專利名稱：一種多核苷酸和多肽鏈序列及其方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及重組DNA療法的領(lǐng)域。其涉及生物-信息學(xué)設(shè)計(jì)、包括前導(dǎo)肽編碼序列的人胰島素前體的人工基因的合成，在表達(dá)載體的克隆以及在有機(jī)體內(nèi)的表達(dá)，優(yōu)選畢赤酵母。本發(fā)明也涉及獲得蛋白質(zhì)前體分子以及后續(xù)的前體分子向功能蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)變的下游工藝方法。
背景技術(shù)：
人胰島素是一種參與血液和體液中的葡萄糖調(diào)節(jié)的多肽激素。當(dāng)缺乏人胰島素時(shí)會(huì)導(dǎo)致1型或2型糖尿病。1型是典型的胰島素依賴糖尿病。在早期時(shí)，胰島素曾使用來自于動(dòng)物源(牛和豬)的進(jìn)行補(bǔ)給，其持續(xù)長期給藥經(jīng)常導(dǎo)致不良的過敏性免疫反應(yīng)或過敏反應(yīng)。下一代的人胰島素通過重組DNA技術(shù)在大腸桿菌(E. coli)中制備得到，并成功地應(yīng)用在過去的這些年中。雖然已經(jīng)通過已申請專利的方法使重組人胰島素在不同的宿主中進(jìn)行表達(dá)來滿足糖尿病治療的需要，但是隨著這種需求的增長迫使人類去探索新的和改進(jìn)的方法以生產(chǎn)商業(yè)上可行數(shù)量的重組人胰島素。目前在市場上可獲的重組人胰島素是通過至少三種不同的表達(dá)系統(tǒng)，即大腸桿菌、畢赤酵母和多形漢遜酵母制得的。大腸桿菌中的過度表達(dá)導(dǎo)致蛋白質(zhì)累積為不溶包涵體。對來自包涵體的重組胰島素的溶解和重折疊需要使用諸如鹽酸胍、尿素等離液劑化學(xué)品，并且即使在深度純化后最終產(chǎn)品中仍會(huì)有痕量的這些化學(xué)品的存在，這是有危險(xiǎn)的?？蛇x地，蛋白質(zhì)可在酵母系統(tǒng)中表達(dá)并以非常高水平的溶解形式分泌到培養(yǎng)基中。然而，由于未知的原因，不同的蛋白質(zhì)在每個(gè)酵母系統(tǒng)中獲得的表達(dá)水平不同。人胰島素的兩條鏈分別用兩種不同的載體表達(dá)，并在純化后在體外組裝在一起。 通過化學(xué)方法使得兩條鏈之間以二硫鍵連接。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明涉及如SEQ ID NO 2所述的多核苷酸序列；如SEQ ID NO 1所述的多肽序列；一種用于獲得具有如SEQ ID NO :1所述的多肽序列的重組胰島素前體分子的方法，所述方法包括以下步驟a)通過裝配聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(assembly PCR)合并SEQ ID NO :3至觀的沈個(gè)寡核苷酸來合成如SEQ ID NO :2所述的多核苷酸序列，并將合成的序列插入至載體中，b)使用所述載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，然后通過抗生素篩選宿主選擇；以及C) 發(fā)酵所選擇的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞并原位捕獲胰島素前體分子以獲得具有如SEQ ID N0:1所述的多肽序列的前體；一種用于在發(fā)酵過程原位捕獲蛋白質(zhì)前體分子的下游工藝方法，所述方法包括以下步驟a)將在發(fā)酵過程中獲得的發(fā)酵產(chǎn)物同步泵入中空纖維收集系統(tǒng)中以獲得滲析物和滯留物，b)將滯留物回收入發(fā)酵罐中，以及c)使所述滲析物通過離子交換色譜柱，然后用TRIS洗脫緩沖液洗脫來獲得所述的蛋白質(zhì)前體分子；一種用于原位轉(zhuǎn)換蛋白質(zhì)前體分子為功能蛋白質(zhì)分子的下游工藝方法，所述方法包括a)通過超濾膜包(TFF Cassette)濃縮所述前體分子，并將濃縮物與有機(jī)溶液混合以獲得滯留物反應(yīng)混合物，b)將所述反應(yīng)混合物通過TPCK胰蛋白酶固定柱進(jìn)行培養(yǎng)以獲得蛋白酯，以及C)將酯加入解封閉緩沖液(deblocking buffer)中，然后通過疏水相互作用色譜柱獲得所述功能蛋白分子；一種用于從具有所述SEQ ID NO :1多肽序列的前體分子獲得重組胰島素分子的方法， 所述方法包括以下步驟a)通過裝配聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)合并SEQ ID NO 3至28的沈個(gè)寡核苷酸來合成如SEQ ID NO :2所述的多核苷酸序列，b)將合成的序列插入至載體中，并使用所述載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，然后通過抗生素篩選宿主選擇，c)發(fā)酵所選擇的宿主細(xì)胞，然后通過下游工藝原位捕獲所述胰島素前體，以及d)原位轉(zhuǎn)變具有如SEQ ID NO :1所述的多肽序列的胰島素前體分子為重組胰島素分子；重組的載體包括如SEQ ID NO :2所述的多核苷酸序列；以及重組宿主細(xì)胞，通過引入包含如SEQ ID NO :2所述的多核苷酸序列的載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化；


1道100bp DNA梯度以及2-5道裝配基因擴(kuò)增(擴(kuò)增產(chǎn)物大小640bp，還有AOXl 區(qū)域圖加凝膠電泳-第二次PCR的產(chǎn)物用1 %瓊脂糖凝膠在TAE緩沖液中檢測。瓊脂糖凝膠灌制上樣量-1.5μ 1的蔗糖染料+5 μ 1-10 μ 1的PCR產(chǎn)物標(biāo)記物-IOObp的標(biāo)記物 0. 8-1. 0 μ 1+2 μ 1 milliQ+1. 5 染料PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小為48;3bp以及在凝膠中觀察為大約500bp圖03 使用BamHl和Notl對pPIC9K載體的雙酶切1 道lkb 的 DNA 梯度2道酶切前的pPIC9K3道酶切后的pPIC9K圖04 用BamHl和Notl對目標(biāo)基因的雙酶切1 道IOObp 的 DNA 梯度2道基因雙酶切圖05 具有經(jīng)設(shè)計(jì)和測序的密碼子以及氨基酸詳細(xì)說明的DNA序列圖譜圖06 在不同誘導(dǎo)階段的發(fā)酵樣品的SDS-PAGE(15%)圖，顯示胰島素前體持續(xù)增加的表達(dá)并分泌入發(fā)酵培養(yǎng)基。1道標(biāo)準(zhǔn)PIP
2道蛋白質(zhì)分子量標(biāo)記；
3道誘導(dǎo)0小時(shí)的發(fā)酵樣品
4道誘導(dǎo)6小時(shí)的發(fā)酵樣品
5道誘導(dǎo)12小時(shí)的發(fā)環(huán)_樣品
6道誘導(dǎo)M小時(shí)的發(fā)環(huán)_樣品
7道誘導(dǎo)30小時(shí)的發(fā)酵樣品；8道誘導(dǎo)36小時(shí)的發(fā)酵樣品；以及9道誘導(dǎo)42小時(shí)的發(fā)酵樣品；圖07 發(fā)酵樣品在不同誘導(dǎo)階段的HPLC圖，[相對于發(fā)酵誘導(dǎo)階段時(shí)間的推移，胰島素前體的量]。隨著誘導(dǎo)期時(shí)間的增長，前體的量逐步增加。增加的量與以毫伏表示的峰的大小相關(guān)。圖08 標(biāo)準(zhǔn)前體的與發(fā)酵(最終)樣品中的前體的比較HPLC圖，顯示選擇性捕獲的胰島素前體。標(biāo)準(zhǔn)品相關(guān)的峰值由lmg/mL的蛋白質(zhì)濃度獲得。發(fā)酵樣品相關(guān)的峰值由 1 1稀釋的培養(yǎng)液獲得。50%稀釋的FMN培養(yǎng)液的峰值大于標(biāo)準(zhǔn)前體的峰值。相應(yīng)>2g/ lit。圖09 胰島素前體(PIP)到人胰島素丁基酯(轉(zhuǎn)肽產(chǎn)物)的酶轉(zhuǎn)化的高效液相色譜(HPLC)圖。在轉(zhuǎn)肽反應(yīng)前，載入所述PIP。在胰蛋白酶消化和轉(zhuǎn)肽之后，產(chǎn)物(HI酯)也載入HPLC中以確定反應(yīng)的完成。前體與其轉(zhuǎn)肽產(chǎn)物之間質(zhì)量平衡基本匹配。圖10 解離TP產(chǎn)物以獲得人胰島素并載入HPLC中以知曉其純度以及圖。在質(zhì)量平衡方面，其與PIP(前體)匹配。圖09中的PIP以及本圖中的HI以同樣濃度(lmg/mL) 載入。(按照英國藥典2007純化的人胰島素的HPLC圖)。圖11 圖表顯示發(fā)酵流程圖，通過具有0. 2μΜ濾膜的中空纖維收集系統(tǒng)原位收集和澄清發(fā)酵液。收集后滯留的細(xì)胞直接與新鮮培養(yǎng)基一起返回發(fā)酵桶中。圖12 圖表顯示了在陽離子交換色譜柱中濃縮以及原位捕獲人胰島素前體，然后通過在TPCK胰蛋白酶固定柱(TPCK trypsin immobilized column)中原位酶切和轉(zhuǎn)肽將該人胰島素前體轉(zhuǎn)變成為胰島素丁基酯的流程圖。將人胰島素酯分離出(deblocked)并通過HIC柱得到純化的人胰島素。圖13純化的人胰島素與商購制劑的SDS PAGE(15% )的比較；
