專利名稱：包含卷曲螺旋和/或系鏈的蛋白質(zhì)復(fù)合體及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的改造蛋白質(zhì)、多特異性蛋白質(zhì)復(fù)合體(包括多特異性抗體)及構(gòu)建它們和產(chǎn)生它們的方法。本發(fā)明還涉及用于獲得多特異性蛋白質(zhì)復(fù)合體的技術(shù)的新應(yīng)用。
背景技術(shù)：
對商業(yè)和治療目的而言有用且可升級(scalable)的用于構(gòu)建多特異性抗體的發(fā)現(xiàn)技術(shù)一直難以找到。已嘗試了許多方法，但幾乎全都具有明顯的缺點(diǎn)，如可溶性差、在哺乳動物細(xì)胞中不可表達(dá)、顯示低產(chǎn)率的異ニ聚體形成、制造的技術(shù)挑戰(zhàn)、免疫原性、體內(nèi)半衰期短、不穩(wěn)定等問題(例如 Hollinger 等，(1993)PNAS 90 :6444-6448 ；US5, 932，448 ；US6, 833，441 ；US 5，591，828 ；US7, 129，330 ；US7, 507，796 ；Fischer 等，(2007)Pathobiology74 :3-14 ；Booy (2006) Arch. Immunol. Ther. Exp. 54 :85-101 ；Cao 等(2003 ) 55 171-197 ;和 Marvin 等，(2006)Current Opinion in Drug Discovery&Development 9(2)184-193)。因此，存在對產(chǎn)生多特異性抗體的改進(jìn)的技術(shù)和方法的需要。發(fā)明概述本發(fā)明提供新的蛋白質(zhì)復(fù)合體，及產(chǎn)生和制備蛋白質(zhì)復(fù)合體的方法。一方面，本發(fā)明涉及與Fe CH組分連接的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域，根據(jù)需要，該卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域可以或可以不從包含F(xiàn)e的蛋白質(zhì)切割。另ー方面,本發(fā)明涉及包含系鏈(tether)和Fe CH組分復(fù)合體的蛋白質(zhì)，該系鏈可以或可以不從該蛋白質(zhì)切割。另ー方面，本發(fā)明涉及可選地能夠形成蛋白質(zhì)復(fù)合體的包含卷曲螺旋、系鏈和Fe CH組分的蛋白質(zhì)，取決于希望的作用，該系鏈和/或卷曲螺旋可以或可以不從該蛋白質(zhì)切割。另ー方面，本發(fā)明提供制備包含系鏈的蛋白質(zhì)的方法，其中通過宿主細(xì)胞切割或通過體外化學(xué)或酶促反應(yīng)切割該系鏈。另ー方面，本發(fā)明涉及可選地能夠形成蛋白質(zhì)復(fù)合體的包含卷曲螺旋、系鏈和Fe CH組分的蛋白質(zhì)，可通過宿主細(xì)胞來從該蛋白質(zhì)切割該系鏈和/或卷曲螺旋，該宿主細(xì)胞表達(dá)該蛋白質(zhì)，且過量表達(dá)能夠從該蛋白質(zhì)切割該系鏈和/或卷曲螺旋的酶。另ー方面，本發(fā)明提供產(chǎn)生包含卷曲螺旋和系鏈的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)復(fù)合體的方法，其中通過宿主細(xì)胞切割或通過體外化學(xué)或酶促反應(yīng)切割該系鏈和/或卷曲螺旋。在一個具體實(shí)施方案中，該蛋白質(zhì)復(fù)合體進(jìn)ー步包含F(xiàn)e CH組分。另ー方面，本發(fā)明涉及用于制備異聚體蛋白質(zhì)復(fù)合體的方法，其包括在從相同或不同的重組核酸序列表達(dá)兩種不同蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞的步驟，其中各蛋白質(zhì)包含卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域和系鏈。在另ー實(shí)施方案中，該宿主細(xì)胞包含編碼能夠切割該系鏈和/或該卷曲螺旋的酶的重組核酸序列。在一個實(shí)施方案中，該制備方法進(jìn)ー步包括分離由該宿主細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的步驟。在另ー實(shí)施方案中，該制備方法進(jìn)ー步包括從宿主細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)切割該系鏈和/或該卷曲螺旋的步驟。另ー方面，本發(fā)明涉及含有或不含該系鏈和/或該卷曲螺旋的本文所述的蛋白質(zhì)復(fù)合體。除本文提供的許多進(jìn)步和優(yōu)勢外，本發(fā)明還提供用于制備基本上同質(zhì)的異源多聚體復(fù)合體的簡單、有效、高產(chǎn)率產(chǎn)生的方法。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含兩條或多條多肽的蛋白質(zhì)復(fù)合體，其中第一多肽包含第一卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域(CC)和第一 Fe CH組分(FcCH);和第二多肽包含(I)第二卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域(CC)和第二 FcCH ；其中該第一 CC和該第二 CC彼此復(fù)合；該第一 FcCH和該第二 FcCH彼此復(fù)合。在一個實(shí)施方案中，該第一 CC包含本文式I的序列，且該第二 CC包含本文式II的序列。第二方面，本發(fā)明涉及(feature)蛋白質(zhì)復(fù)合體，其包含(a)含有第一卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域(CC)的第一多肽，其中該第一 CC包含式I的七殘基重復(fù)序列；和(b)含有Fe CH組分和第二卷曲螺旋(CC)的第二多肽，其中該第二 CC包含式II的七殘基重復(fù)序列，其中式、I和式II中的n大于或等于2，其中在各七殘基重復(fù)序列中，該第一 CC包含電荷與該第二CC中的X’7殘基相反的X5殘基，且該第一 CC包含電荷與該第二 CC中的X’5殘基相反的X7殘基。在一個實(shí)施方案中，該第一多肽進(jìn)一歩包含VH結(jié)構(gòu)域和VL結(jié)構(gòu)域，且該第二多肽進(jìn)ー步包含VH和VL結(jié)構(gòu)域，其中各多肽的VH和VL結(jié)構(gòu)域以VL-CL-系鏈-VH的N端至C端的順序相互連接。在另ー實(shí)施方案中，各多肽的VH結(jié)構(gòu)域彼此不同。在另ー實(shí)施方案中，各多肽的VL結(jié)構(gòu)域彼此不同。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白質(zhì)復(fù)合體包含鉸鏈區(qū)，其中該鉸鏈區(qū)包含其鉸鏈區(qū)中的K222A突變、其鉸鏈區(qū)中的C220A突變，或其鉸鏈區(qū)中的K222A和C220A突變。在一個實(shí)施方案中，該蛋白質(zhì)復(fù)合體選自抗體、免疫黏附素、肽體(p印tibody)或親和體(affibody)。因此，根據(jù)另ー實(shí)施方案，該第一和/或第二多肽可以進(jìn)ー步包含含有結(jié)合靶標(biāo)的序列的抗體(例如VH或VL結(jié)構(gòu)域)、肽體(例如肽)、免疫黏附素(例如胞外域)或支架蛋白的靶結(jié)合序列。根據(jù)ー個實(shí)施方案，該蛋白質(zhì)復(fù)合體是單臂抗體。一方面，本發(fā)明提供包含卷曲螺旋的蛋白質(zhì)復(fù)合體，其包含(a)含有第一卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域(CC)的第一多肽，其中該第一 CC包含式I的七殘基重復(fù)序列(X1X2X3X4X5X6X7)n(式 I) (SEQ ID NO 29)X1是疏水性氨基酸殘基或天冬酰胺，X2、X3和X6各是任意氨基酸殘基，X4是疏水性氣基酸殘基,和X5和X7各是帶電荷氨基酸殘基；和(b)含有第二卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域(CC)的第二多肽，其中該第二 CC包含式II的七殘
基重復(fù)序列(X，ス，2X，3X，4X，5X，6X，7)n(式 II) (SEQ ID NO :30)X’ 是疏水性氨基酸殘基或天冬酰胺，X’ 2、X’ 3和X’ 6各是任意氨基酸殘基，X’ 4是疏水性氨基酸殘基，和X’ 5和X’ 7各是帶電荷氨基酸殘基；
其中式I和式II中的n大于或等于2 ;其中在各七殘基重復(fù)序列中，該第一 CC包含電荷與該第二 CC中的X’ 7殘基相反的X5殘基，且該第一 CC包含電荷與該第二 CC中的X’ 5殘基相反的X7殘基。在一個實(shí)施方案中，該第一和第二多肽各包含VH和CHl結(jié)構(gòu)域,且可以各進(jìn)一步包含鉸合部結(jié)構(gòu)域(hinge domain)。在另一實(shí)施方案中，該第一和第二多肽各進(jìn)一步包含CH2和CH3結(jié)構(gòu)域。還在另一實(shí)施方案中，該第一和第二多肽各包含相對于彼此以VH-CHl-鉸合部-CH2-CH3的N端至C端方向定位的VH、CHl、鉸合部、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域。一方面，本發(fā)明提供抗體，其包含(a)含有VH結(jié)構(gòu)域和第一卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域(CC)的第一多肽，其中該第一 CC包含式I的七殘基重復(fù)序列
(X1X2X3X4X5X6X7)n(式 I)X1是疏水性氨基酸殘基或天冬酰胺，X2、X3和X6各是任意氨基酸殘基，X4是疏水性氨基酸殘基，和X5和X7各是帶電荷氨基酸殘基；和(b)含有VH結(jié)構(gòu)域和第二卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域(CC)的第二多肽，其中該第二 CC包含式II的七殘基重復(fù)序列(X，J，2X，3X，4X，5X，6X，7)n(式 II)X’ 是疏水性氨基酸殘基或天冬酰胺，X’ 2、X’ 3和乂’ 6各是任意氨基酸殘基，X’ 4是疏水性氨基酸殘基，和X’ 5和X’ 7各是帶電荷氨基酸殘基；其中式I和式II中的n大于或等于2 ;其中在各七殘基重復(fù)序列中，該第一 CC包含電荷與該第二 CC中的X’ 7殘基相反的X5殘基，且該第一 CC包含電荷與該第二 CC中的X’ 5殘基相反的X7殘基。在一個實(shí)施方案中，該第一和第二多肽各包含VH和CHl結(jié)構(gòu)域，且可以各進(jìn)一步包含鉸合部結(jié)構(gòu)域。在另一實(shí)施方案中，該第一和第二多肽各進(jìn)一步包含CH2和CH3結(jié)構(gòu)域。還在另一實(shí)施方案中，該第一和第二多肽各包含相對于彼此以VH-CHl-鉸合部-CH2-CH3的N端至C端方向定位的VH、CHHl、鉸合部、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域。在具體實(shí)施方案中，該抗體進(jìn)一步包含第三和第四多肽，其中該第三多肽包含第
一VL結(jié)構(gòu)域，且該第四多肽包含第二 VL結(jié)構(gòu)域。在一個實(shí)施方案中，該第一多肽的VH結(jié)構(gòu)域通過系鏈連接至該第三多肽的VL結(jié)構(gòu)域，且該第二多肽的VH結(jié)構(gòu)域通過系鏈連接至該第四多肽的VL結(jié)構(gòu)域。在另一實(shí)施方案中，該第三多肽進(jìn)一步包含第一 CL結(jié)構(gòu)域，其中該第一 VL和CL結(jié)構(gòu)域相對于彼此以VL-CL的N端至C端方向定位在該第三多肽內(nèi)，且該第四多肽進(jìn)一步包含第二 CL結(jié)構(gòu)域，其中該第二 VL和CL結(jié)構(gòu)域相對于彼此以VL-CL的N端至C端方向定位在該第四多肽內(nèi)。在另一實(shí)施方案中，該第一 VL結(jié)構(gòu)域和該第二 VL結(jié)構(gòu)域的序列相同。在另一實(shí)施方案中，該第一或第二多肽中至少一個的VH的N端以系鏈連接至CL的C端。第二方面，本發(fā)明涉及包含以下的抗體(a)含有VH結(jié)構(gòu)域和第一卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域(CC)的第一多肽，其中該第一 CC包含式I的七殘基重復(fù)序列；和(b)含有CH2和CH3結(jié)構(gòu)域及第二卷曲螺旋(CC)的第二多肽，其中該第二 CC包含式II的七殘基重復(fù)序列，其中式I和式II中的n大于或等于2，其中在各七殘基重復(fù)序列中，該第一 CC包含電荷與該第
二CC中的X’ 7殘基相反的X5殘基，且該第一 CC包含電荷與該第二 CC中的X’ 5殘基相反的X7殘基。在本發(fā)明的第二方面的一個實(shí)施方案中，該第一多肽包含VH和CHl結(jié)構(gòu)域，且可以進(jìn)一步包含鉸合部結(jié)構(gòu)域。在另一實(shí)施方案中，該第一多肽進(jìn)一步包含CH2和CH3結(jié)構(gòu)域。在本發(fā)明的第二方面的另一實(shí)施方案中，該第一多肽包含相對于彼此以VH-CHl-鉸合部-CH2-CH3的N端至C端順序定位的VH、CHl、鉸合部、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域。還在本發(fā)明的第二方面的另一實(shí)施方案中，該抗體進(jìn)一步包含第三多肽，其中該第三多肽包含VL結(jié)構(gòu)域。在一個實(shí)例中，該第三多肽進(jìn)一步包含CL結(jié)構(gòu)域，該 VL和CL結(jié)構(gòu)域相對于彼此以VL-CL的N端至C端方向定位。還在本發(fā)明的第二方面的另一實(shí)施方案中，該第一多肽的VH的N端以系鏈連接至CL的C端。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的雙臂抗體包含一個而不是兩個系鏈，使得該抗體包含(1)含有束縛于本發(fā)明的輕鏈的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域和重鏈的多肽；(2)含有卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域和重鏈的多肽；和(3)含有輕鏈的多肽。在另一實(shí)施方案中，考慮表達(dá)這種雙臂抗體的宿主細(xì)胞。在其他實(shí)施方案中，Xp X’ p X4和X’ 4的任一個中的疏水性氨基酸殘基選自丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸。在另一實(shí)施方案中，x5、x’ 5、X7和夂’7的任一個中的帶電荷氨基酸殘基選自賴氨酸、精氨酸、組氨酸、天冬氨酸和谷氨酸。在另一實(shí)施方案中，在該第一 CC的至少一個七殘基重復(fù)序列中，X1是天冬酰胺，且在該第二CC的至少一個七殘基重復(fù)序列中，各X’ :是天冬酰胺。還在其他實(shí)施方案中，該第一 CC七殘基重復(fù)序列，其中X1是亮氨酸或天冬酰胺，X2是丙氨酸或谷氨酰胺，X3是丙氨酸或谷氨酰胺，X4是亮氨酸，X5是谷氨酸，X6是賴氨酸或色氨酸，X7是谷氨酸；該第二 CC包含七殘基重復(fù)序列，其中X’ I是亮氨酸或天冬酰胺，x%是丙氨酸或谷氨酰胺，X’ 3是丙氨酸或谷氨酰胺，X’ 4是亮氨酸，X’ 5是賴氨酸，X’ 6是賴氨酸或色氨酸，而V 7是賴氨酸。在其他實(shí)施方案中，式I和式II中的n大于或等于3，例如大于或等于4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90 或 100。在其他實(shí)施方案中，該第一或第二 CC中的至少一個在該蛋白質(zhì)的恒定結(jié)構(gòu)域C端連接。例如，該恒定結(jié)構(gòu)域是CH3結(jié)構(gòu)域，該第一 CC在該第一多肽的CH3結(jié)構(gòu)域C端連接，該第二 CC在該第二多肽的CH3結(jié)構(gòu)域C端連接。該連接例如通過可切割的接頭序列連接。在其他實(shí)施方案中，Lys-C內(nèi)肽酶切割位點(diǎn)定位在該第一或第二 CC中的至少一個的N端。另一方面，本發(fā)明涉及包含第一多肽的抗體，該第一多肽含有相對于彼此以VL-CL-系鏈-VH-CH1-CH2-CH3 (式 III)的 N 端至 C 端方向定位的 VL、CL、系鏈、VH、CH1、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域。在一個實(shí)施方案中，該抗體進(jìn)一步包含式III的第二多肽。在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體是多特異性的。例如，該抗體能夠結(jié)合至少2種抗原，或者該抗體能夠結(jié)合同一抗原上的至少2個表位。在另一實(shí)施方案中，該抗體是雙特異性的。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白質(zhì)包含含有甘氨酸(G)和絲氨酸(S)殘基的系鏈。在一個實(shí)施方案中，該系鏈的長度例如在15至50個氨基酸之間。在具體實(shí)施方案中，該系鏈的長度在20至32個氨基酸之間，例如長度為20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31或32個氨基酸。在一個實(shí)施方案中，該系鏈包含GGS重復(fù)序列。在另一實(shí)施方案中，該系鏈?zhǔn)强汕懈畹?。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，可通過同一種酶在該系鏈的N端和C端或N端和C端附近的兩個位點(diǎn)中切割該系鏈。在一個實(shí)施方案中，該系鏈包含弗林蛋白酶的切割位點(diǎn)。在另一實(shí)施方案中，該弗林蛋白酶切割位點(diǎn)是RXRXRR(SEQ ID NO:25)，其中X是任意氨基酸。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含去除Lys-C內(nèi)肽酶切割位點(diǎn)的突變。在一個實(shí)施中，去除Lys-C內(nèi)肽酶切割位點(diǎn)的突變在鉸合部結(jié)構(gòu)域中。例如，該抗體具有K222A取代(EU編號系統(tǒng))。在另一實(shí)施方案中，可通過以下內(nèi)肽酶中的一種或多種來切割該系鏈或接頭弗林蛋白酶、凝血酶、Genenase、Lys_C、Arg-C> Asp_N、Glu_C、因子Xa、煙草蝕紋病毒蛋白酶(TEV)、腸激酶、人鼻病毒C3蛋白酶(HRVC3)或激肽原酶。在具體實(shí)施方案中，該系鏈或接 頭包含天冬酰胺-甘氨酸肽鍵，例如可被羥胺切割的天冬酰胺-甘氨酸肽鍵。在一個實(shí)施方案中，使用KnH技術(shù)，本發(fā)明的抗體進(jìn)一步在CL/CH1中和/或在VH/VL界面中包含突變。在一個實(shí)施方案中，用本發(fā)明的卷曲螺旋及CL/CH1界面上的杵和臼構(gòu)建本發(fā)明的多特異性抗體。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含與細(xì)胞毒劑綴合的恒定區(qū)。還在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體由真核細(xì)胞表達(dá)，例如哺乳動物細(xì)胞，如CHO細(xì)胞。在備選實(shí)施方案中，該抗體由原核細(xì)胞表達(dá)，例如大腸桿菌(E. coli)細(xì)胞。另一方面，本發(fā)明涉及用產(chǎn)生諸如抗體的蛋白質(zhì)復(fù)合體的方法。因此，本發(fā)明提供幾個新的方面。在一個實(shí)施方案中，此方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)包含編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)的載體的細(xì)胞的步驟。在一個實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括從該細(xì)胞或該培養(yǎng)基回收蛋白質(zhì)。在另一實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括以下步驟(a)在含有蛋白A的柱上捕獲抗體；(b)從該柱洗脫抗體；和(C)將洗脫的抗體稀釋在含有離液劑或溫和去垢劑的溶液中。還在另一方面，本發(fā)明涉及在溶液中保持含有卷曲螺旋的抗體的方法。該方法包括在離液劑或溫和去垢劑的存在下保持抗體。可以用于此方法的離液劑或溫和去垢劑的實(shí)例包括精氨酸、鹽酸胍、尿素、高氯酸鋰、組氨酸、十二烷基硫酸鈉(SDS)、Tween、Triton和NP-40。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的異源多聚體復(fù)合體與兩種或多種靶分子結(jié)合。在另一實(shí)施方案中，該異源多聚體復(fù)合體中的各多肽與不同的靶分子結(jié)合。還在另一實(shí)施方案中，該異源多聚體復(fù)合體抑制其所結(jié)合的一種或多種靶分子的生物學(xué)活性。在一個實(shí)施方案中，當(dāng)希望的生物學(xué)作用是使細(xì)胞在靠近效應(yīng)細(xì)胞(例如T淋巴細(xì)胞、天然殺傷細(xì)胞(NK)、巨噬細(xì)胞或其他單核細(xì)胞)的地方排除或失活時，靶分子之一可以是CD3、CD16或CD64。根據(jù)一個實(shí)施方案，本發(fā)明的異源多聚體復(fù)合體與選自以下的至少兩種靶分子結(jié)合IL-1 a 和 IL-I P ;IL-12和 IL-18 ;IL_13和 IL-9 ;IL_13和 IL-4 ;IL_13和 IL-5 ;IL_5和IL-4 ；IL-13 和 IL-I ^ ；IL-13 和 IL-25 ;IL_13 和 TARC ;IL_13 和 MDC ;IL_13 和 MEF ;IL_13和 TGF-P ;IL-13 和 LHR 激動劑;IL_12 和 TWEAK ;IL_13 和 CL25 ;IL_13 和 SPRR2a ;IL_13 和SPRR2b ;IL-13 和 ADAM8 ;IL_13 和 PED2 ;IL17A 和 IL17F ；CD3 和 CD19 ;CD138 和 CD20 ;CD138和 CD40 ; CD 19 和 CD20 ；CD20 和 CD3 ；CD38 和 CD 138 ；CD38 和 CD20 ；CD38 和 CD40 ；CD40 和CD20 ;CD_8 和 IL-6 ；CD20 和 BR3 ；TNF a 和 TGF- ^ ；TNF a 和 IL-I ^ ；TNF a 和 IL-2 ；TNF a和 IL-3 ；TNF a 和 IL-4 ；TNF a 和 IL-5 ；TNF a 和 IL6 ；TNF a 和 IL8 ；TNF a 和 IL-9 ；TNF a 和IL-IO ；TNFa 和 IL-Il ；TNFa 和 IL-12 ；TNFa 和 IL-13 ；TNFa 和 IL-14 ；TNFa 和 IL-15 ；TNFa 和 IL-16 ；TNFa 和 IL-17 ；TNFa 和 IL-18 ；TNFa 和 IL-19 ；TNFa 和 IL-20 ；TNFa 和IL-23 ；TNF a 和 IFN a ；TNF a 和 CD4 ；TNF a 和 VEGF ；TNF a 和 MIF ；TNF a 和 ICAM-I ；TNF a和 PGE4 ；TNF a 和 PEG2 ；TNF a 和 RANK 配體；TNF a 和 Te38 ；TNF a 和 BAFF ；TNF a 和 CD22 ；TNFa 和 CTLA-4 ；TNFa 和 GP130 ；TNFa 和 IL_12p40 ;VEGF 和 HER2 ;VEGF_A 和 HER2 ；VEGF-A和 PDGF ;HER1 和 HER2 ;VEGF_A和 VEGF-C ;VEGF_C和 VEGF-D ;HER2 和 DR5 ;VEGF和 IL-8 ；VEGF和 MET ； VEGFR 和 MET 受體；VEGFR 和 EGFR ；HER2 和 CD64 ；HER2 和 CD3 ；HER2 和 CD16 ；HER2和 HER3 ;EGFR 和 HER2 ;EGFR 和 HER3 ;EGFR 和 HER4 ;IL_13 和 CD40L ；IL4 和 CD40L ；TNFRl 和IL-IR ；TNFRl 和 IL-6R ；TNFRl 和 IL-18R ；EpCAM 和 CD3 ；MAPG 和 CD28 ；EGFR 和 CD64 ；CSPGs和 RGM A ；CTLA-4 和 BTN02 ；IGF1 和 IGF2 ；IGFl/2 和 Erb2B ；MAG 和 RGMA ;NgR 和 RGMA ；NogoA和 RGMA ；OMGp 和 RGMA ;PDL_I 和 CTLA-4 ;及 RGM A 和 RGM B。 在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及分離的抗體，其包含含有SEQ IDNO :1的序列的第一重鏈、含有SEQ ID NO :2的序列的第二重鏈和含有SEQ ID NO :3的序列的輕鏈，其中該抗體特異性結(jié)合Fe e Rl和Fe y R2b。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及分離的抗體，其包含含有SEQ IDNO :4的序列的第一重鏈、含有SEQ ID NO :5的序列的第二重鏈和含有SEQ ID NO :6的序列的輕鏈，其中該抗體特異性結(jié)合J1ER2。還在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及分離的抗體，其包含含有SEQ IDNO :7的序列的第一重鏈、含有SEQ ID NO :5的序列的第二重鏈和含有SEQ ID NO :8的序列的輕鏈，其中該抗體特異性結(jié)合EGFR。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及分離的抗體，其包含含有SEQ IDNO :9的序列的第一輕鏈序列和第一重鏈序列，及含有SEQ ID NO :10的序列的第二輕鏈序列和第二重鏈序列，其中該抗體特異性結(jié)合J1ER2和EGFR。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及分離的抗體，其包含含有SEQ IDN0:11的序列的第一輕鏈序列和第一重鏈序列，及含有SEQ ID NO: 10的序列的第二輕鏈序列和第二重鏈序列，其中該抗體特異性結(jié)合J1ER2和EGFR。本發(fā)明還涉及按照本文所述的方法產(chǎn)生的抗體在治療方法中的用途。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及特異性結(jié)合Fe e Rl和Fe Y R2b的抗體在在受試者中治療變態(tài)反應(yīng)或炎癥反應(yīng)(例如自身免疫病)的方法中的用途。此方法包括以足以在該受試者中治療該變態(tài)反應(yīng)或炎癥反應(yīng)的時間和量對受試者施用抗體或抗體片段。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及特異性結(jié)合J1ER2或EGFR(或HER2和EGFR 二者)的抗體在在受試者中治療腫瘤的方法中的用途。此方法包括以足以在受試者中治療該腫瘤的時間和量對該受試者施用抗體或抗體片段。在具體實(shí)施方案中，本文所述治療方法涉及缺乏卷曲螺旋和/或系鏈的抗體片段的用途。在此實(shí)施方案中，在產(chǎn)生后從抗體切割卷曲螺旋和/或系鏈序列，并將得到的改造抗體用于治療施用。在另一實(shí)施方案中，該治療方法涉及對受試者施用治療有效量的第二藥物。