專利名稱：一種可溶性人重組mica蛋白的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種MICA蛋白的制備方法，尤其是一種可溶性人重組MICA蛋白的制備方法。
背景技術：
移植物發(fā)生免疫排斥反應是自器官移植出現(xiàn)后就一直困擾國內外學者的最大瓶頸，雖然移植免疫機制的研究在不斷深入，大量新免疫抑制藥物在不斷涌現(xiàn)，但是移植后移植物發(fā)生免疫排斥機率仍然較高，而使用免疫抑制劑卻費用昂貴，且長期應用免疫抑制劑還會大大增加后發(fā)生腫瘤、感染的機會，因此對移植免疫的研究依然是最關鍵的課題之一。一直以來，學界都將研究重點放在了經(jīng)典的主要組織相容性復合體(major histocompability complex, MHC)方面，即MHC-I和MHC-II上，并建立了經(jīng)典的免疫排斥理論即同種異基因個體間移植后，受者T細胞通過直接或間接兩條途徑，在協(xié)同刺激因子的作用下獲得激活，從而發(fā)動一系列免疫應答，且認為體液免疫是超急性排斥反應和加速急性排斥反應的主導機制；而急性排斥反應和慢性排斥反應主要由細胞免疫反應機制參與。因此以往在同種異體器官移植前往往需要進行供受體間的經(jīng)典MHC交叉配型(主要是 HLA-A, HLA-B和HLA-DR)試驗，國內外的臨床實驗也證明了移植前經(jīng)典MHC交叉配型陰性的受者和交叉配型陽性的受者相比，前者在移植物免疫排斥發(fā)生率上明顯低于后者。但是后來有研究人員發(fā)現(xiàn)一些即使是經(jīng)典MHC交叉配型一致的受者在移植后，也不能完全避免急性或慢性免疫排斥反應的發(fā)生，在另外一些術前同樣經(jīng)過經(jīng)典HLA交叉配型，且抗HLA抗體檢測陰性卻依然發(fā)生了急性或慢性排斥反應的受體體內，發(fā)現(xiàn)了大量激活的NK細胞和T 細胞，說明細胞免疫反應機制的存在。說明除了經(jīng)典的MHC分子，還存在其他引起細胞免疫反應的未知因素。近些年來，國外一些學者在對MHC的外延性研究中發(fā)現(xiàn)了與經(jīng)典MHC基因有高度同源性的非經(jīng)典MHC-I類基因，其中以MICA基因(major histocompatibility complex class I chain-related gene A，又稱為MHC- I鏈相關基因A)最為引人注目(Giurisato Ε, Cella Μ, Takai Τ, et al. PI3-kinase activation is required to form the NKG2D immunological synapse. Mol Cell Biol, 2007，27:8583-99)。MICA 基因與經(jīng)典 HLA-I 類基因具有較高的同源性，但功能不同。MICA基因位于HLA-B位點著絲粒端約461Λ處，全長11722bp，比經(jīng)典HLA-I類基因長。其編碼產(chǎn)物是一條高度糖基化的蛋白質分子，結構與經(jīng)典的HLA-I類分子a鏈相似，包括3個胞外結構域al、a2和a3，以及跨膜區(qū)和胞內區(qū)， 構型很穩(wěn)定(見圖1和圖2)。MICA基因呈高度多態(tài)性，存在于人、靈長類、狗、羊、牛和豬中， 主要表達于內皮細胞、樹突狀細胞、成纖維細胞、上皮細胞以及多種腫瘤細胞，如肝癌、直腸癌、膠質瘤細胞表面。MICA蛋白的功能是隨著其受體NKG2D及與NKG2D組成復合體DAP10 的發(fā)現(xiàn)之后得到了解的。NKG2D是II型C凝集素樣蛋白，表達于所有NK細胞，、δ T細胞， ⑶8+ T細胞表面，MICA蛋白與NKG2D / DAP10結合后，可以將活化信號傳遞給NK細胞、γ δ T 細胞等[Giurisato Ε, Cella Μ, Takai Τ, et al. PI3_kinase activation is requiredto form the NKG2D immunological synapse. Mol Cell Biol, 2007，27:8583—99]，可能有助于促進它們對表達MICA蛋白的細胞的殺傷，參與免疫應答。