10Xbuffer, IulRNasin (promega 公司生產(chǎn))，IuldNTPs (Roche 公司生產(chǎn))，37°C 水浴 30min。得到的 cDNA 以針對EV71VP1 的特異性引物(EV71-F 5' -GARAGYTCTATAGGRGAYAG-3'； EV71-R 5' -AGAGGGAGRTCTATCTCYCC-3，)進行 PCR 檢測，得到大小為的片段(圖 2)。2) Western blot 檢測鑒定
收集細胞溶于50ul PBS，按比例加入6X蛋白膠上樣緩沖液混勻后，95°C加熱10 min, 10% SDS-PAGE分離樣品。電泳結(jié)束后，用半干轉(zhuǎn)移法將蛋白膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜。 將NC膜置于含5% BSA的TBS中4°C封閉過夜。TBS-T洗滌3次(每次10 min)后，加入 1 1000稀釋的兔抗VPl血清(抗體稀釋液為TBS+0. 5% BSA) 37°C孵育2 h，洗膜3次后，加入AP標記羊抗兔IgG (1:2 500稀釋)于37°C孵育1 h后，洗滌4次，用BCIP/NBT顯色液室溫避光顯色10 min，可看到大小約97KD的條帶(圖3)。
2轉(zhuǎn)染Pl穩(wěn)定表達細胞系獲取復(fù)制缺陷型病毒 (1) EV71全長cDNA克隆的構(gòu)建
以QIAamp Viral RNA Mini Kit試劑盒^jIAGEN公司生產(chǎn))提取EV71基因組RNA，具體操作步驟參見產(chǎn)品說明書。提取的病毒RNA溶于60ulDEPC水中，取14ul，加入lulEV71 特異性引物EV71-RT
GCTATTCTGGTTATAACAAATTTACC
70 V水浴5min后立即置于冰上，加入IulMLV逆轉(zhuǎn)錄酶(promega公司生產(chǎn))， 2ul 10Xbuffer, IulRNasin (promega 公司生產(chǎn))，IuldNTPs (Roche 公司生產(chǎn))，37°C 水浴 30min。得到EV71病毒的cDNA。以EV71cDNA為模板，用LA taq聚合酶進行全長PCR。具體操作如下取 3ulEV71cDNA,加入 IuldNTPs (Roche 公司生產(chǎn))，IulLA taq 聚合酶(Takara 公司生產(chǎn))， 5ullOXLA taq buffer,以及上下游引物各Iul
RT-PCR FCTGTCGACGTCTTAAAACAGCCTGTGGGTTGCAC ； RT-PCR RACCGCTATGCATGCTATTCTGGTTATAACAAATTTACC ； 補加超純水至50ul。為方便克隆，引物兩端分別引入了 Aat II和Nsi酶切位點。PCR獲得大小為7408bp 的片段(圖4)。PCR產(chǎn)物以PCR產(chǎn)物純化試劑盒(omega公司生產(chǎn))純化。將純化后的PCR產(chǎn)物和 pGEM-T easy載體分別以Aat II (NEB公司生產(chǎn))和Nsi I (NEB公司生產(chǎn))酶切過夜，以PCR 產(chǎn)物純化試劑盒(omega公司生產(chǎn))純化后加入T4連接酶(promega公司生產(chǎn))連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，即得到EV71病毒的全長克隆，命名為pEV71。
(2)重組柯薩奇病毒CA16VP1基因質(zhì)粒構(gòu)建
根據(jù)CA16病毒VPl區(qū)基因多序列比對設(shè)計overlap-PCR引物，以overlap-PCR的方法用末端加有EV712A蛋白酶切割位點(AITTL)的CA16VP1基因替換pEV71上的Pl基因， 引物序列如下
primer-1 ATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGC ；
primer-2: TCATATCTGCAATGGGATCCCCCATCGCTTCGTGTTCAGCAGTAT ； primer-3: ATACTGCTGAACACGAAGCGATGGGGGATCCCATTGCAGATATGA ； primer-4: TTCCCGAGCGTAGTGATTGCCAACGTTGTTATCTTGTCTCTA ； primer-5: TAGAGACAAGATAACAACGTTGGCAATCACTACGCTCGGGAA ； primer-6 GTTCCGATACCACGGTGTC。Primer-I 和 primer-2、primer-5 和 primer-6 分別以 EV71-HB0803 株 cDNA 為模板進行PCR。用plasmid mini kit 試劑盒(omega 公司生產(chǎn))從大腸桿菌 DH5 α /pT_CA16VPl 中提取質(zhì)粒PT-CA16VP1，質(zhì)粒上含有CA16病毒的VPl基因，以primer-3和primer-4進行 PCR。PCR產(chǎn)物以膠回收試劑盒純化后按1:1:1比例混合，以primerl和primer-6為上下游引物進行overlap-PCR。overlap-PCR產(chǎn)物兩端帶有的SnaBI和Mil單酶切位點， 將產(chǎn)物片段和EV71-HB0803株全長cDNA克隆分別酶切后加入T4DNA連接酶(promega)連