該第二藥物可以包含另一抗體或抗體片段、化療劑、細(xì)胞毒劑、抗血管發(fā)生劑、免疫抑制劑、前體藥物、細(xì)胞因子、細(xì)胞因子拮抗劑、細(xì)胞毒性放療、皮質(zhì)類固醇、止吐藥、癌癥疫苗、止痛藥或生長抑制劑。該第二藥物可以在施用第一藥物(例如抗體或抗體片段)之前或之后施用。在另一實(shí)施方案中，該第二藥物與第一藥物同時施用。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及分離的多核苷酸，其編碼SEQ IDN0:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、17-18、26、31-32或35-36中任一個的序列或其組合；包含多核苷酸的載體，該多核苷酸含有 SEQ IDNO :1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、17-18、26、31-32 或 35-36 中任一個的序列或其組合；及包含這種載體的宿主細(xì)胞。該宿主細(xì)胞可以是真核細(xì)胞，如酵母、昆蟲或哺乳動物細(xì)胞。在一個實(shí)施方案中，該哺乳動物細(xì)胞是中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞。該宿主細(xì)胞還可以是原核細(xì)胞，如大腸桿菌細(xì)胞。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及分離的多肽，其包含 SEQID NO :1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、17-18、26、31-32 或 35-36 的序列中的任一個或其組合。本發(fā)明的其他特征和優(yōu)勢將從以下發(fā)明詳述、附圖和權(quán)利要求書顯而易見。 附圖簡述圖I是顯示示例性卷曲螺旋(CC)結(jié)構(gòu)中氨基酸間離子相互作用和疏水相互作用的示意圖。第一 CC中的殘基標(biāo)記為X1至X7，第二 CC中的殘基標(biāo)記為X’工至乂’7。顯示了第一 CC的X5殘基和第二 CC的X’ 7殘基之間，以及第一 CC的X7殘基和第二 CC的X’ 5殘基之間的離子相互作用。此外，顯示了\和乂’ 4及&和乂’ i殘基之間的疏水相互作用。圖2A 顯示示例性 ACID, pi (SEQ ID NO :12)和 BASE, pi (SEQ IDNO :13)卷曲螺旋異二聚化結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列及編碼它們的DNA序列(分別為SEQ ID N0:21和SEQ ID NO:22)。圖2B是顯示示例性ACID, pi和BASE, pi卷曲螺旋異二聚化結(jié)構(gòu)域間相互作用的示意圖及各自的DNA序列SEQ ID NO 21和SEQ ID NO :22。圖3是顯示示例性雙特異性抗體結(jié)構(gòu)的示意圖，該雙特異性抗體包含共同輕鏈(共同LC)、異二聚體卷曲螺旋及第一和第二重鏈(HCl和HC2)的鉸鏈區(qū)中去除Lys-C內(nèi)肽酶切割位點(diǎn)的突變(K222A ；Kabat編號系統(tǒng))。圖4A是顯示示例性單臂抗體結(jié)構(gòu)的示意圖，該單臂抗體包含全長重鏈(HCl)、缺乏VH和CHl結(jié)構(gòu)域的部分重鏈(HC2)、輕鏈(共同LC)、異二聚體卷曲螺旋及HCl的鉸鏈區(qū)中去除Lys-C內(nèi)肽酶切割位點(diǎn)的突變(K222A)。圖4B是顯示示例性綴合抗體結(jié)構(gòu)的示意圖，該綴合抗體包含全長重鏈、共同輕鏈、卷曲螺旋及與重鏈恒定區(qū)之一綴合的細(xì)胞毒劑。星號表示細(xì)胞毒劑。圖5是顯示示例性束縛雙特異性抗體結(jié)構(gòu)的示意圖。該抗體包含兩條重鏈(HCl和HC2)和兩條輕鏈(LCl和LC2)。系鏈將HCl可變重鏈的N端連接至LCl恒定輕鏈的C端，第二系鏈將HC2可變重鏈的N端連接至LC2恒定輕鏈的C端。在此實(shí)例中，系鏈包含甘氨酸甘氨酸絲氨酸(GGS)重復(fù)序列。在此圖中，輕鏈(LCl和LC2)不同，但束縛抗體也可以包含共同輕鏈。該示例性束縛抗體進(jìn)一步包含異二聚體卷曲螺旋及HCl和HC2的鉸鏈區(qū)中去除Lys-C內(nèi)肽酶切割位點(diǎn)的突變(K222A)。圖6是顯示示例性重鏈(HC)和輕鏈(LC)以及將可變重鏈N端連接至恒定輕鏈C端的示例性系鏈的結(jié)構(gòu)的示意圖。在此實(shí)例中，系鏈的跨距約為92人,或長度約為22個氨基酸。測試了長度為20、23和26個氨基酸的系鏈。圖7A是顯示包含可切割的系鏈和異二聚體卷曲螺旋的示例性抗體結(jié)構(gòu)的示意圖。如圖中所示，該示例性系鏈將輕鏈(LC)的C端連接至重鏈(HC)的N端?？梢杂美鏛ys-C內(nèi)肽酶、弗林蛋白酶(PCl)或NH2OH(羥胺)在切割位點(diǎn)(X)處從抗體切割系鏈。示例性切割位點(diǎn)定位在系鏈的N端和C端。圖7A中所示的示例性抗體還包含異二聚體卷曲螺旋，其可以用例如Lys-C內(nèi)肽酶、弗林蛋白酶(PCl)或NH2OH在卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域N端的切割位點(diǎn)(X)處從抗體切割。圖7B是顯示示例性可切割系鏈的一系列示意圖。上圖顯示SEQ IDNO :31中的示例性26氨基酸系鏈序列(SEQ ID NO: 17)，其可被弗林蛋白酶切割，且將輕鏈(LC)的N端連接至重鏈的C端。弗林蛋白酶可以在系鏈N端和C端的二堿基位點(diǎn)(精氨酸-精氨酸)切割系鏈序列。下圖顯示SEQ ID NO :32中的示例性26氨基酸系鏈序列(SEQ ID NO 18),其可被Lys-C內(nèi)肽酶在系鏈序列N端和C端的賴氨酸殘基處切割。、圖8顯示與Fe e Rl和Fe Y R2b 二者結(jié)合的雙特異性抗體的重鏈(HC ；抗-Fe y R2b-BASE. pi序列和抗-Fe e Rl-ACID. pi序列)和共同輕鏈(4d5LC)的序列?？?Fe y R2b-BASE. pi序列(SEQ ID NO :1)包含含有BASE, pi卷曲螺旋異二聚化結(jié)構(gòu)域序列和鉸鏈區(qū)中的K222A突變的抗-人Fe Y R2b重鏈序列?？?Fe e Rl-ACID. pi序列(SEQID N02)包含含有ACID, pi卷曲螺旋異二聚化結(jié)構(gòu)域序列和鉸鏈區(qū)中的K222A突變的抗-人Fe e Rl重鏈序列。4d5抗體輕鏈(SEQ ID NO 3)是此雙特異性抗體的Fe y R2b HC和Fe e RlHC 二者共同的。圖9-1和9-2是用來產(chǎn)生示例性單臂抗體的序列。一種示例性單臂抗體特異性結(jié)合HER2，且包含抗-HER2抗體I. ACID, pi序列(含有ACID, pi卷曲螺旋異二聚化結(jié)構(gòu)域序列和 K222A 突變的抗-HER2 抗體 IHC ；SEQID NO 4)、truncFC. BASE, pi 序列(含有 BASE, pi卷曲螺旋異二聚化結(jié)構(gòu)域序列的缺乏VH和CHl結(jié)構(gòu)域的重鏈；SEQ ID NO 5)和抗-HER2抗體ILC序列(SEQ ID NO :6)。另一示例性單臂抗體特異性結(jié)合EGFR，且包含抗-EGFR(D1. 5).ACID, pi序列(含有ACID, pi卷曲螺旋異二聚化結(jié)構(gòu)域序列和鉸鏈區(qū)中的K222A突變的抗-EGFR(D1. 5) HC ；SEQ IDNO 7)、truncFC. BASE, pi 序列(含有 BASE, pi 卷曲螺旋異二聚化結(jié)構(gòu)域序列的缺乏VH和CHl結(jié)構(gòu)域的重鏈；SEQ ID NO 5)和抗-EGFR(D1. 5)抗體LC序列(SEQ ID NO 8)。

圖10顯示結(jié)合HER2和EGFR/HER1 二者的雙特異性抗體的束縛HC和LC (抗HER2 (抗體 I) 26. ACID, pi 和 Dl. 5. 26. BASE, pi)的序列?？?HER2 (抗體 I) 26. ACID, pi 序列包含含有ACID, pi卷曲螺旋異二聚化結(jié)構(gòu)域和K222A突變的通過26氨基酸甘氨酸甘氨酸絲氨酸(GGS)系鏈?zhǔn)`于抗-HER2抗體IHC序列的抗-HER2抗體ILC序列(SEQ ID NO 9)。Dl. 5. 26. BASE, pi序列包含含有BASE, pi卷曲螺旋異二聚化結(jié)構(gòu)域和K222A突變的通過26氨基酸GGS系鏈?zhǔn)`于Dl. 5抗-EGFR抗體HC序列的Dl. 5抗-EGFR抗體LC序列(SEQ IDNO 10)。圖11顯示結(jié)合HER2和EGFR/HER1 二者的另一示例性抗體的束縛HC和LC (抗-HER2(抗體 2). 26. ACID, pi 和 Dl. 5. 26. BASE, pi)的序列。抗-HER2 (抗體 2). 26.ACID, pi序列包含含有ACID, pi卷曲螺旋異二聚化結(jié)構(gòu)域和K222A突變的通過26氨基酸GGS系鏈?zhǔn)`于抗-HER2抗體2HC序列的抗-HER2抗體2LC序列(SEQ ID NO : 11)。Dl. 5. 26.BASE, pi序列包含含有BASE, pi卷曲螺旋異二聚化結(jié)構(gòu)域和K222A突變的通過26氨基酸GGS系鏈?zhǔn)`于Dl. 5抗-EGFR抗體HC序列的Dl. 5抗-EGFR抗體LC序列(SEQ ID NO 10)。圖12A-1和12A-2及12B_1、12B_2和12B-3分別是用來構(gòu)建包含卷曲螺旋異二聚化結(jié)構(gòu)域的抗體的抗-HER2抗體I的部分HC (SEQ IDNO 15)和LC (SEQ ID NO 16)氨基酸序列及DNA序列SEQ ID NO 23和SEQ ID NO :24。圖12A中顯示抗-HER2抗體IHC序列的起點(diǎn)，以及序列中K222A突變的位置。圖12B中顯示抗-HER2抗體I可變輕鏈(VL)的起點(diǎn)、抗-HER2抗體ILC的終點(diǎn)、抗-HER2抗體I可變重鏈(VH)的起點(diǎn)、抗-HER2抗體IVH的終點(diǎn)和K至A的突變的位置。圖12A和12B中還顯示用于構(gòu)建包含這些序列的載體的ClaI/Bsp 106, BamHl和ApaI限制位點(diǎn)的位置。圖13A和13B是一系列質(zhì)譜分析結(jié)果圖和示意圖，顯示可用Lys-C內(nèi)肽酶從示例性a-Fee Rl/a-Fcy R2b雙特異性抗體切割異二聚體卷曲螺旋。顯示了含有卷曲螺旋的抗體(左圖)和不含卷曲螺旋的抗體(右圖)的理論質(zhì)量，其處于各示意圖上方的質(zhì)譜分析結(jié)果圖中所示的實(shí)驗觀測質(zhì)量的誤差范圍之內(nèi)，表明從抗體切割了卷曲螺旋。 圖14A和14B是一系列質(zhì)譜分析結(jié)果圖和示意圖，顯示Lys-C內(nèi)肽酶(右圖)未在示例性a -Fe e Rl/ a -Fe y R2b雙特異性抗體的LC或HC內(nèi)切割，但確實(shí)從HC切割卷曲螺旋(左下方兩張圖和右下方兩張圖的比較)。輕鏈(MW= 26263)、含有卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域的重鏈(MW = 54917或55164)和不含卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域的重鏈(MW = 50528和50767)的理論質(zhì)量處于各構(gòu)建體的質(zhì)譜分析結(jié)果圖中所示的實(shí)驗觀測質(zhì)量的誤差范圍之內(nèi)。圖15是顯示示例性a -Fe e Rl/ a -Fe y R2b雙特異性抗體特異性和同時結(jié)合其兩種抗原的一系列圖。圖16是顯示示例性共同LC a -Fe e Rl/ a -Fe y R2b雙特異性抗體的組胺釋放測定結(jié)果的圖。測定中使用的抗體濃度(Ug/ml)沿X軸顯示，組胺釋放量(ng/ml)沿y軸顯
/Jn o圖17A和17B是一系列質(zhì)譜分析結(jié)果圖和示意圖，顯示可用Lys-C內(nèi)肽酶從示例性單臂a-EGFR抗體切割卷曲螺旋。含有卷曲螺旋的單臂抗體(MW= 109112)和不含卷曲螺旋的單臂抗體(MW= 100419)的理論質(zhì)量處于各構(gòu)建體的質(zhì)譜分析結(jié)果圖中所示的實(shí)驗觀測質(zhì)量的誤差范圍之內(nèi)。圖18A、18B和18C是一系列質(zhì)譜分析結(jié)果圖和示意圖，顯示Lys-C內(nèi)肽酶未切割示例性a -EGFR抗體的LC (單臂輕鏈；左圖)、全長HC (單臂重鏈；中圖)或缺乏VH和CHl結(jié)構(gòu)域的HC (單臂Fe ;右圖)，但確實(shí)從HC及缺乏VH和CHl結(jié)構(gòu)域的HC切割卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域。在顯示質(zhì)譜分析結(jié)果的圖的下方顯示各構(gòu)建體的理論分子量，在各種情況下，理論分子量處于實(shí)驗觀測分子量的誤差范圍之內(nèi)。圖19A和19B是一系列質(zhì)譜分析結(jié)果圖和示意圖，顯示可用Lys-C內(nèi)肽酶從示例性束縛a -EGFR/ a -HER2雙特異性抗體切割卷曲螺旋。圖中還顯示了切割和未切割的抗體的理論分子量，其處于質(zhì)譜分析結(jié)果中所示的各實(shí)驗觀測分子量的誤差范圍之內(nèi)。圖20A和20B是一系列質(zhì)譜分析結(jié)果圖和示意圖，顯示可用Lys-C內(nèi)肽酶從示例性束縛a -EGFR/ a -HER2雙特異性抗體切割卷曲螺旋，其中先用Lys-C內(nèi)肽酶處理抗體，然后對樣品進(jìn)行質(zhì)譜分析。圖中還顯示了切割和未切割的HC/LC復(fù)合體的理論分子量，且各構(gòu)建體的理論分子量處于質(zhì)譜分析結(jié)果中所示的實(shí)驗觀測分子量的誤差范圍之內(nèi)。圖21是顯示來自八隅體分析(Octet analysis)的結(jié)果的圖，顯示野生型抗-HER2抗體I和野生型a -EGFR抗體不與彼此的抗原交叉反應(yīng)，但確實(shí)結(jié)合它們各自的抗原。圖22是顯示來自八隅體分析的結(jié)果的圖，顯示單臂抗-HER2抗體I和單臂a -EGFR抗體不與彼此的抗原交叉反應(yīng)，但確實(shí)結(jié)合它們各自的抗原。圖23A是顯示來自八隅體分析的結(jié)果的圖，顯示示例性束縛雙特異性抗-HER2抗體I/a-EGFR抗體(8323)同時結(jié)合HER2和EGFR 二者。在上跡線中，先用EGFR胞外域(ECD)孵育抗體，然后用HER2受體ECD孵育，在下跡線中，先用HER2受體ECD孵育抗體，然后用EGFRECD孵育。圖23B是顯示示例性雙特異性抗-HER2抗體I/ a -EGFR抗體對HER2 (上)和 EGFRl(下)的結(jié)合親和力的圖。圖24是免疫印跡圖像，顯示示例性雙特異性抗-HER2抗體I/ a -EGFR(DI. 5)抗體以劑量依賴的方式抑制表達(dá)EGFR的NR6細(xì)胞中轉(zhuǎn)化生長因子a (TGFa)介導(dǎo)的EGFR(表皮生長因子受體)磷酸化(左側(cè))。用DL 5抗-EGFR抗體作為對照(右側(cè))。用抗-磷酸酪氨酸(a-pTyr)抗體測定磷酸化水平，并用抗-微管蛋白抗體(a _微管蛋白)作為上樣對照。圖25是顯示雙特異性抗-HER2抗體I/ a -EGFR(DI. 5)抗體在三天的時期內(nèi)抑制穩(wěn)定轉(zhuǎn)染為表達(dá)EGFR的NR6細(xì)胞中TGF a誘導(dǎo)的生長的一系列圖。圖26是顯示示例性雙特異性抗-HER2抗體I/ a -EGFR(DI. 5)抗體在五天的時期內(nèi)以類似于抗-HER2抗體I對照的方式抑制HER2擴(kuò)增的BT474細(xì)胞生長的圖。圖27是顯示使用SCID Beige小鼠的Dl. 5人IgGl對照抗體(抗-EGFR)十天藥物代謝動力學(xué)(PK)分析的Fc-Fc測定和Fc-Fc ELISA測定結(jié)果的一系列圖。圖28A和28B是顯示使用SCID Beige小鼠的示例性雙特異性抗-HER2抗體I/a -EGFR (DI. 5)抗體十天PK分析的EGFR-HER2ELISA和Fc-Fc ELISA測定結(jié)果的一系列圖。圖29是顯示示例性雙特異性抗-HER2抗體I/ a -EGFR (D1. 5)抗體與對照Dl. 5 (抗-EGFR)和對照(抗-HER2抗體2)抗體在小鼠中的暴露的比較的圖。示例性雙特異性抗-HER2抗體I/ a -EGFR(DI. 5)抗體在測試時期內(nèi)在小鼠中具有類似于對照抗體的暴露。圖 30A-1 和 30A-2、30B-1 和 30B-2、30C-1、30C-2、30C-3、30C_4 和 30C-5、30D_1、30D-2和30D-3是質(zhì)譜分析圖，顯示通過共表達(dá)弗林蛋白酶的細(xì)胞進(jìn)行弗林蛋白酶切割后抗體的重鏈和輕鏈的切割產(chǎn)物。圖31是非還原型質(zhì)譜分析圖，顯示通過在共表達(dá)弗林蛋白酶的CHO細(xì)胞中表達(dá)可被弗林蛋白酶切割的束縛卷曲螺旋抗體，并使該抗體暴露于羧肽酶消化而產(chǎn)生的雙特異性抗體。圖32(A)和(B)是還原型質(zhì)譜分析圖，顯示通過在共表達(dá)弗林蛋白酶的CHO細(xì)胞中表達(dá)可被弗林蛋白酶切割的束縛卷曲螺旋抗體，并使該抗體暴露于羧肽酶消化而產(chǎn)生的雙特異性抗體。發(fā)明詳述不受限于理論，申請人相信，即使在免疫球蛋白Fe區(qū)的存在下，本文所述卷曲螺旋異二聚化結(jié)構(gòu)域也令人驚奇地提供驅(qū)動兩個或多個分子以高準(zhǔn)確度和效率結(jié)合在一起的最初觸發(fā)，該Fe區(qū)也在細(xì)胞培養(yǎng)條件下天然相互吸引。通過還原重鏈的同二聚化，本文所述卷曲螺旋異二聚化結(jié)構(gòu)域的使用提供了產(chǎn)生包含F(xiàn)e CH成分的蛋白質(zhì)復(fù)合體(例如多特異性抗體或單臂抗體等)的同質(zhì)群體的能力中的突破。多特異性復(fù)合體對用于治療應(yīng)用有利，因為例如它們可以指導(dǎo)靶標(biāo)(例如腫瘤細(xì)胞)和針對該靶標(biāo)的藥劑(例如T細(xì)胞)的共定位，或者它們可以消除對聯(lián)合治療的需要及與向受試者提供兩種或多種治療相關(guān)的風(fēng)險。此外，為了便于構(gòu)建抗體(包括多特異性抗體)，可以用本發(fā)明的系鏈來連接抗體的輕鏈和重鏈，從而輔助各輕鏈與其關(guān)聯(lián)重鏈的正確結(jié)合。 I.定義本文以最廣泛的含義使用術(shù)語“抗體”，其指包含兩條重鏈和兩條輕鏈的任意免疫球蛋白(Ig)分子，及其任意片段、突變體、變體或衍生物，只要它們顯示希望的生物學(xué)活性(例如表位結(jié)合活性)。抗體的實(shí)例包括單克隆抗體、多克隆抗體、多特異性抗體和抗體片段。在提到可變結(jié)構(gòu)域中的殘基(大致為輕鏈的殘基1-107和重鏈的殘基1-113)時一般使用 Kabat 編號系統(tǒng)(例如 Kabat 等，Sequences of Immunological Interest.第 5版Public Health Service, National Institutesof Health, Bethesda, Md. (1991))。在提到免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)中的殘基時一般使用“EU編號系統(tǒng)”或“EU指數(shù)”(例如Kabat等，上文中報道的EU指數(shù))。“Kabat中的EU指數(shù)”指人IgGlEU抗體的殘基編號。除非本文另有說明，提到抗體可變結(jié)構(gòu)域中的殘基編號意指Kabat編號系統(tǒng)的殘基編號。除非本文另有說明，提到抗體重鏈恒定結(jié)構(gòu)域中的殘基編號意指EU編號系統(tǒng)的殘基編號。以最廣泛的含義使用術(shù)語“多特異性抗體”，且明確涵蓋具有多表位特異性的抗體。這類多特異性抗體包括但不限于包含重鏈可變結(jié)構(gòu)域(Vh)和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的抗體，其中Vh'單元具有多表位特異性；各Vh'單元與不同表位結(jié)合的具有兩個或多個Vh和'結(jié)構(gòu)域的抗體；各單可變結(jié)構(gòu)域與不同表位結(jié)合的具有兩個或多個單可變結(jié)構(gòu)域的抗體；全長抗體；抗體片段，如Fab、Fv、dsFv、scFv ;雙抗體、雙特異性雙抗體和三鏈抗體；共價或非共價連接的抗體片段。“多表位特異性”指與相同或不同靶標(biāo)上的兩個或多個不同表位特異性結(jié)合的能力。“單特異的”指僅與一個表位結(jié)合的能力。根據(jù)一個實(shí)施方案，多特異性抗體是以 5 ii M 至 0. 001pM、3 ii M 至 0. OOlpM, I u M M 0. 001pM、0. 5 u M M 0. OOlpM 或0. I ii M至0. OOlpM的親和力與各表位結(jié)合的IgG抗體。天然存在的基本四鏈抗體單元是由兩條相同的輕(L)鏈和兩條相同的重(H)鏈組成的異四聚體糖蛋白(IgM抗體由5個基本異四聚體單元連同另一稱為J鏈的多肽組成，因此包含10個抗原結(jié)合部位，而分泌性IgA抗體可以多聚化形成包含2-5個基本四鏈單元連同J鏈的多價組合(assemblage))。在IgG的情況下，四鏈單元通常為約150，000道爾頓。各L鏈通過一個共價二硫鍵與H鏈連接，而取決于H鏈同種型，兩條H鏈通過一個或多個二硫鍵相互連接。各H鏈和L鏈還具有規(guī)則間隔的鏈內(nèi)二硫鍵。各H鏈在N端具有可變結(jié)構(gòu)域，對于a鏈和Y鏈，隨后是三個恒定結(jié)構(gòu)域(CH)，對于y和e同種型，隨后是四個CH結(jié)構(gòu)域。各L鏈在N端具有可變結(jié)構(gòu)域(VL)，隨后是其另一端的恒定結(jié)構(gòu)域(CL)。VL與VH比對，CL與重鏈的第一恒定結(jié)構(gòu)域(CHl)比對。認(rèn)為特定氨基酸殘基在輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和重鏈可變結(jié)構(gòu)域之間形成界面。VH和VL配對在一起形成單個抗原結(jié)合部位。不同種類抗體的結(jié)構(gòu)和特性參見例如 Basic and Clinical Immunology,第 8 版,Daniel P. Stites,Abba I. Terr 和 Tristram G. Parslow (編輯),AppIeton&Lange, Norwalk, CT, 1994, 71 頁和
第6章。根據(jù)其恒定結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，可以將來自任意脊椎動物物種的L鏈分配至稱為K和X的兩個明顯不同的類型之一。取決于其重鏈恒定結(jié)構(gòu)域(CH)的氨基酸序列，可以將免疫球蛋白分配至不同種類或同種型。存在五類免疫球蛋白IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其具有分別命名為a、S、Y、e和ii的重鏈。根據(jù)CH序列和功能的相對次要的差異，將Y和a類進(jìn)一步劃分為亞類，例如人類表達(dá)以下亞類IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和 IgA2。術(shù)語“可變的”指可變結(jié)構(gòu)域的某些區(qū)段的序列在抗體間廣泛不同的事實(shí)。V結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)抗原結(jié)合，并限定特定抗體對其特定抗原的特異性。但是，可變性并非在可變結(jié)構(gòu)域 的110個氨基酸的跨度內(nèi)平衡分布。相反，V區(qū)由15-30個氨基酸的稱為構(gòu)架區(qū)(FR)的相對不變的延伸組成，該構(gòu)架區(qū)由長度各為9-12個氨基酸的稱為“高變區(qū)”的極端可變的較短區(qū)域分隔開。天然重鏈和輕鏈的可變區(qū)各包含四個FR，四個FR主要采取￠-折疊構(gòu)象，通過三個高變區(qū)連接，該高變區(qū)形成連接3 -折疊結(jié)構(gòu)的環(huán)，且在一些情況下形成￠-折疊結(jié)構(gòu)的部分。各鏈中的高變區(qū)通過FR近距離保持在一起，并與來自其他鏈的高變區(qū)一起促成抗體抗原結(jié)合部位的形成(見Kabat等，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第 5 版 PublicHealth Service, National Institutes of Health, Bethesda,MD (1991) )0恒定區(qū)不直接涉及抗體與抗原的結(jié)合，但顯示多種效應(yīng)子功能，如抗體在抗體依賴性細(xì)胞毒作用(ADCC)中的參與。在本文中使用時，術(shù)語“高變區(qū)”、“HVR”或“HV”指序列變異度高和/或形成結(jié)構(gòu)上定義的環(huán)的抗體可變結(jié)構(gòu)域區(qū)域。通常，抗體包含六個HVR;三個在VH中(H1、H2、H3)，三個在VL中(L1、L2、L3)。在天然抗體中，H3和L3顯示六個HVR中最大的多樣性，尤其認(rèn)為H3在賦予抗體精細(xì)特異性中發(fā)揮獨(dú)特作用。見例如Xu等，Immunity 13 :37-45 (2000) Johnson和 Wu,在 Methods in Molecular Biology 248 :1-25 (Lo,編輯，Human Press, Totowa, NJ,2003)中。實(shí)際上，僅由重鏈組成的天然存在的駱駝(camelid)抗體在缺乏輕鏈的情況下具有功能且穩(wěn)定。見例如 Hamers-Casterman 等,Nature 363 :446-448(1993) ;Sheriff 等，Nature Struct. Biol. 3 :733-736(1996)。許多HVR描述在使用，且為本文所涵蓋。Kabat互補(bǔ)決定區(qū)(OTR)基于序列變異性，且最常用(Kabat ^,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版 PublicHealth Service, National Institutesof Health,Bethesda, MD. (1991))。而 Chothia指結(jié)構(gòu)環(huán)的位置(Chothia 和 Lesk J. Mol. Biol. 196 :901-917 (1987))。AbM HVR 代表 KabatHVR和Chothia結(jié)構(gòu)環(huán)的折衷,且為Oxford Molecular' s AbM抗體建模軟件所采用?！敖佑|”HVR基于可得的復(fù)合體晶體結(jié)構(gòu)的分析。下文記錄了來自這些HVR中的每一個的殘基。環(huán) Kabat AbMChothia 接觸
LI L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36 L2 L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55 L3 L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96
