專利名稱：糖類結(jié)合模塊及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及糖類結(jié)合模塊(CBM)的抗體模擬物，其特異結(jié)合至HIV糖蛋白的抗原表位。本發(fā)明也涉及抑制HIV活性的方法。
背景技術(shù)：
已知人免疫缺陷病毒(HIV)引起獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)，且因?yàn)镠IV表現(xiàn)快速遺傳漂移，出現(xiàn)了廣泛分歧的株。因此，檢測和治療變異株已證明為有挑戰(zhàn)的且是困難的。也有緊急的需要開發(fā)有效的防病的疫苗和其他治療策略以在該流行病持續(xù)不衰退時(shí)限制HIV傳播。最成功的疫苗由可活性衰減的或滅活的病毒顆粒組成。然而，HIV相關(guān)的猿免疫缺陷病毒的活性衰減，引起沒有所得病原性的保護(hù)性的反應(yīng)還未被實(shí)現(xiàn)，產(chǎn)生使人類實(shí)驗(yàn)棘手的安全問題。同樣，HIV有許多復(fù)雜的機(jī)制來有效地躲避被膜糖蛋白定向的抗體反應(yīng)，包括通過構(gòu)象和立體限制的聚糖屏蔽和掩飾脆弱的受體結(jié)合位點(diǎn)所得屏蔽井-保守的結(jié)構(gòu)。因此，研究轉(zhuǎn)向基于 被膜蛋白的免疫原作為引出抗體的方法。糖蛋白120 (gpl20)為HIV-1被膜棘突的重要組分。Gpl20的內(nèi)部結(jié)構(gòu)域與gp41相互作用，并且外部結(jié)構(gòu)域十分可變且被重糖基化(Kwong, RD.等.Structure of an HIVgpl20 envelope glycoproteinin complex with the CD4 receptor and a neutralizing human antibody.Nature 393，648-659 (1998)) o基于比較序列分析，gpl20被分成五個(gè)保守段(Cl至C5)和五個(gè)可變(VI至 V5)區(qū)域(Willey, R.L.等.Identification of conserved and divergent domainswithin the envelope gene of the acquired immunodeficiency syndrome retrovirus.Proc Natl Acad Sci USA 83，5038-5042 (1986)和 Modrow，S.等.Computer-assistedanalysis of envelope protein sequences of seven human immunodeficiencyvirus isolates -prediction of antigenic epitopes in conserved and variableregions.J Virol 61,570-578(1987))。Cl 和 C5 區(qū)域提供 gpl20 與 gp41 接觸的主要區(qū)域(Helseth，E.，Olshevsky, U.，F(xiàn)urman，C.&Sodroski，J.Human immunodeficiencyvirus type I gpl20envelope glycoprotein regions important for associationwith the gp41 transmembrane glycoprotein.J Virol 65，2119-2123 (1991))，其他保守區(qū)域(C2 至 C4)在 gpl20 分子內(nèi)形成疏水核(Moore，J.P.，Sattentau，QJ.，Wyatt,R.&Sodroski, J.Probing the structure of the human immunodeficiency virussurface glycoprotein gp 120 with a panel of monoclonal antibodies.J Virol 68，469-484 (1994) and Moore, J.P.，Willey, R.L.，Lewis, GK.，Robinson，J.&Sodroski，J.1mmunological evidence for interactions between the first，second，and fifthconserved domains of the gpl20 surface glycoprotein of human immunodeficiencyvirus type l.J Virol 68,6836-6847(1994))且可變區(qū)域，Vl 至 V3，暴露在單肢 gpl20 表面，并具有用于抗體識別和⑶4的結(jié)合位點(diǎn)的主要表位(Chen，L.等.Structural basisof immune evasion at the site of CD4attachment on HIV-1 gpl20.Science 326，1123-1127(2009)，Moore, J.P.&Sodroski, J.Antibody cross-competition analysis ofthe human immunodeficiency virus type I gpl20 exterior envelope glycoprotein.JVirol 70，1863-1872 (1996)，Pollard, S.R.，Rosa，M.D.，Rosa，JJ.&Wiley, D.C.Truneatedvariants of gpl20 bind CD4 with high affinity and suggest a minimum CD4 bindingregion.EMBO J 11，585-591 (1992)and Olshevsky,U.等.Identification of individualhuman immunodeficiency virus type I gpl20 amino acids important for CD4receptor binding.J Virol 64，5701-5707 (1990))。目前，在美國47例中和的識別HIV的單克隆抗體OnAbs)已進(jìn)入I期或II期臨床試驗(yàn)。其中，人mAb 2F5、4E10和2G12已經(jīng)以其識別HIV-1被膜糖蛋白被很好表征(Armbruster， C.等.A phase I trial with two human monoclonal antibodies(hMAb2F5，2G12)against HIV-1.AIDS 16，227-233 (2002)和 Stiegler，G.等.Antiviralactivity of the neutralizing antibodies 2F5 and 2G1 2 in asymptomaticHIV-l-1nfected humans:a phase I evaluation.AIDS 16，2019-2025 (2002)) 大多數(shù)這些抗體主要革G向在病毒表面以其成熟三聚體形式封閉的gpl20區(qū)域(Zwick，M.B.&Burton，D.R.HIV-1 neutralizatio n !mechanisms and relevance to vaccine design.Curr HIVRes 5,608-624(2007)和 Krauss， IJ.等.Fully synthetic carbohydrate HIV antigensdesigned on the logic of the 2G12 antibody.JAm Chem Soc 129，11042-11044 (2007))。Gp120剩余的暴露面被用N連接的甘露糖聚糖Man9-G1CNAC (M9)重糖基化，且很少抗體被分離至成功結(jié)合至此種(免疫沉默的)區(qū)域。然而人mAb2G12被報(bào)道具有對抗HIV-1的分化體 A 和 B 的中和活性(Trkola，A.