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單糖制造方法

文檔序號:393011閱讀:1183來源:國知局
專利名稱:單糖制造方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及單糖制造方法,尤其涉及從木素纖維素原料制造單糖的方法。
背景技術(shù)
隨著近年環(huán)境意識的提聞,關(guān)于有效利用生物質(zhì)的研究盛行。對生物質(zhì)資源中的多糖進(jìn)行分解而得到的糖通過用作微生物的發(fā)酵底物,可用于生產(chǎn)乳酸、異丙醇、こ醇、氨基酸等多種有用物質(zhì)。作為生物質(zhì)原料,通常使用含有木素的木素纖維素、從木素纖維素除去木素而得到的纖維素等。作為木素纖維素原料,例如,可列舉闊葉樹或針葉樹等 木材、麥桿或玉米殘渣等農(nóng)業(yè)殘渣等,另ー方面,作為完全除去了木素的纖維素,可列舉Avicel等試劑形式的纖維素。此外,作為一定程度地除去了木素的木素纖維素原料,可列舉闊葉樹牛皮紙漿(kraft pulp)、針葉樹牛皮紙楽;、機(jī)械紙楽;、來自洋麻等草本的紙楽;;廢紙、或從紙衆(zhòng)廠回收的含有紙漿纖維成分的造紙污泥等。由生物質(zhì)資源中的多糖類制作作為發(fā)酵底物的單糖的方法大致分為兩種方法。一種是使用無機(jī)酸進(jìn)行水解的酸法糖化,另ー種是使用酶或生產(chǎn)該酶的微生物進(jìn)行水解的酶法糖化。與酶法糖化相比,酸法糖化雖然在技術(shù)上可以完成,但是與以淀粉、廢糖蜜等為原料的方法相比,成本還較高,而且因廢棄所使用的酸引起的環(huán)境壓力成為問題,妨礙實用化。另ー方面,在酶法糖化中,已知纖維素酶、半纖維素酶等酶的價格高,這成為實用化的障礙。作為降低用于糖化的酶成本的方法,進(jìn)行了這樣的嘗試通過底物木素纖維素原料的化學(xué)、物理的前處理,提高之后的酶的糖化反應(yīng)效率,降低使用的酶量。作為這樣的嘗試,例如,可以舉出用酸對原料進(jìn)行前處理的方法(日本特開2008-514207號)、用球磨機(jī)粉碎后用酸進(jìn)行蒸煮的前處理方法(日本特開2008-271962號)、通過打漿處理來解開纖維素纖維的前處理方法(日本特開2009-171885號)等。通過上述各種底物前處理方法提高酶反應(yīng)的效果有限,并不是降低成本的關(guān)鍵。例如,對高度除去了木素的紙漿進(jìn)行打漿處理時的酶反應(yīng)的提高效果僅為I. 3倍(日本特開2009-171885號)。其中,使用酸的前處理方法的應(yīng)用報道最多,但以從木素纖維素原料除去木素成分為主要目的,有必要在處理后進(jìn)行將酸和木素分離的エ序。木素的除去程度對糖化酶的酶反應(yīng)性有影響,但是并未報道在處理后尤其是未分離前處理反應(yīng)物時的酶反應(yīng)性、以及該酶反應(yīng)時的酶的行為。此外,為了進(jìn)一歩降低成本,也嘗試了糖化反應(yīng)后回收酶進(jìn)行再利用的方法,但是酶對未分解的底物固體殘渣的粘附妨礙了回收,不能成功地進(jìn)行穩(wěn)定的酶回收。例如,已知利用酶吸附于糖化反應(yīng)后的未分解的底物固體殘渣,吸附回收酶并進(jìn)行再利用的方法(日本特開昭59-213396號、日本特開昭62-208282號、日本專利第1299068號、日本特開昭63-007781號)。然而,日本特開昭59-213396號及日本特開昭62-208282號中記載了可直接利用吸附于底物固體殘渣的酶,另一方面,日本專利第1299068號及日本特開昭63-007781號中記載了對于酶的回收再利用有必要進(jìn)行從底物固體殘渣的分離操作。如上所述,關(guān)于糖化反應(yīng)后的底物固體殘渣的可利用性,很難說見解統(tǒng)一。此外,當(dāng)直接利用吸附于底物固體殘渣的酶吋,可回收的活性量有67% 97%的波動,僅示出了 I次的回收結(jié)果(日本特開昭59-213396號)。此外,也進(jìn)行了利用通電處理從殘渣中分離酶并回收的嘗試(日本特開2008-206484號)。但是,該方法操作復(fù)雜,即使成功地進(jìn)行了酶回收,在成本方面依然存在問題。另外,也嘗試了通過使用超濾膜處理糖化反應(yīng)液來直接回收酶的方法。古市等提出了使用超濾膜處理糖化反應(yīng)液回收酶,進(jìn)一歩用反滲透膜對糖液一方進(jìn)行濃縮的方法(日本特開昭58-198299號)。