Hl H31-H35B H26-H35B H26-H32 H30-H35B(Kabat 編號)Hl H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35(Chothia 編號)H2 II50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58H3 H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101HVR 可以包含以下“延長 HVR”VL 中的 24-36 或 24-34(LI)、46_56 或 50-56 (L2)和 89-97 或 89-96 (L3)，及 VH 中的 26-35 (Hl)、50-65 或 49-65 (H2)和 93-102,94-102 或95-102 (H3)。對于這些定義中的每一個，按照Kabat等，上文編號可變結(jié)構(gòu)域殘基。“構(gòu)架區(qū)”(FR)除⑶R殘基外的那些可變結(jié)構(gòu)域殘基。每個可變結(jié)構(gòu)域通常具有鑒定為FR1、FR2、FR3和FR4的四個FR。如果按照Kabat定義CDR，那么輕鏈FR殘基大致定位在殘基 1-23 (LCFRl)、35-49 (LCFR2)、57-88 (LCFR3)和 98-107 (LCFR4)，而重鏈 FR 殘基大致定位在重鏈殘基中的殘基 1-30 (HCFRl) ,36-49 (HCFR2)、66_94 (HCFR3)和 103-113 (HCFR4)。如果CDR包含來自高變環(huán)的氨基酸殘基，那么輕鏈FR殘基大致定位在輕鏈中的殘基1-25 (LCFRl)、33-49 (LCFR2)、53-90 (LCFR3)和 97-107 (LCFR4)，而重鏈 FR 殘基大致定位在重鏈殘基中的殘基 1-25 (HCFRI)、33-52 (HCFR2)、56-95 (HCFR3)和 102-113 (HCFR4)。在一些情況下，在⑶R包含來自Kabat定義的⑶R和高變環(huán)二者的氨基酸時，將相應(yīng)地調(diào)整FR殘基。例如，在CDRHl包含氨基酸H26 -H35時，重鏈FRl殘基在1_25位，而FR2殘基在36-49位?！叭斯灿袠?gòu)架”是代表人免疫球蛋白VL或VH構(gòu)架序列的選擇中最常存在的氨基酸殘基的構(gòu)架。通常，從可變結(jié)構(gòu)域序列亞組選擇人免疫球蛋白VL或VH序列。通常，該序列亞組是Kabat中的亞組。在一個實(shí)施方案中，對于VL，該亞組是Kabat中的亞組k I。在一個實(shí)施方案中，對于VH，該亞組是Kabat中的亞組III。“完整”抗體的一個實(shí)例是包含抗原結(jié)合部位以及CL和至少重鏈恒定結(jié)構(gòu)域CHl、CH2和CH3的抗體。恒定結(jié)構(gòu)域可以是天然序列恒定結(jié)構(gòu)域(例如人天然序列恒定結(jié)構(gòu)域)或其氨基酸序列變體?！翱贵w片段”包含完整抗體的部分，優(yōu)選完整抗體的抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)。抗體片段的實(shí)例包含F(xiàn)ab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段；雙抗體(Db);串聯(lián)雙抗體(taDb)、線性抗體(例如美國專利號5, 641, 870,實(shí)施例2 ；Zapata等，Protein Eng. 8 (10)1057-1062(1995));單臂抗體、單可變結(jié)構(gòu)域抗體、微型抗體(minibody)、單鏈抗體分子；及從抗體片段形成的多特異性抗體(例如，包括但不限于b-Fc、taDb-Fc、taDb_CH3和(scFV)4-Fc)。表述“單結(jié)構(gòu)域抗體”(sdAb)或“單可變結(jié)構(gòu)域(SVD)抗體”通常指其中單可變結(jié)構(gòu)域(VH或VL)可以賦予抗原結(jié)合的抗體。換言之，該單可變結(jié)構(gòu)域無需與另一可變結(jié)構(gòu)域相互作用來識別靶抗原。單結(jié)構(gòu)域抗體的實(shí)例包含衍生自駱駝(美洲駝(Iamas)和駱駝)和軟骨魚(例如鉸口鯊)的那些，以及通過重組方法衍生自人類和小鼠抗體的那些(Nature (1989) 341 :544-546 ；Dev Comp Immunol (2006) 30 :43-56 ;TrendBiochemSci (2001) 26 :230-235 ；Trends Biotechnol (2003) :21 :484-490 ；W02005/035572 ；WO 03/035694 ；Febs Lett (1994) 339 :285-290 ；W000/29004 ；W0 02/051870)。表述“線性抗體”通常指Zapata 等，Protein Eng. 8(10) :1057-1062(1995)中所述的抗體。簡言之，這些抗體包含一對串聯(lián)Fd區(qū)段(Vh-ChI-Vh-ChI),該區(qū)段與互補(bǔ)輕鏈多肽一起形成一對抗原結(jié)合區(qū)。線性抗體可以是雙特異性的或單特異性的。 本文提到的術(shù)語“杵入臼(knob-into-hole) ”或“KnH”技術(shù)指通過在它們相互作用的界面上在一條多肽中引入隆突(pertuberance)(杵)，另一多肽中引入空穴(臼)來指導(dǎo)兩條多肽在體外或體內(nèi)配對在一起的技術(shù)。例如，已將KnH引入抗體的Fe:Fe結(jié)合界面、(^:011界面或^￥1界面(例如 US2007/0178552 ；W0 96/027011 ；W0 98/050431 JPZhu 等(1997)Protein Science 6 :781-788)。這對在多特異性抗體的制備過程中驅(qū)動兩條不同的重鏈配對在一起尤其有用。例如，在其Fe區(qū)中具有KnH的多特異性抗體可以進(jìn)一步包含與各Fe區(qū)連接的單可變結(jié)構(gòu)域，或進(jìn)一步包含與相似或不同的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域配對的不同重鏈可變結(jié)構(gòu)域。還可以用KnH技術(shù)來將兩個不同的受體胞外域或包含不同靶標(biāo)識別序列的任意其他多肽序列(例如包括親和體、肽體和其他Fe區(qū))配對在一起。木瓜蛋白酶消化抗體產(chǎn)生兩個相同的抗原結(jié)合片段(稱為“Fab”片段)和殘余“Fe”片段(反映易于結(jié)晶的能力的命名)。Fab片段由整條L鏈連同H鏈的可變區(qū)結(jié)構(gòu)域(VH)和一條重鏈的第一恒定結(jié)構(gòu)域(CHl)組成。胃蛋白酶處理抗體產(chǎn)生單個大的F(ab’)2片段，其大致對應(yīng)于具有二價抗原結(jié)合活性且仍能夠交聯(lián)抗原的兩個通過二硫鍵連接的Fab片段。Fab’片段與Fab片段的不同在于在CHl結(jié)構(gòu)域的羧基端具有另外幾個殘基(包括來自抗體鉸鏈區(qū)的一個或多個半胱氨酸)。Fab’ -SH是本文對其中恒定區(qū)的一個或多個半胱氨酸殘基具有自由巰基的Fab’的命名。最初作為其間具有鉸合部半胱氨酸的Fab”片段對產(chǎn)生F(ab’)2抗體片段。還已知抗體片段的其他化學(xué)偶聯(lián)。Fe片段包含通過二硫鍵結(jié)合在一起的兩條H鏈的羧基端部分?？贵w的效應(yīng)子功能由Fe區(qū)中的序列決定；此區(qū)域也是由見于某些細(xì)胞類型上的Fe受體(FcR)識別的部分?！癋v”由緊密非共價結(jié)合的一個重鏈可變結(jié)構(gòu)域和一個輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的二聚體組成。從這兩個結(jié)構(gòu)域的折疊發(fā)出六個高變環(huán)(3個環(huán)來自H鏈，3個環(huán)來自L鏈)，其貢獻(xiàn)用于抗原結(jié)合的氨基酸殘基并賦予抗體抗原結(jié)合特異性。但是，甚至單個可變結(jié)構(gòu)域(或僅包含對抗原特異的三個⑶R的半個Fv)也具有識別和結(jié)合抗原的能力，雖然通常以低于整個結(jié)合部位的親和力結(jié)合。也縮寫為“sFv”或“scFv”的“單鏈Fv”是包含連接入單條多肽鏈的VH和VL抗體結(jié)構(gòu)域的抗體片段。優(yōu)選地，sFv多肽進(jìn)一步在VH和VL結(jié)構(gòu)域之間包含多肽接頭，其使得sFv能夠形成希望的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)。sFv的綜述見Pluckthun, The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies, 113 卷，Rosenburg 和 Moore 編輯，Springer-Verlag, New York,269-315 頁(1994) ；Malmborg 等，J. Immunol. Methods 183 :7-13,1995。術(shù)語“雙抗體”指通過以下制備的小抗體片段在VH和VL結(jié)構(gòu)域之間用短接頭(約5-10個殘基)構(gòu)建sFv片段(見前一段)，使得達(dá)到V結(jié)構(gòu)域的鏈間配對而不是鏈內(nèi)配對，產(chǎn)生二價片段，即具有兩個抗原結(jié)合部位的片段。雙特異性雙抗體是兩個“交疊” sFv片段的異二聚體，其中兩種抗體的VH和VL結(jié)構(gòu)域存在于不同的多肽鏈上。雙抗體更充分地描述于例如 EP 404，097 ；W0 93/11161 ;和 Hollinger 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 6444-6448(1993)中。術(shù)語“單臂抗體”指包含以下的抗體(I)通過肽鍵連接至包含CH2結(jié)構(gòu)域、CH3結(jié)構(gòu)域或CH2-CH3結(jié)構(gòu)域的多肽的可變結(jié)構(gòu)域；和(2)第二 CH2、CH3或CH2-CH3結(jié)構(gòu)域，其中可變結(jié)構(gòu)域未通過肽鍵連接至包含該第二 CH2、CH3或CH2-CH3結(jié)構(gòu)域的多肽。在一個實(shí)施方案中，單臂抗體包含3條多肽(I)包含可變結(jié)構(gòu)域(例如VH)、CH1、CH2和CH3的第一多肽；⑵包含可變結(jié)構(gòu)域(例如VL)和CL結(jié)構(gòu)域的第二多肽；和⑶包含CH2和CH3結(jié)構(gòu)域 的第三多肽。在一個實(shí)施方案中，該第三多肽不包含可變結(jié)構(gòu)域。在另一實(shí)施方案中，單臂抗體具有部分鉸鏈區(qū)，該部分鉸鏈區(qū)包含形成連接恒定重鏈的二硫鍵的兩個半胱氨酸。在一個實(shí)施方案中，單臂抗體的可變結(jié)構(gòu)域形成抗原結(jié)合區(qū)。在另一實(shí)施方案中，單臂抗體的可變結(jié)構(gòu)域是單可變結(jié)構(gòu)域，其中各單可變結(jié)構(gòu)域是抗原結(jié)合區(qū)。本發(fā)明的抗體可以是“嵌合”抗體，其中部分重鏈和/或輕鏈與衍生自特定物種或隸屬于特定抗體種類或亞類的抗體中對應(yīng)的序列相同或同源，而一條或多條鏈的其余部分與衍生自另一物種或隸屬于另一抗體種類或亞類的抗體中對應(yīng)的序列相同或同源，以及這類抗體的片段，只要它們顯示希望的生物學(xué)活性(美國專利號4，816，567 JPMorrison等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 :6851-6855 (1984))。本文中的目的嵌合抗體包含靈長類化(primatized)抗體,其含有衍生自非人靈長類(例如舊大陸猴、猿等)的可變結(jié)構(gòu)域抗原結(jié)合序列和人恒定區(qū)序列。非人(例如嚙齒動物)抗體的“人源化”形式是包含衍生自非人抗體的最少序列的嵌合抗體。在大多數(shù)情況下，人源化抗體是這樣的人免疫球蛋白(受體抗體)，其中用來自具有希望的抗體特異性、親和力和容量的諸如小鼠、大鼠、兔或非人靈長類的非人物種的高變區(qū)(供體抗體)的殘基取代來自受體高變區(qū)的殘基。在一些情況下，用對應(yīng)的非人殘基取代人免疫球蛋白的構(gòu)架區(qū)(FR)殘基。此外，人源化抗體可以包含不見于受體抗體中或供體抗體中的殘基。產(chǎn)生這些修飾來進(jìn)一步改進(jìn)抗體性能。通常，人源化抗體將包含至少一個(且通常為兩個)可變結(jié)構(gòu)域的基本上全部，其中全部或基本上全部高變環(huán)對應(yīng)于非人免疫球蛋白的高變環(huán)，而全部或基本上全部FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗體還將可選地包含至少部分免疫球蛋白恒定區(qū)(Fe)，通常是人免疫球蛋白的恒定區(qū)。進(jìn)一步的詳情見 Jones 等，Nature 321:522-525(1986) ;Riechmann 等，Nature332 :323-329 (1988)；和 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2 :593-596(1992)。本文所用的“復(fù)合體”或“復(fù)合的”指通過不是肽鍵的鍵和/或力(例如范德瓦爾斯力、疏水力、親水力)彼此相互作用的兩個或多個分子的結(jié)合。在一個實(shí)施方案中，該復(fù)合體是異源多聚體。應(yīng)理解，本文所用的術(shù)語“蛋白質(zhì)復(fù)合體”或“多肽復(fù)合體”包括具有與蛋白質(zhì)復(fù)合體中的蛋白質(zhì)綴合的非蛋白質(zhì)實(shí)體(例如，包括但不限于化學(xué)分子，如毒素或檢測劑)的復(fù)合體。本文所用的術(shù)語“異源多聚體”或“異源多聚體的”描述通過非肽鍵共價鍵(例如二硫鍵)和/或非共價作用(例如氫鍵、離子鍵、范德瓦爾斯力和疏水作用)相互作用的兩條或多條多肽，其中至少兩個分子具有相互不同的序列。本文所用的術(shù)語“免疫黏附素”指將異源蛋白質(zhì)(“黏附素”)的結(jié)合特異性與免疫球蛋白恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域的效應(yīng)子功能組合的分子。在結(jié)構(gòu)上，免疫黏附素包含具有希望的結(jié)合特異性的氨基酸序列(該氨基酸序列不同于抗體的抗原識別和結(jié)合部位(即與抗體的恒定區(qū)相比是“異源的”))與免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域序列(例如IgG的CH2和/或CH3序列)的融合。示例性黏附素序列包含含有與目的蛋白質(zhì)結(jié)合的受體或配體部分的連續(xù)氨基酸序列。黏附素序列還可以是結(jié)合目的蛋白質(zhì)，但不是受體或配體序列的序列(例如肽體中的黏附素序列)。可以通過包括噬菌體展示技術(shù)和高流通量分選法的多種方法來選擇或鑒定這類多肽序列。免疫黏附素中的免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域序列可以獲自任意免疫球蛋白，如 IgG-I、IgG-2、IgG-3 或 IgG-4 亞型、IgA(包括 IgA-I 和 IgA-2)、IgE、IgD 或 IgM。、本發(fā)明的“結(jié)合”目的抗原的抗體是這樣的抗體，其以足夠的親和力結(jié)合抗原，使得該抗體可作為診斷劑和/或治療劑用于靶向蛋白質(zhì)或表達(dá)該抗原的細(xì)胞或組織，且未顯著地與其他蛋白質(zhì)交叉反應(yīng)。在這類實(shí)施方案中，通過熒光激活細(xì)胞分選術(shù)(FACS)分析或放射免疫沉淀法(RIA)或ELISA測定，抗體與“非靶”蛋白的結(jié)合程度將小于抗體與其特定靶蛋白的結(jié)合的約10%。對于抗體與靶分子的結(jié)合，術(shù)語“特異性結(jié)合”或與特定多肽或特定多肽靶標(biāo)上的表位“特異性結(jié)合”或?qū)μ囟ǘ嚯幕蛱囟ǘ嚯陌袠?biāo)上的表位“特異”意指顯著不同于非特異性相互作用的結(jié)合(例如非特異性相互作用可以是與牛血清白蛋白或酪蛋白相互作用)。可以例如通過測定分子與對照分子的結(jié)合相比的結(jié)合來測量特異性結(jié)合。例如，可以通過用類似于靶標(biāo)的對照分子(例如過量的未標(biāo)記靶標(biāo))競爭來測定特異性結(jié)合。在這種情況下，如果過量的未標(biāo)記靶標(biāo)競爭性抑制探針標(biāo)記的靶標(biāo)的結(jié)合，則指示特異性結(jié)合?？梢岳缤ㄟ^對靶標(biāo)具有至少約200nM、備選地至少約150nM、備選地至少約100nM、備選地至少約60nM、備選地至少約50nM、備選地至少約40nM、備選地至少約30nM、備選地至少約20nM、備選地至少約10nM、備選地至少約8nM、備選地至少約6nM、備選地至少約4nM、備選地至少約2nM、備選地至少約InM或更大的Kd的分子來顯示本文所用的術(shù)語“特異性結(jié)合”或與特定多肽或特定多肽靶標(biāo)上的表位“特異性結(jié)合”或?qū)μ囟ǘ嚯幕蛱囟ǘ嚯陌袠?biāo)上的表位“特異”。在一個實(shí)施方案中，術(shù)語“特異性結(jié)合”指這樣的結(jié)合，其中分子與特定多肽或特定多肽上的表位結(jié)合，而基本上不與任何其他多肽或多肽表位結(jié)合。“結(jié)合親和力”通常指分子(例如抗體)的單個結(jié)合部位與其結(jié)合配偶體(例如抗原)之間的總和共價相互作用的強(qiáng)度。除非另有說明，本文所用的“結(jié)合親和力”指反映結(jié)合對(例如抗體和抗原)成員間I:I相互作用的內(nèi)在結(jié)合親和力。通常可以通過解離常數(shù)(Kd)來表示分子X對其配偶體Y的親和力。例如，Kd可以是約200nM、150nM、100nM、60nM、50nM、40nM、30nM、20nM、10nM、8nM、6nM、4nM、2nM、InM 或更強(qiáng)?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的常見方法(包括本文所述的那些)來測量親和力。低親和力抗體通常緩慢地結(jié)合抗原，且傾向于容易解離，而高親和力抗體通常更快地結(jié)合抗原，且傾向于保持結(jié)合更長時間。本領(lǐng)域已知測量結(jié)合親和力的多種方法，其中任一種都可以用于本發(fā)明的目的。在一個實(shí)施方案中，用 10個響應(yīng)單位(RU)的固定化抗原CM5芯片在25°C下使用 BIAcore -2000 或 BIAcore -3000 (BIAcore, Inc.，Piscataway, NJ),通過使用表面等離振子共振測定來測量本發(fā)明的“Kd”或“Kd值”。簡言之，按照供應(yīng)商的說明用N-乙基-N，-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)活化羧甲基化葡聚糖生物傳感器芯片(CM5，BIAcore Inc.)。按5 yl/分鐘的流速注入前，用IOmM檸檬酸鈉pH 4. 8將抗原稀釋至5iig/ml ( 0. 2iiM)，以達(dá)到約10個響應(yīng)單位(RU)的偶聯(lián)蛋白質(zhì)。注入抗原后，注入IM乙醇胺來封閉未反應(yīng)的基團(tuán)。對于動力學(xué)測量，按約25 u I/分鐘的流速在25°C下將兩倍系列稀釋的Fab (例如0. 78nM至500nM)注入含0.05% Tween 20的PBS(PBST)。通過同時擬合結(jié)合傳感圖和解離傳感圖，用簡單的一對一 Langmuir 結(jié)合模型(BIAcore Evaluation Software version 3. 2)計算結(jié)合速率(km)和解離速率U。將平衡解離常數(shù)(Kd)計算為比值kf/匕。見例如Chen等，J. Mol. Biol. 293 =865-881 (1999)。如果通過以上表面等離振子共振測定測量的結(jié)合速率超過IO6M-1S'那么可以通過使用熒光淬滅技術(shù)來測定結(jié)合速率，如在分光計，如裝配停流的分光光度計(AvivInstruments)或具有攪拌杯的8000系列SLM-Aminco分光光度計 (ThermoSpectronic)中測量,該技術(shù)在濃度漸增的抗原存在下測量含20nM抗-抗原的抗體(Fab形式)的PBS pH7.2在25°C下的熒光發(fā)射強(qiáng)度(激發(fā)= 295nm;發(fā)射= 340nm，16nm帶通)的增加或減少。還可以用 10個響應(yīng)單位(RU)的固定化抗原CM5芯片在25 °C下使用BIAcore -2000 或 BIAcore -3000 (BIAcore, Inc. , Piscataway, NJ),用上文所述的相同的表面等離振子共振技術(shù)來測定本發(fā)明的“結(jié)合速率(on-rate) ”或“結(jié)合的速率”或“結(jié)合速率(association rate) ”或“k。/。簡言之，按照供應(yīng)商的說明用N-乙基_N’-(3_ 二甲基氨基丙基)_碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)活化羧甲基化葡聚糖生物傳感器芯片(CM5，BIAcore Inc.)。按5 yl/分鐘的流速注入前，用IOmM檸檬酸鈉pH 4. 8將抗原稀釋至5 ii g/ml ( 0. 2 ii M),以達(dá)到約10個響應(yīng)單位(RU)的偶聯(lián)蛋白質(zhì)。注入抗原后，注入IM乙醇胺來封閉未反應(yīng)的基團(tuán)。對于動力學(xué)測量，按約25iU/分鐘的流速在25°C下將兩倍系列稀釋的Fab (例如0. 78nM至500nM)注入含0. 05% Tween 20的PBS (PBST)。通過同時擬合結(jié)合傳感圖和解離傳感圖，用簡單的一對一 Langmuir結(jié)合模型(BIAcoreEvaluation Software version 3. 2)計算結(jié)合速率(kon)和解離速率(koff)。將平衡解離常數(shù)(Kd)計算為比值 koff/kon。見例如 Chen 等，J. Mol. Biol. 293 =865-881 (1999)。但是，如果通過以上表面等離振子共振測定測量的結(jié)合速率超過IO6M4S'則優(yōu)選通過使用熒光淬滅技術(shù)來測定結(jié)合速率，如在分光計，如裝配停流的分光光度計(Aviv Instruments)或具有攪拌杯的8000系列SLM-Aminco分光光度計(ThermoSpectronic)中測量,該技術(shù)在濃度漸增的抗原存在下測量含20nM抗抗原的抗體(Fab形式)的PBS pH7. 2在25°C下的熒光發(fā)射強(qiáng)度(激發(fā)=295nm ;發(fā)射=340nm, 16nm帶通)的增加或減少。除非另有說明，對于本發(fā)明的多肽，如抗體、其片段或衍生物，“具有生物學(xué)活性的”及“生物學(xué)活性”和“生物學(xué)特征”指具有與生物分子結(jié)合的能力?！半捏w”指隨機(jī)產(chǎn)生的肽與Fe結(jié)構(gòu)域的融合。見例如2003年12月9日授予Feige等的美國專利號6，660，843 (以其整體引入作為參考)。它們包含與N端、C端、氨基酸側(cè)鏈，或與一個以上這些位點(diǎn)連接的一條或多條肽。肽體技術(shù)使得能夠設(shè)計摻入了靶向一種或多種配體或受體的肽、tumor-homing肽、膜轉(zhuǎn)運(yùn)肽等的治療劑。已證明肽體技術(shù)可用于設(shè)計許多這類分子，包括線性肽和受二硫鍵限制的肽、“串聯(lián)肽多聚體”(即單鏈Fe結(jié)構(gòu)域上的一種以上肽)。見例如美國專利號6，660，843 ;2003年10月16日公開的美國專利申請?zhí)?003/0195156(對應(yīng)于2002年11月21日公開的WO 02/092620) ;2003年9月18日公開的美國專利申請?zhí)?003/0176352(對應(yīng)于2003年4月17日公開的WO 03/031589) ;1999年10月22日提交的美國系列號09/422,838(對應(yīng)于2000年5月4日公開的WO 00/24770)；2003年12月11日公開的美國專利申請?zhí)?003/0229023 ;2003年7月17日公開的WO03/057134 ；2003年12月25日公開的美國專利申請?zhí)?003/0236193 (對應(yīng)于2004年4月8日提交的PCT/US04/010989) ;2003年9月18日提交的美國系列號10/666，480 (對應(yīng)于2004年4月I日公開的WO 04/026329);其中每項專利在此以其整體引入作為參考。“親和體”指通過肽鍵與Fe區(qū)連接的蛋白質(zhì)的用途，其中用該蛋白質(zhì)作為支架來提供靶分子的結(jié)合表面。該蛋白質(zhì)通常是天然存在的蛋白質(zhì)，如葡萄球菌A蛋白或結(jié)合IgG的B結(jié)構(gòu)域、或從其衍生的Z蛋白(見Nilsson等(1987)，Prot Eng 1，107-133 ;和美國專利號5，143，844)或其片段或衍生物。例如，可以從具有改變的與一個或多個靶分子 的結(jié)合親和力的Z蛋白變體產(chǎn)生親和體，其中已通過隨機(jī)誘變突變Z蛋白的區(qū)段來產(chǎn)生能夠結(jié)合靶分子的變體的文庫。親和體的實(shí)例包括美國專利號6，534，628 ;Nord K等，ProtEng 8:601-608(1995) JPNord K 等，Nat Biotech 15 :772-777 (1997) Biotechnol ApplBiochem. 2008 年 6 月；50(Pt 2) :97_112?！胺蛛x的”異源多聚體或復(fù)合體指已從其天然細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的成分分開和/或回收的異源多聚體或復(fù)合體。其天然環(huán)境的污染成分是可以干擾該異源多聚體的診斷用途或治療用途的物質(zhì)，且可以包含酶、激素和其他蛋白質(zhì)溶質(zhì)或非蛋白質(zhì)溶質(zhì)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，將該異源多聚體純化至(I)通過Lowry法測定蛋白質(zhì)大于95wt%，且最優(yōu)選超過99wt% ； (2)足以通過使用旋杯式測序儀獲得N端或內(nèi)部氨基酸序列的至少15個殘基的程度；或(3)通過使用考馬斯藍(lán)染色或優(yōu)選銀染的還原或非還原條件下的SDS-PAGE顯示同質(zhì)。通常將本發(fā)明的異源多聚體純化至基本上同質(zhì)。用短語“基本上同質(zhì)的”、“基本上同質(zhì)的形式”和“基本同質(zhì)”來指產(chǎn)物基本上不含有源自不希望的多肽組合(例如同型多聚體)的副產(chǎn)物。按純度表示，基本同質(zhì)指副產(chǎn)物的量不超過IOwt%、4wt%、3wt%、2wt%* lwt%或低于lwt%。在一個實(shí)施方案中，副產(chǎn)物低于5%?！吧锓肿印敝负怂?、蛋白質(zhì)、糖類、脂質(zhì)及其組合。在一個實(shí)施方案中，該生物分子存在于自然界中。在用來描述本文所述的多種抗體時，“分離的”指已從其所表達(dá)自的細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)物鑒定并分離和/或回收的抗體。其天然環(huán)境的污染成分是通?？梢愿蓴_該多肽的診斷用途或治療用途的物質(zhì)，且可以包含酶、激素和其他蛋白質(zhì)溶質(zhì)或非蛋白質(zhì)溶質(zhì)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，將該多肽純化至(I)足以通過使用旋杯式測序儀獲得N端或內(nèi)部氨基酸序列的至少15個殘基的程度；或(2)通過使用考馬斯藍(lán)染色或優(yōu)選銀染的還原或非還原條件下的SDS-PAGE顯示同質(zhì)。分離的抗體包括重組細(xì)胞內(nèi)的原位抗體，因為將不存在該多肽天然環(huán)境的至少一種成分。但是，通常將通過至少一個純化步驟來制備分離的多肽。本文所用的“連接的”或“連接”指第一和第二氨基酸序列間的直接肽鍵連接，或涉及第三氨基酸序列的連接，該第三氨基酸序列與第一和第二氨基酸序列連接，且處在第一和第二氨基酸序列之間。例如，接頭肽與一條氨基酸序列的C端連接，與另一氨基酸序列的N端連接。