等.Human monoclonal antibody 2G1 2 definesa distinctive neutralization epitope on the gpl20 glycoprotein of humanimmunodeficiency virus typel.J Virol 70，1100-1108 (1996))并結(jié)合至HIV-1 gpl20 的“沉默的表面”上的表位。使用位點(diǎn)定向突變的丙氨酸掃描研究顯示該表位主要覆蓋高-甘露糖或gpl20上殘基N295，N332，N386，N392，N397和N448的雜合聚糖結(jié)構(gòu)(Sanders,R.W.等.The mannose-dependent epitope for neutralizing antibody 2G1 2 on humanimmunodeficiency virus type I glycoprotein gpl20.J Virol 76，7293-7305 (2002)和 ScanIan， CN.等.The broadly neutralizing ant1-human immunodeficiency virustype lantibody 2G1 2 recognizes a cluster of alphal- > 2mannose residues on theouter face of gpl20.J Virol 76，7306-7321 (2002))，不像多數(shù)抗體識別氨基酸側(cè)鏈的特異構(gòu)型。因此存在以下可能:2G12可被轉(zhuǎn)變成基于糖類表位識別的寬范圍的HIV中和抗體。2G12(PDB ID:1ZLS)的晶體結(jié)構(gòu)及其與寡糖M9的復(fù)合物(PDB ID:10P5)顯示兩個(gè)Fab組裝成Vh結(jié)構(gòu)域交換二聚體，且該Vh結(jié)構(gòu)域位于直接與N-連接的M9相互作用的2G12 重鏈上，尤其是在 gpl20 上包含四甘露糖 Mana (I, 2)Mana (1,2)Mana (1,3)Mana (Man4)部分的Dl臂。此外，在gpl20上的2G12識別位點(diǎn)的分子模型已顯示在N332，N339和N392上的 N-連接聚糖對于 2G12 結(jié)合是關(guān)鍵的(Calarese，D.A.等.Antibody domain exchangeis an immunological solution to carbohydrate cluster recognition.Science 300，2065-2071 (2003))。合成的寡糖Man4和Man9可抑制gpl20和2G12之間的結(jié)合，因此這些寡甘露糖dendrion被鑒定為HIVl中和劑。而且，幾種HIV mAb的IC5。中和曲線顯示2G12的中和能力是中等的(Binley，J.M.等.Comprehensive cross-clade neutralizationanalysis of a panel of ant1-human immunodeficiency virus type I monoclonalantibodies.J Virol78,13232-13252(2004))。根據(jù)蛋白結(jié)構(gòu)分類數(shù)據(jù)(ProteinStructure Classification Database) (CATH)(Orengo, CA.等.CATH-a hierarchic classification of protein domain structures.Structure 5，1093-1108 (1997))，2G12的Vh結(jié)構(gòu)域被分類為具有特特異性特征β -夾心折疊，免疫球蛋白類(Ig-類)結(jié)構(gòu)的超家族2.60.40.10。有趣的是，黑曲霉(Aspergillusniger)葡萄糖淀粉酶的粒狀淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域(SBD)，AnSBD，(PDB ID:IAC0)也已被鑒定于相同的同源超家方矣中(Christiansen, C.等.The carbohydrate-binding module family20-diversity, structure, and function.FEBS J 276，5006-5029 (2009))。2G12 和此糖類結(jié)合模塊(CBM)之間的結(jié)構(gòu)相似性可暗示可被闡明的作為有效的檢測和預(yù)防疾病疫苗的共同功能。發(fā)明概述本發(fā)明提供 預(yù)防性地或治療性地抑制受試者的HIV感染的方法，其中所述方法包括給予受試者有效量的特異性結(jié)合至HIV糖蛋白表位的糖類結(jié)合模塊(CBM)的抗體模擬物。本發(fā)明還提供一種藥物組合物，所述藥物組合物包含治療或預(yù)防有效量的糖類結(jié)合模塊的抗體模擬物和藥學(xué)可接受載體。附圖簡述

圖1.淀粉結(jié)合CBM和2G12的結(jié)構(gòu)、序列和功能的比較。RoSBD與以下的結(jié)構(gòu)重疊(深灰):(a) AnSBD (淺灰)；(b) 2G12VH結(jié)構(gòu)域(淺灰)和(c) 2G12VL結(jié)構(gòu)域(淺灰)。(b)中的Man4以黏代表顯示，(d)基于Dali重疊結(jié)果的RoSBD，AnSBD，2G12VH和2G12Vl的多重序列比對。下劃線的殘基表示β -鏈區(qū)域，且黑體字形式的氨基酸表示在SBD中的配體結(jié)合殘基和在2G12Vh結(jié)構(gòu)域中的Man4-結(jié)合位點(diǎn)，(e)將一百微升的HIV-PC溶液加載至96孔ELISA 板，所述 ELISA 板分別包被有 IOOnM 人 IgG1 第二抗體(2C11),HIV-1 p24 mAb (N29)、HIV-1 gp41mAb (AG10H9) ,HIV-1 gpl20 mAb (ED8.D4)，2G12, RoSBO 和 AnSBD。HRP 結(jié)合的重組gpl20抗原用于信號檢測。差異為統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的(P < 0.0001)。圖2.RoSBD-HIV結(jié)合的特異性。一百微升HIV-PC，RoSBD mAb和HCV-PC在一起混合，加載至RoSBD包被的ELISA板，使其在37°C反應(yīng)Ih0通過加入100 μ L的:(a) HRP-結(jié)合的重組gpl20抗原；(b)HRP-結(jié)合的HCV重組抗原；(c)HRp-結(jié)合的HTLV重組抗原或(d)抗小鼠IgG HRP結(jié)合來實(shí)現(xiàn)檢測。在此甄別值(COV)被定義為ELISA分析中來自正常人血清得到的吸收值加0.1，最大甄別指數(shù)(COI)值通過OD值除以COV計(jì)算。差異為統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的(P < 0.05)。圖3.AnSBD-HIV結(jié)合的特異性。一百微升HIV-PC，RoSBD mAb和HCV-PC在一起混合，加載至AnSBD包被的ELISA板，使其在37°C反應(yīng)lh。通過加入100 μ L的:(a) HRP-結(jié)合的重組gpl20抗原；(b)HRP-結(jié)合的HCV重組抗原；(c)HRP-結(jié)合的HLV抗原或(d)HRP-結(jié)合的抗小鼠IgG來實(shí)現(xiàn)檢測。在此甄別值(COV)被定義為在ELISA分析中來自正常人血清得到的吸收值加0.1，最大甄別指數(shù)(COI)值通過OD值除以COV計(jì)算。差異為統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的(P < 0.0001)。圖4.HIV至SBD的競爭性結(jié)合。HIV-PC分別與相同體積的500nM gpl40、2G12mAb，gpl20 mAb (ED8.D4), gp41 mAb (AG10H9), p24mAb (N29)或人 IgG1 第二抗體(2C11)在 37°C混合lh。