蛋白質三聚體化模序及其應用的制作方法
專利名稱：蛋白質三聚體化模序及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種蛋白質三聚體化模序，本發(fā)明還涉及該蛋白質三聚體化模序在制 備或表達三聚體蛋白質中的應用，屬于三聚體蛋白質基因工程領域。
背景技術：
卷曲螺旋是一類由兩股或兩股以上右手α螺旋相互纏繞而形成的平行或反平行 的左手超螺旋結構的總稱。卷曲螺旋的特征是，螺旋每圈需要3. 5個氨基酸殘基，每兩圈 形成一個循環(huán)，因此形成多個七肽單元的重復序列或稱作七重復序列(abcdefg)!!。最常 見的天然卷曲螺旋一般由2-5個七重復序列組成(Vinson C，Myakishev Μ, Acharya A, et al. Classification of Human B-ZIP Proteins Based onDimerization Properties. Mol Cell Biol. 2002. 22(18) :6321_6335)。七重復序列各個位置的氨基酸在形成和維持卷曲螺旋結構中發(fā)揮不同的作 用。其中a位和d位通常由疏水性氨基酸占據，通常為亮氨酸(Leu)、纈氨酸(Val)或 異亮氨酸(He)。a、d位氨基酸構成卷曲螺旋的疏水核心，在維持卷曲螺旋方面起關鍵 作用，同時這些疏水性氨基酸側鏈的幾何結構對于形成二聚體、三聚體、四聚體或其他 寡聚體起決定性作用(Harbury PB, Zhang T, Kim PS, et al. A switchbetween two-, three-, and four-stranded coiled coils in GCN4 leucine zipper mutants. Science.1993.262(5138) 1401-1407. Harbury PB,Kim PS,Alber T. Crystal structureof an isoleucine-zipper trimer.Nature. 1994. 371 (6492) :80_83.Suzuki K, Hiroaki H, Kohda D, et al. An isoleucine zipper peptide forms a native-like triple strandedcoiled coil in solution. Protein Eng. 1998. 11(11) : 1051-1055·)。 除 了 a、d位以外，其他位置的氨基酸通常是極性氨基酸。其中，e、g位通常為帶電氨基酸，相 鄰e、g位形成螺旋間鹽橋(inter-helical salt bridge)，螺旋間鹽橋對于卷曲螺旋 的多聚化至關重要，常見氨基酸是谷氨酸(Glu)、精氨酸(Arg)和賴氨酸(Lys)，常見的 e-g 組合為 Glu-Arg、Glu-Lys、Arg-Glu> Lys-Glu (Vinson C, Myakishev Μ, AcharyaA, et al. Classification of Human B-ZIP Proteins Based on Dimerization Properties. Mol Cell Biol. 2002. 22(18) :6321-6335. Krylov D,Mikhailenko I，Vinson C. Athermodynamic scale for leucine zipper stability and dimerization specificity :e andg interhelical interactions. EMBO J. 1994. 13(12) :2849_2861.)。在異亮氨酸拉鏈(isoleucinezipper, IZ) IZm 的設計中，e-b-f 位以 Lys-Glu-Lys 的組合形成螺旋內鹽橋，這種鹽橋能夠提高卷曲螺旋的穩(wěn)定性。隨后對異亮氨酸拉鏈 GCN4-pl的晶體結構研究發(fā)現，其C末端的g、c位的Glu、Arg形成的鹽橋提高了模序的熱 穩(wěn)定性，而c-f-c位鹽橋的形成也能夠提高卷曲螺旋的穩(wěn)定性，因此，引入螺旋內鹽橋是蛋 白質寡聚化模序設計中的重要策略。利用天然卷曲螺旋的寡聚化特性，將其與目的蛋白融合表達，已經用于很多研究 中。最常見的應用方向是以天然卷曲螺旋結構替換或部分替代目的蛋白原有的寡聚化區(qū)
3域，從而改變蛋白質的聚合形式、親和性或穩(wěn)定性。另外，特殊卷曲螺旋與目的蛋白融合后， 可以模擬目的蛋白的天然構象，使蛋白質處于活性狀態(tài)，有利于蛋白質結構和功能的研究。 尤其對于那些體外重組表達后很難維持天然構象的蛋白，卷曲螺旋融合表達是解決方案之