本文所用的“接頭”指長度為兩個或多個氨基酸的氨基酸序列。接頭可以由中性極性或非極性氨基酸組成。接頭長度可以是例如2至100個氨基酸，如長度在2至50個氨基酸之間，例如長度為3、5、10、15、20、25、30、35、40、45或50個氨基酸。接頭可以是例如通過自身切割或酶切割或化學(xué)切割“可切割的”。氨基酸序列中的切割位點(diǎn)及在這類位點(diǎn)切割的酶和化學(xué)藥品為本領(lǐng)域公知，且也在本文中描述。本文所用的“系鏈”指連接其他兩條氨基酸序列的氨基酸接頭。本文所述的系 鏈可以將免疫球蛋白重鏈可變結(jié)構(gòu)域的N端與免疫球蛋白輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域的C端連接。在具體實(shí)施方案中，系鏈長度在約15至50個氨基酸之間，例如長度在20至26個氨基酸之間(例如長度為20、21、22、23、24、25或26個氨基酸)。系鏈可以是例如通過自身切割或使用本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)方法和試劑的酶切割或化學(xué)切割“可切割的”?！敖宇^”或“系鏈”的酶切割可以涉及諸如例如LYs-C、Asp-N、Arg-C、V8、Glu-C、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、凝血酶、Genenase、因子Xa、TEV(煙草蝕紋病毒半胱氨酸蛋白酶)、腸激酶、HRVC3 (人鼻病毒C3蛋白酶)、激肽原酶以及枯草蛋白酶樣蛋白原轉(zhuǎn)化酶(例如弗林蛋白酶(PC1)、PC2或PC3)或N-精氨酸二堿基轉(zhuǎn)化酶的內(nèi)肽酶的使用?；瘜W(xué)切割可以涉及例如羥胺、N-氯代琥珀酰亞胺、N-溴代琥珀酰亞胺或溴化氰的使用。本文所用的“Lys-C內(nèi)肽酶切割位點(diǎn)”是可以被Lys-C內(nèi)肽酶在C端一側(cè)切割的氨基酸序列中的賴氨酸殘基。Lys-C內(nèi)肽酶在賴氨酸殘基的C端一側(cè)切割。本文所用的“七殘基重復(fù)序列”指7個連續(xù)氨基酸的序列，其在氨基酸序列中重復(fù)至少一次。七殘基重復(fù)序列可以按照第一重復(fù)序列的C端緊鄰第二重復(fù)序列的N端在氨基酸序列中連續(xù)排列。在一個實(shí)施方案中，七殘基重復(fù)序列具有本文定義的式I或式II的序列。本文所用的“卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域”、“卷曲螺旋異二聚化結(jié)構(gòu)域”、“螺旋”或“螺旋異二聚化結(jié)構(gòu)域”指形成a -螺旋結(jié)構(gòu)的氨基酸序列，該a -螺旋結(jié)構(gòu)可以與第二 a-螺旋結(jié)構(gòu)(第二“卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域”)相互作用來形成“卷曲螺旋”或“異二聚體卷曲螺旋”。a-螺旋結(jié)構(gòu)可以是右手a-螺旋。在一個實(shí)施方案中，a-螺旋結(jié)構(gòu)由七殘基重復(fù)序列構(gòu)成。在一個具體實(shí)施方案中，卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域具有圖I中所示的結(jié)構(gòu)，其中第一和第二 a -螺旋結(jié)構(gòu)的“X/’和“X/ ”位殘基形成疏水相互作用，第一和第二 a -螺旋結(jié)構(gòu)的“X4”和“X/ ”位殘基形成疏水相互作用，第一 a-螺旋結(jié)構(gòu)的“X5”位殘基與第二 a-螺旋結(jié)構(gòu)的“X/”位殘基形成離子相互作用，第一 a-螺旋結(jié)構(gòu)的“X7”位殘基與第二 a-螺旋結(jié)構(gòu)的“X5’”位殘基形成離子相互作用。卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域可以由本文定義的式I或式II的兩個或多個七殘基重復(fù)序列構(gòu)成。“疏水性殘基”指丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸或甲硫氨酸。在具體實(shí)施方案中，該疏水性殘基不是脯氨酸。
“帶電荷殘基”指酸性或堿性氨基酸。賴氨酸、精氨酸和組氨酸是堿性氨基酸，天冬氨酸和谷氨酸是酸性氨基酸?！半x液劑”指通過干擾穩(wěn)定化分子內(nèi)相互作用(例如氫鍵、范德瓦爾斯力或疏水作用)來破壞蛋白質(zhì)(例如抗體)三維結(jié)構(gòu)的水溶性物質(zhì)。示例性離液劑包括但不限于尿素、鹽酸胍、高氯酸鋰、組氨酸和精氨酸?！皽睾腿ス竸敝竿ㄟ^干擾穩(wěn)定化分子內(nèi)相互作用(例如氫鍵、范德瓦爾斯力或疏水作用)來破壞蛋白質(zhì)(例如抗體)三維結(jié)構(gòu)，但不永久性破壞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)以致引起生物學(xué)活性喪失(即不變性蛋白質(zhì))的水溶性物質(zhì)。示例性溫和去垢劑包括但不限于Tween (例如 Tween-20)、Triton (例如 Triton X-100)、NP-40 (壬基苯氧基聚乙氧基乙醇)、NonidetP-40(辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)和十二烷基硫酸鈉(SDS)。 “鉸鏈區(qū)”通常定義為從人IgGl的Glu216延伸至Pro230 (Burton，Molec.Immunol. 22 :161-206(1985))。通過將形成重鏈間S-S鍵的第一個和最后一個半胱氨酸殘基放置在相同位置上，可以將其他IgG同種型的鉸鏈區(qū)與IgGl序列比對。Fe區(qū)的“下鉸鏈區(qū)”通常定義為緊鄰鉸鏈區(qū)C端的殘基延伸，即Fe區(qū)的殘基233至239。在本發(fā)明之前，通常將Fe YR結(jié)合歸因于IgG Fe區(qū)的下鉸鏈區(qū)中的氨基酸殘基。人IgG Fe區(qū)的“CH2結(jié)構(gòu)域”通常從IgG的約殘基231延伸至約340。CH2結(jié)構(gòu)域的獨(dú)特性在于它未與另一結(jié)構(gòu)域緊密配對。相反，完整的天然IgG分子的兩個CH2結(jié)構(gòu)域之間插入了兩個N-連接分支糖鏈。已推測糖類可以提供結(jié)構(gòu)域-結(jié)構(gòu)域配對的替代，并幫助穩(wěn)定 CH2 結(jié)構(gòu)域。Burton, Molec. Immunol. 22 :161-206(1985)?！癈H3結(jié)構(gòu)域”包含F(xiàn)e區(qū)中CH2結(jié)構(gòu)域C端的殘基延伸(即從IgG的約氨基酸殘基341至約氨基酸殘基447)。本文用術(shù)語“Fe區(qū)”來定義免疫球蛋白重鏈的C端區(qū)域，包括天然序列Fe區(qū)和變體Fe區(qū)。雖然免疫球蛋白重鏈Fe區(qū)的邊界可以不同，但人IgG重鏈Fe區(qū)通常定義為從Cys226位氨基酸殘基或從Pro230延伸至其羧基端?？梢岳缭诋a(chǎn)生或純化抗體的過程中，或通過重組改造編碼抗體重鏈的核酸來去除Fe區(qū)的C端賴氨酸(EU編號系統(tǒng)的殘基447)。因此，完整抗體的組合物可以包含去除了所有K447殘基的抗體群體，未去除K447殘基的抗體群體，及具有包含和不含K447殘基的抗體的混合物的抗體群體?！肮δ蹻e區(qū)”具有天然序列Fe區(qū)的“效應(yīng)子功能”。示例性“效應(yīng)子功能”包括Clq結(jié)合；CDC ；Fc受體結(jié)合；ADCC ;吞噬作用；細(xì)胞表面受體(例如B細(xì)胞受體；BCR)下調(diào)等。這類效應(yīng)子功能通常需要Fe區(qū)與結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如抗體可變結(jié)構(gòu)域)組合，且可以用例如本文的定義中公開的多種測定評估?！疤烊恍蛄蠪e區(qū)”包含與見于自然界中Fe區(qū)的氨基酸序列相同的氨基酸序列。天然序列人Fe區(qū)包括天然序列人IgGlFc區(qū)(非A和A同種異型)；天然序列人IgG2Fc區(qū)；天然序列人IgG3Fc區(qū)；天然序列人IgG4Fc區(qū)；及其天然存在的變體?！白凅wFe區(qū)”包含由于至少一個氨基酸修飾(優(yōu)選一個或多個氨基酸取代)而不同于天然序列Fe區(qū)的氨基酸序列的氨基酸序列。優(yōu)選地，與天然序列Fe區(qū)或與親本多肽的Fe區(qū)相比，變體Fe區(qū)具有天然序列Fe區(qū)中或親本多肽Fe區(qū)中的至少一個氨基酸取代，例如約一個至約十個氨基酸取代，且優(yōu)選約一個至約五個氨基酸取代。本文的變體Fe區(qū)將優(yōu)選與天然序列Fe區(qū)和/或與親本多肽Fe區(qū)具有至少約80%同源性，且最優(yōu)選與之具有至少約90%同源性，更優(yōu)選與之具有至少約95%同源性。本文所用的“Fe復(fù)合體”指相互作用在一起的Fe區(qū)的兩個CH2結(jié)構(gòu)域和/或相互作用在一起的Fe區(qū)的兩個CH3結(jié)構(gòu)域，其中CH2結(jié)構(gòu)域和/或CH3結(jié)構(gòu)域通過并非肽鍵的鍵和/或力(例如范德瓦爾斯力、疏水力、親水力)相互作用。本文所用的“Fe成分”指Fe區(qū)的鉸鏈區(qū)、CH2結(jié)構(gòu)域或CH3結(jié)構(gòu)域。本文所用的“Fe CH成分”或“FcCH”指包含F(xiàn)e區(qū)的CH2結(jié)構(gòu)域、CH3結(jié)構(gòu)域或CH2和CH3結(jié)構(gòu)域的多肽?？贵w“效應(yīng)子功能”指可歸因于抗體Fe區(qū)(天然序列Fe區(qū)或氨基酸序列變體Fe區(qū))且隨抗體同種型改變的那些生物學(xué)活性。抗體效應(yīng)子功能的實(shí)例包括Clq結(jié)合和依賴補(bǔ)體的細(xì)胞毒性；Fc受體結(jié)合；依賴抗體的細(xì)胞毒性(ADCC);吞噬作用；細(xì)胞表面受體(例、如B細(xì)胞受體)下調(diào)；及B細(xì)胞活化?！耙蕾嚳贵w的細(xì)胞毒性”或“ADCC”指細(xì)胞毒性的一種形式，其中分泌型Ig結(jié)合至某些細(xì)胞毒性細(xì)胞(例如天然殺傷(NK)細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)上存在的Fe受體(FcR)上，使這些細(xì)胞毒性效應(yīng)細(xì)胞能夠特異性結(jié)合具有抗原的靶細(xì)胞，并在隨后用細(xì)胞毒劑殺死該靶細(xì)胞?？贵w“武裝”細(xì)胞毒性細(xì)胞，且絕對為這種殺傷所需。介導(dǎo)ADCC的初級細(xì)胞(NK細(xì)胞)僅表達(dá)Fe ￥1 111，而單核細(xì)胞表達(dá)？(^1 1、？(^1 11和Fe yRIII。Ravetch和 Kinet, Annu. Rev. Tmmuno1. 9 :457_92 (1991)第 464 頁的表 3 中總結(jié)了造血細(xì)胞上的 FcR表達(dá)。為了評估目的分子的ADCC活性，可以進(jìn)行體外ADCC測定，如美國專利號5，500, 362或5，821，337中所述的ADCC測定。用于這類測定的效應(yīng)細(xì)胞包含外周血單核細(xì)胞(PBMC)和天然殺傷(NK)細(xì)胞。備選地,或此外,可以例如在動物模型,如Clynes等，Proc. Natl.Acad. Sci. USA 95 =652-656(1998)中公開的動物模型中體內(nèi)評估目的分子的ADCC活性。“Fe受體”或“FcR”描述與抗體Fe區(qū)結(jié)合的受體。優(yōu)選的FcR是天然序列人FcR0此外，優(yōu)選的FcR是結(jié)合IgG抗體的FcRU受體)，且包含F(xiàn)e Y RI、Fe Y RII和FcyRIII亞類的受體，包括這些受體的等位基因變體和選擇性剪接形式。Fe YRII受體包含F(xiàn)e Y RIIA (“活化”受體)和Fe Y RIIB (“活化”受體)，它們具有主要在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中不同的相似的氨基酸序列?；罨荏wFe Y RIIA在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中包含基于免疫受體酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受體Fe Y RIIB在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中包含基于免疫受體酪氨酸的抑制基序(ITM)(見DaSron,Annu. Rev. Immunol. 15 :203-234(1997)中的綜述M)。FcR 綜述于 Ravetch 和 Kinet, Annu. Rev. TmmunoI 9 :457-492(1991) ；Capel 等，Immunomethods 4 25-34(1994);和 de Haas 等，J. Lab. Clin. Med. 126 :330-41 (1995)中。本文的術(shù)語“FcR”涵蓋了其他FcR，包括有待將來鑒定的那些。該術(shù)語還包含負(fù)責(zé)將母體IgG轉(zhuǎn)移至胎兒的新生兒受體 FcRn (Guyer 等，J. Immunol. 117 :587 (1976);和 Kim 等，J. Immunol. 24 :249 (1994))。“人效應(yīng)細(xì)胞”是表達(dá)一種或多種FcR，并執(zhí)行效應(yīng)子功能的白細(xì)胞。優(yōu)選地，該細(xì)胞至少表達(dá)Fe y RIII，并執(zhí)行ADCC效應(yīng)子功能。介導(dǎo)ADCC的人白細(xì)胞的實(shí)例包含外周血單核細(xì)胞(PBMC)、天然殺傷(NK)細(xì)胞、單核細(xì)胞、細(xì)胞毒性T細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞；優(yōu)選PBMC和NK細(xì)胞。效應(yīng)細(xì)胞可以分離自天然來源，例如分離自血液?！耙蕾囇a(bǔ)體的細(xì)胞毒性”或“CDC”指在補(bǔ)體的存在下裂解靶細(xì)胞。通過補(bǔ)體系統(tǒng)的第一成分(Clq)與結(jié)合其關(guān)聯(lián)抗原的(適當(dāng)亞類的)抗體的結(jié)合來起始經(jīng)典補(bǔ)體途徑的活化。為了評估補(bǔ)體活化，可以進(jìn)行例如Gazzano-Santoro等，J. Immunol. Methods 202 163(1996)中所述的CDC測定。術(shù)語“治療有效量”指在受試者中治療疾病或障礙的抗體、抗體片段或衍生物的量。在腫瘤(例如癌性腫瘤)的情況下，抗體或抗體片段(例如多特異性抗體或抗體片段)的治療有效量可以減少癌細(xì)胞數(shù)目；減小原發(fā)腫瘤大?。灰种?即在某種程度上減緩和優(yōu)選阻止)癌細(xì)胞浸潤進(jìn)入外周器官；抑制(即在某種程度上減緩和優(yōu)選阻止)腫瘤轉(zhuǎn)移；在某種程度上抑制腫瘤生長；和/或在某種程度上減輕與該障礙相關(guān)的一種或多種癥狀。在抗體或抗體片段可以防止生長和/或殺死現(xiàn)有癌細(xì)胞的程度，它可以是抑制細(xì)胞的和/或毒害細(xì)胞的。對于癌癥治療，可以例如通過評估存活時間、疾病進(jìn)展時間(TTP)、應(yīng)答率(RR)、應(yīng)答持續(xù)時間和/或生活質(zhì)量來測量體內(nèi)功效。“減少或抑制”指弓I起優(yōu)選20 %或更大，更優(yōu)選50 %或更大，且最優(yōu)選75 %、85 %、90%,95%或更大的總體減少的能力。減少或抑制可以涉及所治療的障礙的癥狀、轉(zhuǎn)移的存在或大小、原發(fā)腫瘤的大小或血管發(fā)生障礙中的血管大小或數(shù)目。術(shù)語“癌癥”和“癌性的”指或描述哺乳動物中的生理條件，其通常表征為不受調(diào)節(jié) 的細(xì)胞生長/增殖。此定義中包含良性癌癥和惡性癌癥。癌癥的實(shí)例包括但不限于癌、淋巴瘤、母細(xì)胞瘤、肉瘤和白血病。這類癌癥的更具體的實(shí)例包括鱗狀細(xì)胞癌、小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、肺腺癌、肺鱗狀細(xì)胞癌、腹膜癌、肝細(xì)胞癌、胃癌(包括胃腸癌)、胰腺癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、膠質(zhì)瘤、宮頸癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、肝細(xì)胞瘤(hepatoma)、乳腺癌、結(jié)腸癌、直結(jié)腸癌、子宮內(nèi)膜癌或子宮癌、唾液腺癌、腎癌(例如腎細(xì)胞癌)、肝癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌(h印atic carcinoma)、肛管癌、陰莖癌、黑色素瘤及多種類型的頭癌和頸癌?！霸缙诎┌Y”指未侵入或未轉(zhuǎn)移或分類為0期、I期或II期癌癥的癌癥。術(shù)語“癌前期的”指通常先于癌癥或發(fā)展為癌癥的條件或生長。“非轉(zhuǎn)移性的”指良性或保持在原發(fā)部位且未滲入淋巴管或血管系統(tǒng)或原發(fā)部位以外的組織的癌癥。通常，非轉(zhuǎn)移性癌癥是0期、I期或II期癌癥和有時為III期癌癥的任意癌癥?！吧婕癏ER2異常激活的非惡性疾病或障礙”是不涉及癌癥的病癥，其中患有或易感該疾病或障礙的受試者的細(xì)胞或組織中發(fā)生J1ER2的異常激活。這類疾病或障礙的實(shí)例包括自身免疫病(例如銀屑病)，見下文定義；子宮內(nèi)膜異位癥；硬皮??；再狹窄；息肉，如結(jié)腸息肉、鼻息肉或胃腸道息肉；纖維腺瘤；呼吸道疾病(例如慢性支氣管炎、哮喘(包括急性哮喘和變應(yīng)性哮喘)、囊性纖維化、支氣管擴(kuò)張、變應(yīng)性或其他鼻炎或鼻竇炎、a I-抗-胰蛋白酶缺乏病、咳嗽、肺氣腫、肺纖維化或過度反應(yīng)性氣道、慢性阻塞性肺部疾病及慢性阻塞性肺障礙)；膽囊炎；神經(jīng)纖維瘤?。欢嗄倚阅I??；炎性疾??；皮膚障礙(包括銀屑病和皮炎)；血管??；涉及血管上皮細(xì)胞異常增殖的病癥；胃腸潰瘍;Menetrier病、分泌性腺瘤或蛋白質(zhì)丟失綜合癥；腎障礙；血管發(fā)生障礙；眼病，如年齡相關(guān)性黃斑變性、擬眼組織胞漿菌病綜合癥、來自增生型糖尿病性視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜血管形成、糖尿病性視網(wǎng)膜病變或年齡相關(guān)性黃斑變性的視網(wǎng)膜新生血管形成；骨相關(guān)病變，如骨關(guān)節(jié)炎、佝僂病和骨質(zhì)疏松癥；腦缺血事件后損傷；纖維化或水腫病，如肝硬化、肺纖維化、carcoidosis、甲狀腺炎、全身性高粘滯綜合癥、遺傳性出血性毛細(xì)血管擴(kuò)張癥(Osier Weber-Rendu disease)、慢性阻塞性肺病或燒傷、創(chuàng)傷、輻射、中風(fēng)、缺氧或缺血后的水腫；皮膚過敏反應(yīng)；糖尿病性視網(wǎng)膜病變和糖尿病性腎病；GuiIIain-Barre綜合癥；移植物抗宿主病或移植排斥；Paget??；骨骼或關(guān)節(jié)炎癥；光老化(例如由人皮膚的UV照射引起)；良性前列腺肥大；某些微生物感染，包括選自腺病毒、漢坦病毒、博氏疏螺旋體(Borrelia burgdorferi),耶爾森氏菌屬物種(Yersinia spp.)和百日咳桿菌(Bordetellapertussis)的微生物病原體；血小板聚集引起的血栓；生殖病癥，如子宮內(nèi)膜異位癥、卵巢過度刺激綜合癥、先兆子癇、功能失調(diào)性子宮出血或月經(jīng)頻多；滑膜炎；粥樣斑；急性和慢性腎病(包括增生性腎小球腎炎和糖尿病引起的腎病)；濕疹；增生性瘢痕形成；內(nèi)毒素性休克和真菌感染；家族性腺瘤性息肉??；神經(jīng)變性疾病(例如阿爾茨海默病、AIDS相關(guān)癡呆、帕金森病、肌萎縮性側(cè)索硬化癥、色素性視網(wǎng)膜炎、脊髓性肌萎縮和小腦變性)；骨髓增生異常綜合癥；再生障礙性貧血；缺血性損傷；肺、腎或肝的纖維化；1細(xì)胞介導(dǎo)的過敏性疾病；嬰兒肥厚性幽門狹窄；尿路阻塞性綜合癥；銀屑病關(guān)節(jié)炎；及橋本氏甲狀腺炎。本文的“變應(yīng)性或炎性障礙”是由個體免疫系統(tǒng)過度激活引起的疾病或障礙。示例性變應(yīng)性或炎性障礙包括但不限于哮喘、銀屑病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、特應(yīng)性皮炎、多發(fā)性硬化、全身性紅斑狼瘡、濕疹、器官移植、年齡相關(guān)性黃斑變性、克羅恩氏病、潰瘍性結(jié)腸炎、嗜酸細(xì)胞性食管炎和與炎癥相關(guān)的自身免疫病。本文的“自身免疫病”是由個體自身組織引起且針對個體自身組織的疾病或 障礙或其共分離或表現(xiàn)形式或從其產(chǎn)生的病癥。自身免疫病或障礙的實(shí)例包括但不限于關(guān)節(jié)炎(類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，如急性關(guān)節(jié)炎、慢性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、慢性炎癥性關(guān)節(jié)炎、變性關(guān)節(jié)炎、感染性關(guān)節(jié)炎、Lyme關(guān)節(jié)炎、增生性關(guān)節(jié)炎、銀屑病關(guān)節(jié)炎、椎骨關(guān)節(jié)炎、幼年型類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、arthritischronicaprogrediente、變形性關(guān)節(jié)炎、慢性原發(fā)性多關(guān)節(jié)炎、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎和強(qiáng)直性脊柱炎)；炎性過度增殖性皮膚病；銀屑病，如斑塊狀銀屑病、gutattepsoriasis、膿皰性銀屑病和指甲銀屑??；皮炎，包括接觸性皮炎、慢性接觸性皮炎、變應(yīng)性皮炎、變應(yīng)性接觸性皮炎、皰疹樣皮炎和特應(yīng)性皮炎；X連鎖高IgM綜合癥；蕁麻疹，如慢性變應(yīng)性蕁麻疹和慢性特發(fā)性蕁麻疹，包括慢性自身免疫性蕁麻疹；多肌炎/皮肌炎；青少年型皮肌炎；中毒性表皮壞死溶解癥；硬皮病(包括全身性硬皮病)；硬化癥，如全身性硬化病、多發(fā)性硬化癥(MS)(如spino-optical MS、原發(fā)性進(jìn)行性MS(PPMS)和復(fù)發(fā)_好轉(zhuǎn)型MS(RRMS))、進(jìn)行性全身性硬化癥、動脈粥樣硬化、動脈硬化、播散性硬化和共濟(jì)失調(diào)性硬化；炎性腸病(IBD)(例如克羅恩氏病、自身免疫介導(dǎo)的胃腸疾病、結(jié)腸炎(如潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis, colitisulcerosa)、微小性結(jié)腸炎、膠原性結(jié)腸炎、息肉狀結(jié)腸炎、壞死性小腸結(jié)腸炎和透壁性結(jié)腸炎)和自身免疫性炎性腸病)；壞疽性膿皮??；結(jié)節(jié)性紅斑；原發(fā)性硬化性膽管炎；鞏膜外層炎；呼吸窘迫綜合癥，包括成人型或急性呼吸窘迫綜合癥(ARDS);腦膜炎；全部或部分血管膜的炎癥；虹膜炎；脈絡(luò)膜炎；自身免疫性血液障礙；類風(fēng)濕性脊椎炎；突發(fā)性耳聾；IgE介導(dǎo)的疾病，如過敏癥及變應(yīng)性和特發(fā)性鼻炎；腦炎，如Rasmussen腦炎及邊緣性腦炎和/或腦干腦炎；葡萄膜炎，如前葡萄膜炎、急性前葡萄膜炎、肉芽腫性葡萄膜炎、非肉芽腫性葡萄膜炎、晶狀體抗原性葡萄膜炎、后葡萄膜炎或自身免疫性葡萄膜炎；伴隨和不伴隨腎病綜合癥的腎小球腎炎(GN)，如慢性或急性腎小球腎炎，如原發(fā)性GN、免疫性GN、膜性GN(膜性腎病)、特發(fā)性膜性GN或特發(fā)性膜性腎病、膜性增生性GN(MPGN)(包括I型和II型)和急進(jìn)性GN ;變應(yīng)性病癥；變應(yīng)性反應(yīng)；濕疹，包括變應(yīng)性或特應(yīng)性濕疹；哮喘，如支氣管哮喘(asthma bronchiale, bronchial asthma)和自身免疫性哮喘；涉及T細(xì)胞浸潤和慢性炎癥反應(yīng)的病癥；慢性肺炎性疾病；自身免疫性心肌炎；白細(xì)胞黏附性缺陷；全身性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus (SLE)或 systemic lupuserythematodes)，如皮膚 SLE、亞急性皮膚紅斑狼瘡、新生兒狼瘡綜合癥(NLE)、播散性紅斑狼瘡、狼瘡(包括腎炎、大腦炎、兒科、非腎、腎外、盤狀、脫發(fā))；幼年型(I型)糖尿病，包括小兒胰島素依賴型糖尿病(IDDM);成年型糖尿病(II型糖尿病)；自身免疫性糖尿?。惶匕l(fā)性尿崩癥；與細(xì)胞因子和T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的急性和遲發(fā)型超敏反應(yīng)相關(guān)的免疫應(yīng)答；結(jié)核??；結(jié)節(jié)??；肉芽腫病，包括淋巴瘤樣肉芽腫病、Wegener肉芽腫病；粒細(xì)胞缺乏癥；血管病，包括血管炎(包括大血管血管炎(包括風(fēng)濕性多肌痛和巨細(xì)胞(高安)動脈炎)、中血管血管炎(包括Kawasaki病和結(jié)節(jié)性多動脈炎)、微小性多動脈炎、CNS血管炎、壞死性、皮膚性或過敏性血管炎、系統(tǒng)性壞死性血管炎和ANCA相關(guān)血管炎，如Churg-Strauss血管炎或綜合癥(CSS)、顳動脈炎；再生障礙性貧血、自身免疫性再生障礙性貧血、Coombs陽性貧血、Diamond Blackfan貧血、溶血性貧血或免疫性溶血性貧血，包括自身免疫性溶血性貧血(AIHA)、惡性貧血(perniciousanemia, anemia perniciosa)、Addison病、純紅細(xì)胞性貧血或再生障礙(PRCA)、VIII因子缺乏、血友病A、自身免疫性中性白細(xì)胞減少、全血細(xì)胞減少、白細(xì)胞減少、涉及白細(xì)胞滲出的疾??；CNS炎性障礙；多器官損傷綜合癥，如敗血癥、創(chuàng)傷或出血繼發(fā)的那些；抗原-抗體復(fù)合物介導(dǎo)的疾病；抗腎小球基膜病；抗磷脂抗體綜合癥；變應(yīng)性神經(jīng)炎；Bechet或Behcet ??；CastIeman 綜合癥；Goodpasture 綜合癥；Reynaud 綜合癥；Sjogren 綜合癥；Stevens-Johnson綜合癥；類天皰瘡，如大皰性類天皰瘡和皮膚類天皰瘡；天皰瘡(包括尋常性天皰瘡、落葉性天皰瘡、pemphigus mucus-membrane pemphigoid和紅斑性天皰瘡)；自身免疫性多內(nèi)分泌??；Reiter病或綜合癥；免疫復(fù)合物性腎炎；抗體介導(dǎo)的腎炎；視神經(jīng)脊髓炎；多神經(jīng)?。宦陨窠?jīng)病，如IgM多神經(jīng)病或IgM介導(dǎo)的神經(jīng)?。谎“鍦p少癥(例如心肌梗塞患者所發(fā)展)，包括血栓性血小板減少性紫癜(TTP)和自身免疫性或免疫介導(dǎo)性血小板減少癥，如特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)，包括慢性或急性ITP ;睪丸和卵巢的自身免疫病，包括自身免疫性睪丸炎和卵巢炎；原發(fā)性甲狀腺功能減退、甲狀旁腺功能減退；自身免疫性內(nèi)分泌疾病，包括甲狀腺炎(如自身免疫性甲狀腺炎、橋本病、慢性甲狀腺炎(橋本甲狀腺炎)或亞急性甲狀腺炎)、自身免疫性甲狀腺病、特發(fā)性甲狀腺功能減退、Grave?。