9接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)換DH5ci感受態(tài)細胞，挑單克隆接菌培養(yǎng)，并以質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒， 經(jīng)invitrogen公司測序檢測無誤，即獲得重組CA16病毒VPl的重組質(zhì)粒pEV_CA16VPl。所述大腸桿菌DH5a/pT-CA16VPl已由中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏(地址中國，武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，武漢市武昌區(qū)八一路四9號，430072)，保藏日期是2010年12 月 31 日，保藏號是 CCTCC NO :M2010376o(3)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Pl穩(wěn)定表達細胞系
15ugpEV-CA16VPl以Nsi I (NEB公司生產(chǎn))酶切過夜后，以氯仿異戊醇04:1)抽提兩次，用無水乙醇沉淀，并以70%乙醇洗一次，獲得的線性化DNA溶于無核酶水中。并以 RiboMAX Large Scale RNA Production Systems — T7 體外轉(zhuǎn)錄試劑盒(promega 公司生產(chǎn))進行體外轉(zhuǎn)錄，具體操作步驟見產(chǎn)品說明書。體外轉(zhuǎn)錄后，加入DNA酶(promega公司生產(chǎn))消化15min，除去其中的DNA模板，并以氯仿異戊醇04:1)抽提兩次后以無水乙醇沉淀，方法同上，即得到RNA。轉(zhuǎn)染前一天，將Pl穩(wěn)定表達細胞以每皿5 X IO6個細胞的密度接種于IOcm細胞培養(yǎng)皿中。待細胞培養(yǎng)至70%-80%時，將培養(yǎng)基更換為新鮮的DMEM+10%FBS培養(yǎng)基。池后，以 6ug上述體外轉(zhuǎn)錄出的RNA轉(zhuǎn)染Pl穩(wěn)定表達細胞，轉(zhuǎn)染試劑為TransMessengeKQIAGEN公司生產(chǎn))，轉(zhuǎn)染后6-8 h將培養(yǎng)基更換為DMEM+2%FBS。96h將細胞培養(yǎng)物凍融三次，離心除去細胞碎片即得到EV71復(fù)制缺陷型病毒。(4)復(fù)制缺陷型病毒擴大培養(yǎng)將Pl穩(wěn)定表達細胞以每皿5X IO6個細胞的密度接種于IOcm細胞培養(yǎng)皿中，加入收取的復(fù)制缺陷型病毒，吸附一個半小時后將培養(yǎng)基更換為新鮮的DMEM+2%FBS。72 h后收取上清中的病毒，方法同上。離心除去細胞碎片后將沈mL 含有缺陷型病毒的上清裝入SW^離心管(Beckman公司生產(chǎn))中，30 000 Xg超速離心1 h (4°C)，每管沉淀用大約100 uL PBS重懸，測定濃度，分裝，用于檢測或者凍存于-80°C。(5)復(fù)制缺陷型病毒滴度測定
以復(fù)制缺陷性病毒感染Pl穩(wěn)定表達細胞系。通過測定TCID50來測定病毒滴度。病毒感染Pl穩(wěn)定表達細胞系后，隔2、4、6、9、12、20、28、36、48、72小時收病毒，病毒液從KT1到 10_1(1作連續(xù)10倍的稀釋。在每孔加入細胞懸液100μ1，使細胞量達到2 3X105個/ml。設(shè)正常細胞對照，正常細胞對照作兩縱排，將稀釋好的病毒接種到96孔微量培養(yǎng)板中，每一稀釋度接種一縱排共8孔，每孔接種100μ1。對每一稀釋度中的每一空逐日觀察細胞病變效應(yīng)，并記錄結(jié)果，得到每一時間點的病毒滴度，以此繪制病毒的生長曲線(圖5)。圖中復(fù)制缺陷病毒在Pl穩(wěn)定表達細胞系中的可達到IO6到108，比ΗΒ0803株稍低。3.復(fù)制缺陷型病毒的電鏡觀察