近來美國學者在一些腎移植術前和術后患者的血清中均發(fā)現(xiàn)了 MICA抗體，隨后又在出現(xiàn)排斥反應被切除的移植腎中發(fā)現(xiàn)了更高滴度的該抗體，提示此類患者在腎移植前體內存在同種異型MICA抗原的預致敏，且MICA抗體在腎移植后發(fā)生的排斥反應中可能起著重要作用，但其參與免疫反應的機制仍然不清楚。另外，國外目前對MICA基因及其表達產(chǎn)物MICA蛋白的研究還主要集中在腎移植領域方面，而對于其他器官移植，如MICA蛋白對肝臟移植后免疫排斥反應的影響及其作用機理研究依然較少。綜上所述，目前國內外對于移植免疫的研究仍然存在一些空白點①在封閉移植物經(jīng)典MHC分子的條件下，仍然有部分移植物發(fā)生了急慢性排斥反應，表明有其它尚未知曉的因素引起或參與了該反應，而MICA基因可能是其中比較重要的因素之一。②雖然在一些腎移植前后體內及發(fā)生免疫排斥反應的臟器灌洗液中均發(fā)現(xiàn)了抗MICA抗體，但關于 MICA基因參與的移植免疫排斥反應機制仍然不清楚，且目前大多研究主要集中在腎移植的細胞和分子水平，缺少其他器官如肝移植和大型動物的體內模型研究。要填補上述空白，就需要對MICA基因進行進一步的研究，然而，使用現(xiàn)有技術合成的不溶性人重組MICA基因存在敏感性低，應用方法單一等致命缺陷，致使對MICA基因的研究工作受到制約。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種可溶性人重組MICA蛋白的制備方法，能夠方便、快捷的制取更加接近自然態(tài)的，形成的皺襞更多，反應位點更突出，敏感性更強，液體形態(tài)更加有利于新檢測手段，重復性好的可溶性人重組MICA蛋白。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明可采取下述技術方案
本發(fā)明一種可溶性人重組MICA蛋白的制備方法，包括以下步驟 步驟一取正常健康成年志愿者捐獻的體外外周靜脈血30ml，先用生理鹽水稀釋后 10倍，然后使用淋巴細胞分離液分離出灰白色淋巴細胞層，用PBS液對所述灰白色淋巴細胞層洗滌，在該過程中，使用臺盼蘭計數(shù)單個核細胞活性；
步驟二 利用TRIZOL提取經(jīng)步驟一處理的灰白色淋巴細胞的RNA，利用PCR技術合成和擴增特異性MICA基因片段，KpnI和)(b0I限制性內切酶切取所需要片段克隆入 pEnter_3C 質粒，經(jīng)過序列蹄選后禾丨J用 Baculovirus Expression System and Gateway 技術直接植入桿狀病毒基因組內，重組的桿狀病毒DNA轉染S9f昆蟲細胞，收集病毒后放入無血清的 EXPRESS FIVE SFM 培養(yǎng)基中，3 天后用 50mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8.0.溶液透析，離心獲取上清后用鎳親和力瓊脂糖提取MICA蛋白，利用CENTRIC0N超濾器過濾； 步驟三目標蛋白的純化
a. 二維聚丙烯酰胺凝膠電泳(2D-SDS-PAGE):將目標蛋白在IPG膠條上上樣，聚焦步驟后洗滌，加SDS還原劑，連接到SDS-PAGE平板凝膠中，并以考馬斯亮藍染色，切取寬約Imm 的目標蛋白條帶，用50%甲醛和10%醋酸進行脫色及去除SDS ；
b.串聯(lián)高效液相層析(HPLC)與2D-SDS-PAGE相比，它利用不同分離模式的結合，使混合物中的肽得到更大程度的分離，并且降低低豐度肽的丟失；
步驟四MICA目標蛋白的鑒定是MICA基因的特異性抗體，用Wfestern Blot對MICA基因的特異性抗體Mab 1.7A8進行反向驗證。本發(fā)明的有益效果是使用現(xiàn)有技術合成的不溶性人重組MICA蛋白存在敏感性低，應用方法單一等致命缺陷，與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明提供了一種可溶性人重組MICA蛋白的制備方法，使用本發(fā)明制備方法制得的可溶性人重組MICA蛋白，分子結構域更加接近自然態(tài)的MICA蛋白，形成的皺襞更多，反應位點更突出，敏感性也就更強，同時液體形態(tài)更加有利于新檢測手段，如生物素，免疫熒光等的結合，具有方便，快捷，敏感，重復性好等優(yōu)點；使用本發(fā)明方法制得的可溶性人重組MICA蛋白，在體外由同種異源淋巴細胞所構建的免疫排斥模型中的成功應用，為下一步動物體內實驗和最終應用于臨床提供了有力的實踐支持和打下了堅實的基礎。