欢嘞袤w綜合癥，如自身免疫性多腺體綜合癥(或多腺體內(nèi)分泌病綜合癥)；瘤外綜合癥，包括神經(jīng)系瘤外綜合癥，如Lambert-Eaton肌無力綜合癥或Eaton-Lambert綜合癥、僵人綜合癥(stiff-man syndrome或stiff-person syndrome);腦脊髓炎，如變應(yīng)性腦脊髓炎(allergic encephalomyelitis 或 encephalomyelitisallergica)和實(shí)驗性變應(yīng)性腦脊髓炎(EAE);重癥肌無力，如胸腺瘤相關(guān)重癥肌無力、小腦變性、神經(jīng)性肌強(qiáng)直、視性眼陣攣綜合癥或視性眼陣攣-肌陣攣綜合癥(OMS);感覺神經(jīng)?。欢嘣钚赃\(yùn)動神經(jīng)??；Sheehan綜合癥；自身免疫性肝炎；慢性肝炎；狼瘡樣肝炎；巨細(xì)胞肝炎；慢性活動性肝炎或自身免疫性慢性活動性肝炎；淋巴性間質(zhì)性肺炎；閉塞性細(xì)支氣管炎(非移植)對NSIP ；Guillain-Barre綜合癥；Berger病(IgA腎病);特發(fā)性IgA腎病；線性IgA皮膚病；原發(fā)性膽汁性肝硬變；肺硬變；自身免疫性腸病綜合癥；乳糜瀉；腹腔病；口炎性腹瀉(麩質(zhì)腸病)；頑固性腹瀉；特發(fā)性腹瀉；冷球蛋白血癥；肌萎縮性側(cè)索硬化癥(ALS ；Lou Gehrig 病)；冠狀動脈疾??；自身免疫性耳病，如自身免疫性內(nèi)耳病(AIED)、自身免疫性聽力喪失；視性眼陣攣-肌陣攣綜合癥(OMS);多軟骨炎，如頑固性或復(fù)發(fā)性多軟骨炎；肺泡蛋白沉著癥；淀粉樣變性；鞏膜炎；非癌性淋巴細(xì)胞增多；原發(fā)性淋巴細(xì)胞增多，其包括單克隆B細(xì)胞淋巴細(xì)胞增多(例如良性單克隆丙種球蛋白病和意義未定性單克隆丙種球蛋白病(MGUS));周圍神經(jīng)?。涣鐾饩C合癥；通道病(channelopathy)，如癲癇、偏頭痛、心律失常、肌肉障礙、聾、盲、周期性麻痹和CNS的通道?。还陋?dú)癥；炎性肌??；局灶性節(jié)段性腎小球硬化癥(FSGS);內(nèi)分泌性眼病；葡萄膜視網(wǎng)膜炎；脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜炎；自身免疫性肝障礙；纖維肌痛；多內(nèi)分泌衰竭；Schmidt綜合癥；腎上腺炎；胃萎縮；早老性癡呆；脫髓鞘病，如自身免疫性脫髓鞘??；糖尿病性腎??！Dressier綜合癥；斑禿；CREST綜合癥(鈣質(zhì)沉著、雷諾現(xiàn)象、食道運(yùn)動功能障礙、指端硬化和毛細(xì)血管擴(kuò)張)；雄性和雌性自身免疫性不育；混合性結(jié)締組織病；Chagas病；風(fēng)濕熱；習(xí)慣性流產(chǎn)；農(nóng)民肺；多形性紅斑；心臟切開術(shù)后綜合癥；Cushing綜合癥；養(yǎng)鳥者肺；變應(yīng)性肉芽腫性血管 炎；良性淋巴細(xì)胞性脈管炎；Alport綜合癥；肺泡炎，如變應(yīng)性肺泡炎和致纖維性肺泡炎；間質(zhì)性肺?。惠斞磻?yīng)；麻風(fēng)；瘧疾；利什曼??；kypanosomiasis ;血吸蟲??；蛔蟲??；曲霉?。籗ampter綜合癥；Caplan綜合癥；登革熱；心內(nèi)膜炎；心內(nèi)膜心肌纖維化；彌漫性肺間質(zhì)纖維化；間質(zhì)性肺纖維化；特發(fā)性肺纖維化；囊性纖維化；眼內(nèi)炎；持久性隆起性紅斑；胎兒有核紅細(xì)胞增多癥；嗜酸性筋膜炎；Shulman綜合癥；Felty綜合癥；flariasis ;睫狀體炎，如慢性睫狀體炎、異時性睫狀體炎、虹膜睫狀體炎或Fuch睫狀體炎Menoch-Schonlein紫癜；人免疫缺陷病毒(HIV)感染；艾柯病毒感染；心肌??；阿爾茨海默??；細(xì)小病毒感染；風(fēng)疹病毒感染；接種后綜合癥；先天性風(fēng)疹感染；EB病毒感染；流行性腮腺炎；Evan綜合癥；自身免疫性生殖腺衰竭；Sydenham舞蹈病；鏈球菌感染后腎炎；thromboangitisubiterans ;甲狀腺毒癥；脊髓癆；脈絡(luò)膜炎；巨細(xì)胞多肌痛；內(nèi)分泌性眼??；慢性過敏性肺炎；干燥性角膜結(jié)膜炎；流行性角膜結(jié)膜炎；特發(fā)性腎炎綜合征；微小病變性腎病；良性家族性和缺血-再灌注性損傷；視網(wǎng)膜自身免疫；關(guān)節(jié)炎癥；支氣管炎；慢性梗阻性氣道疾病；硅肺??；口瘡；口瘡性口炎；動脈硬化性障礙；aspermiogenese ；自身免疫性溶血；Boeck病；冷球蛋白血癥；Dupuytren攣縮；晶狀體過敏性眼內(nèi)炎；過敏性腸炎；麻風(fēng)結(jié)節(jié)性紅斑；特發(fā)性面神經(jīng)麻痹；慢性疲勞綜合癥；風(fēng)濕性發(fā)熱；Hamman-Rich??；感覺神經(jīng)性聽力喪失；haemoglobinuria paroxysmatica ;性腺功能減退；區(qū)域性回腸炎；白細(xì)胞減少；傳染性單核細(xì)胞增多癥；貫性脊髓炎；原發(fā)性特發(fā)性黏液水腫；腎?。籵phthalmia symphatica ;肉芽腫性睪丸炎；胰腺炎；急性多神經(jīng)根炎；壞疽性膿皮?。籕uervain甲狀腺炎！acquired spenic atrophy ;抗精子抗體引起的不育；非惡性胸腺瘤；白癜風(fēng)；SCID和EB病毒相關(guān)疾病；獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS);寄生蟲病，如利什曼原蟲；中毒性休克綜合癥；食物中毒；涉及T細(xì)胞侵潤的病癥；白細(xì)胞粘附缺陷；與細(xì)胞因子和T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的急性和遲發(fā)型超敏反應(yīng)相關(guān)的免疫應(yīng)答；涉及淋巴白細(xì)胞滲出的疾病；多器官損傷綜合癥；抗原-抗體復(fù)合物介導(dǎo)的疾?。豢鼓I小球基膜??；變應(yīng)性神經(jīng)炎；自身免疫性多內(nèi)分泌?。宦殉惭?；原發(fā)性黏液水腫；自身免疫性萎縮性胃炎；交感性眼炎；風(fēng)濕性疾?。换旌闲越Y(jié)締組織?。荒I病綜合癥；胰島炎；多內(nèi)分泌腺衰竭；周圍神經(jīng)病型自身免疫性多腺體綜合癥；成人型特發(fā)性甲狀旁腺功能減退(AOIH);全禿；擴(kuò)張型心肌??；獲得性大皰性表皮松解癥(EBA);血色素沉著??；心肌炎；腎病綜合癥；原發(fā)性硬化性膽管炎；化膿性或非化膿性鼻竇炎；急性或慢性鼻竇炎；.篩竇、額竇、上頜竇或蝶竇炎；嗜酸性粒細(xì)胞相關(guān)障礙，如嗜酸粒細(xì)胞增多、肺嗜酸細(xì)胞增多性浸潤、嗜酸細(xì)胞增多-肌痛綜合癥、LoffIer綜合癥、慢性嗜酸細(xì)胞性肺炎、熱帶性肺嗜酸細(xì)胞浸潤癥；支氣管肺曲霉?。磺鼓[或包含嗜酸性細(xì)胞的肉芽腫；過敏反應(yīng)；血清陰性脊椎關(guān)節(jié)炎；多內(nèi)分泌自身免疫??；硬化性膽管炎；鞏膜、鞏膜外層慢性黏膜皮膚念珠菌??；Bruton綜合癥；嬰兒一過性低丙種球蛋白血癥；Wiskott-Aldrich綜合癥；共濟(jì)失調(diào)性毛細(xì)血管擴(kuò)張癥；與膠原性疾病、風(fēng)濕病、神經(jīng)病、缺血性再灌注障礙、血壓應(yīng)答減少、血管功能障礙、antgiectasis,組織損傷、心血管缺血、痛覺過敏、腦缺血和伴血管形成疾病相關(guān)的自身免疫性障礙；變應(yīng)性過敏性障礙；腎小球腎炎；再灌注損傷；心肌或其他組織的再灌注損傷；具有基性巖性成分的皮膚?。患毙曰撔阅X膜炎或其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性障礙；眼和眼眶炎性障礙；粒細(xì)胞輸注相關(guān)綜合癥；細(xì)胞因子誘導(dǎo)的毒性作用；急性嚴(yán)重驗證；慢性頑固性炎癥；腎盂炎；肺硬變；糖尿病性視網(wǎng)膜?。惶悄虿⌒源髣用}障礙；動脈內(nèi)增生；消化性潰瘍；心瓣炎；子宮內(nèi)膜異位癥。本文所用的術(shù)語“細(xì)胞毒劑”指抑制或阻止細(xì)胞的功能和/或引起細(xì)胞的破壞的物質(zhì)。該術(shù)語旨在包含放射性同位素(例如 At211、I131、I125、Y9°、Re186、Re188、Sm153、Bi212、Ra223、P32及Lu的放射性同位素);化療劑，例如氨甲喋呤、adriamicin、長春花生物堿(長春花新 堿、長春滅瘟堿、依托泊苷)、阿霉素、苯丙氨酸氮芥、絲裂霉素C、苯丁酸氮芥、柔紅霉素或其他嵌入劑；酶及其片段，如核溶解酶；抗生素；毒素，如細(xì)菌、真菌、植物或動物來源的小分子毒素或具有酶活性的毒素，包括其片段和/或變體；及本文公開的多種抗腫瘤劑、抗癌劑和化療劑。本文描述其他細(xì)胞毒劑。殺腫瘤劑引起腫瘤細(xì)胞的破壞?！盎焺笔怯糜谥委煱┌Y的化合物?；焺┑膶?shí)例包括烷化劑，如噻替派(thiotepa)和CYTOXAN 環(huán)磷酰胺；烷基磺酸鹽，如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌酰硫燒(piposulfan);氮丙唳，如 benzodopa、卡波醌(carboquone)、meturedopa 和 uredopa ;氣丙和 methylamelamine，包括六甲蜜胺(altretamine)、三亞胺嗪(triethylenemelamine)、三亞乙基磷酰胺、三亞乙基硫代磷酰胺和trimethyIolomelamine ;多聚乙酰(acetogenin)(尤其是番蒸枝內(nèi)酯(bulIatacin)和布拉它辛酮(bulIatacinone)) ； 8 -9-四氫大麻酹(屈大麻酹(dronabinol) ,MARINOL )拉帕醌(beta-lapachone);拉帕醇(Iapachol);秋水仙堿；樺木酸；喜樹堿(包括合成類似物拓?fù)涮婵?topotecan) ( HYCAMTIN )、CPT_11 (伊立替康(irinotecan),CAMPTOSAR )、乙酰喜樹堿、莨菪亭(scopolectin)和9-氨基喜樹堿)；苔蘚抑素(bryostatin) ；callystatin ;CC_1065(包括其阿多來新(adozelesin)、卡折來新(carzelesin)和比折來新(bizelesin)合成類似物)；鬼白毒素；鬼白酸；替尼泊苷(teniposide) ;cryptophycin(尤其是 cryptophycin I^Pcryptophycin 8);多拉司他汀(dolastatin) ;duocarmycin (包括合成類似物 KW-2189 和 CB1-TM1) ；eleutherobin ；pancratistatin ；sarcodictyin ；spongistatin ;氮芥，如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、環(huán)憐酸胺(cholophosphamide)、憐雌氮芥(estramustine)、異環(huán)憐酉先胺(ifosfamide)、氮芥(mechlorethamine)、鹽酸氧氮芥(mechlorethamine oxidehydrochloride)、苯丙氨酸氮芥(melphalan)、新氮芥(novembichin)、膽固醇對苯乙酸氮芥(phenesterine)、松龍苯芥(prednimustine)、氯乙環(huán)磷酰胺(trofosfamide)、尿卩密唳氮芥(uracil mustard) ;nitrosurea，如卡莫司汀(carmustine)、氯服菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(Iomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimnustine);抗生素，如enediyne antibiotics (例如棘孢霉素，尤其是棘孢霉素Y I (見例如 Agnew, Chem Intl. Ed. Engl. 33 183-186 (1994));蒽環(huán)類抗生素(dynemicin)，包括蒽環(huán)類抗生素A ；esperamicin ；以及新制癌菌素色基和相關(guān)色蛋白enediyne抗生素色基)、阿克拉霉素(aclacinomycin)、放線菌素、authramycin、重氮絲氨酸(azaserine)、博來霉素、放線菌素C、carabicin、洋紅霉素、嗜癌素(carzinophilin)、chromomycinis、更生霉素(dactinomycin)、柔紅霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6_ 重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、ADRIAMYCIN 阿霉素(包括嗎啉基-阿霉素、氰基嗎啉基-阿霉素、2-吡咯啉基-阿霉素和脫氧阿霉素)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊達(dá)比星(idarubicin)、麻西羅霉素(marcel Iomycin)、絲裂霉素(如絲裂霉素C)、霉酷酸、諾加霉素(nogalamycin)、橄欖霉素(olivomycins)、派來霉素(peplomycin)、potfiromycin、_呤霉素(puromycin)、三鐵阿霉素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑菌素(streptonigrin)、鏈唑霉素(streptozocin)、殺結(jié)核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、新制癌菌素(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代謝劑，如氨甲噪呤和5-氟尿啼唳(5-FU);葉酸類似物，如二甲葉酸(denopterin)、氨甲喋呤、蝶酰三谷氨酸、三甲喋呤；嘌呤類似物，如氟達(dá)拉濱(fludarabine)、6-巰基p票呤、硫咪票呤(thiamiprine)、硫鳥_呤(thioguanine);啼卩定類似物，如鹽酸環(huán)胞苷 (ancitabine)、氮雜胞苷(azacitidine)、6_ 氮尿苷(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、雙脫氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟脲苷(doxifIuridine)、依諾他賓(enocitabine)、去氧氟尿苷(fIoxuridine);雄激素，如卡普睪酮(calusterone)、丙酸甲雄焼酮(dromostanolone propionate)、環(huán)硫雄醇(epitiostanol)、美雄焼(mepitiostane)、睪內(nèi)酯(testolactone);抗腎上腺素(anti-adrenal)，如氨魯米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane);葉酸補(bǔ)充齊U，如frolinic acid ;醋葡內(nèi)酯(aceglatone);醒磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；恩尿啼 P定(eniluracil)；安 R丫 P定(amsacrine) ；bestrabucil ;比生群(bisantrene)；依達(dá)曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine);秋水仙胺(demecolcine)；地口丫酉昆(diaziquone) ;elfornithine ;醋酸輕P比咔唑(elliptinium acetate) ;epothilone ;乙環(huán)氧唳(etoglucid);硝酸鎵；輕基脲；香燕多糖；氯尼達(dá)明(Ionidainine);美登木素生物堿，如美登素和美登木素柄型菌素；米托胍腙(mitoguazone);米托蒽醌(mitoxantrone)；mopidanmol ；nitraerine ;噴司他丁 (pentostatin);蛋氨氮芥(phenamet) ； P比柔比星(pirarubicin);洛索蒽醌(Iosoxantrone) ；2~ethyIhydrazide ；甲基節(jié)餅(procarbazine) ； PSK 多糖復(fù)合物(JHS Natural Products，Eugene, OR);丙亞胺(razoxane);根霉素(rhizoxin);西佐喃(sizofiran);螺方定錯(spirogermanium);細(xì)格抱氮雜酸(tenuazonic acid);三亞胺酉昆(triaziquone) ;2，2’，2”-三氯三乙胺；單端孢霉烯(trichothecene)(尤其是 T-2 毒素、verracurin A、桿抱菌素(roridin) A 和 anguidine)；
烏拉坦(urethan);脫乙酰長春花堿(ELDISINE , FILDESI.N );達(dá)卡巴嗪(dacarbazine);甘露莫司汀(mannomustine) ;二溴甘露醇(mitobronitol) ;二溴衛(wèi)矛醇(mitolactol);溴丙哌嗪(pipobroman) ；gacytosine ;阿糖胞苷(arabinoside) (“Ara_C”)；噻替派；紫杉焼(taxoid)，例如TAXOLi 紫杉醇(paclitaxel) (Bristol-Myers SquibbOncology，Princeton, NJ)、ABRAXANETM Cremophor-free、紫杉醇的清蛋白改造納米顆粒制劑(American Pharmaceutical Partners, Schaumberg，IL)和 TAXOTERE doxetaxel ( Rhone-PoulenC Rorer, Antony,法國)；chloranbucil ;吉西他濱(gemcitabine) (gemzar )； 6-硫鳥嘌呤；巰基嘌呤；氨甲喋呤；鉬類似物，如順鉬和卡鉬；長春滅癌堿(VELiRAN );鉬；依托泊苷(etoposide) (VP-16);異環(huán)磷酰胺；米托蒽醌；長春花新堿(ONCOVIN );奧沙利鉬(oxaliplatin) ;Ieucovovin ;長春瑞濱
(vinorelbine) ( NAVELBINE );諾消靈(novantrone);依達(dá)曲沙(edatrexate);柔紅霉素；氨基喋呤；伊班磷酸鹽(ibandronate);拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑RFS 2000 ;二氟甲基鳥氨酸(DMFO);類視黃醛，如視黃酸；卡培他濱(capecitabine) (XELODA );以上的任一種的可藥用鹽、酸或衍生物；以及以上的兩種或多種的組合，如CHOP(環(huán)磷酰胺、阿霉素、 長春花新堿和強(qiáng)的松龍的聯(lián)合治療的縮寫)和F0LF0X (奧沙利鉬(EL0XATINTM)與5-FU和 Ieucovovin組合的治療方案的縮寫)。此定義中還包含抗激素劑，其通常以系統(tǒng)治療或全身治療的形式發(fā)揮作用來調(diào)節(jié)、減少、阻斷或抑制可促進(jìn)癌癥生長的激素的作用。它們可以是激素自身。實(shí)例包含抗雌激素和選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑(SERM)，包括例如三苯氧胺(包括NOLVADEX 三苯氧胺)、EVISTA 雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4_輕基他莫昔芬(4-hydroxytamoxifen)、曲沃昔芬(trioxifene)、雷洛昔芬鹽酸鹽(keoxifene)、 LY117018、奧那司酮(onapristone)和 FARESTON 托瑞米芬(toremifene)； 抗孕酮；雌激素受體下調(diào)劑(ERD);發(fā)揮作用來抑制或關(guān)閉卵巢的藥劑，例如，諸如 LUPRON 和EUGARD 醋酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)的促黃體生成激素釋放激素(LHRH)激動劑、乙酸戈舍瑞林(goserelin acetate)、乙酸布舍瑞林 (buserelin acetate)和 tripterelin ;其他抗雄激素物質(zhì)，如氟他米特(flutamide)、 尼魯米特(nilutamide)和比卡米特(bicalutamide);抑制芳香酶(其調(diào)節(jié)腎上腺中的雌激素產(chǎn)生)的芳香酶抑制劑，例如4(5)-咪唑、氨魯米特、MEGASE 醋酸甲地孕酮 (megestr、ol acetate)、AROMASIN ‘依西美坦(exemestane)、formestanie、法屈唑 (fadrozole)、RTVISOR 伏氯唑(vorozole)、FEMARA 來曲唑(Ietrozole)和 ARIMIDEX 阿那曲唑(anastrozole)。此外，化療劑的這種定義包含二磷酸鹽，如氯曲磷酸鹽(Clodronate)(例如BONEFOS 或OSTAC )、DIDROCAL 羥乙二磷酸鹽(etidronate)、ΝΕ-58095、ΖΟΜΕΤΑ 唑來磷酸(zoledronic acid)/唑來磷酸鹽(zoledronate)、FOSAMAX 阿侖磷酸鹽(alendronate)、AREDIA 帕米磷酸鹽 (pamidronate)、SKELJD ‘替魯磷酸鹽(tiIudronate)或ACTONEIj 利塞磷酸鹽 (risedronate);以及曲沙他濱(troxacitabine) (I, 3_ 二氧戍環(huán)胞卩密唳核苷類似物)；反義寡核苷酸，尤其是抑制涉及異常細(xì)胞增殖的信號傳導(dǎo)途徑中的基因(例如PKC-a、Raf、 H-Ras和表皮生長因子受體(EGF-R))表達(dá)的那些；疫苗，如THERATOPE 疫苗和基因治療疫苗，例如AUX)VECTIN 疫苗、LEUVECTIN 疫苗和VAXID 疫苗； UJRTOTECAN 拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制劑；ABARELIX rmRH;二甲苯磺酸拉帕替尼 (lapatinib ditosylate) (ErbB-2和EGFR雙酪氨酸激酶小分子抑制劑，也稱為GW572016)； 及以上任一種的可藥用鹽、酸或衍生物。在本文中使用時，“生長抑制劑”指在體外或體內(nèi)抑制細(xì)胞生長的化合物或組合物。因此，生長抑制劑可以是顯著降低S期細(xì)胞百分比的藥劑。生長抑制劑的實(shí)例包含阻斷細(xì)胞周期進(jìn)程(在S期以外的地方)的藥劑，如誘導(dǎo)Gl停滯和M期停滯的藥劑。經(jīng)典的M期阻斷劑包含長春堿(例如長春花新堿和長春滅瘟堿)、紫杉烷(taxane)及諸如阿霉素、表柔比星、柔紅霉素、依托泊苷和博來霉素的拓?fù)洚悩?gòu)酶II抑制劑。停滯Gl的藥劑也涉及S期停滯，例如DNA烷化劑，如他莫昔芬、強(qiáng)的松、達(dá)卡巴嗪、氮芥、順鉬、氨甲喋呤、 5_氟尿啼卩定和阿糖胞苷。其他信息可以見于TheMolecular Basis of Cancer，Mendelsohn 和 Israel，編輯，第 I 章，標(biāo)題"Cellcycle regulation，oncogenes，and antineoplastic drugs " by Murakami 等(WB Saunders !Philadelphia，1995)，尤其是第 13 頁。紫杉焼 (紫杉醇和紫杉萜(docetaxel)) 二者都是衍生自紫杉的抗癌藥物。衍生自歐洲紫杉的紫杉胳(TAXOTERE ，Rhone-Poulenc Rorer)是紫杉醇(TAXOL· ， Bristol-Myers Squibb)的半合成類似物。紫杉醇和紫杉萜促進(jìn)從微管蛋白二聚體組裝微管，并通過阻止解聚來穩(wěn)定微管，這導(dǎo)致細(xì)胞有絲分裂的抑制。本文所用的“抗癌治療”指在受試者中減少或抑制癌癥的治療?？拱┲委煹膶?shí)例包含細(xì)胞毒性放射治療，以及對受試者施用治療有效量的細(xì)胞毒劑、化療劑、生長抑制劑、癌癥疫苗、血管發(fā)生抑制劑、前體藥物、細(xì)胞因子、細(xì)胞因子拮抗劑、皮質(zhì)類固醇、免疫抑制劑、 止吐藥、抗體或抗體片段、或止痛藥。本申請中所用的術(shù)語“前體藥物”指藥物活性物質(zhì)的前體或衍生形式，與親本藥物相比，其對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性較低，且能夠通過酶激活或轉(zhuǎn)化為更具活性的親本形式。見例如 Wilman, “Prodrugs in CancerChemotherapy，，Biochemical Society Transactions, 14,375-382 頁，615thMeeting Belfast(1986)；和 Stella 等，“Prodrugs :A Chemical Appr oach toTargeted Drug Delivery,’Directed Drug Delivery,Borchardt等，(編輯)， 247-267頁，Humana Press (1985)。前體藥物包括但不限于包含磷酸的前體藥物、包含硫代磷酸的前體藥物、包含硫酸的前體藥物、包含肽的前體藥物、D-氨基酸修飾的藥物、糖基化的前體藥物、包含內(nèi)酰胺的前體藥物、包含可選地取代的苯氧乙酰胺的前體藥物或包含可選地取代的苯乙酰胺的前體藥物、5-氟胞嘧啶及可以轉(zhuǎn)化為更具活性的細(xì)胞無毒性藥物的其他5-氟胞嘧啶前體藥物?？梢匝苌鸀樵诒景l(fā)明中所使用的前體藥物形式的毒害細(xì)胞的藥物的實(shí)例包括但不限于那些上述化療劑。術(shù)語“細(xì)胞因子”是由一個細(xì)胞群體釋放的作為胞間介質(zhì)作用于另一細(xì)胞的蛋白質(zhì)的通用術(shù)語。這類細(xì)胞因子的實(shí)例是淋巴因子、單核因子和傳統(tǒng)的多肽激素。細(xì)胞因子包含生長激素，如人生長激素(HGH)、N-甲硫氨酰人生長激素和牛生長激素；甲狀旁腺激素；甲狀腺素；胰島素；胰島素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素，如促卵泡激素(FSH)、促甲狀腺激素(TSH)和黃體生成素(LH);表皮生長因子(EGF);肝生長因子；成纖維細(xì)胞生長因子(FGF);促乳素；胎盤促乳素；腫瘤壞死因子-α和-β ;繆勒氏管抑制物質(zhì)；小鼠促性腺激素相關(guān)肽；抑制素；激活蛋白；血管內(nèi)皮生長因子；整聯(lián)蛋白；血小板生成素(TPO);神經(jīng)生長因子，如NGF-α ;血小板生長因子；轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)如，TGF-α和TGF-β ;胰島素樣生長因子-I和-II;促紅細(xì)胞生成素(EPO);骨誘導(dǎo)因子；干擾素,如干擾素-α、-β 和-Y ;集落刺激因子(CSF)，如巨噬細(xì)胞-CSF (M-CSF)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞-CSF (GM-CSF)和粒細(xì)胞-CSF(G-CSF);白細(xì)胞介素(IL)，如 IL-U IL-I a、IL-I β , IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、 IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-IU IL-12、IL-18 ;腫瘤壞死因子，如 TNF-a 或 TNF-β ； 及其他多肽因子，包括LIF和kit配體(KL)。如本文所使用，術(shù)語細(xì)胞因子包含來自天然來源或來自重組細(xì)胞培養(yǎng)物的蛋白質(zhì)及天然序列細(xì)胞因子的生物學(xué)活性等同物。