但是,對于酶的回收量并無記載,對于連續(xù)的操作成績也無記載。此外,日本特開2006-87319號中指出即使在用超濾膜處理糖化反應(yīng)液的情況下,酶對未分解殘渣的粘附也會成為問題,并公開了ー種連續(xù)的糖化反應(yīng)方法,在該方法中,在滯留時間內(nèi)96質(zhì)量%的總底物被糖化的條件下,通過膜處理過濾分離酶使其滯留于反應(yīng)體系內(nèi)。這種情況下,由于裝置的結(jié)構(gòu)、操作上、酶活性的降低等導(dǎo)致的殘渣增大與反應(yīng)的不穩(wěn)定性直接相關(guān),所以對于酶和底物的投入量有很大限制。上述利用膜過濾進(jìn)行的酶回收的研究中,雖然將已經(jīng)高程度地除去了木素的紙漿用作底物,但是酶對未分解殘渣的吸附仍然是最大的問題,有必要將其降低。

發(fā)明內(nèi)容
如上所述,雖然開發(fā)了多種利用纖維素酶或半纖維素酶高效率地水解纖維成分從木素纖維素原料制造糖類的技術(shù),但是依然存在糖化所需要的酶的成本高、缺乏經(jīng)濟(jì)性的問題。為了解決上述問題,可嘗試對底物進(jìn)行前處理的方法、和對酶進(jìn)行回收再利用的方法,但是前者效果有限,后者酶回收率低,依然未解決問題。關(guān)于酶回收率低的問題,原因被認(rèn)為是酶對未分解的底物殘渣的吸附,但是,從酶的性質(zhì)上來說,難以防止其對底物吸附。因此,本發(fā)明的目的在于提供一種可削減酶的使用量,簡便且低成本地從木素纖維素原料制造單糖的方法。本發(fā)明如下所述。[I] 一種由木素纖維素原料制造單糖的單糖制造方法,包括得到由木素纖維素原料及糖化酶得到的糖化液;使上述糖化液中的糖化酶吸附于木素纖維素原料將其回收;以及,使用回收的上述糖化酶將木素纖維素原料糖化。[2]如[I]所述的方法,其中,上述木素纖維素原料為闊葉樹牛皮紙漿、針葉樹牛皮紙漿、機(jī)械紙漿、來自草本的紙漿、廢紙、或造紙污泥、或它們的混合物。[3]如[I]或[2]所述的制造方法,其中,上述木素纖維素原料為由前處理得到的前處理原料,所述前處理是在酸性條件下進(jìn)行加熱處理后進(jìn)行中和。[4]如[3]所述的制造方法,其中,上述前處理原料中的半纖維素含量為前處理前的50質(zhì)量%以下。 [5]如[3]或[4]所述的制造方法,其中,上述前處理原料中的糠醛為前處理原料的干燥質(zhì)量的I質(zhì)量%以下。
[6]如[I] [5]中任一項所述的制造方法,其中,上述木素纖維素原料為由前處理得到的前處理原料,所述前處理包括以下(a) (d)(a)得到木素纖維素原料的固態(tài)成分濃度為8質(zhì)量% 30質(zhì)量%的原料液;(b)用終濃度O. 2質(zhì)量% 12質(zhì)量%的無機(jī)酸對上述原料液進(jìn)行酸化;(c)在80°C 150°C下對酸化過的原料液進(jìn)行I小時 6小時保溫(incubating);(d)在20°C 80°C下將上述保溫后的原料液調(diào)節(jié)為pH3 8。[7]如[6]所述的制造方法,其中,上述無機(jī)酸為硫酸、鹽酸、硝酸、磷酸或它們的組合。[8]如[I] [7]中任一項所述的制造方法,其中,上述回收包括以下(e) (h) (e)得到上述糖化液和木素纖維素原料的混合液,所述木素纖維素原料的固態(tài)成分質(zhì)量為上述糖化酶的酶活性成分的總蛋白質(zhì)質(zhì)量的40倍以上;(f)在20°C 80V下進(jìn)行I分鐘 3小時的保溫;(g)將上述保溫后的混合液固-液分離為糖化液和作為固態(tài)成分的吸附有酶的木素纖維素原料;(h)將分離的上述木素纖維素原料作為酶-底物復(fù)合物回收。[9]如[I] [7]中任一項所述的制造方法,其中,上述回收包括以下⑴ (k)(i)在殘存上述糖化酶的酶活性成分的總蛋白質(zhì)質(zhì)量的40倍以上的固態(tài)成分質(zhì)量的木素纖維素原料的條件下,終止糖化反應(yīng);(j)將反應(yīng)終止后的反應(yīng)液固-液分離為糖化液和作為固態(tài)成分的未反應(yīng)的木素纖維素原料;(k)將分離的上述木素纖維素原料作為酶-底物復(fù)合物回收。[10]如[8]或[9]所述的制造方法,其中,包括添加在上述固-液分離時被分離至液體中的酶活性成分的糖化酶進(jìn)行上述再糖化。