ο目前應用最多的模式化三股卷曲螺旋結構是GCN4亮氨酸拉鏈(leucinezipper， LZ)和異亮氨酸拉鏈(isoleucine zipper, IZ)。GCN4是酵母細胞轉錄激活蛋白，其C末端序 列 GCN4-pl(MetLysGlnLeuGluAspLysValGluGluLeuLeuSerLysAsnTyrHisLeuGluAsnGluValA IaArgLeuLysLysLeuValGlyGluArg) (GenBankNPJ) 10907)為 α 螺旋結構，通常以二聚體卷 曲螺旋形式存在。由于七重復序列的a位均為亮氨酸，也稱為亮氨酸拉鏈(LZ) (Landschulz WH,Johnson PF,McKnightSL. The leucine zipper :a hypothetical structure common to a new class of DNAbinding proteins. Science.1988Jun 24 ；240 (4860) :1759_1764·)。 IZ是LZ的一個衍生物，將LZ的a位亮氨酸殘基替換為異亮氨酸殘基，并在d位引入疏水 性氨基酸。這些修飾使得GCN4LZ 二聚體轉變?yōu)榫哂腥刍瘍A向的GCN4IZ(MetLysGlnIl eGluAspLysIleGluGluIleLeuSerLys IleTvrHislleGluAsnGluIleAlaArgI IeLvsLvsLeu IleGlyGluVal) (Harbury PB, Zhang T, Kim PS, Alber T. A switchbetween two-, three-, and four-stranded coiled coils in GCN4 leucine zipper mutants. Science. 1993 Nov 26 ；262 (5138) :1401_1407)。這種修飾不僅改變了卷曲螺旋的聚合狀態(tài)，而且增加了卷曲 螺旋結構的穩(wěn)定性，為設計蛋白質三聚化模序提供了理論指導。2001 年，國際知識產權組織(World Intellectual Property Organization, WIPO)公開了一種利用GCN4IZ穩(wěn)定HIV-I三聚化包膜糖蛋白(envelope glycoprotein, Env)的方法(W0/2001/019958)，其構建方法是刪除Env的跨膜區(qū)、胞內區(qū)和胞外區(qū)C末端 七重復序列(CHR)，保留胞外區(qū)N末端七重復序列(NHR)，并在其羧基末端引入GCN4IZ序 列，作為Env蛋白的三聚化模序，融合后擴展了 Env NHR序列，從而穩(wěn)定三聚化Env蛋白的 結構。2002年，WIPO公開了一組以IZW7為代表的三聚化多肽(WCV2002/024735)，其構建 方法是向 HIV-IEnv NHR 的氨基末端引入 GCN4-pIQI 序列(ArgMetLysGlnGluAspLysGluGl uIleLeuSerLysGlnTyrHisGluAsnGluIleAlaArgAsp)或其衍生物，擴展 NHR 序列，穩(wěn)定三聚 化多肽。其中GCM-pIQI及其衍生物的序列源自GCN4IZ，但進行了點突變或刪除等修飾。 2005年，WIPO公開了另一種穩(wěn)定三聚化多肽的方法(W0/2005/118886)，其核心思想是在 (W0/2002/024735)所描述的多肽IZW7的基礎上，向其C末端引入分子間二硫鍵，通過共價 鍵作用維持三聚化多肽的穩(wěn)定性。上述三項專利申請均利用了 GCN4IZ的三聚化傾向從而穩(wěn)定三聚體蛋白或多肽， 但該模序具有一定的限制性。首先，GCN4蛋白天然以二聚體形式存在，經過a、d位修飾后 雖然具有三聚化傾向，但其形成二聚體或其他寡聚體的趨勢仍然保留，因此降低了產物中 三聚體的比例及產品的純度。更重要的是，在穩(wěn)定三聚體蛋白或多肽的研究中，三聚體的形 成及其穩(wěn)定性的維持必須依賴于Envgp41自身三聚化序列N36和C34的聚合作用，在此過 程中，GCN4主要是通過延長NHR序列起到促進聚合和穩(wěn)定蛋白的作用，并非三聚化過程始 動因素。因此，GCN4模序只能應用于含有自身三聚化模序的蛋白或多肽的研究，當試圖研 究不攜帶自身三聚化模序的目的蛋白時，該序列不是完全令人滿意的。2007年，WIPO公開了一種制備三聚體蛋白的方法(W0/2007/030803)，其構建策略
4是以一個或多個病毒的部分跨膜蛋白作為三聚化模序，并將其引入外源性目的蛋白的羧基 末端，利用模序的三聚化傾向引導外源蛋白形成三聚體。此專利中所涉及的三聚化模序均 來自病毒跨膜蛋白，具有較強的三聚化能力，但是同樣具有局限性。上述的三聚化模序均 屬于病毒抗原，某些病毒如流感病毒包膜血凝素(hemagglutinin，HA)抗原，在人群中具有 較高的抗體滴度，因此利用這種三聚化模序制備的三聚體融合蛋白不能直接作為免疫原使 用，只能用于蛋白質結構和功能的研究。
發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的技術問題是克服現有三聚體蛋白制備技術中所存在的三聚化 模序聚合能力弱、三聚體產物比例低、應用范圍窄等缺點，提供了一種高聚合力、可廣泛應 用的蛋白質三聚化模序，采用該蛋白質三聚化模序所制備的蛋白質產物中三聚體比例大，
