專利名稱：利用廢菌體的β-葡聚糖酶和木聚糖酶的制造方法以及液體培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及同時(shí)高效生產(chǎn)β -葡聚糖酶和木聚糖酶的制造方法以及制造這兩種酶中使用的液體培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
近年來(lái)，為了有效利用纖維素資源，人們探索了有效分解纖維素的方法。人們已經(jīng)了解到自然界中纖維素主要是被微生物分解的，細(xì)菌和絲狀菌等各種各樣的微生物生產(chǎn)纖維素分解酶。這些微生物將纖維素分解酶分泌到菌體外，纖維素經(jīng)該酶作用后，主要經(jīng)纖維低聚糖(Cellooligosaccharides)、纖維二糖被分解為葡萄糖。纖維素分解酶一般稱為纖維素酶。人工制造纖維素酶時(shí)，作為分泌纖維素酶的微生物已知有木霉屬的微生物，并被廣泛利用。而且，也已經(jīng)知道利用含有碳源和氮源等營(yíng)養(yǎng)素的培養(yǎng)基培養(yǎng)屬于木霉屬的微生物，可使其分泌纖維素酶的方法。然而，以前用于制造纖維素酶的方法，作為碳源能夠使用的材料受到限制，高價(jià)的結(jié)晶纖維素，或者即使假如為價(jià)格便宜的纖維素資源，也要進(jìn)行加熱處理或堿處理等前處理，所以需要較高的成本。例如，專利文獻(xiàn)1報(bào)道了將廢紙于硫酸亞鐵溶液中蒸煮，可接種纖維素酶生產(chǎn)菌的纖維素酶生產(chǎn)用底物。另外，專利文獻(xiàn)2報(bào)道了將微粉碎的甘蔗渣于氫氧化鈉中蒸煮，然后再用次氯酸鹽溶液處理，作為可接種纖維素酶生產(chǎn)菌里氏木霉(Trichoderma reesei)的生產(chǎn)纖維素酶用底物的制造方法。另外，利用這些以往方法得到的纖維素酶主要含β -葡聚糖酶，而木聚糖酶活性低，對(duì)于像甘蔗渣和稻秸等那樣的含木聚糖的纖維素資源的分解能力差。因此，對(duì)于目的是有效利用天然存在的各種各樣的纖維素資源來(lái)說(shuō)效率低。專利文獻(xiàn)3報(bào)道了包括對(duì)屬于里氏木霉的變異株進(jìn)行液體培養(yǎng)，對(duì)得到的纖維素酶進(jìn)行提取的工序在內(nèi)的纖維素酶的制造方法。作為培養(yǎng)基的碳源，羅列了纖維素粉末、纖維二糖、濾紙、一般紙類、鋸末、麥糠、稻殼、甘蔗渣、大豆粕、咖啡粕等化學(xué)構(gòu)造和性質(zhì)不同的各種材料(第0011段落)。然而，其中培養(yǎng)操作實(shí)際使用的材料只是纖維二糖(實(shí)施例1)和微晶纖維素(實(shí)施例2、，而有關(guān)其他材料，即天然纖維素材料，沒(méi)有證實(shí)纖維素酶的生成。專利文獻(xiàn)4報(bào)道了使用除去了固體構(gòu)成成分以及進(jìn)行非揮發(fā)成分的濃縮，對(duì)濃縮物進(jìn)行高壓釜處理等予處理的黑麥稀乙醇蒸餾廢液，對(duì)屬于木霉屬的微生物進(jìn)行培養(yǎng)，制造木聚糖酶的方法。然而，由于本技術(shù)中作為碳源使用的黑麥獲得困難，還必須進(jìn)行復(fù)雜的前處理，因此需要高成本，另外，使用該方法反倒使β-葡聚糖酶的產(chǎn)量降低了。
3
另外，在通過(guò)培養(yǎng)微生物的醫(yī)藥品原料、營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充原料、健康需求的原料、嗜好性原料、食藥品的原料及其中間體等生產(chǎn)中，在提取目的成分后剩下的菌體、培養(yǎng)基等都作為廢品被處理掉了。然而，為了廢棄菌體、培養(yǎng)基，為了不給環(huán)境造成惡劣影響必須要進(jìn)行失活和分離等無(wú)害化處理，勢(shì)必需要?jiǎng)诹唾M(fèi)用。為了解決這樣的問(wèn)題，例如，專利文獻(xiàn)5報(bào)道了可將由ftOpionihcter屬或 I^eudomonas屬等發(fā)酵生產(chǎn)后的廢菌體作為蘑菇子實(shí)體栽培用培養(yǎng)基或培養(yǎng)基再利用。然而，利用廢菌體作為用于同時(shí)高效生產(chǎn)β-葡聚糖酶和木聚糖酶的培養(yǎng)基至今還沒(méi)有報(bào)道。以往技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)1 日本特開(kāi)2003-137901專利文獻(xiàn)2 日本特公平5-33984號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)3 日本特開(kāi)平9-163980號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)4 日本特開(kāi)平11-113568號(hào)公報(bào)
專利文獻(xiàn)5 日本特開(kāi)2003-47338

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的課題本發(fā)明正是要解決上述以往的問(wèn)題的發(fā)明，發(fā)明的目的就在于以低成本制造對(duì)含有木聚糖的纖維素資源具有優(yōu)良分解能力的纖維素酶。用于解決課題的手段本發(fā)明者等對(duì)同時(shí)高效生產(chǎn)葡聚糖酶和木聚糖酶，分解(糖化)纖維素資源的酶的制造方法以及該酶的制造進(jìn)行不斷的銳意研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過(guò)作為液體培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)源使用廢菌體，對(duì)屬于木霉屬的微生物進(jìn)行培養(yǎng)的可同時(shí)高效生產(chǎn)β -葡聚糖酶和木聚糖酶的制造方法以及對(duì)制造該酶有用的液體培養(yǎng)基。本發(fā)明提供一種β -葡聚糖酶和木聚糖酶的制造方法，包括使用含有廢菌體的液體培養(yǎng)基作為有機(jī)氮源，對(duì)屬于木霉屬的微生物進(jìn)行培養(yǎng)的工序。在某一實(shí)施方式中，所述廢菌體在所述液體培養(yǎng)基中的濃度為W/V以上。在某一實(shí)施方式中，所述廢菌體在所述液體培養(yǎng)基中的濃度為2 10% W/V。在某一實(shí)施方式中，所述廢菌體的原料是屬于木霉屬的微生物。在某一實(shí)施方式中，所述屬于木霉屬的微生物是里氏木霉。在某一實(shí)施方式中，所述液體培養(yǎng)基還含有作為碳源的天然纖維素材料以及作為氮源的氨態(tài)氮或氨基態(tài)氮。