[11]如[10]所述的制造方法,其中,在上述固-液分離時被分離至液體中的酶活性成分的糖化酶含有葡萄糖苷酶。[12]如[8]或[9]所述的制造方法,其中,上述被分離至液體中的酶活性成分的糖化酶是通過過濾分離或樹脂精制回收在上述固-液分離エ序中被分離至糖化液中的酶活性成分而得到的物質(zhì)。[13]如[I] [12]中任一項所述的制造方法,其中,上述糖化酶是選自纖維素酶及半纖維素酶中的至少ー種。[14]如[13]所述的制造方法,其中,上述纖維素酶是具有內(nèi)切葡聚糖酶、纖維ニ糖水解酶及葡萄糖苷酶的各活性的酶混合物。[15]如[13]或[14]所述的制造方法,其中,半纖維素酶是具有木聚糖酶、木糖苷酶、甘露聚糖酶、果膠酶、半乳糖苷酶、葡糖苷酸酶及阿拉伯呋喃糖苷酶的各活性的酶混合物。


[圖I]為表示本發(fā)明的實施例涉及的木素纖維素原料的前處理品與未進(jìn)行前處理的未處理品的酶糖化反應(yīng)結(jié)果的圖。
[圖2]為表示本發(fā)明的實施例涉及的反復(fù)糖化反應(yīng)的結(jié)果的圖,其中,使用了通過對木素纖維素原料的前處理品的吸附而回收的酶。[圖3]為表示本發(fā)明的實施例涉及的使用了吸附回收酶的反復(fù)糖化反應(yīng)中的催化劑基本単元減少的結(jié)果的圖。[圖4]為表示本發(fā)明的實施例涉及的在補(bǔ)充了未吸附酶活性成分的情況下和未補(bǔ)充未吸附酶活性成分的情況下,分別進(jìn)行的反復(fù)糖化的結(jié)果的圖。[圖5]為表示本發(fā)明的實施例涉及的使用了吸附及膜回收的酶的反復(fù)糖化反應(yīng)中的催化劑基本単元減少的結(jié)果的圖。
具體實施例方式本發(fā)明的單糖制造方法是從木素纖維素原料制造單糖的單糖制造方法,包括如下、步驟得到由木素纖維素原料及糖化酶得到的糖化液;使上述糖化液中的糖化酶吸附于木素纖維素原料將其回收(以下,有時稱為“回收エ序”);以及,使用回收的上述糖化酶將木素纖維素原料糖化(以下,有時稱為“再糖化工序”)。本發(fā)明人等對通過提高糖化酶的回收率進(jìn)行重復(fù)使用來降低成本的方法進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)對于吸附至底物或未分解底物殘渣的酶成分,可不施加特別的剝離處理而直接進(jìn)行再使用。根據(jù)本發(fā)明,使糖化液中的糖化酶吸附于木素纖維素原料將其回收,使用回收的糖化酶將木素纖維素原料糖化得到單糖,因此,可簡便地回收糖化酶,同時可進(jìn)行糖化酶的重復(fù)使用。結(jié)果可大幅減少制造糖類時的酶的使用量,可簡便且低成本地由木素纖維素原料制造單糖。本發(fā)明中,“單糖”主要是指由I個糖單元構(gòu)成的單糖類。需要說明的是,作為單糖,只要是葡萄糖或使用糖化酶由木素纖維素原料得到的其他單糖,就可以沒有特別限制地包含于本發(fā)明的單糖中。但是,本發(fā)明中,含有生成的單糖的糖化液中,也可存在由2個 100個左右的多個糖單元構(gòu)成的寡糖。本說明書中,術(shù)語“エ序”不僅僅是獨立的エ序,即使在不能與其他エ序明確區(qū)別的情況下,只要能夠?qū)崿F(xiàn)本エ序所期待的作用,即可使用本術(shù)語。此外,本說明書中,使用“ ”表示的數(shù)值范圍表示包括“ ”前后所記載的數(shù)值分別作為最小值及最大值的范圍。本發(fā)明中,在提到可構(gòu)成組合物的各成分的量的情況下,在存在多種屬于組合物中各成分的物質(zhì)的情況下,除非另有說明,是指組合物中存在的所述多種物質(zhì)的總量。下面說明本發(fā)明。本發(fā)明涉及的單糖制造方法中,使用由木素纖維素原料及糖化酶得到的糖化液。該糖化液只要是由木素纖維素原料及糖化酶得到的糖化液就沒有特別限制,優(yōu)選為通過使用糖化酶由木素纖維素原料生成單糖(糖化工序)而得到的糖化液。本發(fā)明中,可以將獲得的糖化液用于本制造方法中,也可以引入用于得到糖化液的糖化工序作為本制造方法的