“細(xì)胞因子拮抗劑”指部分或完全阻斷、抑制或中和至少一種細(xì)胞因子的生物學(xué)活性的分子。例如，細(xì)胞因子拮抗劑可以通過抑制細(xì)胞因子表達(dá)和/或分泌，或通過與細(xì)胞因子或細(xì)胞因子受體結(jié)合來抑制細(xì)胞因子活性。細(xì)胞因子拮抗劑包含與細(xì)胞因子或細(xì)胞因子受體結(jié)合的抗體、合成或天然序列肽、免疫黏附素和小分子拮抗劑。細(xì)胞因子拮抗劑可選地與細(xì)胞毒劑綴合或融合。示例性TNF拮抗劑是依那西普(etanercept) ( ENBREL )、 英夫利昔單抗(infliximab) ( REMICADE )和阿達(dá)木單抗(adalimumab) (HUMIRA )。
本文所用的術(shù)語“免疫抑制劑”指發(fā)揮作用來抑制或掩蔽所治療的受試者的免疫系統(tǒng)的物質(zhì)。這包含抑制細(xì)胞因子產(chǎn)生、下調(diào)或抑制自身抗原表達(dá)或掩蔽MHC抗原的物質(zhì)。免疫抑制劑的實(shí)例包含2_氨基-6-芳基-5-取代的嘧啶(見美國專利號 4，665，077);麥考酹酸酯(mycophenolatemofetil),如 CE.LLCEPT ;硫唑嘌呤 (azathioprine) (IMURAN 、AZASAN /6 _ 巰基嘌呤；溴隱定(bromocryptine)； 達(dá)那唑(danazol);氨苯砜(dapsone);戍二醒(其掩蔽MHC抗原,如美國專利號4，120, 649 中所述)；MHC抗原和MHC片段的抗獨(dú)特型抗體；環(huán)孢菌素A ;類固醇，如皮質(zhì)類固醇和糖皮質(zhì)類固醇，例如強(qiáng)的松、諸如PEDIAPRED (強(qiáng)的松龍磷酸鈉)或ORAPRED (強(qiáng)的松龍磷酸鈉口服溶液)的強(qiáng)的松龍、甲基強(qiáng)的松龍和地塞米松；氨甲喋呤(口服或皮下)(RHEUMATREX , TREXALL );輕基氯喹 / 氯喹；柳氮磺卩比唳(sulfasalazine)； 來氟米特(Ieflunomide);細(xì)胞因子或細(xì)胞因子受體拮抗劑，包括抗-干擾素-Y、-β 或-α抗體、抗-腫瘤壞死因子_α抗體(英夫利昔單抗或阿達(dá)木單抗)、抗-TNFa免疫黏附素(ENBREL· ,依那西普)、抗-腫瘤壞死因子-β抗體、抗-白細(xì)胞介素-2抗體和抗-IL-2受體抗體；抗-LFA-I抗體，包括抗-⑶I Ia和抗-⑶18抗體；抗-L3T4抗體； 異源抗淋巴細(xì)胞球蛋白；多克隆或pan-Τ抗體，或單克隆抗-CD3或抗_CD4/CD4a抗體；含 LFA-3結(jié)合結(jié)構(gòu)域的可溶性肽(W0 90/08187);鏈激酶；TGF-β ;鏈道酶；來自宿主的RNA或 DNA ；FK506 ;RS_61443 ;脫氧精胍菌素(deoxyspergualin);雷帕霉素；T 細(xì)胞受體(Cohen 等，美國專利號 5，114,721) ;T-細(xì)胞受體片段(Offner 等 Science 251:430-432(1991)； WO 90/11294 ；Ianeway, Nature 341 :482(1989);和冊 91/01133) ;T 細(xì)胞受體抗體(EP 340，109)，如 Τ10Β9 ;環(huán)磷酰胺(CYTOXAN )·，氨苯砜；青霉胺(CUPRIMINE ); 血漿置換；或靜脈內(nèi)免疫球蛋白(IVIG)。這些可以單獨(dú)或相互組合使用，尤其是類固醇和另一免疫抑制劑的組合，或這類組合后跟隨非類固醇藥劑的維持劑量，以減少對類固醇的需要?！爸雇此帯敝赴l(fā)揮作用來在受試者中抑制或壓制疼痛的藥物。示例性止痛藥包含非類固醇抗炎藥(NSAID)，包括布洛芬(ibupiOfen) ( MOTRIN )、萘普生(naproxen) ( NAPROSYN )、乙酰水楊酸、卩引哚美辛(indomethacin)、舒林酸 (sulindac)和托美汀(tolmetin),包括其鹽和衍生物，以及用來減輕可存在的刺痛的多種其他藥劑，包括抗驚厥劑(加巴噴丁(gabapentin)、苯妥英(phenyloin)、卡馬西平(carbamazepine))或三環(huán)抗憂郁藥。具體實(shí)例包含撲熱息痛(acetaminophen)、阿司
匹林、阿米替林(amitriptyline) ( ELAVIL )、卡馬西平(TEGRETOL )、
苯妥英(DILANTIN )、加巴噴丁( NEURONTIN )、(E) -N-香草基-8-甲基-6-noneamid ( CAPSAICIN )或神經(jīng)阻滯劑。“皮質(zhì)類固醇”指模擬或擴(kuò)大天然存在的皮質(zhì)類固醇的作用的具有類固醇的一般化學(xué)結(jié)構(gòu)的幾種合成或天然存在的物質(zhì)中的任意一種。合成皮質(zhì)類固醇的實(shí)例包含強(qiáng)的松、強(qiáng)的松龍(包括甲基強(qiáng)的松龍)、地塞米松、氟羥脫氫皮留醇和倍他米松。本文所用的“癌癥疫苗”是在受試者中刺激針對癌癥的免疫應(yīng)答的組合物。癌癥疫苗通常由對受試者而言可以是自體(來自自身)或異體(來自其他)的癌癥相關(guān)物質(zhì)或細(xì)胞(抗原)的來源，連同進(jìn)一步刺激和加強(qiáng)針對該抗原的免疫應(yīng)答的其他成分(例如佐齊IJ)組成。癌癥疫苗可以導(dǎo)致刺激受試者的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗一種或幾種具體抗原的抗體和 /或產(chǎn)生攻擊具有那些抗原的癌細(xì)胞的殺傷T細(xì)胞。本文所用的“細(xì)胞毒性放療”指抑制或阻止細(xì)胞的功能和/或引起細(xì)胞的破壞的放射治療。放射治療可以包括例如外部束照射或放射性標(biāo)記藥劑(如抗體)治療。該術(shù)語旨在包含放射性同位素(例如 At211、I121、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、Ra223、p32 和 Lu 的放射性同位素)的使用?！鞍蟹肿印敝缚梢耘c本發(fā)明的蛋白質(zhì)復(fù)合體結(jié)合的分子(根據(jù)斯卡查德分析，優(yōu)選以高于IuM Kd的親和力)。靶分子的實(shí)例包括但不限于血清可溶性蛋白質(zhì)及其受體，如細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體、黏附素、生長因子及其受體、激素、病毒顆粒(例如RSV F蛋白質(zhì)、 CMV、StaphA、流感病毒、丙型肝炎病毒)、微生物(例如細(xì)菌細(xì)胞蛋白質(zhì)、真菌細(xì)胞)、黏附素、CD蛋白及其受體。
“止吐藥”是在受試者中減少或防止惡心的化合物。止吐化合物包含例如神經(jīng)激肽-I受體拮抗劑；5HT3受體拮抗劑(如昂丹司瓊(ondansetron)、格拉司瓊 (granisetron)、托燒司瓊(tropisetron)和 zatisetron) ；GABAB 受體激動劑，如巴氯芬(baclofen);皮質(zhì)類固醇，如地塞米松、KENALOG 、ARISTOCORT 或N AS ALID E ；抗多巴胺；酹噻嗪(例如丙氯拉嗪(prochlorperazine)、氟奮乃靜(fluphenazine)、硫利達(dá)嗪(thioridazine)和美索達(dá)嗪(mesoridazine));屈大麻酌·；metroclopramide ;多潘立酮(domperidone);氟哌唳醇(haloperidol);賽克利嗪 (cyclizine);氯輕安定(Iorazepam);丙氯拉嗪和左美丙嗪(Ievomepromazine)0“受試者”是脊椎動物，如哺乳動物，例如人。哺乳動物包括但不限于農(nóng)場動物(如牛)、運(yùn)動動物、寵物(如貓、狗和馬)、靈長類、小鼠和大鼠。除非另有說明，按照廠家的說明使用實(shí)施例中提到的市售試劑。在以下實(shí)施例和說明書通篇中通過ATCC檢索號標(biāo)識的那些細(xì)胞的來源是美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection), Manassas, VA。除非另有說明，本發(fā)明使用重組DNA技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)方法，如上文和以下教科書中所述的那些=Sambrook等，上文； Ausubel Current Protocols inMolecular Biology(Green Publishing Associates and Wiley Interscience, NY,1989) ；Innis 等，PCR Protocols A Guide to Methods and Applications(Academic Press, Inc. , NY,1990) ；Harlow 等，Antibodies A LaboratoryManual(Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor,1988) ；Gait, Oligonucleotide Synthesis(IRL Press,Oxford,1984) ；Freshney,AnimalCell Culture, 1987 ;Coligan 等，Current Protocols in Immunology, 1991。在本說明書和權(quán)利要求書通篇中，單詞“包含”或其詞形變化形式將理解為意指包含所述整體或整體組，但不排除任意其他整體或整體組。II.含卷曲螺旋的抗體和束縛抗體的構(gòu)建可以通過使用異二聚化結(jié)構(gòu)域(例如卷曲螺旋)和/或系鏈來構(gòu)建本文所述的蛋白質(zhì)復(fù)合體。異二聚化結(jié)構(gòu)域的使用使得能夠構(gòu)建單個抗體內(nèi)具有不同重鏈的抗體的相對純的群體。具體而言，如上文所述，抗體通常包含各與相同的輕鏈配對的兩條相同的重鏈。本發(fā)明的卷曲螺旋異二聚化結(jié)構(gòu)域技術(shù)的使用使得不同抗體重鏈能夠在單個抗體的形成中優(yōu)選相互二聚化。因此，產(chǎn)生的抗體包含兩條不同的重鏈，其中每一條通常(但無需)與相同的輕鏈配對。由于存在不同的重鏈，這種抗體內(nèi)的每對重鏈和輕鏈具有不同的結(jié)合特異性，因此，可認(rèn)為該抗體是多特異性抗體。還可以利用系鏈(單獨(dú)或與 卷曲螺旋技術(shù)組合) 來改造本發(fā)明的抗體。系鏈可以將恒定輕鏈的C端與可變重鏈的N端連接，從而允許正確的輕鏈和重鏈結(jié)合，以及使用單個抗體編碼質(zhì)粒的重組抗體產(chǎn)生。下文進(jìn)一步描述包含卷曲螺旋和/或系鏈的抗體。A.卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域用來產(chǎn)生本文所述蛋白質(zhì)復(fù)合體的異二聚化結(jié)構(gòu)域可以是α螺旋(例如右手α 螺旋)，其可以通過與包含帶相反電荷的殘基的第二 α螺旋結(jié)合來形成卷曲螺旋。為了產(chǎn)生異二聚體分子的同質(zhì)或幾乎同質(zhì)的群體，異二聚化結(jié)構(gòu)域必須具有超過同型二聚體的形成異二聚體的強(qiáng)烈偏好。在這方面，本文所述異二聚化結(jié)構(gòu)域提供超過Fos/Jun亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域的顯著優(yōu)勢，因為Jun易形成同型二聚體。示例性α-螺旋異二聚化結(jié)構(gòu)域顯示于圖1、2Α和2Β中。在具體實(shí)施方案中，第一卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域包含式I的七殘基重復(fù)序列(X1X2X3X4X5X6X7)η(式 I)，其中X1是疏水性氨基酸殘基或天冬酰胺，X2、X3和X6各是任意氨基酸殘基，X4是疏水性氨基酸殘基，和X5和X7各是帶電荷氨基酸殘基，第二卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域包含式II的七殘基重復(fù)序列(X，A，2X，3X，4X，5X，6X，7)n(式 II)，其中X’ i是疏水性氨基酸殘基或天冬酰胺，X’ 2、X’ 3和X’ 6各是任意氨基酸殘基，V 4是疏水性氨基酸殘基，和V 5和X’ 7各是帶電荷氨基酸殘基。在式I和式II 二者中，η大于或等于2 (例如大于或等于3或4)，且小于或等于 100。在一個實(shí)施方案中，η在2至20之間。第一卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域的X5和X7殘基和第二卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域的V 5和X’ 7殘基可以具有(但無需具有)相同的電荷。因此，在一個實(shí)例中，第一卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域的&和&殘基是堿性殘基，而第二卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域的V 5和X’ 7殘基是酸性殘基。在另一實(shí)例中，第一卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域中的X5是堿性殘基，而第一卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域中的X7是酸性殘基。在此實(shí)例中，第二卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域在X’ 5位具有堿性殘基，在X’ 7位具有酸性殘基。如圖I中所示， 第一卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域的X5殘基和第二卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域的V 7殘基之間，以及第一卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域的X7殘基和第二卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域的X’ 5殘基之間存在離子相互作用。在相關(guān)實(shí)例中，第一卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域中的X5是酸性殘基，第一卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域中的X7是堿性殘基，第二卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域中的x’5是酸性殘基，第二卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域中的x’7是堿性殘基。此外，包含在第一和第二卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域二者的\IV I位具有天冬氨酸的至少一個七殘基重復(fù)序列可以用來確保第一和第二卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域的平行取向。七殘基重復(fù)序列中的疏水性殘基優(yōu)選選自丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸。雖然脯氨酸是疏水性氨基酸，但在一個實(shí)施方案中，其不包含在式I或式II的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域中，因為氨基酸序列中存在脯氨酸可以限制其形成α螺旋結(jié)構(gòu)的能力。此外，在其他實(shí)施方案中，式I或式II的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域不包含甘氨酸殘基，這是因為甘氨酸由于其構(gòu)象柔性而不易采取受限制的α螺旋結(jié)構(gòu)。可以包含在式I或式II的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域中的帶電荷殘基包含賴氨酸、精氨酸、組氨酸、天冬氨酸和谷氨酸， 其中賴氨酸、精氨酸和組氨酸是堿性殘基，而天冬氨酸和谷氨酸是酸性殘基。本文所述抗體的構(gòu)建可以使用式I的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域和式II的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域 (第一和第二卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域)，其中第一卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域與抗體的第一恒定結(jié)構(gòu)域(例如第一重鏈的CH3)連接，第二卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域與抗體的第二恒定結(jié)構(gòu)域(例如第二重鏈的 CH3)連接。該連接可以是通過肽鍵直接連接，或者可以通過接頭序列連接。接頭可以與一條氨基酸序列(例如恒定區(qū))的C端和另一氨基酸序列(例如卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域)的N端形成肽鍵。接頭可以足夠長，以允許從抗體恒定區(qū)切割卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域(如本文其他地方進(jìn)一步描述)，但足夠短，以賦予兩個抗體恒定區(qū)(例如兩個重鏈恒定區(qū))的異二聚體結(jié)合。 因此，接頭可以是長度為2至100個氨基酸的氨基酸序列。在具體實(shí)施方案中，接頭長度在 2至50個氨基酸之間，例如長度為3、5、10、15、20、25、30、35、40、45或50個氨基酸。接頭可以由例如中性極性或非極性氨基酸組成。
B.多特異性抗體應(yīng)理解，這類抗體的可變結(jié)構(gòu)域可以衍生自幾種方法。例如，本發(fā)明的抗體的可變結(jié)構(gòu)域可以與本領(lǐng)域已知的現(xiàn)有抗體相同。可以用卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域來產(chǎn)生多特異性抗體(與至少兩種抗原或與同一抗原上的至少兩個表位結(jié)合的抗體)。在一個實(shí)例中，該多特異性抗體是雙特異性抗體。通常，在天然存在的IgG抗體中，抗體中每對重鏈和輕鏈的可變區(qū)相同。本發(fā)明的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域的使用使得抗體內(nèi)的兩條重鏈可以不同，產(chǎn)生具有具有不同結(jié)合特異性的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗體。具體而言，每條重鏈上(例如CH3的C端)的卷曲螺旋異二聚化結(jié)構(gòu)域促進(jìn)不同重鏈間的結(jié)合?？蛇x地，通過可被切割的接頭將卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域連接至重鏈恒定區(qū)，使得可在組裝后從抗體去除該卷曲螺旋。圖3中顯示示例性雙特異性抗體的示意圖，該示例性雙特異性抗體包含兩條不同的重鏈(HCl和HC2)和兩條相同或共同的輕鏈。圖3中的示例性雙特異性抗體還包含異二聚體卷曲螺旋。該抗體還在各卷曲螺旋異二聚化結(jié)構(gòu)域的N端包含Lys-C內(nèi)肽酶切割位點(diǎn)， 該位點(diǎn)允許在抗體組裝完成后從該抗體去除卷曲螺旋。此示例性雙特異性抗體的兩條重鏈都還在鉸鏈區(qū)中包含Κ222Α突變來去除Lys-C內(nèi)肽酶切割位點(diǎn)，使得Lys-C內(nèi)肽酶處理僅導(dǎo)致去除卷曲螺旋，而不導(dǎo)致重鏈恒定區(qū)內(nèi)的切割。雖然該示例性抗體在鉸鏈區(qū)中包含去除Lys-C內(nèi)肽酶切割位點(diǎn)的突變，但Lys-C內(nèi)肽酶切割位點(diǎn)的位置可以取決于所使用的抗體序列而不同。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地掃描抗體序列來確定重鏈或輕鏈序列中是否存在需要去除，以避免在去除卷曲螺旋或系鏈序列時切割抗體自身的任何切割位點(diǎn)(例如Lys-C內(nèi)肽酶切割位點(diǎn))。此外，可以用本文所述方法構(gòu)建多特異性抗體，其中重鏈缺乏CHl結(jié)構(gòu)域(VH直接與鉸合部-CH2結(jié)構(gòu)域連接)，對應(yīng)的輕鏈缺乏CL結(jié)構(gòu)域。這類抗體可以用來使不同抗原聚在一起或用來結(jié)合B細(xì)胞和T細(xì)胞。C.單臂抗體還可以用異二聚化卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域來產(chǎn)生單臂抗體。圖4A中顯示了說明單臂抗體實(shí)例的示意圖。圖4A中所示的示例性抗體包含輕鏈(LC)、一條全長重鏈(HCl)和缺乏 VH和CHl結(jié)構(gòu)域及部分鉸鏈區(qū)的第二重鏈(HC2)。HCl和HC2都在C端包含卷曲螺旋異二聚化結(jié)構(gòu)域。此實(shí)例中的HCl序列在鉸鏈區(qū)中包含K222A突變來去除Lys-C內(nèi)肽酶切割位點(diǎn)，使得Lys-C切割僅去除卷曲螺旋，而不導(dǎo)致重鏈內(nèi)的切割。D.綴合蛋白質(zhì)復(fù)合體、
還可以用卷曲螺旋異二聚化結(jié)構(gòu)域來產(chǎn)生蛋白質(zhì)復(fù)合體，如抗體(例如單特異性抗體、雙特異性抗體、多特異性抗體、單臂抗體或束縛抗體)，其中通過與細(xì)胞毒劑綴合來修飾恒定區(qū)。例如，卷曲螺旋異二聚化結(jié)構(gòu)域使得能夠構(gòu)建這樣的抗體，其中重鏈恒定區(qū)之一 (HCl或HC2)包含允許與細(xì)胞毒劑綴合的修飾，而另一重鏈恒定區(qū)不包含。在一個實(shí)例中， HCl與細(xì)胞毒劑綴合，而HC2不綴合。圖4B中顯示了說明綴合抗體實(shí)例的示意圖。該示例性抗體包含兩條全長重鏈和兩條相同的輕鏈(共同輕鏈)，以及卷曲螺旋。如星號所示，重鏈之一已與細(xì)胞毒劑(例如毒素)綴合。類似地，在備選抗體構(gòu)建體中，輕鏈恒定區(qū)之一可以與細(xì)胞毒劑綴合，而另一輕鏈恒定區(qū)不綴合(例如LCl與細(xì)胞毒劑綴合，而LC2不綴合)。在一個具體實(shí)例中，可以修飾抗體恒定區(qū)來引入親電子部分，其可以與用來將細(xì)胞毒劑與抗體綴合的接頭試劑上或細(xì)胞毒劑自身上的親核取代基反應(yīng)?？梢岳缬酶叩馑猁}氧化劑氧化糖基化抗體的糖，以形成可與接頭試劑或細(xì)胞毒劑的胺基反應(yīng)的醛基或酮基。產(chǎn)生的亞胺希夫堿基團(tuán)可以形成穩(wěn)定連接，或者可以例如通過氫硼化物試劑還原，以形成穩(wěn)定的胺連接。細(xì)胞毒劑上的親核基團(tuán)包括但不限于能夠與抗體區(qū)和接頭試劑上的親電子基團(tuán)反應(yīng)形成共價鍵的胺、巰基、羥基、酰肼、肟、肼、縮氨基硫脲、肼羧酸酯和芳基酰肼基團(tuán)，該接頭試劑包括⑴活性酯，如NHS酯、HOBt酯、鹵甲酸酯和酰基鹵；(ii)烷基鹵和芐基鹵，如鹵乙酰胺；和(iii)醛、酮、羧基和馬來酰亞胺基。E.束縛抗體本發(fā)明還提供用系鏈構(gòu)建的蛋白質(zhì)復(fù)合體，例如抗體可以具有將恒定輕鏈的C端與可變重鏈的N端連接的系鏈。系鏈輔助輕鏈和重鏈的正確結(jié)合(即輕鏈與其所束縛的重鏈的結(jié)合)?？梢栽谟谢驘o上文所述異二聚化結(jié)構(gòu)域的情況下構(gòu)建這種束縛抗體。圖5中顯示包含卷曲螺旋的示例性束縛抗體的示意圖。圖5中所示的示例性抗體包含兩條不同的重鏈(HCl和HC2)，以及兩條不同的輕鏈(LCl和LC2)。還可以將束縛抗體構(gòu)建為包含共同輕鏈和/或共同重鏈。在示例性抗體中，HCl和HC2包含上文所述去除Lys-C內(nèi)肽酶切割位點(diǎn)的鉸鏈區(qū)中的K222A突變，以及其C端的卷曲螺旋異二聚化結(jié)構(gòu)域。束縛抗體中加入異二聚化結(jié)構(gòu)域輔助重鏈/輕鏈復(fù)合體聚在一起，從而減少或消除這類復(fù)合體的同二聚化。在具體實(shí)施方案中，系鏈足夠長，以跨越組裝的抗體中可變重鏈N端和恒定輕鏈C端之間的距離，以允許正確的輕鏈/重鏈結(jié)合，但足夠短，以防止鏈間結(jié)合 (即輕鏈與其不束縛的重鏈的結(jié)合)。在圖6中所示的實(shí)例中，可變重鏈N端和恒定輕鏈C 端之間的距離約為92AJ太鍵跨越約4.3人。在此實(shí)例中，系鏈長度應(yīng)為約22個氨基酸，以跨越可變重鏈N端和恒定輕鏈C端之間的距離。恒定輕鏈C端和可變重鏈N端之間的距離可以在抗體間不同，因此，系鏈的長度也可以在抗體間不同。測試了長度為22、23和26個氨基酸的系鏈，一般而言，15-50個氨基酸的系鏈?zhǔn)怯行У摹Ｏ垫溈梢员３秩犴g而不形成二級結(jié)構(gòu)，為了此目的，可以使用包含甘氨酸(G)和絲氨酸⑶殘基的系鏈。系鏈可以僅由G和S 殘基組成，但也可以包含其他殘基，只要該系鏈保持柔韌來允許抗體的輕鏈和重鏈的組裝。 在具體實(shí)施方案中，系鏈包含GGS重復(fù)序列(圖5)。對于長度為15-30個氨基酸的系鏈,在一個實(shí)施方案中，系鏈包含至少5個GGS重復(fù)序列。本文所述和具有SEQ ID NO : 14的序列的示例性系鏈包含8個GGS重復(fù)序列，且在N端和C端都包含附加的甘氨酸殘基。其他示例性系鏈序列顯示于圖7B中，且在其N端和C端包含弗林蛋白酶切割位點(diǎn)或Lys-C內(nèi)肽酶切割位點(diǎn)。F.系鏈和接頭序列的切割—旦蛋白質(zhì)復(fù)合體已組裝，可以不再需要系鏈，可以根據(jù)需要從該抗體切割系鏈。 可以用見于系鏈中，但不見于抗體序列中的切割位點(diǎn)來去除系鏈。類似地，一旦抗體已組裝，可以不再需要卷曲螺旋，且可以根據(jù)需要從抗體切割卷曲螺旋。圖7A顯示系鏈以及將卷曲螺旋連接至抗體的接頭序列中的示例性切割位點(diǎn)的位置。一般而言，系鏈中的切割位點(diǎn)定位在或靠近系鏈序列的C端和N端，或定位在處于或靠近抗體和系鏈的連接位點(diǎn)的抗體序列內(nèi)。接頭的切割位點(diǎn)一般定位在接頭序列(或卷曲螺旋)的N端,或定位在處于或靠近抗體和接頭(或卷曲螺旋)的連接位點(diǎn)的抗體序列中。如果用Lys-C內(nèi)肽酶(例如在恒定重鏈C端的賴氨酸殘基處)切割接頭，那么可以需要修飾抗體序列來去除Lys-C內(nèi)肽酶切割位點(diǎn)。這種修飾的實(shí)例是將鉸鏈區(qū)中的賴氨酸突變?yōu)楸彼?例如本文所述示例性抗體中的K222A，Kabat編號系統(tǒng)；K222A，EU編號系統(tǒng))。在選擇不同的切割劑用于本發(fā)明時，可以需要其他切割位點(diǎn)的修飾，并以相似的方式產(chǎn)生。在特定位點(diǎn)切割氨基酸序列是本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法，且可以涉及酶切割、化學(xué)切割或自體加工。例如可以用內(nèi)肽酶從蛋白質(zhì)切割系鏈或接頭。示例性內(nèi)肽酶非限制性地包括 Lys-C、Asp-N、Arg-C、V8、Glu_C、凝血酶、Genenase (枯草蛋白酶 BPN’ 的變體)、因子 Xa、 TEV(煙草蝕紋病毒半胱氨酸蛋白酶)、腸激肽、HRV C3 (人鼻病毒C3蛋白酶)、激肽原酶、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶，其全都是市售可得的(例如從Boehringer Mannheim、Thermo Scientif ic 或 New England Biolabs)。Lys-C 在賴氨酸殘基的羧基側(cè)切割，V8和Glu-C在谷氨酸殘基的羧基側(cè)切割，Arg-C在精氨酸殘基的羧基側(cè)切割，Asp-N 在天冬氨酸殘基的氨基側(cè)切割，胰凝乳蛋白酶在酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和亮氨酸殘基的羧基側(cè)切割，胰蛋白酶在精氨酸和賴氨酸的羧基側(cè)切割。TEV在“Gin”和“Gly”殘基之間切割氨基酸序列GluAsnLeuTyrPheGlnGly (SEQ ID N0:19)。這類酶的使用是本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法，且可從廠家獲得流程。 備選地，可以用化學(xué)藥品(如羥胺)從蛋白質(zhì)切割系鏈或接頭。羥胺切割天冬酰胺-甘氨酸肽鍵。如果用羥胺來從蛋白質(zhì)切割系鏈和接頭，可需要突變蛋白質(zhì)中的幾個甘氨酸或天冬酰胺殘基來避免片段化該蛋白質(zhì)。