在某一實(shí)施方式中，所述天然纖維素材料在所述液體培養(yǎng)基中的濃度為2% W/V 以上。在某一實(shí)施方式中，所述天然纖維素材料為選自紙漿、啤酒粕、麥茶抽提粕、小麥麥糠和蘋果渣餅中的至少一種。在某一實(shí)施方式中，在培養(yǎng)的過(guò)程中對(duì)所述液體培養(yǎng)基追加廢菌體。另外本發(fā)明提供一種液體培養(yǎng)基，其含有廢菌體作為有機(jī)氮源，用于培養(yǎng)屬于木霉屬的微生物。在某一實(shí)施方式中，含有W/V以上的所述廢菌體。另外，本發(fā)明提供一種β -葡聚糖酶和木聚糖酶，其是任意前述方法制造的。另外，本發(fā)明提供一種纖維素資源的分解或糖化方法，其特征在于，使用所述的 β-葡聚糖酶和木聚糖酶。發(fā)明的效果本發(fā)明由于有效利用了廢菌體，使產(chǎn)業(yè)廢棄物減少，有益于環(huán)境問(wèn)題的解決。另夕卜，由于可同時(shí)高效生產(chǎn)作為纖維素分解酶的葡聚糖酶和木聚糖酶，對(duì)于甘蔗渣和稻秸等天然纖維素資源的糖化極其有用。特別是對(duì)由纖維素資源制造酒精的生物量乙醇制造有用。


圖1是表示在含有3%的復(fù)寫紙的液體培養(yǎng)基中的、相對(duì)于廢菌體濃度的培養(yǎng)上清液的酶活性變化的圖。圖2是表示在含有的結(jié)晶纖維素的液體培養(yǎng)基中的、相對(duì)于廢菌體濃度的培養(yǎng)上清液的酶活性變化的圖。圖3是表示在使用實(shí)施例1得到的1. 5%廢菌體的培養(yǎng)基以及參考例1得到的 1.5%廢菌體的培養(yǎng)基的各個(gè)上清液，對(duì)稻秸糖化時(shí)，對(duì)生成的葡萄糖濃度進(jìn)行比較的圖。圖4是表示在使用實(shí)施例1得到的1. 5%廢菌體的培養(yǎng)基以及參考例1得到的 1.5%廢菌體的培養(yǎng)基的各個(gè)上清液，對(duì)纖維素原料糖化時(shí)，對(duì)生成的葡萄糖濃度進(jìn)行比較的圖。圖5是表示在含3%啤酒粕的液體培養(yǎng)基中，使用0. 2%多價(jià)胨得到的酶活性，以及相對(duì)于廢菌體濃度的培養(yǎng)上清液的酶活性的變化的圖。圖6是表示在含5%麥茶抽提粕的液體培養(yǎng)基中，使用0. 2%多價(jià)胨得到的酶活性，以及相對(duì)于廢菌體濃度的培養(yǎng)上清液的酶活性的變化的圖。圖7是表示在含5%小麥麥糠的液體培養(yǎng)基中，相對(duì)于廢菌體濃度的培養(yǎng)上清液的酶活性的變化的圖。圖8是表示在含4%蘋果渣餅的液體培養(yǎng)基中，相對(duì)于廢菌體濃度的培養(yǎng)上清液的酶活性的變化的圖。圖9是表示在含3%復(fù)寫紙的液體培養(yǎng)基中，相對(duì)于玉米浸漬液(Corn Steep Liquor)濃度的培養(yǎng)上清液的酶活性的變化的圖。圖10是表示在含3%復(fù)寫紙的液體培養(yǎng)基中，相對(duì)于多價(jià)胨濃度的培養(yǎng)上清液的酶活性的變化的圖。
具體實(shí)施例方式液體培養(yǎng)基本發(fā)明的液體培養(yǎng)基是含有屬于木霉屬微生物成長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)的材料。這樣的液體培養(yǎng)基是將培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分溶解或懸浮于IOOml水的液體培養(yǎng)基(一般稱為Mandel培養(yǎng)基)為基礎(chǔ)調(diào)配的，含有作為介質(zhì)的水、作為有機(jī)氮源的廢菌體等；根據(jù)需要，含有作為碳源的天然纖維素材料等；根據(jù)需要，含有作為氮源的氨態(tài)氮或氨基態(tài)氮等。以下給出了本發(fā)明理想的培養(yǎng)基組成的一個(gè)例子。培養(yǎng)基組成(本發(fā)明)含有廢菌體lg、天然纖維素材料3 5g、(NH4) 2S04 :0. 14g、KH2PO4 :1. 5g、 CaCl2 · 2H20 :0. 03g、MgSO4 · 7H20 :0. 03g、吐溫 80 :0. 1ml、微量元素液(H3BO4 6mg、 (NH4)6Mo7O24 ·4Η20 26mg,FeCl3 ·6Η20 lOOmg、CuSO4 ·5Η20 40mg、MnCl2 ·4Η20 8mg、ZnSO4 ·7Η20 200mg液):0. 1ml、水:100ml (用磷酸或氫氧化鈉將PH調(diào)整為4. 8)另外，作為參考，以下給出了 Mandel培養(yǎng)基的培養(yǎng)基組成的典型例子。培養(yǎng)基組成(Mandel培養(yǎng)基)含有多價(jià)胨0. 2g、結(jié)晶纖維素(Fluka BioChemika生產(chǎn)、商品名微晶纖維素 PH101) :lg、(NH4)2SO4 :0. 14g、KH2PO4 :1. 5g、CaCl2 · 2H20 :0. 03g、MgSO4 · 7H20 :0. 03g、吐溫 80 :0. 1ml、微量元素液(H3BO4 6mg、(NH4)6Mo7O24 ·4Η20 26mg,FeCl3 ·6Η20 1 OOmgXuSO4 ·5Η20 40mg、MnCl2 · 4H20 8mg, ZnSO4 · 7H20 200mg 液):0. 1ml、水:100ml (用磷酸或氫氧化鈉將 PH 調(diào)整為4. 8)需要說(shuō)明的是，有時(shí)取代作為有機(jī)氮源的多價(jià)胨，而使用玉米浸漬液(corn steep liquor)。所謂廢菌體指的是使微生物增殖生產(chǎn)像酶那樣的物質(zhì)生產(chǎn)過(guò)程中，提取目的成分之后殘留的菌體和培養(yǎng)基等殘?jiān)蛘咂浼庸の?。作為廢菌體原料的微生物只要是確認(rèn)對(duì)人體是安全的種類，沒(méi)有特別限定。例如、屬于木霉屬(Trichoderma)、曲霉屬(Aspergillus)、頂孢霉屬(Acremonium)、分枝抱屬(Sporotrichum)> 青霉屬(Penicillium)、碟節(jié)菌屬 (Talaromyces)、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、Neocallimastix 屬、嗜熱真菌屬(Thermomyces 屬) 或梭菌屬(Clostridium)、鏈霉屬(Str印tomyces)的微生物對(duì)人體是安全的，可以用作本發(fā)明的液體培養(yǎng)基。其中優(yōu)選的微生物是屬于木霉屬的微生物。