圖1是MICA和MICB基因在染色體上的位置分布示意圖。圖2是MICA和同源的MHC-I基因在序列上的差別示意圖，
其中al、a2和a3代表胞外域序列；TM代表穿膜區(qū)序列；CY代表細胞質中的尾部序列； L代表引導序列；3’ UT代表3’端不可翻譯序列。
具體實施例方式一種可溶性人重組MICA蛋白的制備方法，包括以下步驟
步驟一取正常健康成年志愿者捐獻的體外外周靜脈血30ml，先用生理鹽水稀釋后， 然后使用淋巴細胞分離液分離出灰白色淋巴細胞層，用PBS液對所述灰白色淋巴細胞層洗滌，在該過程中，使用臺盼蘭計數(shù)單個核細胞活性；
步驟二 利用TRIZOL (新型總RNA抽提試劑)提取經(jīng)步驟一處理的灰白色淋巴細胞的 RNA,利用PCR技術(Polymerase Chain Reaction,聚合酶鏈式反應)合成和擴增特異性MICA 基因片段，KpnI和)(b0I限制性內切酶切取所需要片段克隆入pEnter-3C質粒，經(jīng)過序列篩選后利用Baculovirus Expression System and Gateway技術直接植入桿狀病毒基因組內，重組的桿狀病毒DNA轉染S9f昆蟲細胞，收集病毒后放入無血清的EXPRESS FIVE SFM 培養(yǎng)基中，3天后用50mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8.0.溶液透析，離心獲取上清后用鎳親和力瓊脂糖提取MICA蛋白，利用CENTRIC0N超濾器過濾； 步驟三目標蛋白的純化；
a.二維聚丙烯酰胺凝膠電泳(2D-SDS-PAGE):將目標蛋白在IPG膠條上上樣，聚焦步驟后洗滌，加SDS還原劑，連接到SDS-PAGE平板凝膠中，并以考馬斯亮藍染色，切取寬約Imm 的目標蛋白條帶，用50%甲醛和10%醋酸進行脫色及去除SDS ；
b.串聯(lián)高效液相層析(HPLC):與2D-SDS-PAGE相比，它利用不同分離模式的結合，使混合物中的肽得到更大程度的分離，并且降低低豐度肽的丟失；
步驟四MICA目標蛋白的鑒定是MICA基因的特異性抗體，用Wfestern Blot對MICA 基因的特異性抗體Mab 1.7A8進行反向驗證。應用例1
建立人重組MICA抗原刺激小鼠淋巴細胞體外免疫反應模型，包括以下步驟 步驟一首先將得到的重組MICA蛋白通過皮內注射至BALB/C小鼠腳墊內，10天后處死，手術摘除小鼠脾臟，全身淋巴結群(主要腹腔內，四肢，頸部)，加入足量RPMI 1640培養(yǎng)液后充分碾成組織勻漿，過濾后加紅細胞裂解液離心后，利用淋巴細胞分離液分離淋巴細胞。本階段共行小鼠動物實驗20例，獲取淋巴細胞樣本15份，4份用于步驟2，3份用于步驟3，3份用于步驟4，5份用于步驟5。步驟二 分別用重組MICA蛋白、植物凝集素(PHA)、美洲商陸絲裂原(PWM)、血藍蛋白(KLH)刺激得到的淋巴細胞，6天后同位素3H標記的胸腺核苷3H-TDR滲入單個核細胞， 液體閃爍儀測定吸收入細胞的咕的CPM值，以PHA刺激組為陽性對照組，未刺激組為陰性對照組。結果MICA組CPM值為1M7，明顯高于未刺激組(CPM值為612):表明重組MICA蛋白可以激活淋巴細胞，引起細胞增殖。步驟三為確定參加免疫反應的主要細胞類型。用CFSE染色淋巴細胞，分別以加入PHA刺激作為陽性對照，加入重組MICA蛋白刺激為實驗組，未刺激組為陰性對照，培養(yǎng)6 天后上述三組中分別加入抗⑶3和抗⑶19抗體，通過熒光激活細胞分類器(FACS)的門控通道對增殖的細胞分類計數(shù)。觀察對比三組之間⑶3+ (T細胞)和⑶19+ (B細胞)淋巴細胞百分數(shù)的差異。結果MICA組T淋巴細胞比例45. 2%，明顯高于未刺激組35. 4%，B淋巴細胞比例低于未刺激組。表明重組MICA蛋白再次刺激小鼠體外淋巴細胞主要是引起⑶3+T 細胞增殖。步驟四為確定參加免疫反應的細胞亞型，在CD3+類群細胞中加入抗CD4+-APC 和抗⑶8+ -PE培養(yǎng)染色后仍通過FACS門控通道分類計數(shù)。