ー個エ序。本發(fā)明中使用的木素纖維素原料只要是木素含量低的生物質(zhì)原料即可。低木素含量是指低于生物質(zhì)原料的平均木素含量即30質(zhì)量%的值,優(yōu)選為20質(zhì)量%以下,更優(yōu)選為10質(zhì)量%以下。作為木素含量低的原料,優(yōu)選以纖維素、半纖維素為主要成分的纖維,所述纖維如下得到利用堿提取或堿性消化(alkali digestion)等化學(xué)紙漿制造法、或有機(jī)溶解等方法,從針葉樹、闊葉樹、伐木殘料、建筑廢材、剪枝廢棄物、鋸屑、洋麻、及稻草、麥桿等農(nóng)業(yè)廢棄物等木素纖維素材料中高度除去木素而得到。較優(yōu)選例如闊葉樹牛皮紙漿、針葉樹牛皮紙漿、機(jī)械紙漿、來自洋麻等草本的紙漿、廢紙、或造紙污泥(含有從紙漿廠回收的紙漿纖維成分)、或它們的混合物。如果是這些原料,例如可進(jìn)行使用糖化酶的可靠的糖化處理。特別優(yōu)選使用_葉樹牛皮紙漿、針葉樹牛皮紙漿,均可以從一般的紙漿制造企業(yè)獲得。本發(fā)明的酶糖化方法中,作為底物的木素纖維素原料優(yōu)選為由前處理得到的前處理原料,所述前處理是在酸性條件下進(jìn)行加熱處理之后進(jìn)行中和;更優(yōu)選木素含量低的木素纖維素原料的前處理原料。通過對木素纖維素原料進(jìn)行前處理,可加快酶對木素纖維素原料的吸附速度。通過在酸性條件下進(jìn)行加熱然后進(jìn)行中和的前處理,可部分分解生物質(zhì)原料中的半纖維素,轉(zhuǎn)換為木糖等單糖。上述來自木素纖維素原料的半纖維素成分的減少可提高使用酶的原料糖化的效率,同時也有助于提高之后的酶的吸附回收率。作為前處理原料,優(yōu)選半纖維素含量為前處理前的半纖維素含量的50質(zhì)量%以下,即,前處理的程度優(yōu)選半纖維素成分的50質(zhì)量%以上分解為可溶性的單糖或寡糖,更期待作為副產(chǎn)物的糠醛僅為木素纖維素原料的干燥質(zhì)量的I質(zhì)量1^以下。通過使半纖維素含量為前處理前的半纖維素含量的50質(zhì)量%以下,可進(jìn)ー步提高糖化酶處理效率。通過使作為副產(chǎn)物的糠醛為I質(zhì)量以下,可以不給糖化反應(yīng)液中的收率帶來很大影響,井能夠抑制之后的酶反應(yīng)エ序和酶的吸附回收エ序中的微生物的污染。需要說明的是,由于糠醛具有較低的沸點,所以可通過對生成單糖液進(jìn)行減壓濃縮處理而容易地除去。半纖維素含量只要為前處理前的半纖維素含量的50質(zhì)量%以下,就沒有必要完 全除去半纖維素,可以殘留30質(zhì)量%以上,也可以殘留40質(zhì)量%以上。該前處理中,首先,用水稀釋木素纖維素原料使得固態(tài)成分濃度為8質(zhì)量% 30質(zhì)量%,得到原料液。木素纖維素原料由于溶解度極低,所以制備成固態(tài)成分懸濁液。作為前處理中使用的無機(jī)酸,可以從硫酸、鹽酸、硝酸、磷酸等中選擇,它們可以單獨使用也可以組合使用。如果為上述無機(jī)酸,例如可以使前處理效率良好。其中,在エ業(yè)應(yīng)用中,優(yōu)選廉價的硫酸。該前處理包括將無機(jī)酸添加至原料液中使其終濃度為O. 2質(zhì)量% 12質(zhì)量%來進(jìn)行酸化;以及在80°C 150°C下對酸化過的原料液進(jìn)行I小時 6小時保溫。進(jìn)ー步優(yōu)選使木素纖維素原料的固態(tài)成分濃度為8質(zhì)量% 20質(zhì)量%,添加無機(jī)酸使其終濃度為O. 2質(zhì)量% 5質(zhì)量%,在90°C 150°C下進(jìn)行I小時 4小時保溫。對于前處理反應(yīng)中使用的反應(yīng)容器沒有特別限定,可以考慮具有耐酸性的加熱壓カ容器、或?qū)⒕哂心退嵝缘娜萜髦糜诜磻?yīng)釜之類的加熱壓カ裝置中進(jìn)行處理的方案。將保溫后的原料液在20°C 80°C下調(diào)節(jié)為pH3 8、優(yōu)選為pH4 7,制成木素纖維素原料前處理品(前處理原料)。對于PH調(diào)節(jié)用的堿試劑沒有特別限定,可使用NaOH或Κ0Η、氨等。前處理后的木素纖維素原料的溶解度依舊低,作為固態(tài)成分懸濁液回收。本發(fā)明中的糖化酶是指將木素纖維素原料分解為單糖單元的酶,只要是將木素纖維素原料分解為單糖的酶即可,只要是具有纖維素酶及半纖維素酶各活性的酶即可。纖維素酶只要是將纖維素分解為葡萄糖的酶即可,可列舉具有內(nèi)切葡聚糖酶、纖維ニ糖水解酶及β -葡萄糖苷酶各活性中的至少ー種活性的酶,從酶活性的觀點考慮,優(yōu)選為具有上述各活性的酶混合物。同樣地,半纖維素酶只要是可將半纖維素分解為木糖等單糖的酶即可,可列舉具有木聚糖酶、木糖苷酶、甘露聚糖酶、果膠酶、半乳糖苷酶、葡糖苷酸酶及阿拉伯呋喃糖苷酶各活性中的至少ー種活性的酶,從酶活性的觀點考慮,優(yōu)選為具有上述各活性的酶混合物。