優(yōu)選的屬于木霉屬的微生物為里氏木霉或綠色木霉(Trichoderma viride)。特別優(yōu)選里氏木霉。廢菌體的制造方法，首先是將作為原料的微生物接種于適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中，在適當(dāng)?shù)臈l件下進(jìn)行培養(yǎng)，獲得培養(yǎng)液。培養(yǎng)中使用的培養(yǎng)基優(yōu)選Mandel培養(yǎng)基那樣的液體培養(yǎng)基。因?yàn)閺呐囵B(yǎng)液中容易分離菌體。在一優(yōu)選的實(shí)施方式中，用于制造廢菌體的培養(yǎng)與本說(shuō)明書中說(shuō)明的本發(fā)明方法使用的培養(yǎng)相同。然后，將培養(yǎng)后得到的培養(yǎng)液分離為上清液和菌體。分離方法可以使用通常的方法，例如，過(guò)濾法以及離心分離法等。培養(yǎng)液或上清液在分離工序前或后對(duì)微生物用高壓爸，例如，于121°C進(jìn)行15分鐘加熱滅菌殺死菌體。該微生物的加熱滅菌可以在添加到培養(yǎng)基前進(jìn)行，也可以在添加到培養(yǎng)基后通過(guò)對(duì)培養(yǎng)基加熱滅菌來(lái)進(jìn)行。加熱工序和分離工序可以進(jìn)行多次。由培養(yǎng)液分離的濕菌體殘?jiān)芍苯幼鳛閺U菌體使用。也可以使該濕菌體進(jìn)一步干燥，做成干燥菌體殘?jiān)笞鳛閺U菌體使用。干燥方法可以使用通常方法，例如，自然干燥法、 熱風(fēng)干燥法、減壓干燥法以及噴霧干燥法等。液體培養(yǎng)基中的廢菌體濃度優(yōu)選W/V以上。液體培養(yǎng)基中的廢菌體的濃度更優(yōu)選2 10% W/V、進(jìn)一步優(yōu)選2 8% W/V、3 6% W/V。當(dāng)廢菌體濃度達(dá)不到1 % W/V時(shí)，纖維素酶、特別是木聚糖酶的產(chǎn)量有時(shí)增大量不大。所謂天然纖維素材料指的是原樣保持天然存在的分子構(gòu)造的非水溶性纖維素。例如，紙、紙漿、啤酒粕、麥茶抽提粕、小麥麥糠、蘋果渣餅?zāi)菢拥墓麑?shí)渣餅等就屬于天然纖維素材料。反之，例如，像纖維二糖和微晶纖維素那樣的結(jié)晶纖維素是纖維素通過(guò)纖維素酶分解，以具有特定結(jié)構(gòu)的方式進(jìn)行精制得到的純化合物，不屬于這里所說(shuō)的天然纖維素材料。所謂紙漿指的是制造紙類的原料中使用的纖維。紙漿的種類優(yōu)選像化學(xué)紙漿和廢紙紙漿那樣纖維素純度高的紙漿。優(yōu)選的紙漿是來(lái)自于將紙類分解、切斷等之后得到的紙類的紙漿。作為優(yōu)選的紙類的具體例子，如高級(jí)紙、低級(jí)紙、復(fù)寫用紙、報(bào)紙以及瓦楞紙板紙等。紙類只要優(yōu)選的含有紙漿的都可以，可以是印刷過(guò)或用筆寫過(guò)的紙以及一般稱為廢紙的紙。例如，可以使用舊書、雜志以及用過(guò)的筆記本紙、活頁(yè)紙、信封、便箋、明信片、綿紙 (tissue paper)等。液體培養(yǎng)基中的紙漿濃度優(yōu)選2% W/V以上。如果紙漿濃度達(dá)不到2% W/V，則纖維素酶、特別是葡聚糖酶的產(chǎn)量有時(shí)增大量不大。液體培養(yǎng)基中的紙漿濃度優(yōu)選3% W/V以上、更優(yōu)選4% W/V以上、5% W/V以上、6% W/V以上、7% W/V以上。另外，為了容易進(jìn)行液體培養(yǎng)基的攪拌混合，紙類最好是用撕碎機(jī)(shredder)裁斷后使用。所謂啤酒粕指的是啤酒制造工序中的副產(chǎn)品，是使大麥發(fā)芽了的麥芽糖化后，將麥汁過(guò)濾除去后剩下的殘?jiān)?。?duì)大麥的種類、副原料的種類等沒(méi)有限制，另外本發(fā)明的啤酒粕也包括使麥芽的使用比率降低了的發(fā)泡酒等制造工序中的副產(chǎn)品殘?jiān)?。啤酒粕在啤酒制造工序中大量產(chǎn)生，容易獲得。而且由于啤酒粕是食品制造的副產(chǎn)物，都嚴(yán)格進(jìn)行原料階段的品質(zhì)檢查以及制造工序管理，所以衛(wèi)生品質(zhì)上非常安全。作為啤酒粕的種類，例如有生啤酒粕、脫水啤酒粕、干燥啤酒粕。液體培養(yǎng)基中的啤酒粕開(kāi)始濃度優(yōu)選2% W/V以上。如果啤酒粕濃度低于2% W/ V，纖維素酶、特別是β-葡聚糖酶的產(chǎn)量有時(shí)增大量不大。液體培養(yǎng)基中的啤酒粕濃度優(yōu)選3% W/V以上、更優(yōu)選4% W/V以上、5% W/V以上、6% W/V以上、7% W/V以上。所謂麥茶抽提粕指的是用水等抽提溶劑從焙煎了的麥粒抽提出水溶性成分后剩下的殘?jiān)?。麥茶抽提粕在麥茶的制造工程中大量產(chǎn)生，容易獲得。而且由于麥茶抽提粕是食品制造的副產(chǎn)物，都嚴(yán)格進(jìn)行原料階段的品質(zhì)檢查以及制造工序管理，所以衛(wèi)生品質(zhì)上非常安全。可作為麥茶抽提粕原料的麥子只要是適于制造麥茶的，其種類沒(méi)有特別限定。一般在麥茶的制造中都用大麥，例如，六條大麥、二條大麥、去殼大麥燕麥等。其中優(yōu)選六條大麥和二條大麥。也可以將它們混合后使用。麥茶抽提粕的制造方法，首先對(duì)大麥等的麥粒進(jìn)行焙煎。焙煎方法一般有熱風(fēng)焙煎、砂炒焙煎、遠(yuǎn)紅外焙煎等。焙煎時(shí)的溫度為100 700°C、優(yōu)選200 600°C，焙煎時(shí)間為1 60分鐘，優(yōu)選5 60分鐘。然后將焙煎了的麥粒浸漬于抽提溶劑中，優(yōu)選地加熱到80°C以上。抽提溶劑一般使用水。通過(guò)用熱水煮，麥粒中含有的水溶性成分被抽提到水中。在從麥粒抽提的水溶性成分中含有風(fēng)味成分和淀粉等。抽提時(shí)間沒(méi)有特別限定，優(yōu)選于20分鐘至1小時(shí)范圍內(nèi)進(jìn)行。