純度高。本發(fā)明所要解決的技術問題是通過以下技術方案來實現的一種蛋白質三聚體化模序(MTI)，其氨基酸序列為SEQ ID NO 2所示；編碼SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的核苷酸序列、含有該核苷酸序列的原核或真 核表達載體以及含有原核或真核表達載體的宿主細胞也當然屬于本發(fā)明的保護范疇之列。 優(yōu)選的，編碼SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的核苷酸序列為SEQ ID NO :1所示。其中，SEQID NO :2 為Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ile-Lys-Glu-Glu-Ile-Ala-Lys-Ile-Lys-Glu-Glu-Ile-Ala-Lys-Ile-Lys-Glu-Lys-Ile-Ala-Glu-Ile-Glu-Lys-Arg-Ile-Ala-Glu-Ile-Glu-Lys-Arg-Ile-Ala-Gly-Gly-Cys-Cys本發(fā)明蛋白質三聚化模序MTI根據天然三聚體卷曲螺旋的序列特征而設計，序列 更加優(yōu)化。本發(fā)明在設計蛋白質三聚化模序的過程中，充分考慮了各個氨基酸形成寡聚體 的傾向，排除了那些可能具有二聚化、四聚化等寡聚能力的氨基酸，提高了產品三聚化成分純度。本發(fā)明三聚化模序MTI的氨基酸序列的核心是四個七重復序列=Glu-Ile-Ala-L ys-IIe-Lys-Glu-Glu-IIe-Ala-Lys-IIe-Lys-Glu-Lys-IIe-Ala-Glu-IIe-Glu-Lys-Arg-Il e-Ala-Glu-IIe-Glu-Lys ；上述七重復序列的七個氨基酸殘基依次用g-a-b-c-d-e-f表示， 本發(fā)明中，將異亮氨酸(Ile)引入a、d位，形成卷曲螺旋的疏水核心，該穩(wěn)定的核心對于三 聚體的形成有利；第1、2個七重復序列g-c-f位Glu-Lys-Glu組合的目的是為了形成螺旋 內鹽橋，提高三聚化模序的穩(wěn)定性。第4個七重復序列的g位精氨酸(Arg)在三聚體形成 中具有重要意義，因此選擇Arg占據該位置，提高模序的三聚化能力。在SEQ ID NO :2中的N末端、核心序列的第1個七重復序列g位之前的 Ile-Lys-Glu，以及在SEQ ID NO :2中的C末端、核心序列的第4個七重復序列f位之后 Arg-Ile-Ala為“保護性氨基酸”，其作用是使內部氨基酸形成七重復序列的卷曲螺旋結構。 其中，Ile-Lys-Glu上游的Gly-Gly-Ser-Gly-Gly序列是模序SEQ IDNO :2與目的蛋白之間 的連接序列(linker)，它的作用一方面保持三聚化模序SEQID NO :2與目的蛋白的結構相 對獨立，另一方面也可以作為N末端的“保護性氨基酸”，增加卷曲螺旋中螺旋的成分，使螺 旋結構更加穩(wěn)定。
本發(fā)明所要解決的另一個技術問題是將上述蛋白質三聚體化模序應用于制備蛋
白質三聚體。本發(fā)明所要解決的另一個技術問題是通過以下技術方案來實現的本發(fā)明蛋白質三聚體化模序MTI在制備蛋白質三聚體中的應用，包括(1)將本發(fā)明蛋白質三聚體化模序MTI的基因序列與目的蛋白基因相連接，得到 融合基因；二者的連接次序是蛋白質三聚體化模序的氨基末端與目的蛋白的羧基末端相 連接；(2)將步驟(1)所得到的融合基因克隆至原核或真核表達載體，構建得到融合蛋 白原核或真核表達載體；(3)將所構建的原核或真核表達載體在體內或體外表達融合蛋白，即得。本發(fā)明蛋白質三聚化模序(MTI)可廣泛用于天然構象為三聚體的蛋白質的結構 和功能研究?？捎糜隗w外表達天然以三聚體形式存在的蛋白質，進而用于篩選和三聚體形 式目的蛋白相互作用的配體分子。本發(fā)明蛋白質三聚化模序(MTI)可用于構建和表達天然以三聚體形式存在的病 毒表面抗原，產物可作為DNA免疫原，用于體內表達，構建候選基因疫苗；表達產物可作為 蛋白免疫原，構建候選亞單位疫苗，有潛在的遠期社會和經濟效益。本發(fā)明所涉及的蛋白質 三聚化模序MTI可用于天然以三聚體形式存在的病毒表面蛋白的表達，表達產物可用于診 斷試劑的開發(fā)并應用于病毒性疾病的診斷，將產生較大的經濟效益。
圖1是三聚化模序MTI引入目的蛋白羧基末端的模式圖；以及將三聚化模序MTI 引入目的蛋白的羧基末端而獲得的融合蛋白；圖2是將融合蛋白基因引入表達載體的模式圖；圖3是目的蛋白在293T細胞中瞬時表達及鑒定的結果圖。
具體實施例方式下面結合實施例對本發(fā)明作進一步說明，應該理解的是，這些實施例僅用于例證 的目的，決不限制本發(fā)明的保護范圍。本實施例中的蛋白質三聚化模序MTI氨基酸序列為
0032]Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ile-Lys-Glu-Glu-Ile-Ala-Lys-Ile-Lys-Glu-Glu-Ile-Ala-Lys-Ile-Lys-Glu-Lys-Ile-Ala-Glu-Ile-Glu-Lys-Arg-Ile-Ala-Glu-Ile-Glu-Lys-Arg-Ile-Ala-Gly-Gly-Cys-Cys(SEQ ID NO :2)。實施例1一、流感病毒血凝素蛋白(hemagglutinin，HA)HAl亞基與MTI的融合重組體 HAl-MTI的構建1、獲取HAl基因首先提取流感病毒A/Hong Kong/8/68 (美國ATCC)總RNA，以獲 得的總RNA為模板，進行RT反應產生cDNA ；再以cDNA為模板，利用引物HAlUP(TACAGGATC CGCCATGAAGACTATCATTGCT)和 HA1D0WN(TCTAGCTAGCAGTTTGTTTCTCTGGTACATTTCGC)PCR 擴增 HAl基因，反應條件為98°C 15s，60°C 10s，72°C 2min，共30個循環(huán)，DNA聚合酶為PrimeStarHS DNA Polymerase (日本 TaKaRa)。