道1 胰島素前體；
道2 蛋白質(zhì)分子量標(biāo)記物；
道3 純化的胰島素前體；
道4:分離后的人胰島素；
道5 精制后的人胰島素以及
道6 商購重組人胰島素(Huminsulin R)
圖14胰島素前體和純化HI以及市售HI的蛋白質(zhì)印跡圖像(Westernimage)
道1 預(yù)染色的蛋白質(zhì)標(biāo)記物
道2 捕獲自FMN培養(yǎng)液的胰島素前體
道3 純化的 bigtec 人胰島素(bigtec human Insulin)
道4:商購的人胰島素
圖15密碼子配對優(yōu)化寡核苷酸裝配序列(裝配聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的產(chǎn)物)
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明涉及如SEQ ID NO 2所述的多核苷酸序列。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述多核苷酸編碼一種包括重組人胰島素前體和信號肽的融合多肽。本發(fā)明涉及如SEQ ID NO 1所述的多肽序列。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述多肽是一種包括重組人胰島素前體和信號肽的融合多肽。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，所述多肽序列對應(yīng)于如SEQ ID NO 2所述的多核苷酸序列，其中該多核苷酸經(jīng)轉(zhuǎn)錄后修飾和密碼子優(yōu)化獲得相應(yīng)的如SEQ ID NO 1的多肽。本發(fā)明涉及一種用于獲得具有如SEQ ID NO :1所述的多肽序列的重組胰島素前體分子的方法，所述方法包括以下步驟a)通過裝配聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)合并SEQ ID NO :3至觀的沈個(gè)寡核苷酸以合成如 SEQ ID NO :2所述的多核苷酸序列，并將合成的序列插入至載體中，b)使用所述載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，然后通過抗生素篩選宿主選擇，以及c)發(fā)酵所選擇的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞并原位捕獲胰島素前體分子以獲得具有如SEQ ID NO 1所述的多肽序列的前體。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，該多肽是一種包括重組人胰島素前體和信號肽的融合多肽。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，合成的多核苷酸以及載體經(jīng)過限制性內(nèi)切酶酶切將所述多核苷酸插入所述表達(dá)載體中，并且其中所述限制性內(nèi)切酶選自包括BamHI，NotI, SacI, BgIII和hell或其任意組合的組。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，所述載體選自包括pPIC9K和pPICZa的組，優(yōu)選 PPIC9K，以及其中所述宿主選自包括畢赤酵母，甲醇畢赤酵母，季也蒙畢赤酵母和卡利比克畢赤酵母的組，優(yōu)選畢赤酵母。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，通過中空纖維收集系統(tǒng)和離子交換色譜柱進(jìn)行前體分子的原位捕獲以獲得所述前體。本發(fā)明涉及一種用于在發(fā)酵過程中原位捕獲蛋白質(zhì)前體分子的下游工藝方法，所述方法包括以下步驟a)將在發(fā)酵過程中獲得的發(fā)酵產(chǎn)物同步泵入中空纖維收集系統(tǒng)中以獲得滲析物和滯留物，b)將滯留物回收入發(fā)酵罐中，以及c)使?jié)B析物通過離子交換色譜柱，然后用TRIS洗脫緩沖液洗脫以獲得所述蛋白質(zhì)前體分子。