然后，分離抽提液作為麥茶，剩下的物質(zhì)為麥茶抽提粕。抽提液的分離可以用傾析、過(guò)濾、離心分離等通常的方法進(jìn)行。而麥茶抽提粕，根據(jù)需要可進(jìn)行洗凈、脫水、干燥等處理。液體培養(yǎng)基中的麥茶抽提粕的濃度優(yōu)選3% W/V以上。如果麥茶抽提粕的濃度達(dá)不到3% W/V，纖維素酶、特別是葡聚糖酶的產(chǎn)量有時(shí)增大量不大。液體培養(yǎng)基中的麥茶抽提粕的濃度更優(yōu)選4% W/V以上、更優(yōu)選5% W/V以上、6% W/V以上、7% W/V以上、8% W/V以上。所謂小麥麥糠指的是小麥的外皮和胚芽的混合物。而從小麥去除小麥麥糠(即外皮和胚芽)后細(xì)微化后的產(chǎn)物是小麥粉。小麥麥糠作為例如工業(yè)上獲得食用小麥粉的制造面粉工序的副產(chǎn)物而大量產(chǎn)生，很容易得到。而這樣的小麥麥糠由于是制造食品的副產(chǎn)物， 所以都嚴(yán)格進(jìn)行原料階段的品質(zhì)檢查以及制造工序管理，衛(wèi)生品質(zhì)上非常安全，優(yōu)選地用于本發(fā)明的方法中。用于制備小麥麥糠的小麥的種類沒(méi)有特別限定，如北進(jìn)(*々ν >，Hokushin), 福清(么< 々力、Fukusayaka)、農(nóng)林61號(hào)、南部小麥(f > 7·· 二 Λ年，Nanbukomugi)、北之香(今夕乂力才1J , Kitanokaori)、春富(‘、卟二夕力，haruyutaka)、春之戀(春忑戀)寸。一般小麥麥糠的粒子形狀為薄片狀。薄片狀的小麥麥糠可原樣使用。也可以將它們適當(dāng)粉碎，使粒子細(xì)化后使用，還可以造粒使其形成粒子的塊狀后使用。小麥麥糠的形態(tài)，可以是例如、大的麥糠、小的麥糠、粉末等。也可以使用作為食品原料以及健康食品等市場(chǎng)上銷售的產(chǎn)品。液體培養(yǎng)基中的小麥麥糠濃度優(yōu)選為3% W/V以上。如果小麥麥糠的濃度低于3% W/V，纖維素酶、特別是β-葡聚糖酶的產(chǎn)量有時(shí)增大量不大。液體培養(yǎng)基中的小麥麥糠濃度更優(yōu)選4% W/V以上，更優(yōu)選在5% W/V以上、6% W/V以上、7% W/V以上、8% W/V以上。所謂果實(shí)渣餅指的是在果汁等的制造工序中的副產(chǎn)品，將果實(shí)壓榨后，濾去果汁后剩下的殘?jiān)?。果?shí)渣餅在果汁等的制造工序中大量產(chǎn)生，容易獲得。而且由于果實(shí)渣餅是食品制造的副產(chǎn)物，所以都嚴(yán)格進(jìn)行原料階段的品質(zhì)檢查以及制造工序管理，衛(wèi)生品質(zhì)上非常安全。果實(shí)渣餅優(yōu)選蘋果、梨、桃、櫻桃、草莓等那樣的薔薇科果實(shí)的渣餅。優(yōu)選蘋果渣餅，因?yàn)槟軌蚋咝a(chǎn)所期望的酶。蘋果的品種只要迄今為止用于制造蘋果果汁的蘋果就可以，例如、“富士”、“律輕 (。力、'3 ) ”、“王林”、“紅金蘋果(夕 3 f) ”、“紅星蘋果(Starking delicious) ”、 “陸奧”等。蘋果的果實(shí)無(wú)論是完全成熟的，還是未完全成熟的都可以。果實(shí)渣餅的制造方法，首先將果實(shí)洗凈。此時(shí)如果有不適合作原料的果就去除掉。 將洗凈的果實(shí)送入破碎機(jī)，進(jìn)行破碎。破碎的果實(shí)通過(guò)泵等輸送到油壓搾汁機(jī)，進(jìn)行搾汁。 然后從搾汁機(jī)回收渣餅。果實(shí)渣餅根據(jù)需要還可進(jìn)行洗凈、脫水、干燥等處理。液體培養(yǎng)基中果實(shí)渣餅的濃度優(yōu)選2% W/V以上。果實(shí)渣餅的濃度如果低于2% W/V，纖維素酶、特別是β-葡聚糖酶的產(chǎn)量有時(shí)增大量不大。液體培養(yǎng)基中果實(shí)渣餅的濃度更優(yōu)選3% W/V以上、更優(yōu)選3% W/V以上、4% W/V以上、5% W/V以上、6% W/V以上。液體培養(yǎng)基中天然纖維素材料的濃度越高越好。即，其上限為可以對(duì)液體培養(yǎng)基進(jìn)行攪拌混合的限度的量。因?yàn)槿绻后w培養(yǎng)基不能攪拌，微生物就不能均一地混合在液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)就不能正常進(jìn)行。液體培養(yǎng)基中紙漿濃度的上限根據(jù)攪拌設(shè)備的性能，可以為 20、15、10 或 8% ff/V0天然纖維素材料中，除紙、紙漿以外的材料，例如、啤酒粕、麥茶抽提粕、小麥麥糠和果實(shí)的渣餅等優(yōu)選地在導(dǎo)入液體培養(yǎng)基時(shí)進(jìn)行前處理。優(yōu)選的前處理為，例如粉碎處理和脫木質(zhì)素處理。如從這些天然纖維素材料除去木質(zhì)素，則堅(jiān)固的細(xì)胞壁被破壞，使得纖維素容易利用，酶的生產(chǎn)也變得容易。另外通過(guò)對(duì)天然纖維素進(jìn)行粉碎處理，可以更有效地進(jìn)行脫木質(zhì)素處理。脫木質(zhì)素處理的方法雖然沒(méi)有特別限定，例如可舉出以下方法在像氫氧化鈉那樣的強(qiáng)堿性物質(zhì)存在下，或者在像硫酸或磷酸那樣的強(qiáng)酸性物質(zhì)存在下，高溫加熱，使其分解的方法；通過(guò)微生物使其分解的方法；在高溫 高壓下通過(guò)水熱處理使其分解的方法。如果考慮到對(duì)處理設(shè)備和環(huán)境的負(fù)荷，優(yōu)選高溫·高壓下通過(guò)水熱處理使其分解的方法。另外，還可以進(jìn)一步進(jìn)行加熱殺菌等對(duì)液體培養(yǎng)基的原料通常進(jìn)行的前處理。所謂氨態(tài)氮指的是氨或由氨衍生的銨鹽中含有的氮。而所謂的氨基態(tài)氮指的是胺或由胺衍生的氨基化合物中含有的氮。含有氨態(tài)氮或氨基態(tài)氮的化合物，例如為硫酸銨、硝酸銨、磷酸氫二銨、氯化銨、氨水、尿素、氨基酸及其鹽(例如，亮氨酸、谷氨酸鈉)。其中，作為氮源適用于本發(fā)明的液體培養(yǎng)基的特別優(yōu)選的化合物是硫酸銨。其理由是價(jià)格低，而且很容易得到。液體培養(yǎng)基中氨態(tài)氮或氨基態(tài)氮的濃度，以銨的摩爾數(shù)表示，為30 660mM。優(yōu)選 40 580mM。如果濃度低于30mM，纖維素酶、特別是β -葡聚糖酶的產(chǎn)量有時(shí)增大量不大。 另外，該濃度如果超過(guò)660mM，酶的生產(chǎn)率將降低。另外，液體培養(yǎng)基中氨態(tài)氮或氨基態(tài)氮的濃度優(yōu)選地根據(jù)液體培養(yǎng)基中天然纖維素材料濃度進(jìn)行增減，例如，天然纖維素材料濃度為4% W/V時(shí)，如果考慮到成本等因素，優(yōu)選50mM。g -葡聚糖酶和木聚糖酶的制造方法人們已經(jīng)了解木霉屬絲狀菌是纖維素糖化所需要的纖維素酶的生產(chǎn)菌。本發(fā)明中使用的屬于木霉屬的微生物只要是能生產(chǎn)纖維素酶，沒(méi)有特別限定。屬于木霉屬的微生物優(yōu)選里氏木霉或綠色木霉。特別優(yōu)選里氏木霉。絲狀菌里氏木霉和綠色木霉的菌學(xué)性質(zhì)例如在E. G. Simmons, Abst. 2nd International Mycological Congress (美國(guó)福羅里達(dá)州 Tampa，1077 年 8 月)618 頁(yè)中有報(bào)道。