2、HA1-MTI融合重組體的構建將編碼MTI蛋白的基因(GGAGGTTCTGGAGGGATTA AAGAGGAGATTGCCAAAATCAAAGAAGAAATAGCTAAGATCAAAGAGAAGATAGCTGAGATTGAAAAGAGAATCG CAGAAATTGAAAAGAGAATTGCTGGCGGTTGTTGC) (SEQ ID NO :1)合成于載體 pcDNA3. 1 (+)(美 國Invitrogen)的多克隆位點EcoR I, Xho I之間獲得載體pcMTI，再將純化后的HAl基 因克隆至含有MTI基因的pcMTI載體上，其中，HAl基因C末端與MTI基因N末端相連，并 位于同一讀碼框內，獲得融合蛋白表達載體(HAl-MTI)；將純化后的HAl基因克隆至載體 pcDNA3. 1 (+)(美國Invotrogen)上獲得不含MTI基因的單純HAl表達載體(HAlwt)。二、融合蛋白的表達1、真核細胞轉染實驗將人胚腎293T細胞(美國ATCC)以5X IO5個/孔的密度 鋪于6孔板內，置于37°C、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。至細胞生長面積為孔板底面積的 85% -90%時，將4μ g重組蛋白表達載體HAl-MTI或HAlwt轉染至293T細胞內，所用的轉 染試劑為Lipofectamine 2000(美國Invitrogen)，轉染操作參考試劑說明書。2、表達產物的收獲轉染后72h，將293T細胞培養(yǎng)上清轉移至2. Oml離心管內， 3000 Xg離心5min，棄去細胞碎片，將離心上清分裝于0. 5ml離心管中，于_40°C保存。三、利用特異性抗體通過western blotting方法檢測產物中的HAl重組蛋白1、聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳向125μ 1收獲的細胞上清中加入 25 μ 16Xnon-reduced loading buffer(0. 35M Tris-HCl pH6. 8,30 % 甘油，10 % SDS, 0.012%溴酚藍)，充分混勻，1001煮沸21^11，418000\8，離心101^11，蛋白樣品加載至8% SDS-PAGE 凝膠中，160V 電泳 lh。2,ffestern blotting 電泳結束后，將蛋白質轉印至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉于 37°C封閉2h。封閉后的PVDF膜與兔抗HA單克隆抗體(1 1000，美國CST)于4°C過夜孵 育，再與辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔IgG于37°C孵育lh。加入過氧化物酶底物， 顯示蛋白條帶。試驗結果見圖3。用HAl表達載體(HAlwt)和融合蛋白表達載體(HAl-MTI)瞬時轉 染293T細胞后收獲培養(yǎng)上清液，用非還原PAGE檢測其中的目的蛋白。第一泳道是用HAlwt 轉染組檢測到的單體形式的目的蛋白；第二泳道是用HAl-MTI轉染組檢測到的目的蛋白天 然三聚化形式；第三泳道是陰性對照。從試驗結果可見，本發(fā)明所表達的融合蛋白產物三聚 體比例大，純度高。
權利要求
一種蛋白質三聚體化模序，其特征在于其氨基酸序列為SEQ ID NO2所示。
2.編碼權利要求1所述蛋白質三聚體化模序的核苷酸序列。
3.按照權利要求2所述的核苷酸序列，其特征在于其為SEQID N0:1所示。
4.含有權利要求2或3所述核苷酸序列的表達載體。
5.含有權利要求4所述表達載體的宿主細胞。
6.權利要求1所述的蛋白質三聚體化模序在制備或表達蛋白質三聚體中的應用。
7.權利要求2或3所述的核苷酸序列在制備或表達蛋白質三聚體中的應用。
8.按照權利要求7所述的應用，包括(1)將權利要求2或3所述的核苷酸序列與目的基因相連，得到融合基因；二者的連接 次序為蛋白質三聚體化模序的氨基末端與目的蛋白的羧基末端相連接；(2)將步驟(1)所得到的融合基因克隆至原核表達載體或真核表達載體，構建得到融 合蛋白原核表達載體或真核表達載體；(3)將所構建的原核或真核表達載體在體內或體外表達融合蛋白，即得。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種蛋白質三聚體化模序及其應用。該三聚體化模序的氨基酸序列為SEQ ID NO1所示。本發(fā)明蛋白質三聚化模序根據天然三聚體卷曲螺旋的序列特征而設計，序列更加優(yōu)化。在設計蛋白質三聚化模序的過程中，充分考慮了各個氨基酸形成寡聚體的傾向，排除了那些可能具有二聚化、四聚化等寡聚能力的氨基酸，提高了產品三聚化成分純度。本發(fā)明蛋白質三聚化模序可廣泛用于天然構象為三聚體的蛋白質的結構和功能研究，可用于體外表達天然以三聚體形式存在的蛋白質，進而用于篩選和三聚體形式目的蛋白相互作用的配體分子。本發(fā)明蛋白質三聚化模序可用于構建和表達天然以三聚體形式存在的病毒表面抗原，構建候選基因疫苗或亞單位疫苗。
文檔編號C07K14/005GK101928718SQ20101013311
公開日2010年12月29日 申請日期2010年3月12日 優(yōu)先權日2010年3月12日
發(fā)明者凌虹, 周海舟, 李妍, 王甲業(yè), 鐘國才 申請人:哈爾濱醫(yī)科大學
技術領域：