于干凈的一次性手套上滴加10 μ L濃縮的缺陷型病毒，用專用鑷子(北京新興百瑞公司生產(chǎn))將銅網(wǎng)(北京新興百瑞公司生產(chǎn))插入假型病毒的液滴中，吸附aiiin。滴加10 UL 1% PTA負染液于干凈的一次性手套另一處，將銅網(wǎng)從假型病毒的液滴中取下，濾紙條輕輕吸去多余的液體后，將銅網(wǎng)插入負染液的液滴中，染色anin。將銅網(wǎng)從負染液中取出，吸去多余液體，于干燥處放置過夜，在透射電鏡(中科院武漢病毒所分析測試中心)下進行觀察， 拍照，在電鏡下可以看到大量的病毒顆粒結(jié)構(gòu)(圖6)。盡管本發(fā)明的內(nèi)容是結(jié)合本實施例進行說明，但是不能認為是對本發(fā)明范圍的限制，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求書限定。另外，本領(lǐng)域的技術(shù)人員在所附權(quán)利要求書限定的范圍內(nèi)對本發(fā)明進行各種改動或修飾，這些改動或修飾形式同樣落在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種復(fù)制缺陷型抗EV71和CA16病毒雙價疫苗的制備方法，其特征在于該方法的步驟包括構(gòu)建EV71P1多聚蛋白穩(wěn)定表達細胞系、構(gòu)建以CA16VP1基因替代EV71P1基因的 EV71病毒全長cDNA克隆、轉(zhuǎn)染Pl穩(wěn)定表達細胞系獲取復(fù)制缺陷型病毒作為疫苗，具體是(1)構(gòu)建EV71P1多聚蛋白穩(wěn)定表達細胞系1)重組慢病毒載體質(zhì)粒構(gòu)建以引物Pl-SalI-Kozak-F和 Pl-NotI-R對保藏號為 CCTCC NO :V201020 的 EV71-HB0803 株全長cDNA克隆為模板進行PCR，酶切后連接到MLV逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pFB-neo上，得到插入 Pl 的載體 pFB-neo-Pl，Pl-SalI-Kozak-F CTCCCGTCGACCCACCATGGGCTCCCAGGTCTCCACACA,Pl-NotI-R :CTCCCGCGGCCGC TTAGAGCGTAGTGATTGCCGTTC,2)假病毒包裝以pFB-neo-Pl和編碼VSVG蛋白的pLP/VSVG質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染用于包裝MLV假病毒的 GP2-293細胞，獲得假病毒，3)vero細胞G418最適篩選濃度的確定以梯度稀釋法確定vero細胞對G418最低敏感濃度，最低敏感濃度+100ug/ml即為抑制濃度，4)假病毒感染vero細胞及G418篩選陽性細胞單克隆假病毒感染24h后加入含有篩選濃度G418的培養(yǎng)基，獲得抗性細胞后繼續(xù)以G418篩選單克隆；篩選3輪后在G418培養(yǎng)基中生長較快、長勢良好的克隆，鑒定其Pl多聚蛋白表達情況，5)EV71Pl多聚蛋白穩(wěn)定表達細胞系的PCR及Wfestern blot檢測鑒定提取細胞核酸和蛋白，分別用RT-PCR和Western Blot方法檢測核酸水平和蛋白水平 Pl多聚蛋白的表達，(2)獲取重組CA16VP1基因的復(fù)制缺陷型病毒1)EV71全長cDNA克隆的構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄PCR獲取全長cDNA后克隆到pGEM_T easy載體上的T7啟動子下游，得到EV71全長cDNA克隆pEV71，2)重組柯薩奇病毒CA16VP1基因質(zhì)粒構(gòu)建提取保藏號為CCTCC NO :M2010376的大腸桿菌DH5 α /pT_CA16VPl中的質(zhì)粒 pT-CA16VPl，PCR獲得CA16VP1基因，并用CA16的VPl基因替換EV71全長cDNA克隆pEV71 上的Pl區(qū)，3)獲得復(fù)制缺陷型病毒帶有CA16 VPl的EV71重組子質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)錄后轉(zhuǎn)染Pl穩(wěn)定表達細胞系，收取上清中的缺陷型病毒，4)復(fù)制缺陷型病毒擴大培養(yǎng)以獲得的缺陷型病毒感染Pl穩(wěn)定表達細胞系，獲得大量的子代復(fù)制缺陷型病毒，經(jīng)過上述步驟，得到的復(fù)制缺陷型病毒即為抗EV71和CA16病毒雙價疫苗。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征是在假病毒包裝過程中，將GP2-293細胞于37°C、體積濃度為5%ω2細胞培養(yǎng)箱中，以DMEM+10%FBS培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征是采用以下方法對GP2-293細胞進行培養(yǎng)轉(zhuǎn)染前一天，將每皿5X IO6個細胞的密度接種于IOcm細胞培養(yǎng)皿中；待細胞培養(yǎng)至70%-80%時，將培養(yǎng)基更換為新鮮的DMEM+10%FBS培養(yǎng)基；Ih后，將5ugpFB-neo_Pl和 2. 5ugpLP/VSVG共轉(zhuǎn)染用于包裝MLV假病毒的GP2-293細胞，轉(zhuǎn)染6-8 h后將培養(yǎng)基更換為 DMEM+2%FBS ；24h后觀察收取上清，加入新鮮培養(yǎng)基，4 后再次收取細胞上清；兩次上清合并后離心，除去細胞碎片，以0. 45 μ m孔徑濾器過濾，獲得整合有Pl基因的MLV假病毒。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征是在共轉(zhuǎn)染GP2-293細胞過程中，所采用的轉(zhuǎn)染試劑為磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征是通過RT-PCR獲得EV71病毒全長cDNA， 并克隆到pGEM-T easy載體上的T7啟動子下游，得到EV71-ΗΒ0803株全長cDNA克隆 pEV710