液體培養(yǎng)使用通常的通氣攪拌培養(yǎng)設(shè)備，使用上述本發(fā)明的液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為20 33°C，優(yōu)選為觀 30°C，培養(yǎng)pH為4 6，培養(yǎng)4 10天。從培養(yǎng)最初就使用上述液體培養(yǎng)基的情況下，液體培養(yǎng)基中含有的成分(例如、碳源和氮源)的濃度相當(dāng)于本發(fā)明的培養(yǎng)方法中上述成分的初期濃度。在培養(yǎng)過(guò)程中也可以向液體培養(yǎng)基中追加廢菌體。由于隨著培養(yǎng)進(jìn)行，培養(yǎng)基中的廢菌體被分解，有時(shí)通過(guò)補(bǔ)充廢菌體可以提高纖維素酶的產(chǎn)率。在追加廢菌體的情況下，在培養(yǎng)過(guò)程中也可以根據(jù)需要適當(dāng)追加天然纖維素材料、氨態(tài)氮或氨基態(tài)氮。然后通過(guò)離心分離、過(guò)濾等眾所周知的方法從該培養(yǎng)液中除去菌體，可得到木霉屬絲狀菌培養(yǎng)上清液。在木霉屬絲狀菌培養(yǎng)液或培養(yǎng)上清液中含有高濃度的目的的纖維素酶，即β-葡聚糖酶和木聚糖酶。得到的培養(yǎng)液或培養(yǎng)上清液的β -葡聚糖酶活性在30U/ml以上，優(yōu)選在50U/ml 以上，更優(yōu)選在60U/ml以上，更優(yōu)選在70U/ml以上。而該培養(yǎng)液或培養(yǎng)上清液的木聚糖酶活性在25U/ml以上，優(yōu)選在30U/ml以上，更優(yōu)選在40U/ml以上，更優(yōu)選在50U/ml以上。培養(yǎng)液或培養(yǎng)上清液的葡聚糖酶活性、木聚糖酶活性中的任一個(gè)如果低于上述下限，對(duì)于目的是有效利用天然存在的各種各樣纖維素資源的效果就要降低。另外，上述半纖維素酶活性可以通過(guò)以來(lái)自“oat spelts”的木聚糖為底物的酶加水分解后生成的還原糖與DNS反應(yīng)，以540nm的吸光度的增加量進(jìn)行定量。更具體來(lái)說(shuō)，向1. 9ml 木聚糖底物溶液中(將Sigma公司生產(chǎn)的“Xylan，from oat spelts”溶解在200mM醋酸緩沖液(pH4. 5)中)加入0. Iml培養(yǎng)液或培養(yǎng)上清液，然后于40°C下準(zhǔn)確進(jìn)行10分鐘酶反應(yīng)后，加^ilDNS試劑(含有0. 75%二硝基水楊酸、1. 2%氫氧化鈉、22. 5%酒石酸鈉鉀4水和物、0. 3%乳糖1水和物)，進(jìn)行充分混合，停止反應(yīng)。為了對(duì)反應(yīng)停止液中含有的還原糖量進(jìn)行定量，將反應(yīng)停止液于沸騰水浴中準(zhǔn)確加熱15分鐘。 然后冷卻到室溫后，通過(guò)測(cè)定540nm的吸光度以相當(dāng)于木糖的還原糖量進(jìn)行定量。1單位的半纖維素酶活性以于40°C下反應(yīng)10分鐘的條件下，1分鐘生成相當(dāng)于1 μ mol木糖的還原糖的酶量表示。本發(fā)明中所謂的“對(duì)屬于木霉屬的微生物進(jìn)行培養(yǎng)”指的是像技術(shù)常識(shí)那樣對(duì)該微生物進(jìn)行培養(yǎng)的操作。即，在以制造葡聚糖酶和木聚糖酶為目的，進(jìn)行液體培養(yǎng)的方法中，只要至少存在在上述本發(fā)明的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)屬于木霉屬的微生物的過(guò)程，該培養(yǎng)方法屬于本發(fā)明的方法。一旦進(jìn)行培養(yǎng)，液體培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)由于屬于木霉屬的微生物的消費(fèi)而減少。因此， 在培養(yǎng)末期，培養(yǎng)基中的碳源和氮源(包括有機(jī)氮源)的濃度低于規(guī)定的濃度，結(jié)果可能在不屬于本發(fā)明液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)基中培養(yǎng)屬于木霉屬的微生物。即便在這樣場(chǎng)合，例如在開(kāi)始培養(yǎng)時(shí)刻，使用的液體培養(yǎng)基屬于含有規(guī)定濃度的碳源、氮源的本發(fā)明的液體培養(yǎng)基時(shí)，至少在培養(yǎng)初期是在本發(fā)明的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)屬于木霉屬的微生物，所以該培養(yǎng)方法當(dāng)然屬于本發(fā)明方法。另外，在這樣特別是從培養(yǎng)開(kāi)始時(shí)刻起就大量含有碳源的情況下，如上所述，考慮到對(duì)液體培養(yǎng)基進(jìn)行攪拌混合時(shí)的方便性，優(yōu)選地將碳源、氮源濃度的上限限制在某一程度。相反，即使在培養(yǎng)初期，培養(yǎng)基中的碳源或氮源濃度比規(guī)定濃度低，使用不屬于本發(fā)明的液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，只要例如，在培養(yǎng)開(kāi)始后再追加，使培養(yǎng)基中的碳源或氮源濃度達(dá)到規(guī)定濃度以上時(shí)，由于之后在本發(fā)明的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)了屬于木霉屬的微生物，所以該培養(yǎng)方法也屬于本發(fā)明方法。纖維素原料的分解或糖化方法通過(guò)本發(fā)明的方法得到的β -葡聚糖酶和木聚糖酶可用于對(duì)纖維素原料進(jìn)行分解或糖化。這里所說(shuō)的纖維素原料可為合成纖維素或天然纖維素資源。所謂合成纖維素表示作為纖維素粉末已經(jīng)流通的材料。所謂天然纖維素資源可舉出甘蔗渣、稻秸、麥秸、啤酒粕、木材等。本發(fā)明由于可以同時(shí)高效生產(chǎn)葡聚糖酶和木聚糖酶，所以特別適于對(duì)甘蔗渣、稻秸、麥秸、啤酒粕等天然纖維素資源的糖化。