觀察對比三組之間⑶4+和 ⑶8+ T淋巴細胞百分數(shù)的差異。培養(yǎng)6天后，三組中各自用高爾基復合體抑制劑藍菌素A (Brefeldin A)處理細胞4h后分別加入抗CD4+ -PerCP和抗CD8+ -APC,經(jīng)FACS門控通道分類后在⑶4+和⑶8+兩大類群中加入FACS溶解液和抗IL-4-PE和抗IFN-γ-PE，再次經(jīng)門控通道分類。觀察對比三組之間IL-4和IFN-γ百分數(shù)的差異。結果MICA組⑶4+淋巴細胞從例觀.3%，明顯高于未刺激組，⑶8+淋巴細胞比例與未刺激組無明顯區(qū)別，IL-4與 IFN- γ百分數(shù)均明顯增加。表明重組MICA蛋白刺激引起⑶4+Τ淋巴細胞激活和細胞增殖， ⑶8+Τ淋巴細胞無明顯變化。步驟五為判斷MHC及NKG2D受體對重組MICA蛋白刺激所產(chǎn)生的免疫反應的影響。用CFSE染色淋巴細胞，分別加入抗MHC-I (H-Id/H-2Dd/H-2DI)抗體，抗MHC-II (抗 ΙΑ/IE)抗體、抗MHC-I + MHC-II抗體、抗NKG2D抗體和PBS，再以重組MICA蛋白刺激增殖后加入抗⑶4+ -APC JSFACS分類計數(shù)。結果抗NKG2D組⑶4+淋巴細胞比例23. 7%，明顯低于PBS組，表明抗NKG2D組⑶4+T淋巴細胞增殖受到抑制，表明重組MICA蛋白通過NKG2D 途徑激活⑶4+ T淋巴細胞。
權利要求
1. 一種可溶性人重組MICA蛋白的制備方法，其特征在于包括以下步驟 步驟一取正常健康成年志愿者捐獻的體外外周靜脈血30ml，先用生理鹽水稀釋后10 倍，然后使用淋巴細胞分離液分離出灰白色淋巴細胞層，用PBS液對所述灰白色淋巴細胞層洗滌，在該過程中，使用臺盼蘭計數(shù)單個核細胞活性；步驟二 利用TRIZOL提取經(jīng)步驟一處理的灰白色淋巴細胞的RNA，利用PCR技術合成和擴增特異性MICA基因片段，KpnI和)(b0I限制性內切酶切取所需要片段克隆入 pEnter_3C 質粒，經(jīng)過序列蹄選后禾丨J用 Baculovirus Expression System and Gateway 技術直接植入桿狀病毒基因組內，重組的桿狀病毒DNA轉染S9f昆蟲細胞，收集病毒后放入無血清的 EXPRESS FIVE SFM 培養(yǎng)基中，3 天后用 50mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8.0.溶液透析，離心獲取上清后用鎳親和力瓊脂糖提取MICA蛋白，利用CENTRIC0N超濾器過濾； 步驟三目標蛋白的純化a.二維聚丙烯酰胺凝膠電泳將目標蛋白在IPG膠條上上樣，聚焦步驟后洗滌，加SDS 還原劑，連接到SDS-PAGE平板凝膠中，并以考馬斯亮藍染色，切取寬約Imm的目標蛋白條帶，用50%甲醛和10%醋酸進行脫色及去除SDS ；b.串聯(lián)高效液相層析與2D-SDS-PAGE相比，它利用不同分離模式的結合，使混合物中的肽得到更大程度的分離，并且降低低豐度肽的丟失；步驟四MICA目標蛋白的鑒定是MICA基因的特異性抗體，用Wfestern Blot對MICA 基因的特異性抗體Mab 1.7A8進行反向驗證。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種可溶性人重組MICA蛋白的制備方法，步驟一取健康成年志愿者捐獻的體外外周靜脈血30ml，生理鹽水稀釋后用淋巴細胞分離液分離出灰白色淋巴細胞層；步驟二利用TRIZOL提取經(jīng)處理的灰白色淋巴細胞的RNA，經(jīng)序列篩選后植入桿狀病毒基因組內，重組，收集，透析，離心獲取MICA蛋白，用CENTRICON超濾器過濾；步驟三目標蛋白的純化；步驟四MICA目標蛋白的鑒定。本發(fā)明制備方法制得的可溶性重組MICA蛋白，分子結構域更加接近自然態(tài)的MICA蛋白，具有方便，快捷，敏感，重復性好等優(yōu)點；在體外免疫排斥模型中的成功應用，為動物體內實驗和臨床應用提供了實踐支持和打下了堅實的基礎。
文檔編號C12N15/866GK102154302SQ20111000353
公開日2011年8月17日 申請日期2011年1月10日 優(yōu)先權日2011年1月10日
發(fā)明者丁國平, 曹利平, 闕日升 申請人:浙江大學