本發(fā)明中,對于“酶活性成分”來說,在形成酶混合物的情況下,是指上述糖化酶中的每ー種;在使用単獨的糖化酶的情況下,是指使用的糖化酶本身。對于上述纖維素酶及半纖維素酶的來源沒有限制,可使用絲狀菌、擔(dān)子菌、細(xì)菌類等的半纖維素酶。例如,可以單獨使用或混合兩種以上來使用Trichoderma屬、Acremonium ノ禹、Aspergillus ノ禹、Irpex ノ禹、Aeromonas 屬、しIostridium 屬、Bacillus ノ禹、Pseudomonas屬、Penicillium屬、Humicola屬等各種來源的酶和/或利用基因重組制造出的酶。此外,作為酶源,也可直接使用通常市售的纖維素酶制劑或上述菌的培養(yǎng)物或其濾液。需要說明的是,其中,優(yōu)選來自Trichoderma屬、Acremonium屬的纖維素酶等纖維素分解カ強(qiáng)的纖維素酶。作為市售的纖維素酶及半纖維素酶,可使用AccelleraselOOO (Genencor公司制)、Accellerasel500(Genencor 公司制)、AccelleraseXC(Genencor 公司制)> AccelleraseXY (Genencor 公司制)、Celluclast (Novozymes 公司制)、CellicCTec (Novozymes 公司制)、Cellic HTec (Novozymes 公司制)、Acremonium Cellulase (明治制果(株)制)、meicelase (明治制果(株)制)、Cellulase Amano A (天野酶(株)制)、Cellulase Amano T(天野酶(株)制)、Cellulase Daiwa(大和化成(株)制)、Cellulizer (Nagase 生化學(xué)エ業(yè)(株)制)、Driselase (協(xié)和發(fā)酵(株)制)、CellulaseOnozuka (Yakult 藥品エ業(yè)(株)制)、Cellulosin (Hankyu Bioindustry Co.,Ltd 制)等。此外,作為市售的β -葡萄糖苷酶,可使用Novozyme 188 (Novozymes公司制)、AccelleraseBG(Genencor 公司制)等。本發(fā)明的糖化反應(yīng)這樣進(jìn)行向木素纖維素原料中加入酶,一邊攪拌ー邊使反應(yīng)進(jìn)行。對于糖化反應(yīng)中使用的反應(yīng)容器沒有特別限定,優(yōu)選可攪拌以使得裝入的木素纖維素原料、酶類充分混合,而且具有溫度調(diào)節(jié)功能以使得能夠保持在使用的酶的最適溫度。對于反應(yīng)溫度來說,例如,為以Trichoderma屬為代表的霉菌來源的市售酶時,優(yōu)選為40°C 55°C。糖化反應(yīng)槽中的液體pH優(yōu)選保持在所使用的酶的最適pH,例如,為Trichoderma屬來源的市售的酶時,優(yōu)選pH4至7之間。對于反應(yīng)中裝入的、作為底物的木素纖維素原料和酶的濃度沒有特別限定。對于木素纖維素原料前處理品的移液、裝入等操作來說,優(yōu)選為8質(zhì)量% 30質(zhì)量%的固態(tài)成分濃度。此外,對于使用的酶來說,可以根據(jù)其活性投入足以高效地分解底物的量。酶的量可根據(jù)酶的種類等適當(dāng)調(diào)整。本發(fā)明的回收ェ序優(yōu)選如下進(jìn)行。即,優(yōu)選包括如下步驟得到上述糖化液和木素纖維素原料的混合液;進(jìn)行規(guī)定時間的保溫;將上述保溫后的混合液固-液分離為糖化液和作為固態(tài)成分的吸附有酶的木素纖維素原料;將分離的上述木素纖維素原料作為酶-底物復(fù)合物回收。通過上述回收,可將酶活性成分的總蛋白質(zhì)質(zhì)量的70質(zhì)量%以上吸附在固態(tài)成分上來回收。上述エ序中的木素纖維素原料與其說是作為酶底物發(fā)揮作用不如說是作為酶的吸附劑發(fā)揮作用。為了充分地確保酶的吸附量,并且不減少固-液分離中的糖液部分的比例(=容積效率的維持),優(yōu)選使用固態(tài)成分質(zhì)量為糖化酶的酶活性成分的總蛋白質(zhì)質(zhì)量的40倍以上、優(yōu)選200倍以上的木素纖維素原料,此外,在能夠保持糖化酶的穩(wěn)定性的溫度、例如20°C 80°C的溫度下進(jìn)行I分鐘 3小時保溫。由此,可有效地將可溶化形態(tài)的糖化酶吸附在作為固態(tài)成分的木素纖維素原料上。