纖維素資源的分解或糖化方法只要是使用眾所周知的方法就可以，沒(méi)有特別限制，舉一例子，使作為底物的纖維素原料懸浮于水性介質(zhì)中，添加上述培養(yǎng)液或培養(yǎng)上清液，一邊攪拌或震蕩，一邊加溫進(jìn)行糖化反應(yīng)的方法。代替顯示纖維素分解活性的上述培養(yǎng)液或培養(yǎng)上清液，也可以使用其干燥物、或使干燥物分散或溶解于水后的液體。纖維素原料最好預(yù)先進(jìn)行脫木質(zhì)素。懸濁方法、攪拌方法、上述混合液的添加方法、添加順序、它們的濃度等反應(yīng)條件可以按照能夠以更高收率獲得葡萄糖那樣進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。此時(shí)的反應(yīng)液的pH和溫度只要是處于不使酶失活的范圍內(nèi)就可以，一般來(lái)說(shuō)，在常壓下進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，溫度可設(shè)定在30 70°C、pH為3 7的范圍。另外，該壓力、溫度、pH 也可以像上述那樣，按照能夠以更高收率獲得葡萄糖那樣進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，然而常壓下，在醋酸或磷酸緩沖液中，優(yōu)選在溫度50 60°C、pH4 6的范圍下進(jìn)行。反應(yīng)時(shí)間一般為6 147小時(shí)、優(yōu)選24 72小時(shí)。通過(guò)纖維素的糖化，可以得到含有葡萄糖的水溶液。得到的水溶液可以根據(jù)需要， 實(shí)施脫色、脫鹽、除酶等精制處理。精制方法只要是眾所周知的方法沒(méi)有特別的限制，例如， 可以使用活性碳處理、離子交換樹(shù)脂處理、色譜分析處理、精密過(guò)濾、超濾、反滲透過(guò)濾等過(guò)濾處理、晶析處理等，可以單獨(dú)使用這些處理方法，也可以使用2種以上處理方式組合。通過(guò)上述方法精制了的葡萄糖為主要成分的水溶液可以直接使用，也可以根據(jù)需要，通過(guò)干燥使其固化。干燥方法只要是眾所周知的方法，沒(méi)有特別限制，例如，可以使用噴霧干燥、冷凍干燥、鼓式干燥、薄膜干燥、板式干燥、氣流干燥、真空干燥等，可以單獨(dú)使用這些方法，也可以使用2種以上處理方式組合。實(shí)施例以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更具體說(shuō)明，但本發(fā)明并不限定于這些實(shí)施例。實(shí)施例1將里氏木霉QM9414接種在Mandel培養(yǎng)基中，在與本實(shí)施例中說(shuō)明的同樣條件進(jìn)行培養(yǎng)，得到培養(yǎng)液。將得到的培養(yǎng)液經(jīng)離心分離機(jī)(BECMAN COULTER公司生產(chǎn)“Avanti HP-25”)分離，進(jìn)行集菌。使該菌體殘?jiān)诩s60°C下干燥約M小時(shí)，獲得廢菌體。將里氏木霉QM9414(NBRC 31329)于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上在下培養(yǎng)7 天，使孢子充分形成。然后在帶擋板的500mL容量三角燒瓶中像下述那樣準(zhǔn)備IOOmM的液體培養(yǎng)基將作為Mandel培養(yǎng)基碳源的結(jié)晶纖維素置換為復(fù)寫紙3% (3g/100ml)，另外添加作為無(wú)機(jī)氮源的硫酸銨，而將作為有機(jī)氮源的多價(jià)胨換成上述廢菌體，廢菌體濃度按照分別達(dá)到0. 5%、1. 0%、1. 5%、2. 0%、3. 0%的方式添加，再用磷酸或氫氧化鈉將pH調(diào)整到4. 8。接下來(lái)液體培養(yǎng)基用高壓釜在121°C下進(jìn)行15分鐘的加熱滅菌。然后將1白金圏的培養(yǎng)了的里氏木霉接種于該液體培養(yǎng)基，于、ISOrpm下震蕩培養(yǎng)7天。在第7天，對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行離心分離，測(cè)定上清液的β -葡聚糖酶活性和木聚糖酶活性。(酶活性的測(cè)定) 對(duì)上述得到的培養(yǎng)液進(jìn)行酶活性測(cè)定。 β -葡聚糖酶活性，使用Mega-Zyme公司生產(chǎn)的β -葡聚糖酶測(cè)定試劑盒，通過(guò)對(duì)以色素標(biāo)記了的葡聚糖為底物進(jìn)行酶分解生成的染色片段進(jìn)行吸光度測(cè)定。具體來(lái)說(shuō)，向0. ImL偶氮大麥葡聚糖底物溶液中加入0. ImL培養(yǎng)液，于40°C下準(zhǔn)確進(jìn)行10分鐘酶
11反應(yīng)后，加0. 6mL停止液(含有4 %醋酸鈉、0. 4 %醋酸鋅、80 %甲氧基乙醇(pH5)〕，放置5 分鐘，停止反應(yīng)。然后離心分離后，測(cè)定上清液590nm的吸光度。1單位的β-葡聚糖酶活性以在40°C、反應(yīng)10分鐘條件下，以1分鐘內(nèi)生成相當(dāng)于1 μ mol葡萄糖的還原糖的酶量表示。
而木聚糖酶活性，通過(guò)以來(lái)自“oat spelts”的木聚糖作為底物的酶加水分解生成的還原糖與DNS反應(yīng)，通過(guò)MOnm吸光度的增加值進(jìn)行定量。更具體來(lái)說(shuō)，向1. 9ml的
木聚糖底物溶液[將Sigma公司生產(chǎn)的“Xylan，from oat spelts”溶解于200mM醋酸緩沖液(PH4. 5)]中加入0. ImL培養(yǎng)液，于40°C下準(zhǔn)確進(jìn)行10分鐘酶反應(yīng)后，加入4mLDNS試劑 (含有0. 75%二硝基水楊酸、1. 2%氫氧化鈉、22. 5%酒石酸鈉鉀4水和物、0. 3%乳糖1水和物)充分混合，使反應(yīng)停止。為了對(duì)反應(yīng)停止液中含有的還原糖量進(jìn)行定量，將反應(yīng)停止液于沸騰水浴中準(zhǔn)確加熱15分鐘。然后冷卻至室溫后，通過(guò)測(cè)定540nm的吸光度，以相當(dāng)于木糖的還原糖量進(jìn)行定量。1單位的木聚糖酶活性以于40°C、10分鐘的反應(yīng)條件下，1分鐘生成相當(dāng)于Iymol木糖的還原糖的酶量表示。結(jié)果如圖1所示。參考例1將Mandel培養(yǎng)基的作為碳源的結(jié)晶纖維素(Fluka BioChemika生產(chǎn)、商品名微晶纖維素PH101)的濃度調(diào)整為1%，而將作為有機(jī)氮源的多價(jià)胨換成像實(shí)施例1那樣得到的廢菌體，分別按照濃度達(dá)到0. 5%、1. 0%、1. 5%、2. 0%、3. 0%的方式進(jìn)行添加，像實(shí)施例 1那樣準(zhǔn)備液體培養(yǎng)基。