該混合物唄轉(zhuǎn)移至包被有(a) RoSBD或(b) AnSBD的板并用HRP結(jié)合的重組gp120抗原檢測。差異為統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的(P < 0.0001)。圖5.聚糖的競爭性結(jié)合。HIV-PC與500 μ M的大豆凝集素(SBA)、G7、β CD或甘露糖的每一種在37°C混合lh。該混合物被轉(zhuǎn)移至用IOOnM: (a) RoSBD和(b) AnSBD預(yù)包被的ELISA板。該反應(yīng)用HRP結(jié)合重組gpl20抗原檢測。差異為統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的(P < 0.01)。圖6.使用mAb和SBD100 μ L的HIV-1發(fā)生率/患病率性能組(PRB601)成員的HIV結(jié)合曲線被分別加載到用 IOOnM:(a)HIV-l-p24mAb(N29) ； (b)HIV-l-gp41mAb (AG10H9)；(c)gpl20mAb (ED8.D4) ； (d) HIV-l_2G12mAb ； (e) RoSBO 或(f) AnSBD 預(yù)包被的 ELISA 板且用HRP-結(jié)合重組的gp 120抗原檢測。在此甄別值(COV)被定義為在ELISA分析中來自正常人血清得到的吸收值加0.1，最大甄別指數(shù)(COI)值通過OD值除以COV計(jì)算。圖7.HIV-2G12和HIV-SBD結(jié)合曲線。一百微升HIV-1性能組(PRB601)成員被分別加載至用100nM(a)2G12，(b)RoSBD和(c) AnSBD預(yù)包被的96孔ELISA板。該反應(yīng)用HRP結(jié)合重組的gpl20抗原檢測。含5% BSA的PBS(PH7.4)被用作NC陰性對照(NC)。甄別值(COV)被定義為在ELISA分析中來自正常人血清得到的吸收值加0.1，最大甄別指數(shù)(COI)值通過OD值除以COV計(jì)算。差異為統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的(P < 0.0001)。圖8.RoSBD的聚糖結(jié)合活性。(a)聚糖微陣列分析通過對功能的Glycomics,核心H設(shè)備的聯(lián)合進(jìn)行。用于分析的第一抗體為抗RoSBD單克隆抗體，且第二抗體為Alexa Fluor488-結(jié)合的山羊抗小鼠 IgG。 (b)六十微升 0.7pM IgGl (2C11)、HIV_lgpl40、Man4_0R 或Manl-Asn/PBS(pH7.4)置于玻璃管中，并將60 μ L磁性試劑加入該玻璃管并在4°C混合15秒然后進(jìn)行磁性減少測量。該混合物的磁性感受性使用XacPro-SlOl閱讀器在25°C測量。圖9.合成的Man4的結(jié)構(gòu)(為6_氨基己基糖苷Man4_0R)和M9_Asn (來自SBA)。圖10.RoSBD上的Man4結(jié)合位點(diǎn)。(a)使用PyMOL計(jì)算和顯示的表面能力，顯示陰性(紅色)和陽性(藍(lán)色)能力。左邊組:具有標(biāo)記的殘基Thr33，Tyr56和AsplOO的VH-Man4, Man4以褐色顯示。右邊組:顯示位點(diǎn)I的關(guān)鍵結(jié)合殘基(Trp47，Tyr83和Tyr94)和位點(diǎn)II的關(guān)鍵結(jié)合殘基(Tyr32和Phe58)的標(biāo)記RoSBD_G7復(fù)合物。G7分子以青色(cyan)顯示，(b)預(yù)測的RoSBD上Man4結(jié)合位點(diǎn)的帶狀圖。Man4分子以褐色顯示。左邊組:顯示Tyr32, Ser33和Lys34殘基。右邊組:顯示Tyr32, Ser33和Lys34殘基，(c)野生型和突變的RoSBD的HIV結(jié)合。將100 μ L HIV-PC溶液加載至用IOOnM野生型RoSBD或突變的 RoSBD Ν29Α, Υ32Α, S33A, Κ34Α, W47A, F58A, Υ83Α, Υ93Α 和 Υ94Α 預(yù)包被的 96 孔 ELISA板中。HRP結(jié)合重組的gpl20抗原用于信號檢測。顯示的結(jié)果表示一式三份樣品的土SD。★ , P < 0.05 ；★★, P < 0.01 ;★★★, P < 0.0001。圖11.RoSBD氨基酸對于HIV-1復(fù)制和細(xì)胞存活力的影響。HIV-1RTMF (AZT-抗性病毒)，用增加濃度的RoSBD處理。8天后通過使用HIV-lp24抗原ELISA測量病毒復(fù)制，且根據(jù)劑量響應(yīng)曲線計(jì)算對于抑制的IC5tl值。不同濃度的RoSBD對H9細(xì)胞存活力的影響和MTT分析被用于檢測H9細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)胞毒性。圖12.對于抑制HIV-1進(jìn)入的可能策略，(a) HIV-1進(jìn)入靶細(xì)胞需要gpl20與細(xì)胞表面受體⑶4和共受體CCR-5的結(jié)合。(b)中和mAb2G12通過識別HIV gpl20的⑶4結(jié)合結(jié)構(gòu)域阻礙HIV-1感染。(c) SBD/CBM可識別HIV-1并作為2G12mAb的模擬物來阻礙HIV-1感染。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供預(yù)防性地或治療性地抑制受試者的HIV感染的方法，所述方法包括給予受試者有效量的特異性結(jié)合至HIV糖蛋白表位的糖類結(jié)合模塊(CBM)的抗體模擬物。此處使用的術(shù)語“CBM”指在糖類-活性酶中與具有糖類結(jié)合活性的謹(jǐn)慎折疊鄰近的(contiguous)氨基酸序列。在糖苷水解酶的一級結(jié)構(gòu)分類中，按基于氨基酸序列相似性SBM被分類至59家族且它們表現(xiàn)出不同的配體特異性，依照糖類活性酶(Carbohydrate-Active EnZyme) (CAZy)數(shù)據(jù)庫(Cantarel, B.L.等.TheCarbohydrate-Active EnZymes database (CAZy): an expert re source forGlycogenomics.Nucleic Acids Res 37，D233-238 (2009))，其包括幾種特異性例如纖維素、木聚糖和淀粉結(jié)合。本發(fā)明中，SBM特異性地結(jié)合至存在于HIV糖蛋白表位中的聚糖結(jié)構(gòu)。優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述HIV糖蛋白為gpl20，且所述聚糖結(jié)構(gòu)為N連接的高甘露糖聚糖 Man9-GlcNAc(M9)。