本發(fā)明涉及一種蛋白質三聚體化模序，本發(fā)明還涉及該蛋白質三聚體化模序在制 備或表達三聚體蛋白質中的應用，屬于三聚體蛋白質基因工程領域。
背景技術：
卷曲螺旋是一類由兩股或兩股以上右手α螺旋相互纏繞而形成的平行或反平行 的左手超螺旋結構的總稱。卷曲螺旋的特征是，螺旋每圈需要3. 5個氨基酸殘基，每兩圈 形成一個循環(huán)，因此形成多個七肽單元的重復序列或稱作七重復序列(abcdefg)!!。最常 見的天然卷曲螺旋一般由2-5個七重復序列組成(Vinson C，Myakishev Μ, Acharya A, et al. Classification of Human B-ZIP Proteins Based onDimerization Properties. Mol Cell Biol. 2002. 22(18) :6321_6335)。七重復序列各個位置的氨基酸在形成和維持卷曲螺旋結構中發(fā)揮不同的作 用。其中a位和d位通常由疏水性氨基酸占據，通常為亮氨酸(Leu)、纈氨酸(Val)或 異亮氨酸(He)。a、d位氨基酸構成卷曲螺旋的疏水核心，在維持卷曲螺旋方面起關鍵 作用，同時這些疏水性氨基酸側鏈的幾何結構對于形成二聚體、三聚體、四聚體或其他 寡聚體起決定性作用(Harbury PB, Zhang T, Kim PS, et al. A switchbetween two-, three-, and four-stranded coiled coils in GCN4 leucine zipper mutants. Science.1993.262(5138) 1401-1407. Harbury PB,Kim PS,Alber T. Crystal structureof an isoleucine-zipper trimer.Nature. 1994. 371 (6492) :80_83.Suzuki K, Hiroaki H, Kohda D, et al. An isoleucine zipper peptide forms a native-like triple strandedcoiled coil in solution. Protein Eng. 1998. 11(11) : 1051-1055·)。 除 了 a、d位以外，其他位置的氨基酸通常是極性氨基酸。其中，e、g位通常為帶電氨基酸，相 鄰e、g位形成螺旋間鹽橋(inter-helical salt bridge)，螺旋間鹽橋對于卷曲螺旋 的多聚化至關重要，常見氨基酸是谷氨酸(Glu)、精氨酸(Arg)和賴氨酸(Lys)，常見的 e-g 組合為 Glu-Arg、Glu-Lys、Arg-Glu> Lys-Glu (Vinson C, Myakishev Μ, AcharyaA, et al. Classification of Human B-ZIP Proteins Based on Dimerization Properties. Mol Cell Biol. 2002. 22(18) :6321-6335. Krylov D,Mikhailenko I，Vinson C. Athermodynamic scale for leucine zipper stability and dimerization specificity :e andg interhelical interactions. EMBO J. 1994. 13(12) :2849_2861.)。在異亮氨酸拉鏈(isoleucinezipper, IZ) IZm 的設計中，e-b-f 位以 Lys-Glu-Lys 的組合形成螺旋內鹽橋，這種鹽橋能夠提高卷曲螺旋的穩(wěn)定性。隨后對異亮氨酸拉鏈 GCN4-pl的晶體結構研究發(fā)現，其C末端的g、c位的Glu、Arg形成的鹽橋提高了模序的熱 穩(wěn)定性，而c-f-c位鹽橋的形成也能夠提高卷曲螺旋的穩(wěn)定性，因此，引入螺旋內鹽橋是蛋 白質寡聚化模序設計中的重要策略。利用天然卷曲螺旋的寡聚化特性，將其與目的蛋白融合表達，已經用于很多研究 中。最常見的應用方向是以天然卷曲螺旋結構替換或部分替代目的蛋白原有的寡聚化區(qū)
3域，從而改變蛋白質的聚合形式、親和性或穩(wěn)定性。另外，特殊卷曲螺旋與目的蛋白融合后， 可以模擬目的蛋白的天然構象，使蛋白質處于活性狀態(tài)，有利于蛋白質結構和功能的研究。 尤其對于那些體外重組表達后很難維持天然構象的蛋白，卷曲螺旋融合表達是解決方案之
ο目前應用最多的模式化三股卷曲螺旋結構是GCN4亮氨酸拉鏈(leucinezipper， LZ)和異亮氨酸拉鏈(isoleucine zipper, IZ)。GCN4是酵母細胞轉錄激活蛋白，其C末端序 列 GCN4-pl(MetLysGlnLeuGluAspLysValGluGluLeuLeuSerLysAsnTyrHisLeuGluAsnGluValA IaArgLeuLysLysLeuValGlyGluArg) (GenBankNPJ) 10907)為 α 螺旋結構，通常以二聚體卷 曲螺旋形式存在。由于七重復序列的a位均為亮氨酸，也稱為亮氨酸拉鏈(LZ) (Landschulz WH,Johnson PF,McKnightSL. The leucine zipper :a hypothetical structure common to a new class of DNAbinding proteins. Science.1988Jun 24 ；240 (4860) :1759_1764·)。 