此外,除了將用于吸附的木素纖維素原料重新放入糖化反應(yīng)完成后的溶液中的方法之外,也可以在糖化反應(yīng)中途使其終止,使糖化酶吸附在未分解的底物殘渣上。即,也可以是包括如下步驟的回收エ序在規(guī)定量的木素纖維素原料殘存的條件下使糖化反應(yīng)終止;將反應(yīng)終止后的反應(yīng)液固-液分離為糖化液和作為固態(tài)成分的未反應(yīng)的木素纖維素原料;將分離的上述木素纖維素原料作為酶-底物復(fù)合物回收。由此,可以緊接著糖化エ序進(jìn)行吸附,可以在更短時間內(nèi)進(jìn)行酶的回收。需要說明的是,對于回收エ序來說,使用前處理原料來吸附糖化酶的情況可以在更短時間內(nèi)有效地回收。當(dāng)使用未進(jìn)行前處理的未處理的木素纖維素原料吋,優(yōu)選進(jìn)行60分鐘 120分鐘,另一方面,當(dāng)使用前處理原料吋,優(yōu)選進(jìn)行I分鐘 120分鐘。對于反應(yīng)的終止來說,優(yōu)選在從可溶性的分解生成單糖及寡糖類的蓄積量逆推算出的反應(yīng)容器內(nèi)的底物殘渣的量為反應(yīng)容器內(nèi)的糖化酶的酶活性成分的總蛋白質(zhì)質(zhì)量的200倍以下的固態(tài)成分質(zhì)量時終止反應(yīng),進(jìn)ー步優(yōu)選在40倍以上的固態(tài)成分質(zhì)量時終止反應(yīng)。通過在底物殘渣的量為反應(yīng)容器內(nèi)的糖化酶的酶活性成分的總蛋白質(zhì)質(zhì)量的200倍以下的固態(tài)成分質(zhì)量時終止反應(yīng),作為糖化工序,可充分地產(chǎn)生單糖,通過為40倍以上的固態(tài)成分質(zhì)量,可確保作為吸附用的充分量的底物量。由此,底物殘渣與酶蛋白質(zhì)的質(zhì)量比充分,可吸附70質(zhì)量%以上的酶蛋白質(zhì)。需要說明的是,反應(yīng)容器內(nèi)的底物殘渣量可通過用高效液相色譜等公知的分析器測定混合液中的單糖或寡糖各自的量或它們的總量等來確認(rèn)。吸附于木素纖維素原料的酶的回收如下進(jìn)行對上述處理后的液體進(jìn)行離心、或粗過濾等操作,從而分離成糖化液和作為固態(tài)成分的木素纖維素原料,分離取得固態(tài)成分一方。可以將上述吸附有酶的木素纖維素原料作為酶-底物復(fù)合物供給至下ー批的糖化反應(yīng)中。應(yīng)用于糖化液與底物固態(tài)物的分離的離心或粗過濾的條件可直接應(yīng)用本領(lǐng)域內(nèi)通常使用的方法,例如,在離心的情況下,可設(shè)置為500 X g 10000 X g,在粗過濾的情況,可使用不銹鋼、陶瓷、樹脂制的過濾器,使用網(wǎng)眼尺寸為O. I μ m 2_的過濾器進(jìn)行過濾。另ー方面,對于固-液分離エ序的分離至上清糖化液中的酶活性成分,優(yōu)選將其回收并用于再糖化。通過上述的回收方法追加回收未吸附的酶成分,可以使本發(fā)明中再次的酶糖化反應(yīng)更穩(wěn)定地進(jìn)行。對于被分離至液體中的酶成分,使用膜從上清糖化液過濾分離回收或使用蛋白質(zhì) 精制用樹脂柱進(jìn)行精制并回收,可以與吸附于上述的固態(tài)成分而被回收的酶成分合并,供給至下ー批的糖化反應(yīng)エ序?;蛘撸粡纳鲜鎏腔夯厥彰福硇刑砑酉喈?dāng)活性量的新的酶成分。從而可以以與前ー批的糖化反應(yīng)エ序相同的活性量繼續(xù)進(jìn)行糖化反應(yīng)。發(fā)現(xiàn)上述固-液分離エ序中被分離至上清糖化液中的酶成分主要含有β -葡萄糖苷酶、一部分內(nèi)切葡聚糖酶。因此,從糖化效率的觀點考慮,優(yōu)選將葡萄糖苷酶、內(nèi)切葡聚糖酶或它們的組合用作追加的糖化酶?;厥蘸蟮奶腔ば蛑校褂猛ㄟ^上述回收エ序回收的糖化酶,將木素纖維素原料糖化(本說明書中,有時稱為“再糖化”)。優(yōu)選追加上述固-液分離エ序中回收的被分離至液體中的酶。由此,即使進(jìn)行重復(fù)再糖化,也可維持單糖蓄積率。使用吸附于木素纖維素原料而被回收的糖化酶、和被分離至液體中的酶(將它們合并,稱為回收酶混合物)進(jìn)行再糖化時,作為通過吸附于底物固態(tài)物來 回收的酶成分,優(yōu)選使用追加了與被分離至糖化液中的活性量相當(dāng)?shù)男碌拿富钚猿煞值拿富旌衔铩亩筛艿乜刂?、?guī)定用于再糖化的酶活性量。