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，該滲析物包括澄清的無細(xì)胞培養(yǎng)液以及包括濃縮細(xì)胞的所述滯留物。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，其中滯留物和新鮮培養(yǎng)基一起返回發(fā)酵罐中的發(fā)酵容器，并且該滲析物通過離子交換色譜柱以捕獲所述蛋白質(zhì)前體。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，所述蛋白質(zhì)前體選擇性地結(jié)合到離子交換色譜柱的聚合物基體上，并被洗脫緩沖液洗脫。本發(fā)明涉及一種用于原位轉(zhuǎn)換蛋白質(zhì)前體分子為功能蛋白質(zhì)分子的下游工藝方法，所述方法包括
a)通過超濾膜包(TFF Cassette)濃縮前體分子，并將所述濃縮物與有機(jī)溶液混合以獲得滯留物反應(yīng)混合物，b)將所述反應(yīng)混合物通過TPCK胰蛋白酶固定柱進(jìn)行培養(yǎng)以獲得蛋白酯，以及c)將酯加入解封閉緩沖液中，然后通過疏水相互作用色譜柱獲得所述功能蛋白分子。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，將所述前體分子濃縮至大約100mg/ml至200mg/ml的范圍。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，所述有機(jī)溶液包括溶解在1 1 ν/ν的二甲基亞砜 (DMSO)甲醇中的O-叔丁基-L-蘇氨酸-叔丁基酯醋酸鹽和包含色氨酸和三氟乙酸組合的解封閉緩沖液。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，所述TPCK柱使用CaCl2和醋酸進(jìn)行平衡，并且所述疏水相互作用色譜柱使用醋酸和硫酸銨的組合進(jìn)行平衡。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，所述培養(yǎng)的時(shí)間范圍為大約1. 5小時(shí)至大約3. 5小時(shí)，而且所述培育的溫度范圍為大約15°C至大約25°C。本發(fā)明涉及一種用于從具有如SEQ ID NO :1所述的多肽序列的前體分子獲得重組胰島素分子的方法，所述方法包括以下步驟a)合成通過裝配聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)合并SEQ ID NOS :3至28的沈個(gè)寡核苷酸來合成如SEQ ID NO :2所述的多核苷酸序列，b)將合成的序列插入至載體中，并使用所述載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，然后通過抗生素篩選宿主選擇，c)發(fā)酵所選擇的宿主細(xì)胞，然后通過下游工藝原位捕獲所述胰島素前體，以及d)原位轉(zhuǎn)變具有如SEQ ID NO :1所述的多肽序列的胰島素前體分子原位為重組胰島素分子。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述多肽是一種包含重組人胰島素前體和信號肽的融合多肽。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，所述合成的多核苷酸和所述載體受到限制性內(nèi)切酶酶切將所述多核苷酸插入所述表達(dá)載體中，并且其中所述限制性內(nèi)切酶選自包括BamHI， NotI, SacI, BgIII和SacII或其任意組合的組。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，載體選自包括pPIC9K和pPICZa的組，優(yōu)選pPIC9K， 并且其中宿主選自包括畢赤酵母，甲醇畢赤酵母，季也蒙畢赤酵母和卡利比克畢赤酵母的組。在另一個(gè)本發(fā)明的實(shí)施例中，通過中空纖維收集系統(tǒng)和離子交換色譜柱進(jìn)行前體分子的原位捕獲以獲得所述前體。在另一個(gè)本發(fā)明的實(shí)施例中，通過將所述前體分子通過超濾膜包(TFF Cassette) 和TPCK胰蛋白酶固定柱進(jìn)行前體分子的轉(zhuǎn)變以獲得蛋白酯。