此處使用的術(shù)語“抗體模擬物”指與抗體在對抗靶結(jié)構(gòu)結(jié)合方面具有相似功能的物體，但其結(jié)構(gòu)比抗體簡單。為生產(chǎn)大量抗體需要如下步驟:(a)將單抗體形成細(xì)胞融合至培養(yǎng)生長的腫瘤細(xì)胞。所得的細(xì)胞被稱為雜交瘤，(b)每種雜交瘤產(chǎn)生相對大量的相同的抗體分子，和(C)使得該雜交瘤在培養(yǎng)中增加，有可能產(chǎn)生細(xì)胞群，該細(xì)胞群的每個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生相同的抗體分子。制造真正的抗體是消耗勞動(dòng)和消耗費(fèi)用的；然而，本發(fā)明中，廣泛的包括細(xì)菌、酵母、昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞的宿主可被用于產(chǎn)生CBM的抗體模擬物而不使用動(dòng)物，這更簡單且更經(jīng)濟(jì)。此處使用的術(shù)語“受試者”指動(dòng)物，優(yōu)選哺乳動(dòng)物，且更優(yōu)選人。本發(fā)明中，優(yōu)選的CBM為淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域(SBD)。此處使用的術(shù)語“SBD”指可結(jié)合粒狀或可溶淀粉的功能性結(jié)構(gòu)域，以增加酶的活性位點(diǎn)的底物的局部濃度，且這也可以分裂淀粉表面的結(jié)構(gòu)，由此增強(qiáng)淀粉分解率。目前，有九種淀粉結(jié)合CBM家族:CBM20、CBM21、CBM25、CBM26、CBM34、CBM41、CBM45、CBM48和CBM53。本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案中，SBD為SBM家族20和21的成員，它分別得自黑曲霉(Aspergillus niger)葡萄糖淀粉酶(AnSBD)和稻根霉(Rhizopusoryzae)葡萄糖淀粉酶(RoSBD)。使用分子模型的稻根霉(Rhizopus oryzae)葡萄糖淀粉酶(RoSBD)的 SBD 的結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系(Chou,ff.1.,Pai,T.ff.,Liu, S.Η., Hsiung, Β.K.&Chang,Μ.D.The family 21 carbohydrate-binding module of glucoamylase from Rhizopusoryzae consists of two sites playing distinct roles in ligand binding.BiochemJ 396，469-477 (2006))和核磁共振(NMR)光譜已被驗(yàn)證(Liu, Y.N.，Lai, Υ.Τ.，Chou,W.1.，Chang, Μ.D.&Lyu, RC.Solution structure of family 21 carbohydrate-bindingmodule from Rhizopus oryzae glucoamylase.Biochem J 403，21-30 (2007))。此夕卜，RoSBD上的maltoheptaose(G7)和β-環(huán)糊精(β-CD)結(jié)合位點(diǎn)已通過X-射線結(jié)晶照相法(crystallography)檢測(Tung，J.Y.等.Crystal structures of the starch-bindingdomain from Rhizopus oryzae glucoamylase reveal a polys accharide-binding path.Biochem J 416，27-36 (2008)) 本發(fā)明還提供一種藥物組合物，所述藥物組合物包含治療或預(yù)防有效量的糖類結(jié)合模塊的抗體模擬物和藥學(xué)可接受載體。術(shù)語“藥學(xué)可接受載體”、“藥學(xué)可接受賦形劑”、“生理學(xué)可接受載體”或“生理學(xué)可接受賦形劑”指藥學(xué)可接受材料、組合物或載體，例如液體或固體填充劑、稀釋劑、賦形劑、溶劑或封裝材料。每種組分應(yīng)為在與藥物制劑的其他成分可相容的意義上是“藥學(xué)可接受的”。它還應(yīng)該適合用于與人和動(dòng)物的組織或器官而沒有過多的毒性、刺激、過敏反應(yīng)、免疫發(fā)生或其他問題或并發(fā)癥，與合理的收益/風(fēng)險(xiǎn)比相稱。此處公開的藥物組合物可以單位劑型或多劑型公開。此處使用的單位劑型指物理學(xué)上離散的適合給予至人和動(dòng)物受試者的單位且被本領(lǐng)域已知的獨(dú)立包裝。每個(gè)單位劑量包含預(yù)測定量的足以產(chǎn)生所需的治療效果的活性成分，結(jié)合所需的藥物載體或賦形劑。單位劑型的實(shí)例包括注射劑(ampoule)、注射管(syringe)和獨(dú)立包裝的片劑和膠囊。單位劑型可以其部分或其多數(shù)給予。多劑型為包裝在單容器中以被以分開的單位劑型給予的復(fù)數(shù)的相同單位劑型。多劑量的實(shí)例包括小瓶的、瓶的片劑或膠囊或瓶的品脫或加侖(Pintsor gallons)。此處公開的組合物可被單獨(dú)給予，或與一種或多種其他此處公開的化合物、一種或多種其他活性成分組合。包含此處公開的化合物的藥物組合物可被配制成多種用于經(jīng)口的、腸胃外的和局部給予的劑型。該藥物組合物還可被配制為改性釋放的劑型，包括延遲_、增強(qiáng)的_、延長的_、持續(xù)的_、脈動(dòng)的_、控制的_、加速的-和快速的_、靶向的_、程序化的-釋放、和胃的保留劑型。這些劑型可按照本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法和技術(shù)制備。此處公開的藥物組合物可一次給予，或者在時(shí)間間隔多次給予。應(yīng)理解治療的精確劑量和持續(xù)時(shí)間可隨著年齡、重量和待治療的患者的狀態(tài)變化，且可被經(jīng)驗(yàn)地使用已知的測試方案測定或通過插補(bǔ)法從體內(nèi)或體外試驗(yàn)或診斷數(shù)據(jù)測定。還應(yīng)理解對于任何特定的個(gè)體，特定的劑量方案應(yīng)隨 時(shí)間根據(jù)個(gè)體需要和管理或監(jiān)督該配方的給予的人的職業(yè)判斷來調(diào)整。此處公開的藥物組合物可以用于經(jīng)口給予的固體、半固體或液體劑型公開。此處使用的，經(jīng)口給予也包括頰的、舌的和舌下給予。合適的經(jīng)口劑型包括，但不限于，片劑、膠囊、丸、糖錠(troches)、錠劑(lozenges)、軟錠劑(pastilles)、扁囊(cachets)、丸(pellets)、含藥口香糖、整裝粉劑、泡騰的(effervescent)或非冒泡的粉末或顆粒、溶液、乳液、懸液、溶液、薄脆餅(wafes)、噴灑(sprinkles)、酏和糖楽；。除了活性成分,該藥物組合物還包含一種或多種藥學(xué)可接受的載體或賦形劑，包括但不限于，結(jié)合劑、填充劑、稀釋劑、崩解齊IJ、濕潤齊U、潤滑劑、助流齊U、著色齊U、染料遷移抑制劑、增舔劑和調(diào)味齊U。本發(fā)明還提供檢測樣品的HIV的方法，所述方法包括將特異性結(jié)合至HIV糖蛋白表位的糖類結(jié)合模塊(CBM)的抗體模擬物加入至樣品；和檢測所述抗體和樣品之間的結(jié)合反應(yīng)。在檢測HIV的方法中，SBM特異性地結(jié)合至存在于糖蛋白表位中的聚糖結(jié)構(gòu)。如下實(shí)施例為非限制性的且僅代表本發(fā)明的各方面和特征。
實(shí)施例實(shí)施例1SBD和2G12之間的結(jié)構(gòu)關(guān)系基于結(jié)構(gòu)的多重序列比對二級結(jié)構(gòu)預(yù)測使用 Jpred 服務(wù)器(server) (Cuff, J.A., Clamp, M.E., Siddiqui,A.S.，F(xiàn)inlay, M.&Barton，GJ.JPred:a consensus secondary structure predictionserver.Bioinformatics 14,892-893 (1998))和網(wǎng)絡(luò)蛋白序列分析(Network ProteinSequence Analysis) (NPSA)服務(wù)器。Jpred和NPSA服務(wù)器提供一致的結(jié)果,分別來自六種(NNSSP, DSC, PREDATOR, MULPRED, ZPRED 和 PHD)和十二種(SOPM，SOPMA, HNN, MLRC, DPM,DSC, GORI, GORII, GORIV, PHD, PREDATOR 和 SMPA96)不同的方法。結(jié)果RoSBD或AnSBD和其他蛋白結(jié)構(gòu)域之間的結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系檢測通過使用DALI 數(shù)據(jù)庫 in silico 進(jìn)行(Holm, L., Kaariainen, S., Rosenstrom, P.