切割肽鍵的許多其他化學(xué)藥品為本領(lǐng)域已知。例如，N-氯代琥珀酰亞胺在色氨酸殘基的 C 端一側(cè)切割(Shechter 等，Biochemistry 15 :5071-5075(1976))。N-溴代琥珀酰亞胺和溴化氰也在色氨酸殘基的C端一側(cè)切割。此外，可以用2-硝基氰硫基苯甲酸或有機(jī)磷來在半胱氨酸殘基的N端一側(cè)切割蛋白質(zhì)(見例如EP 0339217)。還可以在二堿基位點(diǎn)(例如精氨酸-精氨酸、賴氨酸-精氨酸或賴氨酸-賴氨酸位點(diǎn))切割接頭或系鏈。在二堿基位點(diǎn)切割的酶為本領(lǐng)域已知，且包括例如N-精氨酸二堿基轉(zhuǎn)化酶(Chow等，JBC 275 :19545-19551(2000))和枯草蛋白酶樣蛋白原轉(zhuǎn)化酶，如弗林蛋白酶(PCl)、PC2 和 PC3 (PeptideBiosynthesis and Processing (Fricker 編輯)1-16 頁,CRC Press, Boca Raton，F(xiàn)L 中的 Steiner (1991) ;Muller 等，JBC 275:39213-39222，(2000))。還已知蛋白質(zhì)自體加工。例如，Hedgehog蛋白質(zhì)通過該蛋白質(zhì)內(nèi)的蛋白水解活性在Gly. AspTrpAsnAlaArgTrp. CysPhe切割位點(diǎn)(SEQ IDNO 20)切割。接頭或系鏈序列中可以包含自我蛋白酶解位點(diǎn)。G.其他蛋白質(zhì)特征 本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以包含來自任意來源(包括人或鼠來源)的序列，或其組合。蛋白質(zhì)的某些部分(例如高變區(qū))的序列還可以是人工序列，如通過篩選包含隨機(jī)序列的文庫(例如噬菌體展示文庫)鑒定的序列。在抗體包含來自不同來源的序列的情況下，該抗體可以是“嵌合”抗體，其中部分重鏈和/或輕鏈與衍生自特定物種或隸屬于特定抗體種類或亞類的抗體中對應(yīng)的序列相同或同源，而一條或多條鏈的其余部分與衍生自另一物種或隸屬于另一抗體種類或亞類的抗體中對應(yīng)的序列相同或同源，以及這類抗體的片段，只要它們顯示希望的生物學(xué)活性(美國專利號 4, 816, 567 ；和 Morrison 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 6851-6855(1984))。這類嵌合抗體可以例如包含鼠可變區(qū)(或其部分)和人恒定區(qū)。可選地，嵌合抗體還可以是“人源化”抗體，其包含衍生自非人抗體的最少序列。 人源化抗體通常是這樣的人抗體(受體抗體)，其中用來自具有希望的抗體特異性、親和力和容量的諸如小鼠、大鼠、兔或非人靈長類的非人物種的高變區(qū)(供體抗體)的殘基取代來自受體高變區(qū)的殘基。在一些情況下，用對應(yīng)的非人殘基取代人免疫球蛋白的構(gòu)架區(qū)(FR) 殘基。此外，人源化抗體可以包含不見于受體抗體中或供體抗體中的殘基。產(chǎn)生這些修飾來進(jìn)一步改進(jìn)抗體性能。通常，人源化抗體將包含至少一個(且通常為兩個)可變結(jié)構(gòu)域的基本上全部，其中全部或基本上全部高變環(huán)對應(yīng)于非人免疫球蛋白的高變環(huán)，而全部或基本上全部FR是人免疫球蛋白序列的FR?？蛇x地，人源化抗體還將包含至少部分免疫球蛋白恒定區(qū)(Fe),通常是人免疫球蛋白的恒定區(qū)。進(jìn)一步的詳情見Jones等，Nature321 522-525 (1986) ；Riechmann 等，Nature 332 :323-329(1988);和 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2 :593-596(1992)。更具體而言，人源化抗體可以具有一個或多個從非人來源引入其中的氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基通常稱為“輸入”殘基，其通常取自“輸入”可變區(qū)。可以基本上按照 Winter 及其同事的方法(Jones 等，Nature321 :522-525(1986) ;Riechmann 等，Nature 332 :323-327(1988) ;Verhoeyen 等，Science 239 :1534-1536 (1988))，通過用嚙齒動物 CDR 或CDR序列取代對應(yīng)的人抗體序列來進(jìn)行人源化。因此，“人源化”抗體是這樣的嵌合抗體(美國專利號4，816，567)，其中用對應(yīng)的來自非人物種的序列取代了基本上少于完整的人可變結(jié)構(gòu)域。實(shí)際上，人源化抗體通常是這樣的人抗體，其中用來自嚙齒動物抗體中類似位點(diǎn)的殘基取代一些⑶R殘基，且可能取代一些FR殘基。用于產(chǎn)生人源化抗體的人可變結(jié)構(gòu)域(輕鏈和重鏈二者)的選擇對減低抗原性非常重要。按照所謂的“最佳適合”法，針對已知的人可變結(jié)構(gòu)域序列的整個文庫篩選嚙齒動物的可變結(jié)構(gòu)域序列。然后接受最接近于嚙齒動物序列的人序列作為人源化抗體的人構(gòu)架區(qū)(FR) (Sims 等，J. Immunol. 151 :2296 (1993) ；Chothia 等，J. Mol. Biol. 196 901(1987))。另一種方法使用衍生自特定輕鏈或重鏈亞組的所有人抗體的共有序列的特定構(gòu)架。相同的構(gòu)架可以用于幾種不同的人源化抗體(Carter等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 4285 (1992) ；Presta 等，J. Immnol. 151 :2623 (1993))。保留對抗原的高親和力和其他有利的生物學(xué)特性來人源化抗體也很重要。為了達(dá)到此目的，按照示例性方法，通過用親本序列和人源化序列的三維模型分析親本序列和多種概念性人源化產(chǎn)物的方法來制備人源化抗體。三維免疫球蛋白模型通?？傻?，并為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉。說明和顯示所選擇的候選免疫球蛋白序列的可能的三維構(gòu)象結(jié)構(gòu)的計算機(jī)程序也可得。這些顯示的檢查允許分析殘基在候選免疫球蛋白序列的功能發(fā)揮中可能的作用，即分析影響候選免疫球蛋白結(jié)合其抗原的能力的殘基。這樣，可以從受體序列和輸入序列選擇和組合FR殘基， 使得達(dá)到希望的抗體特征，如增加的對一種或多種靶抗原的親和力。一般而言，CDR殘基直接且最實(shí)質(zhì)地涉及影響抗原結(jié)合。III.載體、宿主細(xì)胞和重組方法為了重組產(chǎn)生本發(fā)明的抗體，分離編碼它的核酸并插入可復(fù)制載體進(jìn)行進(jìn)一步克隆(DNA的擴(kuò)增)或進(jìn)行表達(dá)。用常規(guī)方法(例如通過使用能夠與編碼抗體的重鏈和輕鏈的基因特異性結(jié)合的寡核苷酸探針)容易地分離和測序編碼抗體的DNA。許多載體是可得的。載體的選擇部分取決于要使用的宿主細(xì)胞。通常，優(yōu)選的宿主細(xì)胞具有原核或真核(通常是哺乳動物，但也包括真菌(例如酵母)、昆蟲、植物和來自其他多細(xì)胞生物的有核細(xì)胞) 來源。應(yīng)理解，任意同種型的恒定區(qū)(包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE恒定區(qū))都可以用于此目的，且這類恒定區(qū)可以獲自任意人種或動物物種。a.用原核宿主細(xì)胞產(chǎn)生抗體i.載體構(gòu)建可以用標(biāo)準(zhǔn)重組技術(shù)獲得編碼本發(fā)明的抗體的多肽成分的多核苷酸序列。可以從諸如雜交瘤細(xì)胞的產(chǎn)抗體細(xì)胞分離和測序希望的多核苷酸序列。備選地，可以用核苷酸合成儀或PCR技術(shù)合成多核苷酸。一旦獲得，即可將編碼多肽的序列插入能夠在原核宿主中復(fù)制和表達(dá)異源多核苷酸的重組載體中?？梢詫⒈绢I(lǐng)域可得和已知的許多載體用于本發(fā)明的目的。適當(dāng)?shù)妮d體的選擇將主要取決于待插入載體中的核酸的大小和待用該載體轉(zhuǎn)化的具體宿主細(xì)胞。取決于其功能(擴(kuò)增或表達(dá)異源多核苷酸，或二者)及其與它所駐留的具體宿主細(xì)胞的相容性，每個載體包含多種成分。載體成分通常包括但不限于復(fù)制起點(diǎn)、選擇標(biāo)記基因、啟動子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)、信號序列、異源核酸插入片段和轉(zhuǎn)錄終止序列。通常，將包含衍生自與宿主細(xì)胞相容的物種的復(fù)制子和控制序列的質(zhì)粒載體用于這些宿主。載體通常攜帶復(fù)制位點(diǎn)，以及能夠在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中提供表型選擇的標(biāo)記序列。例如，通常用衍生自大腸桿菌物種的質(zhì)粒PBR322轉(zhuǎn)化大腸桿菌。PBR322包含編碼氨芐青霉素(Amp)和四環(huán)素(Tet)抗性的基因，因此提供了用于鑒定轉(zhuǎn)化細(xì)胞的簡便手段。pBR322、 其衍生物或其他微生物質(zhì)?；蚴删w還可以包含或修飾為包含微生物可以用其來表達(dá)內(nèi)源蛋白質(zhì)的啟動子。Carter等，美國專利號5，648，237中詳細(xì)描述了用來表達(dá)具體抗體的 PBR322衍生物的實(shí)例。此外，包含與宿主微生物相容的復(fù)制子和控制序列的噬菌體載體可以用作與這些宿主相關(guān)的轉(zhuǎn)化載體。例如，諸如λ GEM. TM.-11的噬菌體可以用于產(chǎn)生可用來轉(zhuǎn)化諸如大腸桿菌LE392的易感宿主細(xì)胞的重組載體。本發(fā)明的表達(dá)載體可以包含編碼多肽成分中的每一種的兩個或多個啟動子-順反子對。啟動子是定位在順反子上游(5，)的不翻譯的調(diào)節(jié)序列，其調(diào)節(jié)該順反子的表達(dá)。 原核啟動子通常分為誘導(dǎo)型和組成型兩類。誘導(dǎo)型啟動子是響應(yīng)培養(yǎng)條件的變化(例如營養(yǎng)物的存在或卻非或溫度變化)而起始其控制下的順反子的提高水平的轉(zhuǎn)錄的啟動于。多種潛在的宿主細(xì)胞識別的大量啟動子是公知的?？梢酝ㄟ^經(jīng)限制酶消化從來源 DNA去除啟動子并將分離的啟動子序列插入本發(fā)明的載體來將所選擇的啟動子與編碼重鏈或輕鏈的順反子DNA有效連接。天然啟動子序列和許多異源啟動子都可以用來指導(dǎo)靶基因的擴(kuò)增和/或表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，利用異源啟動子，因為與天然靶多肽啟動子相比， 它們通常允許所表達(dá)的靶基因的更多的轉(zhuǎn)錄和更高的產(chǎn)率。適合用于原核宿主的啟動子包含PhoA啟動子、β-galactamase和乳糖啟動子系統(tǒng)、色氨酸(trp)啟動子系統(tǒng)及雜合啟動子,如tac或trc啟動子。但是,在細(xì)菌中具有功能的其他啟動子(如其他已知的細(xì)菌或噬菌體啟動子)也是適宜的。已公開了它們的核苷酸序列，從 而使得技術(shù)人員能夠用接頭或銜接子提供任意需要的限制位點(diǎn)來將它們連接至編碼靶輕鏈和靶重鏈的順反子(Siebenlist等，(1980)Cell 20:269)。在本發(fā)明的一個方面，重組載體內(nèi)的每個順反子包含指導(dǎo)所表達(dá)的多肽跨膜易位的分泌信號序列成分。通常，信號序列可以是載體的成分，或者它可以是插入載體中的靶多肽DNA的部分。選擇用于本發(fā)明的目的的信號序列應(yīng)是宿主細(xì)胞可識別和加工(即通過信號肽酶切割)的信號序列。對于不識別和加工異源多肽的天然信號序列的原核宿主細(xì)胞， 用選自例如堿性磷酸酶、青霉素酶、Ipp、或熱穩(wěn)定腸毒素II(STII)前導(dǎo)序列、LamB、PhoE> PelB、OmpA和MBP的原核信號序列取代該信號序列。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，用于表達(dá)系統(tǒng)的兩個順反子中的信號序列是STIII信號序列或其變體。另一方面，本發(fā)明的免疫球蛋白的產(chǎn)生可以發(fā)生在宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，因此無需在各順反子內(nèi)存在分泌信號序列。在這方面，免疫球蛋白輕鏈和重鏈在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)、 折疊，并組裝形成功能性免疫球蛋白。某些宿主菌株(例如大腸桿菌trxB菌株)提供有利于~■硫鍵形成的胞質(zhì)條件，從而允許所表達(dá)的蛋白質(zhì)亞基的正確折置和組裝(Proba和 Pluckthun, Gene, 159 :203 (1995))。適合用于表達(dá)本發(fā)明的抗體的原核宿主細(xì)胞包括古細(xì)菌和真細(xì)菌，如革蘭氏陰性菌或革蘭氏陽性菌。有用的細(xì)菌的實(shí)例包括埃希氏菌屬(Escherichia)(例如大腸桿菌)、芽孢桿菌屬(Bacilli)(例如枯草芽孢桿菌(B. subtilis))、腸細(xì)菌、假單胞菌屬 (Pseudomonas)物種(例如銅綠假單胞菌(P. aeruginosa))、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)、粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescans)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、 變形桿菌屬(Proteus)、志賀氏菌屬(Shigella)、根瘤菌屬(Rhizobia)、透明顫菌屬(Vitreoscilla)、副球菌屬(Paracoccus)。在一個實(shí)施方案中，使用革蘭氏陰性細(xì)胞。在一個實(shí)施方案中，用大腸桿菌細(xì)胞作為本發(fā)明的宿主。大腸桿菌菌株的實(shí)例包括菌株 W3110 (Bachmann, Cellular and MolecularBiology,第 2 卷(Washington, D. C. American Society for Microbiology，1987)，1190-1219 頁；ATCC 保藏號 27，325)及其衍生物，包括具有基因型 W3110 Δ fhuA( Δ tonA)ptr31ac Iq lacL8 Δ ompT Δ (nmpc-fepE) degP41kanR 的菌株33D3 (美國專利號5，639，635)。其他菌株及其衍生物，如大腸桿菌294 (ATCC 31，446)、 大腸桿菌B、大腸桿菌λ 1776 (ATCC 31,537)和大腸桿菌RV308 (ATCC 31,608)也適宜。這些實(shí)例是說明性的而不是限制性的。用于構(gòu)建上述細(xì)菌中任一種的具有確定基因型的衍生物的方法為本領(lǐng)域已知，并描述于例如Bass等，Proteins 8 :309-314 (1990)中。通常有必要考慮復(fù)制子在細(xì)菌細(xì)胞中的可復(fù)制性來選擇適當(dāng)?shù)募?xì)菌。例如，在用諸如PBR322、 PBR325、pACYC177或pKN410的公知質(zhì)粒來提供復(fù)制子時，可以適宜地用大腸桿菌、沙雷氏菌屬(Serratia)物種或沙門氏菌屬(Salmonella)物種作為宿主。通常，宿主細(xì)胞應(yīng)分泌最小量的蛋白水解酶，且可希望在細(xì)胞培養(yǎng)物中摻入附加的蛋白酶抑制劑。ii.抗體產(chǎn)生用上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，并在根據(jù)誘導(dǎo)啟動子、選擇轉(zhuǎn)化體或擴(kuò)增編碼希望的序列的基因的需要改進(jìn)的常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)化意指將DNA引入原核宿主中，使得DNA可作為染色體外元件復(fù)制或通過染色體整合體(integrant)復(fù)制。取決于所使用的宿主細(xì)胞，用適合于這類細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。通常將利用氯化鈣的鈣處理用于包含實(shí)質(zhì)性細(xì)胞壁障礙的細(xì)菌細(xì)胞。用于轉(zhuǎn)化的另一種 方法利用聚乙二醇/DMS0。所使用的另一種技術(shù)是電穿孔。在本領(lǐng)域已知且適合用于培養(yǎng)所選擇的宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基中培養(yǎng)用于產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的原核細(xì)胞。適宜的培養(yǎng)基的實(shí)例包括添加了必需的營養(yǎng)補(bǔ)充物的Luria培養(yǎng)基 (LB)。在一些實(shí)施方案中，培養(yǎng)基還包含根據(jù)表達(dá)載體的構(gòu)建選擇的選擇劑，以選擇性允許包含表達(dá)載體的原核細(xì)胞的生長。例如，向培養(yǎng)基中加入氨芐青霉素使表達(dá)氨芐青霉素抗性基因的細(xì)胞生長。還可以按適當(dāng)濃度包含除碳、氮和無機(jī)磷酸鹽來源以外的任意必需補(bǔ)充物，其單獨(dú)引入或作為與另一補(bǔ)充物或培養(yǎng)基的混合物(如復(fù)合氮源)引入?？蛇x地，培養(yǎng)基可以包含選自谷胱甘肽、半胱氨酸、胱胺、巰基乙酸鹽、二硫赤蘚糖醇和二硫蘇糖醇的一種或多種還原劑。在適宜的溫度培養(yǎng)原核宿主細(xì)胞。對于大腸桿菌生長，例如，優(yōu)選的溫度在從約 20°C至約39°C的范圍內(nèi)，更優(yōu)選從約25°C至約37°C，甚至更優(yōu)選在約30°C。主要取決于宿主生物，培養(yǎng)基的pH可以是從約5至約9的范圍內(nèi)的任意pH。對于大腸桿菌，pH優(yōu)選從約 6. 8至約7. 4，且更優(yōu)選約7. O。如果將誘導(dǎo)型啟動子用于本發(fā)明的表達(dá)載體中，則在適合用于激活該啟動子的條件下誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)。在本發(fā)明的一方面，用PhoA啟動子控制多肽的轉(zhuǎn)錄。因此，在用于誘導(dǎo)的磷酸鹽限制培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。優(yōu)選地，該磷酸鹽限制培養(yǎng)基是C. R. A.P 培養(yǎng)基(見例如 Simmons 等，J. Immunol. Methods (2002), 263 :133-147)。如本領(lǐng)域已知，可以根據(jù)所利用的載體構(gòu)建體使用多種其他誘導(dǎo)物。在一個實(shí)施方案中，所表達(dá)的本發(fā)明的多肽分泌進(jìn)入宿主細(xì)胞周質(zhì)，且從宿主細(xì)胞周質(zhì)回收。蛋白質(zhì)回收通常涉及破裂微生物，通常通過諸如滲透壓休克、超聲處理或裂解的手段來破裂。一旦細(xì)胞破裂，即可通過離心或過濾去除細(xì)胞碎片或整個細(xì)胞?？梢岳缤ㄟ^親和樹脂層析進(jìn)一步純化蛋白質(zhì)。備選地，蛋白質(zhì)可以轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入培養(yǎng)基，并從培養(yǎng)基中分離?？梢詮呐囵B(yǎng)物去除細(xì)胞，并過濾和濃縮培養(yǎng)物上清來進(jìn)一步純化所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。可以用公知的方法(如聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)和Western印跡測定)進(jìn)一步分離和鑒定所表達(dá)的多肽。在本發(fā)明的一方面，通過發(fā)酵法大量進(jìn)行抗體產(chǎn)生。可獲得多種大規(guī)模補(bǔ)料分批發(fā)酵方法來進(jìn)行重組蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。大規(guī)模發(fā)酵具有至少1000升的容量，優(yōu)選約1，000至 100，000升的容量。這些發(fā)酵罐用攪拌槳來分配氧和營養(yǎng)物，尤其是葡萄糖(優(yōu)選的碳/能量來源)。小規(guī)模發(fā)酵通常指體積容量不超過約100升，且可以在從約I升至約100升的范圍內(nèi)的發(fā)酵罐中的發(fā)酵。在發(fā)酵法中，通常在細(xì)胞在適 宜條件下生長至希望的密度(例如0D550為約 180-220)后起始蛋白質(zhì)表達(dá)的誘導(dǎo)，細(xì)胞在該階段處于早穩(wěn)定期。如本領(lǐng)域已知和上文所述，根據(jù)所利用的載體構(gòu)建體，可以使用多種誘導(dǎo)物。可以在誘導(dǎo)前培養(yǎng)細(xì)胞較短時期。雖然可以使用更長或更短的誘導(dǎo)時間，但通常誘導(dǎo)細(xì)胞約12-50小時。為了改善本發(fā)明的多肽的產(chǎn)率和質(zhì)量，可以修改多種發(fā)酵條件。例如，為了改善分泌性抗體多肽的正確組裝和折疊，可以用過量表達(dá)伴侶蛋白質(zhì)(如Dsb蛋白質(zhì)(DsbA、DsbB、 DsbC、DsbD和/或DsbG)或FkpA (具有分子伴侶活性的肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶))的附加質(zhì)粒來共轉(zhuǎn)化宿主原核細(xì)胞。已顯示伴侶蛋白質(zhì)促進(jìn)細(xì)菌宿主細(xì)胞中產(chǎn)生的異源蛋白質(zhì)的正確折疊和可溶性(Chen 等，(1999) J. Biol. Chem. 274 :19601-19605 ;Georgiou 等，美國專利號 6，083，715 ；Georgiou 等，美國專利號 6，027，888 ；Bothmann 和 Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275 :17100-17105 ;Ramm 和 Pluckthun，(2000)J. Biol. Chem. 275 :17106-17113 ；Arie 等，(2001)Mol. Microbiol. 39 :199-210)。為了最小化所表達(dá)的異源蛋白質(zhì)(尤其是對蛋白水解敏感的那些)的蛋白水解， 可以將某些蛋白水解酶缺陷的宿主菌株用于本發(fā)明。例如，可以修飾宿主細(xì)胞菌株來在編碼已知的細(xì)菌蛋白酶(如蛋白酶III、OmpT、Degp、TSp、蛋白酶I、蛋白酶Mi、蛋白酶V、蛋白酶VI及其組合)的基因中產(chǎn)生一個或多個遺傳突變。一些大腸桿菌蛋白酶缺陷菌株是可得的，且描述于例如 Joly 等，(1998)，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 :2773-2777 ；Georgiou 等，美國專利號 5, 264, 365 ；Georgiou 等,美國專利號 5, 508, 192 ；Hara 等,Microbial Drug Resistance, 2 :63-72 (1996)中。在一個實(shí)施方案中，用蛋白水解酶缺陷，且用過量表達(dá)一種或多種伴侶蛋白質(zhì)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌株作為本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)中的宿主細(xì)胞。iii.抗體純化可以利用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)純化方法。以下方法是適宜的純化方法的示例免疫親和柱或離子交換柱上的分級分離、乙醇沉淀、反相HPLC、二氧化硅上或陽離子交換樹脂(如DEAE)上的層析、層析聚焦、SDS-PAGE、硫酸銨沉淀和使用例如S^hadex G-75 的凝膠過濾。一方面，用固定在固相上的A蛋白進(jìn)行本發(fā)明的全長抗體產(chǎn)物的免疫親和純化。A 蛋白是來自金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的41kD細(xì)胞壁蛋白質(zhì),其以高親和力與抗體的Fe區(qū)結(jié)合。Lindmark等，(1983) J. Immunol. Meth. 62 :1_13。優(yōu)選A蛋白所固定的固相是包含玻璃表面或二氧化硅表面的柱，更優(yōu)選可控孔度玻璃柱或硅酸柱。在一些應(yīng)用中，已在防止污染物的非特異性黏附的嘗試中用諸如甘油的試劑包被柱。作為純化的第一步，將衍生自上述細(xì)胞培養(yǎng)物的制備物應(yīng)用在固定了 A蛋白的固相上，以允許目的抗體與A蛋白的特異性結(jié)合。然后洗滌固相，以去除與固相非特異性結(jié)合的污染物?？梢酝ㄟ^洗脫在包含離液劑或溫和去垢劑的溶液中來從固相回收目的抗體。示例性離液劑和溫和去垢劑包括但不限于鹽酸胍、尿素、高氯酸鋰、精氨酸、組氨酸、SDS (十二燒基硫酸鈉)、Tween、Triton和NP-40,其全都是市售可得的。從柱(例如mAbSure柱)洗脫后，將抗體稀釋在包含離液劑或溫和去垢劑的溶液中，以保持洗脫后的抗體的穩(wěn)定性，并允許通過Lys-C內(nèi)肽酶有效去除卷曲螺旋。b.用真核宿主細(xì)胞產(chǎn)生抗體載體成分通常包括但不限于以下中的一種或多種信號序列、復(fù)制起點(diǎn)、一個或多個標(biāo)記基因、增強(qiáng)子元件、啟動子和轉(zhuǎn)錄終止序列。i.信號序列成分用于真核宿主細(xì)胞的載體可以包含信號序列或在成熟蛋白質(zhì)或目的多肽的N端具有特異性切割位點(diǎn)的其他 多肽。所選擇的異源信號序列可以是宿主細(xì)胞識別和加工(即通過信號肽酶切割)的信號序列。在哺乳動物細(xì)胞表達(dá)中，哺乳動物信號序列，以及病毒分泌前導(dǎo)序列(例如單純皰疹gD信號)是可得的。這類前體區(qū)的DNA與編碼抗體的DNA符合讀框地連接。ii.復(fù)制起點(diǎn)通常，哺乳動物表達(dá)載體不需要復(fù)制起點(diǎn)成分。例如，通常可以使用SV40起點(diǎn)，但只是因為它包含早期啟動子。iii.選擇基因成分表達(dá)載體和克隆載體可以包含選擇基因，其也稱為選擇標(biāo)記。典型的選擇基因編碼這樣的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)(a)賦予對抗生素或其他毒素(例如氨芐青霉素、新霉素、氨甲喋呤或四環(huán)素)的抗性；(b)彌補(bǔ)相關(guān)的營養(yǎng)缺陷；或(C)提供從復(fù)合培養(yǎng)基不可得的關(guān)鍵