IZ是LZ的一個衍生物，將LZ的a位亮氨酸殘基替換為異亮氨酸殘基，并在d位引入疏水 性氨基酸。這些修飾使得GCN4LZ 二聚體轉變?yōu)榫哂腥刍瘍A向的GCN4IZ(MetLysGlnIl eGluAspLysIleGluGluIleLeuSerLys IleTvrHislleGluAsnGluIleAlaArgI IeLvsLvsLeu IleGlyGluVal) (Harbury PB, Zhang T, Kim PS, Alber T. A switchbetween two-, three-, and four-stranded coiled coils in GCN4 leucine zipper mutants. Science. 1993 Nov 26 ；262 (5138) :1401_1407)。這種修飾不僅改變了卷曲螺旋的聚合狀態(tài)，而且增加了卷曲 螺旋結構的穩(wěn)定性，為設計蛋白質三聚化模序提供了理論指導。2001 年，國際知識產權組織(World Intellectual Property Organization, WIPO)公開了一種利用GCN4IZ穩(wěn)定HIV-I三聚化包膜糖蛋白(envelope glycoprotein, Env)的方法(W0/2001/019958)，其構建方法是刪除Env的跨膜區(qū)、胞內區(qū)和胞外區(qū)C末端 七重復序列(CHR)，保留胞外區(qū)N末端七重復序列(NHR)，并在其羧基末端引入GCN4IZ序 列，作為Env蛋白的三聚化模序，融合后擴展了 Env NHR序列，從而穩(wěn)定三聚化Env蛋白的 結構。2002年，WIPO公開了一組以IZW7為代表的三聚化多肽(WCV2002/024735)，其構建 方法是向 HIV-IEnv NHR 的氨基末端引入 GCN4-pIQI 序列(ArgMetLysGlnGluAspLysGluGl uIleLeuSerLysGlnTyrHisGluAsnGluIleAlaArgAsp)或其衍生物，擴展 NHR 序列，穩(wěn)定三聚 化多肽。其中GCM-pIQI及其衍生物的序列源自GCN4IZ，但進行了點突變或刪除等修飾。 2005年，WIPO公開了另一種穩(wěn)定三聚化多肽的方法(W0/2005/118886)，其核心思想是在 (W0/2002/024735)所描述的多肽IZW7的基礎上，向其C末端引入分子間二硫鍵，通過共價 鍵作用維持三聚化多肽的穩(wěn)定性。上述三項專利申請均利用了 GCN4IZ的三聚化傾向從而穩(wěn)定三聚體蛋白或多肽， 但該模序具有一定的限制性。首先，GCN4蛋白天然以二聚體形式存在，經過a、d位修飾后 雖然具有三聚化傾向，但其形成二聚體或其他寡聚體的趨勢仍然保留，因此降低了產物中 三聚體的比例及產品的純度。更重要的是，在穩(wěn)定三聚體蛋白或多肽的研究中，三聚體的形 成及其穩(wěn)定性的維持必須依賴于Envgp41自身三聚化序列N36和C34的聚合作用，在此過 程中，GCN4主要是通過延長NHR序列起到促進聚合和穩(wěn)定蛋白的作用，并非三聚化過程始 動因素。因此，GCN4模序只能應用于含有自身三聚化模序的蛋白或多肽的研究，當試圖研 究不攜帶自身三聚化模序的目的蛋白時，該序列不是完全令人滿意的。2007年，WIPO公開了一種制備三聚體蛋白的方法(W0/2007/030803)，其構建策略
4是以一個或多個病毒的部分跨膜蛋白作為三聚化模序，并將其引入外源性目的蛋白的羧基 末端，利用模序的三聚化傾向引導外源蛋白形成三聚體。此專利中所涉及的三聚化模序均 來自病毒跨膜蛋白，具有較強的三聚化能力，但是同樣具有局限性。上述的三聚化模序均 屬于病毒抗原，某些病毒如流感病毒包膜血凝素(hemagglutinin，HA)抗原，在人群中具有 較高的抗體滴度，因此利用這種三聚化模序制備的三聚體融合蛋白不能直接作為免疫原使 用，只能用于蛋白質結構和功能的研究。
發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的技術問題是克服現有三聚體蛋白制備技術中所存在的三聚化 模序聚合能力弱、三聚體產物比例低、應用范圍窄等缺點，提供了一種高聚合力、可廣泛應 用的蛋白質三聚化模序，采用該蛋白質三聚化模序所制備的蛋白質產物中三聚體比例大，
純度高。本發(fā)明所要解決的技術問題是通過以下技術方案來實現的一種蛋白質三聚體化模序(MTI)，其氨基酸序列為SEQ ID NO 2所示；編碼SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的核苷酸序列、含有該核苷酸序列的原核或真 核表達載體以及含有原核或真核表達載體的宿主細胞也當然屬于本發(fā)明的保護范疇之列。 優(yōu)選的，編碼SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的核苷酸序列為SEQ ID NO :1所示。其中，SEQID NO :2 為Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ile-Lys-Glu-Glu-Ile-Ala-Lys-Ile-Lys-Glu-Glu-Ile-Ala-Lys-Ile-Lys-Glu-Lys-Ile-Ala-Glu-Ile-Glu-Lys-Arg-Ile-Ala-Glu-Ile-Glu-Lys-Arg-Ile-Ala-Gly-Gly-Cys-Cys本發(fā)明蛋白質三聚化模序MTI根據天然三聚體卷曲螺旋的序列特征而設計，序列 更加優(yōu)化。