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于CA16VP1基因是通過提取大腸桿菌 DH5 α /pT-CA16VPl中的質(zhì)粒pT_CA16VPl，然后進行PCR獲得。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于以overlap-PCR的方法用CA16的VPl 基因替換EV71-HB0803株全長cDNA克隆pEV71上的Pl區(qū)，引物為primer-Ι ATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGC，primer-2 TCATATCTGCAATGGGATCCCCCATCGCTTCGTGTTCAGCAGTAT, primer-3 :ATACTGCTGAACACGAAGCGATGGGGGATCCCATTGCAGATATGA， primer-4 :TTCCCGAGCGTAGTGATTGCCAACGTTGTTATCTTGTCTC ΤΑ, primer-5 TAGAGACAAGATAACAACGTTGGCAATCACTACGCTCGGGAA, primer-6 :GTTCCGATACCACGGTGTC。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于I^rimer-I和primer-2、primer-5和 primer-6分別以EV71全長cDNA克隆pEV71為模板進行PCR，Primer-3和primer-4以 PT-CA16VP1質(zhì)粒為模板PCR ；片段以膠回收試劑盒純化后按1:1:1比例混合，以I^rimer-I 和primer-6為上下游引物進行overlap-PCR，得到overIap-PCR產(chǎn)物。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于overlap-PCR產(chǎn)物兩端帶有的SnaBI 和Mil單酶切位點，將產(chǎn)物片段和EV71全長cDNA克隆pEV71分別酶切后加入T4DNA連接酶連接；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)換DH5 α感受態(tài)細胞，挑單克隆接菌培養(yǎng)，并以質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，經(jīng)invitrogen公司測序檢測無誤。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所制備的復(fù)制缺陷型病毒，采用以下方法進行檢測(1)復(fù)制缺陷型病毒滴度測定以復(fù)制缺陷型感染Pi穩(wěn)定表達細胞系，取時間點收病毒，有限連續(xù)稀釋測定滴度；(2)復(fù)制缺陷型病毒的檢測將濃縮的的復(fù)制缺陷型病毒制備樣品，電鏡觀察。
全文摘要
本發(fā)明是復(fù)制缺陷型抗EV71和CA16病毒雙價疫苗的制備方法，該方法包括構(gòu)建EV71P1多聚蛋白穩(wěn)定表達細胞系、構(gòu)建以CA16VP1基因替代EV71P1基因的EV71病毒全長cDNA克隆、轉(zhuǎn)染P1穩(wěn)定表達細胞系獲取復(fù)制缺陷型病毒的步驟。本發(fā)明的優(yōu)點是(1)操作簡便，所需時間短，以少量復(fù)制缺陷型病毒感染穩(wěn)定表達P1細胞系到產(chǎn)生下一代復(fù)制缺陷型病毒只需24h；(2)復(fù)制缺陷性疫苗不能復(fù)制，安全性高；(3)產(chǎn)量大，產(chǎn)生的復(fù)制缺陷病毒滴度高達106到108；(4)直接從細胞上清收取復(fù)制缺陷病毒作為疫苗，雜質(zhì)少，便于純化。
文檔編號C12N15/85GK102284058SQ20111000847
公開日2011年12月21日 申請日期2011年1月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月17日
發(fā)明者張萬坡, 張振峰, 李紅霞, 柯賢良, 王漢中, 鄭振華 申請人:中國科學(xué)院武漢病毒研究所