&Schenkel,A.Searching protein structure databases with DaliLite v.3.Bioinformatics 24,2780-2781 (2008))?？傆?jì)對于RoSBD和AnSBD分別有555和535種結(jié)構(gòu)上相關(guān)的蛋白被檢索到，并按照它們功能分類。如預(yù)期的，兩種情況下最相似的蛋白(即，在前200)主要為淀粉處理酶或CBM，然后是抗體家族。特別是，RoSBD和AnSBD分別與158和57種免疫球蛋白結(jié)構(gòu)關(guān)聯(lián)。其中，RoSBD類似于三種糖結(jié)合mAb:2G12、2H1和F22-4，它們分別識別致病的微生物 HIV,新型串酵 母(Cryptococcus neoformans)和弗氏志賀菌(Shigella flexneri)。此外，RoSBD ;類似于13HIV中和mAb包括2F5和FAB 1583。類似地，AnSBD類似于兩種糖結(jié)合抗體:2H1和SEl 55-4mAb的單鏈抗體可變結(jié)構(gòu)域(ScFv);和兩種HIV結(jié)合mAb、2F5和G3-519。2G12,RoSBD和AnSBD之間的結(jié)構(gòu)關(guān)聯(lián)使得容易推導(dǎo)出這些SBD可具有識別HIV的糖蛋白的能力。圖1顯示對于RoSBD、AnSBD，和2G12人mAb的VH和VL結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)比較結(jié)果。雖然RoSBD和AnSBD、VH和VL之間的序列同一性低至分別為8.3%、9.5%和10.9%，但重疊的影響表明在結(jié)構(gòu)配對之間總體三維結(jié)構(gòu)是非常相似，平均根均值方差(root mean squaredeviation) (RMSD)值分別為 1.4Ao (圖 la)、2.9Αο (圖 lb)和 3.0Ao (圖 lc)。雖然圖1d中RoSBD、AnSBD、VH和VL的多重序列比對顯示出低的同源性，但兩種SBD和VH中關(guān)鍵的配體結(jié)合位點(diǎn)是很保守的(Tung, J.Y.等.Crystal structures of the starch-bindingdomain from Rhizopus oryzae glucoamylase reveal a polys accharide-binding path.Biochem J 416，27-36 (2008))。RoSBD, AnSBD 和 2G12 的 VH 和 VL 結(jié)構(gòu)域之間的結(jié)構(gòu)相似性可表明對于SBD和2G12的相似的結(jié)合特異性。實(shí)施例2SBD和2G12之間的功能關(guān)系微生物和質(zhì)粒大腸桿菌(Escherichiacoli) ToplOF ' (Invitrogen)被用于質(zhì)粒處理，而大腸桿菌(E.coli)BL21-Gold(DE3) (Invitrogen)用于蛋白表達(dá)。載體 pET_23a(+)和pET-15b (Novagen),都包含T7引物(promoter),都分別用于在大腸桿菌細(xì)胞中重組的RoSBD 和 AnSBD 表達(dá)。用于 pET23a(+)-RoSBD 的正向(forward)引物 5'-CATATGGCAAGTATTCCTAGCAGT-3' (SEQ ID 號 I)和反向引物 5' -CTCGAGTCATGTAGATACTTGGT-3/ (SEQ ID 號 2)分別包含 NdeI 和 XhoI 限制(restriction)位點(diǎn)，以及用于pET15b-AnSBD 的正向引物 5' -CATATGAGCAAGACCAGCACCAGT-3 ' (SEQ ID 號 3)和反向引物 5' -CTCGAGCTACCGCCAGGTGT-3' (SEQ ID 號 4)分別包含 NdeI 和 XhoI 限制位點(diǎn)，這些引物用于克隆和序列分析。
SBD的轉(zhuǎn)化和表達(dá)使用熱激方法將pET表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌(E.coli)表達(dá)細(xì)胞(Chou，W.1.，Pai, Tff., Liu, S.H., Hsiung, B.K.&Chang, Μ.D.The family 21 carbohydrate-bindingmodule of glucoamylase from Rhizopus oryzae consists of two sites playingdistinct roles in ligand binding.Biochem J 396,469-477 (2006))。100 微升感受態(tài)細(xì)胞核IOOng DNA或20 μ L連接混合物被混合，然后冰上孵育30min。將細(xì)胞在42°C水浴中加熱30至60秒,然后置于冰上超過2min。將轉(zhuǎn)化細(xì)胞鋪展至含100 μ g/mL氨芐青霉素的Luria-Bertani (LB)瓊脂板上并在37°C孵育過夜以測定轉(zhuǎn)化細(xì)胞的數(shù)量。蛋白表達(dá)通過將0.5mM異丙基β _D_硫代半乳糖苷(IPTG) (Promega)加入至培養(yǎng)基誘導(dǎo)，并在20°C以250x g震蕩下孵育16h。通過在4°C以3，700X g離心15min收獲細(xì)胞。SBD的純化包含重組蛋白的大腸桿菌(E.coli)的細(xì)胞沉淀物(pellet)重懸于IOOmL結(jié)合緩沖液(50mM NaOAc,pH 5.5)中，通過勻衆(zhòng)裂解(EmulsiFlex_C5 homogenizer,AVESTIN)，且細(xì)胞碎片通過在4°C 16，OOOx g離心30min除去。將所得細(xì)胞裂解液加載至5mL直鏈淀粉樹脂柱(New England Biolabs)上。然后將該柱用50mL結(jié)合緩沖液(50mMNa0Ac,pH 5.5)洗滌，且所吸附的蛋白用洗脫緩沖液(IOmM甘氨酸-Na0H，pH 11洗脫。純化的SBD通過在超濾單兀(Centricon-10,Millipore)中離心濃縮并且緩沖液換成50mM NaOAc, pH 5.5 (Lin,S.C.等.CBM21 starch-binding domain:a new purification tag for recombinantprotein engineering.Protein Expr Purif 65，261-266 (2009))。質(zhì)譜分析 重組蛋白的分子量檢測通過液相色譜/質(zhì)譜儀(LC/MS) (Waters)進(jìn)行。完整的SBD(IOOpmol)用在50% (v/v)乙腈中的0.1 %甲酸酸化，且數(shù)據(jù)在正常掃描分辨率(scanresolution)下800_1800m/z范圍獲得。對最初的具有多重的荷電的離子系列的電噴射質(zhì)譜去卷積(deconvoluted)以得到質(zhì)譜。夾心ELISA首先將純化的SBD (100 μ L的IOOnM溶液)稀釋至SBD包被緩沖液(50mM Tris-HCl緩沖液，pH 8)，然后用移液管加入(pipeted)至96孔ELISA板(Greiner-Bio One),然后在 4°C 孵育 16h。相似地，首先將 100μ L 的 IOOnM 2G12 mAb (Polymum Scientific)稀釋至2G12包被緩沖液(50mM甘氨酸-HCl緩沖液，pH 3)，然后用移液管加入至第二 ELISA板，40C 16h。分別將以下四種試劑的每一種(IOOyL)加入至SBD-包被的或2G12-包被的ELISA板，并使其在37°C反應(yīng)Ih:(i)HIV-PC(HIV抗原和抗體陽性血清，ID#9144532 ；SeraCareLife Sciences), (ii) 1.0 μ g/mL Ant1-RoSBD mAb (由作者生產(chǎn)，可通過索取獲得)，(iii)HCV-PC(抗-HCV Mixed Titer Performance Panel ;成員(member) 10, ID#PHV205 ；SeraCareLife Sciences)和(iv)HTLV-PC(Ant1-HTLV I/II Mixed Titer Performance Panel ;成員 10，ID#PRP206 ； SeraCare Life Sciences)。分別使用 HIV p24ELISA 試劑盒(PerkinElmer)和抗HIV抗體1+2ELISA試劑盒(Abbott Diagnostics),根據(jù)說明書，將HIV-PC確認(rèn)為HIV抗原陽性和抗-HIV抗體陽性。之后，將該板用PBST (0.0lM磷酸鹽緩沖液加0.05%tween-20, pH 7.1)洗滌三次。