此外,也優(yōu)選向通過吸附至底物固態(tài)物來回收的酶成分中追加通過過濾分離或樹脂精制回收在固-液分離エ序中被分離至糖化液中的酶活性成分而得到酶活性成分,從而得到酶混合物。由此,沒有必要追加酶,可大幅降低酶的使用量。需要說明的是,作為對分離的酶活性成分進(jìn)行過濾分離或樹脂精制的方法,可使用可回收酶活性成分的膜裝置或樹脂柱,可舉出例如旭化成公司制“MICROZA pencil-scale型module ACP-0013D”等。各酶的活性回收值可直接使用通常使用的方法得到。例如,β_葡萄糖苷酶活性值可設(shè)定為通過用HPLC對底物纖維素ニ糖的分解速度進(jìn)行定量而確定的值。此外,內(nèi)切葡聚糖酶活性值可設(shè)定為測定590nm的吸光度變化來確定底物Azo-CM-Cellulose的分解活性而得到的值。對上述活性值與相當(dāng)于最初投入的酶濃度的酶標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行比較,可計算出酶活性回收率。進(jìn)ー步向上述回收酶混合物中追加作為底物的木素纖維素原料或其前處理品,用水調(diào)節(jié)濃度使得與最初的糖化反應(yīng)條件一致,然后,控制pH、溫度進(jìn)行攪拌同時進(jìn)行再糖化反應(yīng)。以上的一系列的酶糖化、酶回收、再糖化可以重復(fù)實施,在維持酶的活性的期間內(nèi),可持續(xù)降低催化劑成本。實施例通過以下的實施例進(jìn)ー步具體地說明本發(fā)明,但是本發(fā)明并不受以下實施例的任何限制,另外,除非另有說明”是指質(zhì)量%。[實施例I]木素纖維素原料的前處理準(zhǔn)備闊葉樹牛皮紙漿(LBKP)作為木素纖維素含有物(以下“木素纖維素原料”、“紙漿”、和“LBKP”各術(shù)語表示相同含義,可相互交換使用)。取LBKP放入玻璃燒杯中并用水稀釋使得固態(tài)成分濃度為10% [w/V],接著,以終質(zhì)量濃度O. 5%添加硫酸。對于裝入有LBKP-硫酸溶液的燒杯,在反應(yīng)釜中于130°C下加熱4小時。冷卻后,用NaOH、和檸檬酸緩沖液(終濃度20mM)調(diào)節(jié)至pH5.0,形成木素纖維素原料前處理品。用高效液相色譜(HPLC)分析上述木素纖維素原料前處理品,半纖維素成分的88%被分解為可溶性的木糖,確認(rèn)到糠醛的生成量僅為原料的干燥質(zhì)量的O. 5%。<分析條件>
分析儀器日本分光HPLC柱ULTR0NPS-80H(300 X 8mm ;信和化工株式會社制)分析溫度50°C流動相高氯酸水溶液pH2. I[實施例2]酶對木素纖維素原料的吸附試驗
分別研究酶對木素纖維素原料、和木素纖維素原料前處理品的吸附性。使用含有內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶、β -葡萄糖苷酶、和半纖維素酶的市售的纖維素酶水溶液(商品名Accellerasel000, Genencor公司制)作為酶。用Bradford法測定使用的纖維素酶水溶液的蛋白質(zhì)濃度,結(jié)果為2. 5質(zhì)量%。使用燒瓶,向20mM的檸檬酸緩沖液中加入纖維素酶水溶液和木素纖維素原料前處理品,使得蛋白質(zhì)質(zhì)量木素纖維素原料前處理品固態(tài)成分質(zhì)量比為I : 13、1 40、I 67、1 120,1 200。在45°C緩慢攪拌燒瓶,I分鐘后回收吸附試驗液,以7000X g離心,得到上清液。用Bradford法測定離心上清液中的蛋白質(zhì)濃度,與未進(jìn)行吸附處理的纖維素酶水溶液的蛋白質(zhì)濃度進(jìn)行比較。同樣地,向20mM的檸檬酸緩沖液中加入纖維素酶水溶液和LBKP (未處理品),使得蛋白質(zhì)質(zhì)量LBKP固態(tài)成分質(zhì)量比為I : 13、1 40,1 67、1 120,1 200。在45°C下緩慢攪拌燒瓶,I分鐘后回收吸附試驗液,以7000Xg離心,得到上清液。用Bradford法測定離心上清液中的蛋白質(zhì)濃度,與未進(jìn)行吸附處理的纖維素酶水溶液的蛋白質(zhì)濃度進(jìn)行比較。以上的研究中的酶活性成分總蛋白質(zhì)量的、使用木素纖維素原料、及木素纖維素原料前處理品的吸附回收率示于表I。[表 I]
權(quán)利要求
1.一種由木素纖維素原料制造單糖的單糖制造方法,包括 得到由木素纖維素原料及糖化酶得到的糖化液; 使所述糖化液中的糖化酶吸附于木素纖維素原料將其回收;以及, 使用回收的所述糖化酶將木素纖維素原料糖化。