將里氏木霉QM9414(NBRC 31329)在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上于下，培養(yǎng)7天，使孢子充分形成，將1白金圏的該孢子接種于液體培養(yǎng)基，于^°C、 ISOrpm下，震蕩培養(yǎng)7天。在第7天，對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行離心分離，像實(shí)施例1那樣測(cè)定β-葡聚糖酶活性和木聚糖酶活性。結(jié)果如圖2所示。實(shí)施例2使用實(shí)施例1中得到的培養(yǎng)上清液(3%復(fù)寫紙、1. 5%的廢菌體)以及參考例1中得到的培養(yǎng)上清液(1%微結(jié)晶纖維素培養(yǎng)基、1. 5%的廢菌體)，進(jìn)行纖維素原料的糖化試驗(yàn)。作為供糖化用的纖維素原料，準(zhǔn)備稻秸和日本造紙化學(xué)公司生產(chǎn)的纖維素“KC-FL0CK”。 稻秸用以下方法進(jìn)行脫木質(zhì)素處理。對(duì)稻秸進(jìn)行微粉碎，然后懸浮于0. 3Ν的NaOH中，于120°C下處理15分鐘，用水充分洗凈后，進(jìn)行干燥。纖維素原料的糖化，將由纖維素原料0. Sg、培養(yǎng)上清液9. 0ml、lM醋酸緩沖液(PH4. 8) :0. 2ml構(gòu)成的溶液(纖維素原料8%溶液)于50°C、pH4. 8下震蕩48小時(shí)，進(jìn)行糖化，對(duì)生成的葡萄糖用葡萄糖Cl-Test Wako (和光純藥工業(yè))進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果如圖3和圖4所示。實(shí)施例3從啤酒的制造過(guò)程中收集啤酒粕，于0. 3N氫氧化鈉水溶液中在121°C下通過(guò)15分鐘的高壓釜處理除去木質(zhì)素，充分水洗后，使其干燥。將里氏木霉QM9414(NBRC 31329)于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上在下培養(yǎng)7 天，使孢子充分形成。然后在帶擋板的500mL容量三角燒瓶中像下述那樣準(zhǔn)備IOOmM的液體培養(yǎng)基將作為Mandel培養(yǎng)基碳源的結(jié)晶纖維素置換為上述脫木質(zhì)素處理后的啤酒粕 3% (3g/100ml)，另外添加作為無(wú)機(jī)氮源的硫酸銨，而將有機(jī)氮源換成0.2%多價(jià)胨，或者與實(shí)施例ι同樣地得到的廢菌體，按照廢菌體濃度分別達(dá)到o.s^u.o^d.o^d.o^那樣添加之后，用磷酸或氫氧化鈉將PH調(diào)整到4. 8。將1白金圏的培養(yǎng)的里氏木霉接種于該液體培養(yǎng)基，于^°C、ISOrpm下震蕩培養(yǎng)7天。在第7天，對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行離心分離，用與實(shí)施例1同樣地方法測(cè)定上清液的葡聚糖酶活性和木聚糖酶活性。結(jié)果如圖5所示。實(shí)施例4使用丸粒麥茶(7寸t 卜公司生產(chǎn))與開(kāi)水，熬出麥茶。除去作為水溶液的麥茶，將剩下的粕水洗后，使其干燥，得到麥茶抽提粕。將得到的麥茶抽提粕進(jìn)行粉碎處理，于0. 3Ν氫氧化鈉水溶液中在121°C下通過(guò)15 分鐘的高壓釜處理除去木質(zhì)素，充分水洗后，使其干燥。得到的麥茶抽提粕于0. 3N氫氧化鈉水溶液中在121°C下通過(guò)15分鐘的高壓釜處理除去木質(zhì)素，充分水洗后，使其干燥。將里氏木霉QM9414(NBRC 31329)于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上在下培養(yǎng)7 天，使孢子充分形成。然后將作為Mandel培養(yǎng)基碳源的結(jié)晶纖維素置換為5%的上述脫木質(zhì)素處理后麥茶粕(3g/100ml)，其他使用與實(shí)施例3同樣的方法操作，對(duì)得到的培養(yǎng)液進(jìn)行酶活性測(cè)定。結(jié)果如圖6所示。實(shí)施例5對(duì)小麥麥糠(昭和產(chǎn)業(yè)社制)進(jìn)行粉碎處理，于0. 3N氫氧化鈉水溶液中在121 °C 下通過(guò)15分鐘的高壓釜處理除去木質(zhì)素，充分水洗后，使其干燥。將里氏木霉QM9414(NBRC 31329)于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上在下培養(yǎng)7 天，使孢子充分形成。然后在500mL容量帶擋板的三角燒瓶中像下述那樣準(zhǔn)備IOOmM的液體培養(yǎng)基將作為Mandel培養(yǎng)基碳源的結(jié)晶纖維素置換為上述脫木質(zhì)素處理后的小麥麥糠 5% (5g/100mL)，另外添加1 %作為無(wú)機(jī)氮源的硫酸銨，而將作為有機(jī)氮源的多價(jià)胨換成像實(shí)施例1那樣得到的廢菌體，按照濃度分別達(dá)到0. 5 %、1. 0 %、2. 0 %、3. 0 %、4. 0 %、5. 0 % 那樣添加之后，用磷酸或氫氧化鈉將PH調(diào)整到4. 8。然后將1白金圏的培養(yǎng)的里氏木霉接種于該液體培養(yǎng)基，于^°C、ISOrpm下震蕩培養(yǎng)7天。在第7天，對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行離心分離， 用與實(shí)施例1同樣的方法測(cè)定上清液的葡聚糖酶活性和木聚糖酶活性。結(jié)果如圖7所不。實(shí)施例6使用粉碎裝置(AM0S公司生產(chǎn)“錘磨機(jī)”)將蘋果果實(shí)(品種“富士”)粉碎，接著使用蘋果搾汁裝置(月島-ANDRITZ生產(chǎn)“軋輥式榨汁過(guò)濾機(jī)”)進(jìn)行搾汁。從搾汁機(jī)回收渣餅，進(jìn)行水洗、干燥。得到的蘋果渣餅于0. 3N氫氧化鈉水溶液中在121°C下通過(guò)15分鐘的高壓釜處理除去木質(zhì)素，充分水洗后，進(jìn)行干燥，實(shí)施粉碎處理，使其大小均一后使用。將里氏木霉QM9414(NBRC 31329)于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上在下培養(yǎng)7 天，使孢子充分形成。然后在500mL容量帶擋板的三角燒瓶中像下述那樣準(zhǔn)備IOOmM的液體培養(yǎng)基將作為Mandel培養(yǎng)基碳源的結(jié)晶纖維素置換為4% (4g/100mL)上述進(jìn)行了脫木質(zhì)素處理的蘋果榨汁粕，另外添加作為無(wú)機(jī)氮源的硫酸銨，而將作為有機(jī)氮源的多價(jià)胨換成像實(shí)施例1那樣得到的廢菌體，按照濃度分別達(dá)到0. 