以下四種結(jié)合試劑的每一種被分別稀釋成0.05 μ g/mL并以100 μ L/孔加入，37 °C 30min:⑴HRP-結(jié)合重組 gpl20 抗原(General Biologicals), (ii)HRP-結(jié)合的抗小鼠 IgG(Jackson ImmunoResearch)， (iii)HRP-結(jié)合的 HCV 重組抗原(GeneralBiologicals)和(iv) HRP-結(jié)合的 HTLV 重組抗原(General Biologicals),然后用 PBST 洗三次。3,3' ,5,51 -四甲基聯(lián)苯胺(General Biologicals)底物以100 μ L/孔加入,并使其在37°C進(jìn)行30min顏色顯現(xiàn)。通過加入100 μ L/孔的2Ν硫酸終止顏色反應(yīng)，使用Emax精確微量培養(yǎng)板閱讀器(Molecular Devices)在450nm測量吸光度。甄別值(COV)被定義為陰性對照的0D，(正常人血清)+0.1。顯示出甄別指數(shù)(COI)大于I的樣品被認(rèn)為陽性，其中COI =(測試樣品的0D)/C0V。統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析通過雙向(two-way)ANOVA進(jìn)行,然后進(jìn)行不成對的(unpaired)雙尾 t 檢驗(yàn) GraphPad Prism Version 4 ；GraphPad Software)。P < 0.05 被認(rèn)為顯著的。結(jié)果 直接夾心酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)使用HIV-特異的mAb或SBD-包被的微量滴定板和辣根過氧化物酶(HRP)連接的重組gpl20進(jìn)行；顯示甄別指數(shù)(COI) > I的樣品被視為陽性。圖1e顯示在HIV抗原和抗體陽性對照(HIV-PC)中存在的HIV抗原通過抗-p24mAb (N29)，抗-gp41 mAb (AG10H9)，抗-gpl20 mAb (ED8.D4)和 2G12 如預(yù)期的被清楚滴檢測至IJ。在包被有任一 SBD的板中觀察到信號，這明顯顯示RoSBD和AnSBD具有相似的HIV檢測能力。圖2a顯示RoSBD結(jié)合僅在HIV-PC被測試時(shí)發(fā)生。觀察到與抗-丙型肝炎病毒(HCV)混合的滴定度性能陽性對照(HCV-PC)或抗-人T-淋巴細(xì)胞病毒(HTLV)混合的滴定度性能陽性對照(HTLV-PC)的可忽略的交叉反應(yīng)。此外，HRP-結(jié)合的HCV重組抗原、HRP-結(jié)合的HTLV重組抗原和HRP-結(jié)合的抗-小鼠IgG沒有得到明顯的表示RoSBD具有對HIV-PC特異識別的信號(圖2)，這可能由于結(jié)合至HIVgpl20抗原。圖3a顯示AnSBD結(jié)合至HIV-PC的最大COI與RoSBD的那種相似，且對于AnSBD結(jié)合至HIV-PC或HTLV-PC沒有觀察到交叉反應(yīng)。圖3b和3c顯示在HRP-結(jié)合的重組gp120存在時(shí)AnSBD表現(xiàn)對HIV-PC的結(jié)合特異性。此外，在小鼠抗-RoSBD mAb和AnSBD之間沒有結(jié)合(圖3d)。實(shí)施例3RoSBD和AnSBD和HIV-1糖蛋白之間的特異性HIV mAb和聚糖的競爭性ELISA以下肽和mAb用于競爭性ELISA實(shí)驗(yàn):(i)人IgG1第二抗體([2C11];對于人IgGi的亞類特異的且沒有同型限制；Fe-區(qū)特異的)第二抗體，(ii)HIV-l p24肽([N29]，根據(jù)HIV-1 p24的N-末端殘基1-104的合成肽)，(iii)HIV-1 gpl20肽([ED8.D4];按照人HIV-1 BH8 隔離 gpl60 的殘基 427-448 的合成肽)，(iv)HIV-1 gp41 肽([AG10H9]，按照HIV-1 gpl60 的殘基 721-744 的合成肽)，(v) 2G12 mAb (對抗 HIV-1 gpl20 的重組人 mAb)，卜1)8 140 011￥分化體4，株92/呢/037)。所有得自Abeam，除了 2G12和gpl40，它們購自Polymun Scientific。對于ELISA實(shí)驗(yàn)，50 μ L HIV-PC與等體積的500ηΜ的以上⑴至(vi)的每種混合。將該混合物轉(zhuǎn)移至RoSBD或AnSBD包被的板并在37°C孵育lh，然后用PBST洗滌三次。通過加入100 μ L的0.05 μ g/mLHIVl重組gpl20 HRP-結(jié)合抗原檢測反應(yīng)。對于檢測聚糖效果的實(shí)驗(yàn)，50 μ L的500 μ M的四種樣品，大豆凝集素(SBA)、maltoheptaose (G7)、β-環(huán)糊精(PCD)和甘露糖(Sigma-Aldrich)的每一種與等體積的HIV-PC混合。將該混合物轉(zhuǎn)移至RoSBD或AnSBD包被的板并在37°C孵育lh，然后用PBST洗滌三次。該反應(yīng)通過加入100 μ L的0.05 μ g/mL重組gpl20抗原檢測。通過加入100 μ L的0.05 μ g/mL HRP-結(jié)合的HIV I重組gpl20抗原檢測反應(yīng)。結(jié)果兩種SBD和HIV-1之間的分子相互作用的特異性在包括mAb、糖蛋白和聚糖的競爭者存在時(shí)被評估。圖4a和4b中，人IgG1QCll)第二抗體的存在未顯示出抑制效果，表明沒有非特異性競爭發(fā)生。然而，對于HIV-PC結(jié)合至RoSBO和AnSBD的COI值分別顯著減少至72%和60%，在重組HIV-1 gpl40存在時(shí)，中國倉鼠卵巢(CHO)-表達(dá)的包裝糖蛋白包含與gpl20相同的高甘露糖型聚糖。這表明SBD和HIV糖蛋白之間的分子相互作用。此外，mAb 2G12，抗-gpl20 mAb，抗-gp41 mAb 和抗-p24 mAb 競爭劑對于 RoSBD-HIV PC 結(jié)合的抑制率分別為55%,42%,22%^P 13%，其中AnSBD的該值分別為33%,18%,6%^Ρ 10%。在與mAb (對于gpl20)的競爭時(shí)SBD和HIV-PC結(jié)合的明顯減少導(dǎo)致對SBD識別HIV的結(jié)論的進(jìn)一步支持。該數(shù)據(jù)明顯顯示每種SBD和HIV gpl20之間的特異性相互作用，假定在gpl20上包含聚糖部分。此外，發(fā)現(xiàn)500μΜ四 聚糖蛋白大豆凝集素(SBA)具有Μ9部分、maltoheptaose (G7)和β-環(huán)糊精(β⑶)部分，對于RoSBD-HIV和AnSBD-HIV分別抑制結(jié)合達(dá)38%，20%和23%，以及16%，13%和11%，但甘露糖單糖未顯示出抑制效果(圖5)。這些數(shù)據(jù)暗示SBA和SBD的多糖配體對HIV結(jié)合弱競爭。