2.如權(quán)利要求I所述的制造方法,其中,所述木素纖維素原料為闊葉樹牛皮紙漿、針葉樹牛皮紙漿、機(jī)械紙漿、來自草本的紙漿、廢紙、或造紙污泥、或它們的混合物。
3.如權(quán)利要求I或2所述的制造方法,其中,所述木素纖維素原料為由前處理得到的前處理原料,所述前處理是在酸性條件下進(jìn)行加熱處理后進(jìn)行中和。
4.如權(quán)利要求3所述的制造方法,其中,所述前處理原料中的半纖維素含量為前處理前的50質(zhì)量%以下。
5.如權(quán)利要求3或4所述的制造方法,其中,所述前處理原料中的糠醛為前處理原料的干燥質(zhì)量的I質(zhì)量%以下。
6.如權(quán)利要求I 5中任一項所述的制造方法,其中,所述木素纖維素原料為由前處理得到的前處理原料,所述前處理包括以下(a) (d) (a)得到木素纖維素原料的固態(tài)成分濃度為8質(zhì)量% 30質(zhì)量%的原料液; (b)用終濃度為0.2質(zhì)量% 12質(zhì)量%的無機(jī)酸對所述原料液進(jìn)行酸化; (c)在80°C 150°C下對酸化過的原料液進(jìn)行I小時 6小時保溫; (d)在20°C 80°C下將所述保溫后的原料液調(diào)節(jié)為pH3 8。
7.如權(quán)利要求6所述的制造方法,其中,所述無機(jī)酸為硫酸、鹽酸、硝酸、磷酸或它們的組合。
8.如權(quán)利要求I 7中任一項所述的制造方法,其中,所述回收包括以下(e) (h) (e)得到所述糖化液和木素纖維素原料的混合液,所述木素纖維素原料的固態(tài)成分質(zhì)量為所述糖化酶的酶活性成分的總蛋白質(zhì)質(zhì)量的40倍以上; (f)在20°C 80°C下進(jìn)行I分鐘 3小時的保溫; (g)將所述保溫后的混合液固-液分離為糖化液和作為固態(tài)成分的吸附有酶的木素纖維素原料; (h)將分離的所述木素纖維素原料作為酶-底物復(fù)合物回收。
9.如權(quán)利要求I 7中任一項所述的制造方法,其中,所述回收包括以下(i) (k) (i)在殘存所述糖化酶的酶活性成分的總蛋白質(zhì)質(zhì)量的40倍以上的固態(tài)成分質(zhì)量的木素纖維素原料的條件下,終止糖化反應(yīng); (j)將反應(yīng)終止后的反應(yīng)液固-液分離為糖化液和作為固態(tài)成分的未反應(yīng)的木素纖維素原料; (k)將分離的所述木素纖維素原料作為酶-底物復(fù)合物回收。
10.如權(quán)利要求8或9所述的制造方法,其中包括 添加在所述固-液分離時被分離至液體中的酶活性成分的糖化酶,進(jìn)行所述糖化。
11.如權(quán)利要求10所述的制造方法,其中,在所述固-液分離時被分離至液體中的酶活性成分的糖化酶含有3-葡萄糖苷酶。
12.如權(quán)利要求8或9所述的制造方法,其中,所述被分離至液體中的酶活性成分的糖化酶是通過過濾分離或樹脂精制來回收在所述固-液分離中被分離至糖化液中的酶活性成分而得到的物質(zhì)。
13.如權(quán)利要求I 12中任一項所述的制造方法,其中,所述糖化酶是選自纖維素酶及半纖維素酶中的至少一種。
14.如權(quán)利要求13所述的制造方法,其中,所述纖維素酶是具有內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶及3-葡萄糖苷酶的各活性的酶混合物。
15.如權(quán)利要求13或14所述的制造方法,其中,所述半纖維素酶是具有木聚糖酶、木糖苷酶、甘露聚糖酶、果膠酶、半乳糖苷酶、葡糖苷酸酶及阿拉伯呋喃糖苷酶的各活性的酶混合物。
全文摘要
本發(fā)明提供一種由木素纖維素原料制造單糖的單糖制造方法,包括得到由木素纖維素原料及糖化酶得到的糖化液;使上述糖化液中的糖化酶吸附于木素纖維素原料將其回收;以及使用回收的上述糖化酶將木素纖維素原料糖化。
文檔編號C12P19/14GK102666871SQ201080051800
公開日2012年9月12日 申請日期2010年11月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月27日
發(fā)明者中山章, 安樂城正, 木村櫻子, 松本和也, 渡邊清一, 藤井亮太, 遠(yuǎn)藤絢子, 長部雅巳 申請人:三井化學(xué)株式會社