本發(fā)明在設計蛋白質三聚化模序的過程中，充分考慮了各個氨基酸形成寡聚體 的傾向，排除了那些可能具有二聚化、四聚化等寡聚能力的氨基酸，提高了產品三聚化成分純度。本發(fā)明三聚化模序MTI的氨基酸序列的核心是四個七重復序列=Glu-Ile-Ala-L ys-IIe-Lys-Glu-Glu-IIe-Ala-Lys-IIe-Lys-Glu-Lys-IIe-Ala-Glu-IIe-Glu-Lys-Arg-Il e-Ala-Glu-IIe-Glu-Lys ；上述七重復序列的七個氨基酸殘基依次用g-a-b-c-d-e-f表示， 本發(fā)明中，將異亮氨酸(Ile)引入a、d位，形成卷曲螺旋的疏水核心，該穩(wěn)定的核心對于三 聚體的形成有利；第1、2個七重復序列g-c-f位Glu-Lys-Glu組合的目的是為了形成螺旋 內鹽橋，提高三聚化模序的穩(wěn)定性。第4個七重復序列的g位精氨酸(Arg)在三聚體形成 中具有重要意義，因此選擇Arg占據該位置，提高模序的三聚化能力。在SEQ ID NO :2中的N末端、核心序列的第1個七重復序列g位之前的 Ile-Lys-Glu，以及在SEQ ID NO :2中的C末端、核心序列的第4個七重復序列f位之后 Arg-Ile-Ala為“保護性氨基酸”，其作用是使內部氨基酸形成七重復序列的卷曲螺旋結構。 其中，Ile-Lys-Glu上游的Gly-Gly-Ser-Gly-Gly序列是模序SEQ IDNO :2與目的蛋白之間 的連接序列(linker)，它的作用一方面保持三聚化模序SEQID NO :2與目的蛋白的結構相 對獨立，另一方面也可以作為N末端的“保護性氨基酸”，增加卷曲螺旋中螺旋的成分，使螺 旋結構更加穩(wěn)定。
本發(fā)明所要解決的另一個技術問題是將上述蛋白質三聚體化模序應用于制備蛋
白質三聚體。本發(fā)明所要解決的另一個技術問題是通過以下技術方案來實現的本發(fā)明蛋白質三聚體化模序MTI在制備蛋白質三聚體中的應用，包括(1)將本發(fā)明蛋白質三聚體化模序MTI的基因序列與目的蛋白基因相連接，得到 融合基因；二者的連接次序是蛋白質三聚體化模序的氨基末端與目的蛋白的羧基末端相 連接；(2)將步驟(1)所得到的融合基因克隆至原核或真核表達載體，構建得到融合蛋 白原核或真核表達載體；(3)將所構建的原核或真核表達載體在體內或體外表達融合蛋白，即得。本發(fā)明蛋白質三聚化模序(MTI)可廣泛用于天然構象為三聚體的蛋白質的結構 和功能研究?？捎糜隗w外表達天然以三聚體形式存在的蛋白質，進而用于篩選和三聚體形 式目的蛋白相互作用的配體分子。本發(fā)明蛋白質三聚化模序(MTI)可用于構建和表達天然以三聚體形式存在的病 毒表面抗原，產物可作為DNA免疫原，用于體內表達，構建候選基因疫苗；表達產物可作為 蛋白免疫原，構建候選亞單位疫苗，有潛在的遠期社會和經濟效益。本發(fā)明所涉及的蛋白質 三聚化模序MTI可用于天然以三聚體形式存在的病毒表面蛋白的表達，表達產物可用于診 斷試劑的開發(fā)并應用于病毒性疾病的診斷，將產生較大的經濟效益。
圖1是三聚化模序MTI引入目的蛋白羧基末端的模式圖；以及將三聚化模序MTI 引入目的蛋白的羧基末端而獲得的融合蛋白；圖2是將融合蛋白基因引入表達載體的模式圖；圖3是目的蛋白在293T細胞中瞬時表達及鑒定的結果圖。
具體實施例方式下面結合實施例對本發(fā)明作進一步說明，應該理解的是，這些實施例僅用于例證 的目的，決不限制本發(fā)明的保護范圍。本實施例中的蛋白質三聚化模序MTI氨基酸序列為
0032]Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ile-Lys-Glu-Glu-Ile-Ala-Lys-Ile-Lys-Glu-Glu-Ile-Ala-Lys-Ile-Lys-Glu-Lys-Ile-Ala-Glu-Ile-Glu-Lys-Arg-Ile-Ala-Glu-Ile-Glu-Lys-Arg-Ile-Ala-Gly-Gly-Cys-Cys(SEQ ID NO :2)。實施例1一、流感病毒血凝素蛋白(hemagglutinin，HA)HAl亞基與MTI的融合重組體 HAl-MTI的構建1、獲取HAl基因首先提取流感病毒A/Hong Kong/8/68 (美國ATCC)總RNA，以獲 得的總RNA為模板，進行RT反應產生cDNA ；再以cDNA為模板，利用引物HAlUP(TACAGGATC CGCCATGAAGACTATCATTGCT)和 HA1D0WN(TCTAGCTAGCAGTTTGTTTCTCTGGTACATTTCGC)PCR 擴增 HAl基因，反應條件為98°C 15s，60°C 10s，72°C 2min，共30個循環(huán)，DNA聚合酶為PrimeStarHS DNA Polymerase (日本 TaKaRa)。2、HA1-MTI融合重組體的構建將編碼MTI蛋白的基因(GGAGGTTCTGGAGGGATTA AAGAGGAGATTGCCAAAATCAAAGAAGAAATAGCTAAGATCAAAGAGAAGATAGCTGAGATTGAAAAGAGAATCG CAGAAATTGAAAAGAGAATTGCTGGCGGTTGTTGC) (SEQ ID NO :1)合成于載體 pcDNA3. 