實(shí)施例4SBD和2G12的競爭性HIV-1檢測為評估用于HIV ELISA的SBD的實(shí)際應(yīng)用，一組HIV-1發(fā)生率/患病率性能組樣品(PRB601 ;SeraCare Life Sciences),包含7個(gè)一致的發(fā)生和8個(gè)一致的患病樣品,表征為HIV-1陽性的，被用于比較抗_p24，抗_gp41，抗-gpl20和2G12 mAb，以及RoSBD和AnSBD之間的HIV檢測性能。結(jié)果圖6顯示所有包被材料為活性的且此兩種SBD顯示明顯的檢測信號。雖然對于15個(gè)樣品的類似的檢測曲線在SBD或HIV-特異性的mAb包被的分析被觀察到，2G12和RoSBD顯示相對較高的檢測靈敏度；顯然，樣品號5，6，8，10，11和13比其他包含更多的HIV-1抗原。這些數(shù)據(jù)明顯支持我們的SBD的HIV-1抗原識別能力。此外，不僅信號的檢測模式而且信號的相對范圍在2G12(圖7a) ,RoSBD (圖7b)和AnSBD (圖7c)之間非常相似。2G12-，RoSBD-和AnSBD-包被的ELISA的檢測率分別高至93%，93%和87%。應(yīng)注意的是樣品號I和號2分別未被RoSBD和2G12檢測，但據(jù)發(fā)現(xiàn)它們的HIV-1RNA含量分別為3 X IO4和2 X IO3副本/mL。HIV抗原ELISA和HIV-1-RNA試驗(yàn)之間的偏差可來自于不同的檢測目標(biāo)或表面糖蛋白的不同表達(dá)水平。實(shí)施例5
的特異甘露聚糖結(jié)合活性RoSBD的聚糖陣列篩選聚糖微陣列分析通過對功能的Glycomics的聯(lián)合(CFG),核心H設(shè)備進(jìn)行(Raman,R.等.Advancing glycomics:implementation strategies at the consortium forfunctional glycomics.Glycobiology 16,82R_90R(2006))。哺乳動(dòng)物印刷陣列包含總計(jì)377不同的天然和合成的聚糖。簡要地說，將七十微升的RoSBD (200 μ g/mL)施用至陣列的印刷的表面，覆有蓋玻片，并在黑暗潮濕的小室中37°C孵育lh。孵育之后，移走蓋玻片并用TSM 緩沖液(50mM Tris-HCl,pH 7.5，10mMMgC12 和 0.5M sucrose)沖洗四次。將七十微升的抗-RoSBD mAb施用至微陣列的印刷表面，并在潮濕的小室中于37°C孵育lh。為檢測結(jié)合，將該微陣列與5 μ g/mL濃度，在PBS緩沖液中的第二抗體，Alexa Fluor 488-結(jié)合的山羊抗-小鼠IgG(Invitrogen)在37°C在潮濕的小室中孵育Ih,然后進(jìn)行洗漆步驟。結(jié)合程度使用Perkin-Elmer MicroarrayXL4000掃描儀測定,并使用Imagene (V.6)圖像分析軟件分析。完全的聚糖陣列數(shù)據(jù)組可在依據(jù)cfg_rRequest_l 340的CFG數(shù)據(jù)檔案中發(fā)現(xiàn)。磁性減少結(jié)合分析對于磁性還原(MR)測量(MagQu)，含均勻分散的涂有親水表面活性劑(例如葡聚糖)的63.2nm磁性納米顆粒(MagQu)溶液被使用。在外部多重ac磁性領(lǐng)域,該磁性納米顆粒通過磁性相互作用震蕩并顯示出混合頻率磁性感受性(X ac)，對存在與顆粒表面相互作用的分子敏感的磁性特性。在測試樣品中X ac值因此響應(yīng)磁性納米顆粒和結(jié)合分子之間的聯(lián)合而減少以產(chǎn)生MR信號。

在包含理論空燃比(stoichiometric ratio)為1: 2的七水合硫酸亞鐵(FeS04.7H20)和六水合氯化亞鐵(FeCl3.H2O)的亞鐵鹽溶液與等體積的水性葡聚糖(Sigma-Aldrich)混合并在室溫分散于水中。將該混合物加熱至70-90 °C并用IONNaOH(Showa chemical)滴定以形成Fe3O4顆粒。通過在25°C以3，700X g離心15min和凝膠過濾層析(Sigma-Aldrich)去除凝聚物和過度的非結(jié)合葡聚糖。含F(xiàn)e3O4磁性納米顆粒的磁性液體被用磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.4)稀釋至
0.3emu/g (或 8.3mg Fe/mL),然后與純化的 RoSBD (200 μ L, 1.0mg/mL)結(jié)合至葡聚糖上氧化的醛基以產(chǎn)生CH = N-連接。六十微升的0.7pM IgGl (2C11), HIV-1-gp 140，Man4 (為 6-氨基己基糖苷(Man4_0R)), M9_Asn(0da, Y.等.Crocus sativus lectinrecognizesMan3GlcNAc in the N-glycan core structure.J Biol Chem 275，26772-26779(2000))，或SBA與PBS(pH 7.4)溶液分離地加入至玻璃管并置于25°C。然后將另一 60 μ L包含RoSBD-包被的納米顆粒的磁性試劑加入至該玻璃管并在25°C混合15秒。最終，在25°C使用XacPro-SlOl閱讀器(MagQu)用于測量MR信號，檢測該混合物。隨著該結(jié)合使得磁性納米顆粒能變得較大或簇生的，試劑的減少的X ac被記錄。結(jié)果圖8a清楚滴證實(shí)兩個(gè)主要信號通過RoSBD檢測:聚糖54Fuca (1,2)GalMl,3)GalNAc0 (lj3)Gala 和聚糖 187Mana (1,2)Mana (1,2)Mana (U)Mantl (Man4)。前者與人血型 0 抗原糖基化聯(lián)合(Korchagina, E.Y.等.Design of the blood group AB glycotope.GlycoconjJ 22,127-133(2005))，而后者為HIV gpl20以及SBA中M9的合成的聚糖組分(Wang，J.，Li，H.，Zou, G.&Wang, L.X.Novel template-assembled oligosaccharide clustersas epitope mimics for HIV-neutralizing antibody 2G12.Design, synthesis, andantibody binding study.0rg Biomol Chem 5,1529-1540(2007))。此種數(shù)據(jù)對于 RoSBD和HIV gpl20之間的相互作用提供了額外的和獨(dú)立的證據(jù)路線，因?yàn)樽R別宿主上的⑶4受體的Man4作為HIV-1進(jìn)入的關(guān)鍵組分。有趣的是，2G12也已知結(jié)合至HIV-1 gpl20的該Man4結(jié)構(gòu),使用聚糖陣列分析和其他方法(Ji, X., Gewurz, H.&Spear, GT Mannose bindinglectin (MBL) and HIV MoI Tmmunol 42,145-152 (2005)和Liu,WT等.Identification andcharacterization of a novel fibril forming peptide in fungal starch bindingdomain.Biochem Biophys Res Commun 311,966-970(2008))。RoSBD的實(shí)時(shí)聚糖結(jié)合信號被使用磁性減少(MR)分析檢測(Hong C.Y，WCC，ChiuY.C, Yang S.Y, Horng H.E 和 Yang H.CMagnetic susceptibility reduction method formagnetically labeled immunoassay.Applied Physics Letters 88,21252(2006))。含RoSBD-包被的磁珠和磷酸鹽緩沖液(PBS)或人IgG1的典型的實(shí)時(shí)磁性響應(yīng)，xac，顯示于圖8b中(實(shí)心點(diǎn)和實(shí)心三角)，表明RoSBD和人IgG1，第二抗體之間的非特異性相互作用不存在，也證實(shí)于圖4。