專利名稱：一株染料降解菌的分離及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于環(huán)境微生物領(lǐng)域，涉及一株分離自土壤的對偶氮染料有很好降解效果的酵母菌株(Issatchenkia orientalis YP-1)，及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
偶氮染料是合成染料中為數(shù)最多的品種，廣泛應(yīng)用在紡織、印染和印刷等行業(yè)，約占有機染料產(chǎn)品總量的80%。他們的分子結(jié)構(gòu)中含偶氮基團(-N = N-)，這些基團常與一個或多個芳香環(huán)系統(tǒng)相連構(gòu)成一個共軛體系而作為染料的發(fā)色基團。染料的高色度會影響水體的正常功能，導(dǎo)致水體透光率降低，抑制水體中光合作用的自然過程，進而影響到各級消費者的生長，破壞水體生態(tài)系統(tǒng)。隨著染料和印染工業(yè)的迅猛發(fā)展，染料的種類和數(shù)量不斷增加，并朝著抗光解、抗氧化、抗生物氧化方向發(fā)展，用于其生產(chǎn)和應(yīng)用的染料廢水的成分也隨著工藝和技術(shù)的變化越來越復(fù)雜。此外，染料廢水排放量大、有機物濃度高、色度大、 可生化性差、水質(zhì)水量變化大，從而使染料廢水處理難度加大。同時，偶氮染料的降解產(chǎn)物多為聯(lián)苯胺等一些致癌的芳香類化合物，排入水體將會對人體健康和生態(tài)環(huán)境造成嚴(yán)重危害。近年來，隨著工業(yè)生產(chǎn)和紡織品的使用，染料廢水大量增加，已成為全球性最普遍的污染物之一，廣泛存在于空氣及大氣降塵物、水體、土壤、底泥、生物體等自然環(huán)境中，成為環(huán)境中無所不在的污染物。由于偶氮染料可溶于水、有機溶劑或轉(zhuǎn)變成溶液或經(jīng)后處理成分散狀態(tài)而進行染色，微生物降解是使其脫色的主要途徑。篩選高效降解菌具有重要的實踐意義。鄰苯二甲酸酯降解微生物篩選常用的方法是采集土壤樣品，經(jīng)富集培養(yǎng)、平板劃線等操作，分離得到單菌落，然后經(jīng)馴化培養(yǎng)，或紫外化學(xué)誘變等方法獲取高效降解菌株，或通過細胞工程、基因工程等技術(shù)手段構(gòu)建工程菌株。印染廠附近的廢水來源復(fù)雜，有機污染物程度較高。其中，偶氮染料是生活污水中的主要污染物之一。污水處理中，有機污染物的去除主要是通過活性污泥中的微生物降解而得以完成，從而達到污水凈化的目的。然而，隨著印染業(yè)的發(fā)展，染料廢水的污染也不斷加劇，因此，獲得高效降解菌并應(yīng)用于實踐，對于降低染料廢水在環(huán)境中的危害具有現(xiàn)實意義。本專利是從土壤中分離出的一株高效降解偶氮染料的菌株，經(jīng)鑒定為 Issatchenkia orientalis YP_1，實驗表明該菌能利用偶氮染料作為唯一碳源和能源生長繁殖，在純培養(yǎng)條件下，該菌1 能將無機鹽培養(yǎng)基中200mg/L染料降解完全，且在寬pH范圍內(nèi)均能較好的降解染料；該菌同時對多種偶氮染料如活性艷紅K-2BP，活性黑KN-B，活性紅B-2BF等均具有良好的脫色能力。充分說明該菌可用于修復(fù)染料廢水生物處理和染料污染地區(qū)的治理。目前尚無利用東方伊薩酵母降解染料研究的文獻報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一株分離自土壤的能夠高效降解偶氮染料的酵母菌株，利用該菌株對染料進行脫色的方法。該酵母菌是一株具有極高活力，對染料脫色能力極強的菌株，其培養(yǎng)方法簡單，生長速度快，不易變異，可以用作研究酵母對染料脫色機制的模式菌株，更重要的是可以直接用于染料的脫色。該菌株具有在染料廢水處理的工業(yè)化應(yīng)用前景。本發(fā)明所提供的降解偶氮染料的菌株是從土壤中分離篩選出來的。將其編號為 YP-I，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期為2010年12月30 日，分類命名為Issatchenkia orientalis YP-1。保藏編號為CGMCC No. 4523。將該菌株序列在Genbank中BLAST檢索比對，發(fā)現(xiàn)該序列與Issatchenkia orientalis菌株QD15. 126S rRNA基因序列高度同源(99% )。綜合形態(tài)、生化和分子鑒定結(jié)果，最終確定菌株YP-I為東 Tj^3-BJ Issatchenkia orientalis。本發(fā)明所提供的降解偶氮染料的菌株是從土壤中分離篩選出來的。該菌株的分離方法如下1、培養(yǎng)基配制1)菌種保藏培養(yǎng)基(固體，1L):蛋白胨20g，酵母粉10g，葡萄糖20g，瓊脂20g，加水至 1L, pH6. 0 ；2)菌種活化培養(yǎng)基(液體，1L)蛋白胨20g，酵母粉10g，氯化鈉20g，瓊脂20g加水至 1L, pH 6. 0 ；3)脫色培養(yǎng)基(液體，1L)葡萄糖 2g，KH2P041g, (NH4)2S041g, MgS04 · 7H20 0. 5g，染料50mg，加水至IL0以上培養(yǎng)基均在121°C滅菌15_30min。2、菌種活化挑取染料降解菌至菌種保藏培養(yǎng)基，28°C連續(xù)劃線、挑單菌落培養(yǎng)兩次后，挑取單菌落在菌種活化培養(yǎng)基中，于^°C，150-200r/min搖床振蕩培養(yǎng)12_24h ；由本發(fā)明技術(shù)方案生產(chǎn)的染料菌劑能夠有效降解環(huán)境中的偶氮染料廢水。以下通過具體實施例詳細說明本發(fā)明的實施，目的在于幫助讀者更好地理解本發(fā)明的精神實質(zhì)，但不作為對本發(fā)明實施范圍的限定。