1 (+)(美 國Invitrogen)的多克隆位點EcoR I, Xho I之間獲得載體pcMTI，再將純化后的HAl基 因克隆至含有MTI基因的pcMTI載體上，其中，HAl基因C末端與MTI基因N末端相連，并 位于同一讀碼框內，獲得融合蛋白表達載體(HAl-MTI)；將純化后的HAl基因克隆至載體 pcDNA3. 1 (+)(美國Invotrogen)上獲得不含MTI基因的單純HAl表達載體(HAlwt)。二、融合蛋白的表達1、真核細胞轉染實驗將人胚腎293T細胞(美國ATCC)以5X IO5個/孔的密度 鋪于6孔板內，置于37°C、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。至細胞生長面積為孔板底面積的 85% -90%時，將4μ g重組蛋白表達載體HAl-MTI或HAlwt轉染至293T細胞內，所用的轉 染試劑為Lipofectamine 2000(美國Invitrogen)，轉染操作參考試劑說明書。2、表達產物的收獲轉染后72h，將293T細胞培養(yǎng)上清轉移至2. Oml離心管內， 3000 Xg離心5min，棄去細胞碎片，將離心上清分裝于0. 5ml離心管中，于_40°C保存。三、利用特異性抗體通過western blotting方法檢測產物中的HAl重組蛋白1、聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳向125μ 1收獲的細胞上清中加入 25 μ 16Xnon-reduced loading buffer(0. 35M Tris-HCl pH6. 8,30 % 甘油，10 % SDS, 0.012%溴酚藍)，充分混勻，1001煮沸21^11，418000\8，離心101^11，蛋白樣品加載至8% SDS-PAGE 凝膠中，160V 電泳 lh。2,ffestern blotting 電泳結束后，將蛋白質轉印至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉于 37°C封閉2h。封閉后的PVDF膜與兔抗HA單克隆抗體(1 1000，美國CST)于4°C過夜孵 育，再與辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔IgG于37°C孵育lh。加入過氧化物酶底物， 顯示蛋白條帶。試驗結果見圖3。用HAl表達載體(HAlwt)和融合蛋白表達載體(HAl-MTI)瞬時轉 染293T細胞后收獲培養(yǎng)上清液，用非還原PAGE檢測其中的目的蛋白。第一泳道是用HAlwt 轉染組檢測到的單體形式的目的蛋白；第二泳道是用HAl-MTI轉染組檢測到的目的蛋白天 然三聚化形式；第三泳道是陰性對照。從試驗結果可見，本發(fā)明所表達的融合蛋白產物三聚 體比例大，純度高。
權利要求
一種蛋白質三聚體化模序，其特征在于其氨基酸序列為SEQ ID NO2所示。
2.編碼權利要求1所述蛋白質三聚體化模序的核苷酸序列。
3.按照權利要求2所述的核苷酸序列，其特征在于其為SEQID N0:1所示。
4.含有權利要求2或3所述核苷酸序列的表達載體。
5.含有權利要求4所述表達載體的宿主細胞。
6.權利要求1所述的蛋白質三聚體化模序在制備或表達蛋白質三聚體中的應用。
7.權利要求2或3所述的核苷酸序列在制備或表達蛋白質三聚體中的應用。
8.按照權利要求7所述的應用，包括(1)將權利要求2或3所述的核苷酸序列與目的基因相連，得到融合基因；二者的連接 次序為蛋白質三聚體化模序的氨基末端與目的蛋白的羧基末端相連接；(2)將步驟(1)所得到的融合基因克隆至原核表達載體或真核表達載體，構建得到融 合蛋白原核表達載體或真核表達載體；(3)將所構建的原核或真核表達載體在體內或體外表達融合蛋白，即得。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種蛋白質三聚體化模序及其應用。該三聚體化模序的氨基酸序列為SEQ ID NO1所示。本發(fā)明蛋白質三聚化模序根據天然三聚體卷曲螺旋的序列特征而設計，序列更加優(yōu)化。在設計蛋白質三聚化模序的過程中，充分考慮了各個氨基酸形成寡聚體的傾向，排除了那些可能具有二聚化、四聚化等寡聚能力的氨基酸，提高了產品三聚化成分純度。本發(fā)明蛋白質三聚化模序可廣泛用于天然構象為三聚體的蛋白質的結構和功能研究，可用于體外表達天然以三聚體形式存在的蛋白質，進而用于篩選和三聚體形式目的蛋白相互作用的配體分子。本發(fā)明蛋白質三聚化模序可用于構建和表達天然以三聚體形式存在的病毒表面抗原，構建候選基因疫苗或亞單位疫苗。
文檔編號C07K14/005GK101928718SQ20101013311
公開日2010年12月29日 申請日期2010年3月12日 優(yōu)先權日2010年3月12日
發(fā)明者凌虹, 周海舟, 李妍, 王甲業(yè), 鐘國才 申請人:哈爾濱醫(yī)科大學
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0187139... 來自[中國] 2024年04月24日 14:36贊贊贊
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