然而，在存在痕量的HIV-gpl40(0.7pM)時(shí)，明顯的減少的MR信號(開口正方形)被檢測(Λ Xa。為3.5%)。有趣的是，相同摩爾濃度的Man4(為6-氨基己基糖苷，Man4-0R)，M9_Asn (來自SBA)和SBA (圖9)的存在導(dǎo)致相似的MR信號(十字和開口三角形;A Xac分 別為3.6%，3.6%和4.0)。在MR實(shí)驗(yàn)中對于HIV-gpl40，Man4-0R，M9-Asn和整個(gè)SBA清楚地觀察到特征信號減少，對RoSBD和高甘露糖型聚糖之間的直接分子相互作用提供了強(qiáng)力證據(jù)。如根據(jù)其四價(jià)的特征預(yù)期的，SBA比其他反應(yīng)快得多?？傊?，這些結(jié)果證明RoSBD和AnSBD通過新的蛋白-聚糖相互作用結(jié)合至HIV-PC中的天然HIV抗原，特異靶向HIV-1 gpl20上的Man4部分。實(shí)施例6SBD和Man4_結(jié)合蛋白之間的結(jié)構(gòu)相似性和在RoSBD上定位(Mapping)Man4結(jié)合位點(diǎn)推定的Man4結(jié)合位點(diǎn)的分子模型RoSBD的推定的Man4結(jié)合位點(diǎn)的模型建立通過使用Dali服務(wù)器將RoSBD復(fù)合物(PDB ID:2V8M)和2G12_Man4復(fù)合物(PDB ID:1ZLS)的三維結(jié)構(gòu)疊加進(jìn)行。單糖Man4為
了發(fā)現(xiàn)推定的RoSBD上5A半徑內(nèi)的結(jié)合殘基。此外，使用來自2G12-Man4復(fù)合物的Man4
相配之物，Man4適合于RoSBD-G7結(jié)構(gòu)的G7結(jié)合位點(diǎn)，以此最保守的己糖環(huán)與結(jié)合位點(diǎn)I和
II相互作用。在預(yù)計(jì)的RoSBD-Man4復(fù)合物中Man4的5 A半徑內(nèi)的殘基被標(biāo)記。RoSBD的定點(diǎn)突變RoSBD及其突變體使用基于PCR的QuikChange 定點(diǎn)突變方法(Stratagene)以pET23a-RoSBD作為模板產(chǎn)生。用于擴(kuò)增SBD衍生物的引物對被設(shè)計(jì)并列于表I中。PCR混合物包含IOng模板、0.625μ L的每種引物(10 μ Μ)，2.5 μ L反應(yīng)緩沖液(IOx), 3.125 μ LdNTP (2.5mM)，0.25 μ L Pfu Turbo DNA 聚合酶(20U/ μ L) (Stratagene)，用 ddH20 加至終體積為25 μ L。用于本研究的熱循環(huán)條件為I周期的95°C 5min和20周期的:95°C Imin (變性)，45°C至65°C 30秒(退火)和68°C 8min (延伸)，和最終的I周期的68°C IOmin0 PCR反應(yīng)在熱循環(huán)儀(9700, Applied Biosystems)中進(jìn)行。每個(gè)突變質(zhì)粒的序列通過DNA序列
分析驗(yàn)證。表1.用于定點(diǎn)突變的寡核苷酸引物。產(chǎn)生丙氨酸密碼子的突變被加下劃線。指
示-F'和-R'的引物分別包含正義和反義鏈。
權(quán)利要求
1.一種預(yù)防性地或治療性地抑制受試者HIV感染的方法，所述方法包括給予受試者有效量的特異性結(jié)合至HIV糖蛋白表位的糖類結(jié)合模塊(CBM)的抗體模擬物。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述SBM特異性結(jié)合至存在于HIV糖蛋白表位中的聚糖結(jié)構(gòu)。
3.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述HIV糖蛋白為HIVl-gpl20。
4.權(quán)利要求2所述的方法，其中所述聚糖結(jié)構(gòu)為N-連接的高甘露糖聚糖Man9GlcNAc2。
5.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述CBM為淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域(SBD)。
6.權(quán)利要求5所述的方法，其中所述SBD為選自CBM家族20、21、25、26、34、41、45、48和53的成員。
7.權(quán)利要求6所述的方法，其中所述SBD為CBM家族20。
8.權(quán)利要求6所述的方法，其中所述SBD為CBM家族21。
9.權(quán)利要求5所述的方法，其中所述SBD得自稻根霉葡萄糖淀粉酶(RoSBD)或黑曲霉葡萄糖淀粉酶(AnSBD)。
10.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述受試者為人。
11.一種藥物組合物，所述藥物組合物包含治療或預(yù)防有效量的糖類結(jié)合模塊(CBM)的抗體模擬物(免疫球蛋白類)和藥學(xué)可接受載體。
12.權(quán)利要求11所述的組合物，其中所述CBM特異性結(jié)合至存在于HIV糖蛋白表位中的富甘露糖聚糖結(jié)構(gòu)。
13.權(quán)利要求11所述的組合物，其中所述CBM為淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域(SBD)。
14.權(quán)利要求12所述的組合物，其中所述SBD得自稻根霉葡萄糖淀粉酶(RoSBD)或黑曲霉葡萄糖淀粉酶(AnSBD)。
15.權(quán)利要求11所述的組合物，所述組合物為片劑、膠囊或懸液的形式。
16.一種檢測樣品的HIV的方法，所述方法包括將特異性結(jié)合至HIV糖蛋白表位的糖類結(jié)合模塊(CBM)的抗體模擬物加入至樣品；和檢測所述抗體和所述樣品之間的結(jié)合反應(yīng)。
17.權(quán)利要求16所述的方法，其中所述CBM特異性結(jié)合至存在于糖蛋白表位中的富甘露糖聚糖結(jié)構(gòu)。
18.權(quán)利要求16所述的方法，其中所述糖蛋白為HIVl-gpl20。
19.權(quán)利要求17所述的方法，其中所述聚糖結(jié)構(gòu)為N-連接的高甘露糖聚糖Man9GlcNAc2。
20.權(quán)利要求16所述的方法，其中所述CBM為淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域(SBD)。
21.權(quán)利要求20所述的方法，其中所述SBD為選自CBM家族20、21、25、26、34、41、45、48和53的成員。
22.權(quán)利要求21所述的方法，其中所述SBD為CBM家族20。
23.權(quán)利要求21所述的方法，其中所述SBD為CBM家族21。
24.權(quán)利要求20所述的方法，其中所述SBD得自稻根霉葡萄糖淀粉酶(RoSBD)或黑曲霉葡萄糖淀粉酶(AnSBD)。
25.權(quán)利要求16所述的方法，其中所述樣品分離自人。
全文摘要
本發(fā)明提供一種抑制受試者HIV感染的方法，所述方法包括給予受試者有效量的特異性結(jié)合至HIV糖蛋白表位的糖類結(jié)合模塊(CBM)的抗體模擬物。本發(fā)明還提供一種藥物組合物，所屬藥物組合物包含治療或預(yù)防有效量的糖類結(jié)合模塊的抗體模擬物和藥學(xué)可接受載體。本發(fā)明提供預(yù)防性地或治療性地抑制受試者的HIV感染的方法，所述方法包括給予受試者有效量的特異性結(jié)合至HIV糖蛋白表位的糖類結(jié)合模塊(CBM)的抗體模擬物。
文檔編號C12Q1/70GK103097411SQ201080021113
公開日2013年5月8日 申請日期2010年5月12日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月12日
發(fā)明者張大慈, 李遠(yuǎn)川, 黃榮淵, 林淑娟, 周維宜, 劉錫輝 申請人:張大慈