具體實施例方式實施例1菌體的培養(yǎng)用接種環(huán)挑取酵母菌株Issatchenkia orientalis YP-1接到上述菌種活化培養(yǎng)斜面上，在溫度設(shè)置為28 V的培養(yǎng)箱里，培養(yǎng)1-3天，菌落松脆狀，乳白色，表面平滑，不反光，邊緣呈蝕刻狀。然后，用接種環(huán)從斜面上挑取生長良好的菌體接到裝有培養(yǎng)液的三角瓶中，在溫度設(shè)置為^°C、轉(zhuǎn)速為200rmp的搖床上培養(yǎng)1_3天，所得菌體離心 (9000rmp) lOmin，菌體用無菌生理鹽水(0. 8% )和無菌水洗滌，再離心，反復(fù)2_3次，即可獲得白色無污染的該酵母細胞。如前所述，培養(yǎng)該菌株的培養(yǎng)基組成分為蛋白胨20g，酵母粉10g，氯化鈉20g，瓊脂20g加水至1L，pH 6.0,液體培養(yǎng)基不加瓊脂。上述培養(yǎng)基和培養(yǎng)液均在121°C、0. IMPa下滅菌20min.實施例2 偶氮染料降解菌劑對搖瓶中偶氮染料的脫色效果1)在100ml脫色培養(yǎng)基中接種Iml的菌液；以不加染料培養(yǎng)基作為對照組。2)每隔池取樣一次，利用紫外分光光度計測定培養(yǎng)液在染料最大吸收峰的吸收值。脫色率(％) = (A-B)/AX 100，其中A為脫色前脫色培養(yǎng)液的OD值，B為脫色后脫色培養(yǎng)液的OD值。在該培養(yǎng)條件下，酵母菌株Issatchenkia orientalis YP-1對染料脫色率12小時內(nèi)可達99%以上。 本發(fā)明所提供的降解染料的菌株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期為2010年12月30日，分類命名為Issatchenkia orientalis YP-I0 保藏編號為CGMCC No. 4523。
權(quán)利要求
1.一株能夠高效降解偶氮染料的酵母菌株，其特征在于該菌株命名為Issatchenkia orientalis YP_1，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號 CGMCC No. 4523。
2.權(quán)利要求1所述的Issatchenkiaorientalis YP-1，其特征在于菌落松脆狀，乳白色，表面平滑，不反光，邊緣呈蝕刻狀。該菌株的16S rDNA基因序列已經(jīng)遞交到了 GenBank 數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)該序列與Issatchenkia orientalis菌株QD15. U6S rRNA基因序列高度同源 (99% )。
3.權(quán)利要求書1所述酵母菌株Issatchenkiaorientalis YP-1的培養(yǎng)方法，其特征是將該菌菌體接到斜面上，在25-30°C下，斜面培養(yǎng)基上生長1-3天，挑取菌體在25-30°C下， 培養(yǎng)液中培養(yǎng)2-3天，經(jīng)離心可以獲得該菌株的純細胞。所述的培養(yǎng)基組成為蛋白胨20g， 酵母粉10g，氯化鈉20g，瓊脂20g加水至1L，pH 6.0,液體培養(yǎng)基不加瓊脂。
4.權(quán)利要求書1所述酵母菌株Issatchenkiaorientalis YP-I的用途，其特征是能使多種偶氮染料脫色，其脫色培養(yǎng)基(液體，1L):葡萄糖10g，KH2P041g, (NH4)2S041g, MgS04 · 7H20 0. 5g，酵母粉 0. 2g，染料 50mg,加水至 IL0
5.權(quán)利要求書4所述的用途，其特征是以該菌為菌種，以染料為碳源，降解染料。
全文摘要
本發(fā)明涉及一株分離自土壤的能夠高效降解偶氮染料的酵母菌株，利用該菌株對染料進行脫色的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。經(jīng)鑒定這株菌為Issatchenkia orientalis YP-1，并將其保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.4523，將該菌株序列在Genbank中BLAST檢索比對，發(fā)現(xiàn)該序列與Issatchenkia orientalis菌株QD15.126SrRNA基因序列高度同源(99％)。該菌株從土壤中大量篩選得到的一支純的菌株。它在以染料為碳源的培養(yǎng)基和培養(yǎng)液中生長良好，它對多種偶氮染料均具有良好的脫色效果。由本發(fā)明技術(shù)方案生產(chǎn)的降解菌劑能高效降解環(huán)境中的偶氮染料，保護生態(tài)環(huán)境。
文檔編號C12R1/645GK102168026SQ201110007559
公開日2011年8月31日 申請日期2011年1月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月14日
發(fā)明者于影, 余志晟, 張慕明, 張洪勛, 金德才 申請人:中國科學(xué)院研究生院