5%、1. 0%、2. 0%、3. 0%那樣添加之后，用磷酸或氫氧化鈉將PH調(diào)整到4. 8。然后將1白金圏培養(yǎng)的里氏木霉接種于該液體培養(yǎng)基，于^°C、ISOrpm下震蕩培養(yǎng)7天。在第7天，對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行離心分離，用實(shí)施例1同樣的方法測(cè)定上清液的β-葡聚糖酶活性和木聚糖酶活性。結(jié)果如圖8所示。參考例2將里氏木霉QM9414(NBRC 31329)于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上在下培養(yǎng)7 天，使孢子充分形成。然后在500mL容量帶擋板的三角燒瓶中像下述那樣準(zhǔn)備IOOmM的液體培養(yǎng)基將作為Mandel培養(yǎng)基碳源的結(jié)晶纖維素置換為復(fù)寫紙3% (3g/100mL)，另外添加作為無(wú)機(jī)氮源的硫酸銨，而將作為有機(jī)氮源的多價(jià)胨換成玉米浸漬液(Corn Steep Liquor :CSL)，按照濃度分別達(dá)到0. 5 %、1. 0 %、2. 0%、3. 0%那樣添加之后，用磷酸或氫氧化鈉將PH調(diào)整到4.8。然后將1白金圏培養(yǎng)的里氏木霉接種于該液體培養(yǎng)基，于^°C、 ISOrpm下震蕩培養(yǎng)7天。在第7天，對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行離心分離，用與實(shí)施例1同樣的方法測(cè)定上清液的β-葡聚糖酶活性和木聚糖酶活性。結(jié)果如圖9所示。參考例3將里氏木霉QM9414(NBRC 31329)于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上在下培養(yǎng)7 天，使孢子充分形成。然后在500mL容量帶擋板的三角燒瓶中像下述那樣準(zhǔn)備IOOmM的液體培養(yǎng)基將作為Mandel培養(yǎng)基碳源的結(jié)晶纖維素置換為復(fù)寫紙3% (3g/100mL)，另外添加
作為無(wú)機(jī)氮源的硫酸銨，而將作為有機(jī)氮源的多價(jià)胨按照濃度分別達(dá)到0.5%、1.0%、 2.0%、3.0%的方式添加之后，用磷酸或氫氧化鈉將pH調(diào)整到4.8。然后將1白金圏培養(yǎng)的里氏木霉接種于該液體培養(yǎng)基，于^°C、ISOrpm下震蕩培養(yǎng)7天。在第7天，對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行離心分離，用與實(shí)施例1同樣的方法測(cè)定上清液的葡聚糖酶活性和木聚糖酶活性。結(jié)果如圖10所示。產(chǎn)業(yè)上利用的可能性能夠同時(shí)高效生產(chǎn)對(duì)稻秸等天然纖維素資源的糖化極其有用的葡聚糖酶和木聚糖酶，可利用于由纖維素資源制造乙醇的生物量制造乙醇。
權(quán)利要求
1.一種葡聚糖酶和木聚糖酶的制造方法，包括使用含有廢菌體的液體培養(yǎng)基作為有機(jī)氮源，對(duì)屬于木霉屬的微生物進(jìn)行培養(yǎng)的工序。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的葡聚糖酶和木聚糖酶的制造方法，其特征是在于，所述廢菌體在所述液體培養(yǎng)基中的濃度為W/V以上。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的β-葡聚糖酶和木聚糖酶的制造方法，其特征在于，所述廢菌體在所述液體培養(yǎng)基中的濃度為2 10% W/V。
4.根據(jù)權(quán)利要求1 3中任一項(xiàng)所述的β-葡聚糖酶和木聚糖酶的制造方法，其特征在于，所述廢菌體的原料是屬于木霉屬的微生物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1 4中任一項(xiàng)所述的β-葡聚糖酶和木聚糖酶的制造方法，其特征在于，所述屬于木霉屬的微生物為里氏木霉。
6.根據(jù)權(quán)利要求1 5中任一項(xiàng)所述的β-葡聚糖酶和木聚糖酶的制造方法，其特征在于，所述液體培養(yǎng)基還含有作為碳源的天然纖維素材料以及作為氮源的氨態(tài)氮或氨基態(tài)氮。
7.根據(jù)權(quán)利要求1 6中任一項(xiàng)所述的β-葡聚糖酶和木聚糖酶的制造方法，其特征在于，所述天然纖維素材料在所述液體培養(yǎng)基中的濃度為2% W/V以上。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的β-葡聚糖酶和木聚糖酶的制造方法，其特征在于，所述天然纖維素材料為選自紙漿、啤酒粕、麥茶抽提粕、小麥麥糠以及蘋果渣餅中的至少一種。
9.根據(jù)權(quán)利要求1 8中任一項(xiàng)所述的β-葡聚糖酶和木聚糖酶的制造方法，其特征在于，在培養(yǎng)的過(guò)程中對(duì)所述液體培養(yǎng)基追加廢菌體。
10.一種用于培養(yǎng)屬于木霉屬的微生物的液體培養(yǎng)基，其含有廢菌體作為有機(jī)氮源。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的液體培養(yǎng)基，其特征在于，含有w/ν以上的所述廢菌體。
12.一種β -葡聚糖酶和木聚糖酶，其是使用權(quán)利要求1 9中任一項(xiàng)所述方法制造的。
13.—種纖維素資源的分解或糖化方法，其特征在于，使用權(quán)利要求12所述的β-葡聚糖酶和木聚糖酶。
全文摘要
一種以低成本制造對(duì)含有木聚糖的纖維素資源具有優(yōu)良分解能力的纖維素酶。一種β-葡聚糖酶和木聚糖酶的制造方法，包括使用含有廢菌體的液體培養(yǎng)基作為有機(jī)氮源，對(duì)屬于木霉屬的微生物進(jìn)行培養(yǎng)的工序。
文檔編號(hào)C12R1/885GK102482654SQ20108003713
公開(kāi)日2012年5月30日 申請(qǐng)日期2010年8月17日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月24日
發(fā)明者福田和郎 申請(qǐng)人:朝日集團(tuán)控股株式會(huì)社