營養(yǎng)物。選擇方案的一個實(shí)例是利用藥物來阻斷宿主細(xì)胞的生長。異源基因成功轉(zhuǎn)化的那些細(xì)胞產(chǎn)生賦予藥物抗性的蛋白質(zhì)，因此從選擇方案存活下來。這種顯性選擇的實(shí)例使用藥物新霉素、霉酚酸和潮霉素。適合用于哺乳動物細(xì)胞的選擇標(biāo)記的另一實(shí)例是使得能夠鑒定有能力攝取抗體核酸的細(xì)胞的那些，如DHFR、胸苷激酶、金屬硫蛋白I和II (優(yōu)選靈長類金屬硫蛋白基因)、 腺苷脫氨酶、鳥氨酸脫羧酶等。例如，首先通過在包含氨甲喋呤(Mtx) (DHFR的競爭性抑制劑)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所有轉(zhuǎn)化體來鑒定DHFR選擇基因轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。在利用野生型DHFR時，適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞是缺乏DHFR活性的中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系(例如ATCC CRL-9096)。備選地，可以通過包含用于該選擇標(biāo)記的選擇劑的培養(yǎng)基(如氨基糖苷抗生素， 例如卡那霉素、新霉素或G418)中的細(xì)胞生長來選擇用編碼抗體、野生型DHFR蛋白質(zhì)和另一選擇標(biāo)記(如氨基糖苷3’-磷酸轉(zhuǎn)移酶(APH))的DNA序列轉(zhuǎn)化或共轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞(尤其是包含內(nèi)源DHFR的野生型宿主)。見例如美國專利號4，965，199。iv.啟動子成分表達(dá)載體和克隆載體通常包含宿主生物可識別，且與抗體多肽核酸有效連接的啟動子。已知真核生物的啟動子序列。基本上所有真核基因都具有定位在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游約25至30個堿基的富含AT的區(qū)域。見于許多基因的轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)上游70至80個堿基的另一序列是CNCAAT區(qū)，其中N可以是任意核苷酸。大多數(shù)真核基因的3’端是AATAAA序列， 其可以是將poly A尾添加至編碼序列3’端的信號。所有這些序列都適宜地插入真核表達(dá)載體中。例如通過獲自病毒(例如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(如腺病毒2)、牛乳頭狀病毒、禽肉瘤病毒、巨細(xì)胞病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒、乙型肝炎病毒和猿猴病毒40(SV40))基因組、獲自異源哺乳動物啟動子(例如肌動蛋白啟動子或免疫球蛋白啟動子)或獲自熱休克啟動子的啟動子來控制哺乳動物宿主細(xì)胞中來自載體的抗體多肽轉(zhuǎn)錄，只要這類啟動子與宿主細(xì)胞系統(tǒng)相容。作為SV40限制片段方便地獲得SV40病毒的早期和晚期啟動子，該限制片段還包含SV40病毒復(fù)制起點(diǎn)。作為HindIII E限制片段方便地獲得人巨細(xì)胞病毒的立即早期啟動子。美國專利號4，419，446中公開了用牛乳頭狀病毒作為載體在哺乳動物宿主中表達(dá)DNA 的系統(tǒng)。美國專利號4，601，978中描述了此系統(tǒng)的修改。備選地，可以用勞斯肉瘤病毒長末端重復(fù)序列作為啟動子。、V.增強(qiáng)子元件成分可以通過將增強(qiáng)子序列插入載體來增加高等真核生物的編碼抗體多肽的DNA的轉(zhuǎn)錄?，F(xiàn)已知來自哺乳動物基因(例如珠蛋白、彈性蛋白酶、清蛋白、甲胎蛋白和胰島素基因)的許多增強(qiáng)子序列。另外，可以使用來自真核細(xì)胞病毒的增強(qiáng)子。實(shí)例包括復(fù)制起點(diǎn)晚期一側(cè)(bp 100-270)的SV40增強(qiáng)子、巨細(xì)胞病毒早期啟動子增強(qiáng)子、復(fù)制起點(diǎn)晚期一側(cè)的多瘤增強(qiáng)子和腺病毒增強(qiáng)子。用于增強(qiáng)真核啟動子的激活的元件的描述還見Yaniv，NatUre 297 :17-18(1982)。增強(qiáng)子可以在抗體多肽編碼序列5’或3’的位置連接入載體，只要達(dá)到增強(qiáng)，但通常定位在啟動子5’的位點(diǎn)。vi.轉(zhuǎn)錄終止成分用于真核宿主細(xì)胞的表達(dá)載體通常還將包含終止轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定mRNA所必需的序列。通?？蓮恼婧嘶虿《綝NA或cDNA的5’和(偶爾)3’非翻譯區(qū)獲得這類序列。這些區(qū)域包含轉(zhuǎn)錄為編碼抗體的mRNA的非翻譯部分中的聚腺苷酰化片段的核苷酸區(qū)段。一種有用的轉(zhuǎn)錄終止成分是牛生長激素聚腺苷?；瘏^(qū)。見WO 94/11026及其中公開的表達(dá)載體。vii.宿主細(xì)胞的選擇和轉(zhuǎn)化適合用于克隆或表達(dá)本文的載體中的DNA的宿主細(xì)胞包含本文所述高等真核細(xì)胞，包括脊椎動物宿主細(xì)胞。培養(yǎng)脊椎動物細(xì)胞的繁殖(組織培養(yǎng))已成為常規(guī)方法。有用的哺乳動物宿主細(xì)胞系的實(shí)例是SV40轉(zhuǎn)化的猴腎CVI細(xì)胞系(C0S-7，ATCC CRL 1651)； 人胚腎細(xì)胞系(293或針對在懸浮培養(yǎng)物中生長亞克隆的293細(xì)胞，Graham等，J. Gen. Virol. 36 :59(1977));幼倉鼠腎細(xì)胞(BHK，ATCC CCL 10);中國倉鼠卵巢細(xì)胞/-DHFR(CH0， Urlaub 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216(1980));小鼠支持細(xì)胞(TM4,Mather, Biol. R印rod. 23 :243-251(1980));猴腎細(xì)胞(CV1ATCC CCL 70);非洲綠猴腎細(xì)胞(VER0-76，ATCC CRL-1587);人宮頸癌細(xì)胞(HELA, ATCC CCL 2);犬腎細(xì)胞(MDCK, ATCC CCL34)； buffalo 大鼠肝細(xì)胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442);人肺細(xì)胞(Wl38, ATCC CCL 75);人肝細(xì)胞 (Hep G2，HB 8065);小鼠乳腺腫瘤(MMT060562, ATCC CCL51) ；TRI 細(xì)胞(Mather 等，Annals N. Y. Acad. Sci. 383 :44-68(1982)) ；MRC 5 細(xì)胞；FS4 細(xì)胞；和人肝癌細(xì)胞系(Hep G2)。用上述用于抗體產(chǎn)生的表達(dá)載體或克隆載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，并在根據(jù)誘導(dǎo)啟動子、選擇轉(zhuǎn)化體或擴(kuò)增編碼希望的序列的基因的需要改進(jìn)的常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。viii.培養(yǎng)宿主細(xì)胞可在多種培養(yǎng)基中培養(yǎng)用來產(chǎn)生本發(fā)明的抗體的宿主細(xì)胞。諸如Han^ s FlO(Sigma)^Minimal Essential Medium(MEM)(Sigma)、RPMI_1640(Sigma)和Dulbecco' s Modified Eagle' s Medium(DMEM, Sigma)的市售培養(yǎng)基適合用于培養(yǎng)宿主細(xì)胞。此外， 可以用 Ham 等，Meth. Enz. 58 :44(1979) ；Barnes 等，Anal. Biochem. 102 :255(1980)；美國專利號 4，767，704,4, 657，866,4, 927，762,4, 560，655 或 5，122，469 ；W0 90/03430 ；W0 87/00195 ;或美國專利Re. 30，985中所述的任意培養(yǎng)基作為宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基?？梢愿鶕?jù)需要向任意這些培養(yǎng)基中補(bǔ)充激素和/或其他生長因子(如胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白或表皮生長因子)、鹽(如氯化鈉、鈣、鎂和磷酸鹽)、緩沖液(如HEPES)、核苷酸(如腺苷和胸苷)、抗生素(如GENTAMYCIN 藥物)、痕量元素(定義為通常以微摩爾范圍內(nèi)的終濃度存在的無機(jī)化合物)和葡萄糖或等同的能量來源。還可以按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的適當(dāng)濃度包含任意其他必需的補(bǔ)充物。培養(yǎng)條件(如溫度、PH等)是之前用于選擇用于表達(dá)的宿主細(xì)胞的那些，且對普通技術(shù) 人員而言將是顯而易見的。ix.抗體的純化使用重組技術(shù)時，抗體可以在胞內(nèi)產(chǎn)生，或者直接分泌進(jìn)入培養(yǎng)基。如果抗體在胞內(nèi)產(chǎn)生，作為第一步驟，例如通過離心或超濾去除顆粒碎片(宿主細(xì)胞或裂解片段)。多肽分泌進(jìn)入培養(yǎng)基時，通常首先用市售蛋白質(zhì)濃縮濾器(例如Amicon或Millipore Pellicon 超濾單元)濃縮來自這類表達(dá)系統(tǒng)的上清?？梢栽谌我馍鲜霾襟E中包含蛋白酶抑制劑(如 PMSF)來抑制蛋白水解，且可以包含抗生素來防止外來污染物的生長。可以用例如羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析和親和層析純化從細(xì)胞制備的抗體組合物，親和層析是優(yōu)選的純化技術(shù)。A蛋白作為親和配體的適合性取決于抗體中存在的任意免疫球蛋白Fe結(jié)構(gòu)域的種類和同種型。可以用A蛋白來純化基于人Y I、γ2或γ4重鏈的抗體(Lindmark等，J. Immunol. Meth. 62 :1-13 (1983))。建議G蛋白用于所有小鼠同種型和人Y 3 (Guss等，EMBO J. 5 :15671575 (1986))。親和配體所附著的基質(zhì)最常是瓊脂糖，但其他基質(zhì)也是可得的。與用瓊脂糖可以達(dá)到的流速和處理時間相比，機(jī)械穩(wěn)定的基質(zhì) (如可控孔度玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯)允許更快的流速和更短的處理時間?？贵w包含 CH3 結(jié)構(gòu)域時，用 Bakerbond ABX 樹脂(J. T. Baker, Phillipsburg, NJ)進(jìn)行純化。取決于待回收的抗體，用于蛋白質(zhì)純化的其他技術(shù)(如離子交換柱上的分級分離、乙醇沉淀、 反相HPLC、二氧化硅上的層析、肝素SEPHAR0SETM上的層析、陰離子或陽離子交換樹脂(如聚天冬氨酸柱)上的層析、層析聚焦、SDS-PAGE和硫酸銨沉淀)也是可得的。在一個實(shí)施方案中，通過洗脫在包含離液劑或溫和去垢劑的溶液中來從柱的固相回收目的抗體。示例性離液劑和溫和去垢劑包括但不限于鹽酸胍、尿素、高氯酸鋰、精氨酸、 組氨酸、SDS (十二烷基硫酸鈉)、Tween、Triton和NP-40，其全都是市售可得的。
任意一個或多個初步純化步驟后，可以對包含目的抗體和污染物的混合物進(jìn)行低 PH疏水作用層析，該層析使用pH在約2. 5-4. 5之間的洗脫緩沖液，優(yōu)選在低鹽濃度(例如約0-0. 25M鹽)下進(jìn)行。X.使用桿狀病毒的抗體產(chǎn)生可以通過用例如Iipofectin (可從GIBC0-BRL購得)將編碼抗體或抗體片段和BaculoGold 病毒DNA (Pharmingen)的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入昆蟲細(xì)胞(如草地夜蛾 (Spodoptera frugiperda)細(xì)胞(例如 Sf9 細(xì)胞；ATCC CRL1711)或黑腹果蜆(Drosophila melan0gaSter)S2細(xì)胞)來產(chǎn)生重組桿狀病毒。在具體實(shí)例中，在包含于桿狀病毒表達(dá)載體內(nèi)的附加表位的上游融合抗體序列。這類附加表位包含聚組氨酸標(biāo)記?？梢岳枚喾N質(zhì)粒，包括衍生自諸如pVL1393 (Novagen)或pAcGP67B (Pharmingen)的市售質(zhì)粒的質(zhì)粒。簡言之，可以用與5’和3’區(qū)互補(bǔ)的引物PCR擴(kuò)增編碼抗體或其片段的序列。5’引物可以摻入側(cè)翼(選擇的)限制酶位點(diǎn)。然后可以用選擇的限制酶消化產(chǎn)物，并亞克隆入表達(dá)載體。用表達(dá)載體轉(zhuǎn)染后，在28°C孵育宿主細(xì)胞(例如Sf9細(xì)胞)4-5天，收獲釋放的病毒，并用于進(jìn)一步擴(kuò)增?？梢园蠢?O’ Reilley 等(Baculovirusexpression vectors A Laboratory Manual. Oxford 0xf ord U niversityPress (1994))所述進(jìn)行病毒感染和蛋白質(zhì)表達(dá)。然后可以例如通過如下Ni2+螯合物親和層析來純化所表達(dá)的帶有聚組氨酸標(biāo)記的抗體?？梢园碦upert等(Nature 362 :175-179 (1993)所述從重組病毒感染的Sf9細(xì)胞制備提取物。簡言之，洗滌Sf9細(xì)胞，重懸在超聲處理緩沖液(25mL HEPES pH 7.9 ； 12. 5mM MgCl2 ；0. ImM EDTA ;10%甘油；0. I % NP-40 ；0. 4M KCl)中，并在冰上超聲處理兩次20秒。通過離心澄清超聲處理產(chǎn)物(sonicate),將上清50倍稀釋在上樣緩沖液(50mM磷酸鹽；300mM NaCl ;10%甘油；pH 7. 8)中，并濾過O. 45 μ m濾器。按5mL柱床體積制備Ni2+-NTA瓊脂糖柱(可從Qiagen購得)，用25mL水洗滌，并用25mL上樣緩沖液平衡。按O. 5mL/分鐘將過濾的細(xì)胞提取物上樣在柱上。用上樣緩沖液洗滌柱至基線A28tl,在該時間點(diǎn)開始級分收集。 然后，用洗脫非特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)的第二洗滌緩沖液(50mM磷酸鹽；300mM NaCl ;10%甘油；pH 6. O)洗滌柱。再次達(dá)到A28tl基線后，用含O至500mM咪唑梯度的第二洗滌緩沖液沖洗柱。收集ImL級分，并通過SDS-PAGE和銀染或用與堿性磷酸酶綴合的Ni2+-NTA(Qiagen) 進(jìn)行的Western印跡來分析?；旌习疵摰膸в蠬isltl標(biāo)記的抗體的級分,并對上樣緩沖液透析。備選地，可以用已知的層析技術(shù)(包括例如A蛋白或G蛋白柱層析)進(jìn)行抗體的純化?？梢酝ㄟ^洗脫在包含離液劑或溫和去垢劑的溶液中來從柱的固相回收目的抗體。示例性離液劑和溫和去垢劑包括但不限于鹽酸胍、尿素、高氯酸鋰、精氨酸、組氨酸、SDS (十二烷基硫酸鈉)、Tween、Triton和NP-40，其全都是市售可得的。c.優(yōu)化的純化技術(shù)下文顯示可以用于包含卷曲螺旋的抗體的一種具體的純化方法。
權(quán)利要求
1.抗體，其包含 (a)含有VH結(jié)構(gòu)域和第一卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域(CC)的第一多肽，其中所述第一CC包含式I的七殘基重復(fù)序列 (X1X2X3X4X5X6X7) n(式 I) X1是疏水性氨基酸殘基或天冬酰胺， X2、X3和X6各是任意氨基酸殘基， X4是疏水性氨基酸殘基，和 X5和X7各是帶電荷氨基酸殘基；和 (b)含有VH結(jié)構(gòu)域和第二卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域(CC)的第二多肽，其中所述第二CC包含式II的七殘基重復(fù)序列(X，4，2X’ 3X，4X，5X，6X，7)n(式 II) X’ !是疏水性氨基酸殘基或天冬酰胺， V2、V 3和X’ 6各是任意氨基酸殘基， X’ 4是疏水性氨基酸殘基，和 V5和X’ 7各是帶電荷氨基酸殘基； 其中式I和式II中的η大于或等于2 ;和 其中在各七殘基重復(fù)序列中，所述第一 CC包含電荷與所述第二 CC中的X’ 7殘基相反的X5殘基，且所述第一 CC包含電荷與所述第二 CC中的X’ 5殘基相反的X7殘基。
2.權(quán)利要求I的抗體，其中所述第一和第二多肽各包含VH和CHl結(jié)構(gòu)域。
3.權(quán)利要求2的抗體，其中所述第一和第二多肽各進(jìn)一步包含鉸合部結(jié)構(gòu)域。
4.權(quán)利要求1-3中任一項的抗體，其中所述第一和第二多肽各進(jìn)一步包含CH2和CH3結(jié)構(gòu)域。
5.權(quán)利要求I的抗體，其中所述第一和第二多肽各包含相對于彼此以VH-CHl-鉸合部-CH2-CH3的N端至C端方向定位的VH、CHl、鉸合部、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域。
6.權(quán)利要求1-5中任一項的抗體，其中所述抗體進(jìn)一步包含第三和第四多肽，其中所述第三多肽包含第一 VL結(jié)構(gòu)域，且所述第四多肽包含第二 VL結(jié)構(gòu)域。
7.權(quán)利要求6的抗體，其中所述第一多肽的VH結(jié)構(gòu)域通過系鏈連接至所述第三多肽的VL結(jié)構(gòu)域，且所述第二多肽的VH結(jié)構(gòu)域通過系鏈連接至所述第四多肽的VL結(jié)構(gòu)域。
8.權(quán)利要求6的抗體，其中所述第三多肽進(jìn)一步包含第一CL結(jié)構(gòu)域，其中所述第一 VL和CL結(jié)構(gòu)域相對于彼此以VL-CL的N端至C端方向定位在所述第三多肽內(nèi)，且所述第四多肽進(jìn)一步包含第二 CL結(jié)構(gòu)域，其中所述第二 VL和CL結(jié)構(gòu)域相對于彼此以VL-CL的N端至C端方向定位在所述第四多肽內(nèi)。
9.權(quán)利要求6-8中任一項的抗體，其中所述第一VL結(jié)構(gòu)域和所述第二 VL結(jié)構(gòu)域的序列相同。
10.權(quán)利要求1-9中任一項的抗體，其中所述第一多肽或所述第二多肽中至少一個的VH的N端以系鏈連接至CL的C端。
11.抗體，其包含 (a)含有VH結(jié)構(gòu)域和第一卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域(CC)的第一多肽，其中所述第一 CC包含式I的七殘基重復(fù)序列(X1X2X3X4X5X6X7) n(式 I) X1是疏水性氨基酸殘基或天冬酰胺， X2、X3和X6各是任意氨基酸殘基， X4是疏水性氨基酸殘基，和 X5和X7各是帶電荷氨基酸殘基；和 (b)含有CH2和CH3結(jié)構(gòu)域及第二卷曲螺旋(CC)的第二多肽，其中所述第二 CC包含式II的七殘基重復(fù)序列(X，4，2X’ 3X，4X，5X，6X，7)n(式 II) X’ !是疏水性氨基酸殘基或天冬酰胺， V2、V 3和X’ 6各是任意氨基酸殘基， X’ 4是疏水性氨基酸殘基，和 V5和X’ 7各是帶電荷氨基酸殘基； 其中式I和式II中的η大于或等于2 ;和 其中在各七殘基重復(fù)序列中，所述第一 CC包含電荷與所述第二 CC中的X’ 7殘基相反的X5殘基，且所述第一 CC包含電荷與所述第二 CC中的X’ 5殘基相反的X7殘基。
12.權(quán)利要求11的抗體，其中所述第一多肽包含VH和CHl結(jié)構(gòu)域。
13.權(quán)利要求12的抗體，其中所述第一多肽進(jìn)一步包含鉸合部結(jié)構(gòu)域。
14.權(quán)利要求12或13的抗體，其中所述第一多肽進(jìn)一步包含CH2和CH3結(jié)構(gòu)域。
15.權(quán)利要求11的抗體，其中所述第一多肽包含相對于彼此以VH-CHl-鉸合部-CH2-CH3的N端至C端方向定位的VH、CHl、鉸合部、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域。
16.權(quán)利要求11-15中任一項的抗體，其中所述抗體進(jìn)一步包含第三多肽，其中所述第三多肽包含VL結(jié)構(gòu)域。
17.權(quán)利要求16的抗體，其中所述第三多肽進(jìn)一步包含CL結(jié)構(gòu)域，且所述VL和CL結(jié)構(gòu)域相對于彼此以VL-CL的N端至C端方向定位。
18.權(quán)利要求11-17中任一項的抗體，其中所述第一多肽的VH的N端以系鏈連接至CL的C端。
19.權(quán)利要求1-18中任一項的抗體，其中XpV P X4和V 4任一個中的所述疏水性氨基酸殘基選自丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸。
20.權(quán)利要求1-19中任一項的抗體，其中Χ5、V5、X7和V 7任一個中的所述帶電荷氨基酸殘基選自賴氨酸、精氨酸、組氨酸、天冬氨酸和谷氨酸。
21.權(quán)利要求1-20中任一項的抗體，其中在所述第一CC的至少一個七殘基重復(fù)序列中，X1是天冬酰胺，其中在所述第二 CC的至少一個七殘基重復(fù)序列中，各X’ !是天冬酰胺。
22.權(quán)利要求1-21中任一項的抗體，其中 (a)所述第一 CC包含七殘基重復(fù)序列，其中 X1是亮氨酸或天冬酰胺， X2是丙氨酸或谷氨酰胺， X3是丙氨酸或谷氨酰胺， X4是亮氨酸， X5是谷氨酸，X6是賴氨酸或色氨酸，和 X7是谷氨酸；和 (b)所述第二 CC包含七殘基重復(fù)序列，其中 VI是亮氨酸或天冬酰胺， X’ 2是丙氨酸或谷氨酰胺， X’ 3是丙氨酸或谷氨酰胺， V4是亮氨酸， X’ 5是賴氨酸， X’ 6是賴氨酸或色氨酸，和 V7是賴氨酸。
23.權(quán)利要求1-22中任一項的抗體，其中η大于或等于3。
24.權(quán)利要求23的抗體，其中η大于或等于4。
25.權(quán)利要求1-24中任一項的抗體，其中所述第一或所述第二CC中至少一個在所述抗體的恒定結(jié)構(gòu)域C端連接。
26.權(quán)利要求25的抗體，其中所述恒定結(jié)構(gòu)域是CH3結(jié)構(gòu)域，且所述第一CC在所述第一多肽的CH3結(jié)構(gòu)域C端連接，所述第二 CC在所述第二多肽的CH3結(jié)構(gòu)域C端連接。
27.權(quán)利要求25或26的抗體，其中通過可切割的接頭序列連接。
28.權(quán)利要求1-27中任一項的抗體，其中Lys-C內(nèi)肽酶切割位點(diǎn)定位在所述第一或所述第二 CC中至少一個的N端。
29.包含第一多肽的抗體，所述第一多肽包含相對于彼此以VL-CL-系鏈-VH-CH1-CH2-CH3 (式III)的N端至C端方向定位的VL、CL、系鏈、VH、CHU CH2和CH3結(jié)構(gòu)域。
30.權(quán)利要求29的抗體，其中所述抗體進(jìn)一步包含式III的第二多肽。
31.權(quán)利要求1-9或30中任一項的抗體，其中所述抗體是多特異性的。
32.權(quán)利要求31的抗體，其中所述抗體能夠結(jié)合至少2種抗原。
33.權(quán)利要求31的抗體，其中所述抗體能夠結(jié)合同一抗原上的至少2個表位。
34.權(quán)利要求1-9或30中任一項的抗體，其中所述抗體是雙特異性的。
35.權(quán)利要求7、10、18、29或30中任一項的抗體，其中所述系鏈包含甘氨酸(G)和絲氨酸⑶殘基。
36.權(quán)利要求7、10、18、29、30或35中任一項的抗體，其中所述系鏈長度在15至50個氨基酸之間。
37.權(quán)利要求36的抗體，其中所述系鏈長度在20至26個氨基酸之間。
38.權(quán)利要求7、10、18、29、30或35-37中任一項的抗體，其中所述系鏈包含GGS重復(fù)序列。
39.權(quán)利要求7、10、18、29、30或35-38中任一項的抗體，其中所述系鏈?zhǔn)强汕懈畹摹?br> 40.權(quán)利要求28-39中任一項的抗體，其中所述抗體包含去除Lys-C內(nèi)肽酶切割位點(diǎn)的突變。
41.權(quán)利要求40的抗體，其中所述去除Lys-C內(nèi)肽酶切割位點(diǎn)的突變在鉸合部結(jié)構(gòu)域中。
42.權(quán)利要求41的抗體，其中所述抗體具有K222A取代(EU編號系統(tǒng))。
43.權(quán)利要求27或39的抗體，其中所述系鏈或所述接頭可被以下內(nèi)肽酶中的一種或多種切割弗林蛋白酶、凝血酶、Genenase、Lys_C、Arg-C> Asp_N、Glu_C、因子Xa、煙草蝕紋病毒蛋白酶(TEV)、腸激酶、人鼻病毒C3蛋白酶(HRV C3)和激肽原酶。
44.權(quán)利要求27或39的抗體，其中所述系鏈或所述接頭包含天冬酰胺-甘氨酸肽鍵。
45.權(quán)利要求44的抗體，其中所述天冬酰胺-甘氨酸肽鍵可被羥胺切割。
46.權(quán)利要求1-45中任一項的抗體，其中所述抗體包含與細(xì)胞毒劑綴合的恒定區(qū)。
47.權(quán)利要求1-45中任一項的抗體，其中所述抗體由哺乳動物細(xì)胞表達(dá)。
48.權(quán)利要求47的抗體，其中所述哺乳動物細(xì)胞是CHO細(xì)胞。
49.權(quán)利要求1-45中任一項的抗體，其中所述抗體由原核細(xì)胞表達(dá)。
50.權(quán)利要求49的抗體，其中所述原核細(xì)胞是大腸桿菌細(xì)胞。
51.產(chǎn)生抗體的方法,所述方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)包含編碼權(quán)利要求1-45中任一項的抗體的載體的細(xì)胞的步驟。
52.權(quán)利要求51的方法，其中所述方法進(jìn)一步包括從所述細(xì)胞或所述培養(yǎng)基回收所述抗體。
53.權(quán)利要求52的方法，其進(jìn)一步包括以下步驟 (a)在包含A蛋白的柱上捕獲所述抗體， (b)從所述柱洗脫所述抗體，和 (C)將所述洗脫抗體稀釋在包含離液劑或溫和去垢劑的溶液中。
54.在溶液中保持包含卷曲螺旋的抗體的方法，所述方法包括在離液劑或溫和去垢劑的存在下保持所述抗體。
55.權(quán)利要求53或54的方法，其中所述離液劑或溫和去垢劑是精氨酸、鹽酸胍、尿素、高氯酸鋰、組氨酸、十二燒基硫酸鈉(SDS)、Tween、Triton或NP-40。
全文摘要
本發(fā)明提供用卷曲螺旋和/或系鏈構(gòu)建的改造蛋白質(zhì)復(fù)合體，及產(chǎn)生、使用和純化這類復(fù)合體(如多特異性抗體或其他多特異性含F(xiàn)c復(fù)合體)的方法。
文檔編號C12N5/10GK102712696SQ201080051673
公開日2012年10月3日 申請日期2010年9月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月16日
發(fā)明者A·C·文德爾, B·弗拉尼克, D·L·伊頓, E·H·克里斯騰森 申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司