在另一個(gè)本發(fā)明的實(shí)施例中，將該蛋白酯加入解封閉緩沖液中，然后通過疏水相互作用色譜柱獲得所述重組胰島素分子。本發(fā)明涉及一種重組載體，包含如SEQ ID NO 2所述的多核苷酸序列。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述載體選自包括pPIC9K和pPICZa的組，優(yōu)選PPIC9K。本發(fā)明涉及一種重組宿主細(xì)胞，通過引入包括如SEQ ID NO 2所述的多核苷酸序列的載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述宿主選自包括畢赤酵母，甲醇畢赤酵母，季也蒙畢赤酵母和卡利比克畢赤酵母的組，優(yōu)選畢赤酵母，并且所述載體選自包括PPIC9K及 pPICZa 的組，優(yōu)選 pPIC9K。本發(fā)明的主要目的是從頭設(shè)計(jì)和表達(dá)編碼包含如SEQ ID NO=I的氨基酸序列的 “分泌信號和重組胰島素前體融合蛋白質(zhì)”的基因。本發(fā)明涉及一種用于獲得重組人胰島素的方法，該方法包含以下步驟a)設(shè)計(jì)和構(gòu)建一種胰島素前體-信號肽融合蛋白的編碼基因；b)將所述前體-信號肽融合蛋白的編碼基因連接至載體上；c)通過轉(zhuǎn)化(電穿孔)進(jìn)宿主獲得多個(gè)拷貝的所述前體-信號肽融合蛋白的編碼基因；d)發(fā)酵轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞系以獲得重組人胰島素前體；以及e)通過有效的人胰島素前體的下游工藝獲得所述重組人胰島素。在本發(fā)明中，對核苷酸序列進(jìn)行了優(yōu)化用于提高目標(biāo)蛋白質(zhì)的表達(dá)和分泌至發(fā)酵
培養(yǎng)基中。在克隆構(gòu)建、克隆、轉(zhuǎn)化、發(fā)酵、下游工藝過程中在多個(gè)步驟進(jìn)行優(yōu)化使得產(chǎn)率、可量測性和生物效能得到總體提高。使用原位捕獲和原位轉(zhuǎn)變前體為最終產(chǎn)物以減少工藝時(shí)間、成本、人力以及節(jié)省試劑。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，通過基于在畢赤酵母中高度表達(dá)的蛋白質(zhì)的“密碼子配對頻率”對核苷酸序列進(jìn)行多級式在硅片優(yōu)化得到所述SEQ ID No. 2。通過mRNA 二級結(jié)構(gòu)預(yù)測和移去高熔點(diǎn)的莖環(huán)組織(這使得核糖體運(yùn)動(dòng)不受限制并高速進(jìn)行蛋白質(zhì)合成) 進(jìn)一步調(diào)整該序列以促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成。密碼子配對優(yōu)化密碼子優(yōu)化是一種基因優(yōu)化的方法，其中修飾所合成的基因序列以符合特定生物體的“密碼子使用模式”。在此，對于特定的氨基酸序列，選擇“最常用的密碼子”(從氨基酸的簡并密碼子列表中)用于該有機(jī)體。因此該氨基酸序列保持原樣但具有不同的DNA序列，以匹配于該有機(jī)體。然而，這沒有考慮在蛋白質(zhì)合成過程中，核糖體成對讀取的密碼子的事實(shí)。在核糖體相鄰位置上有兩個(gè)密碼子結(jié)合位點(diǎn)。通過進(jìn)行大量分析觀察到畢赤酵母通過特定形式使用“密碼子配對”。因此對所構(gòu)建的DNA序列進(jìn)行修飾以匹配“密碼子配對使用頻率”。這是一種新的且沒有報(bào)道過的用于在基因表達(dá)優(yōu)化的方法。使用一種專有的內(nèi)部開發(fā)的軟件進(jìn)行這種優(yōu)化。發(fā)現(xiàn)通過這種基因優(yōu)化(圖15)，表達(dá)水平可以提高大約30%。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，對整個(gè)基因序列(即胰島素前體及分泌信號)一起進(jìn)行優(yōu)化，由于其在表達(dá)宿主中表達(dá)單鏈蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，所述前體由大約沈個(gè)用于編碼胰島素前體-單肽融合蛋白質(zhì)的寡核苷酸構(gòu)建。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，所述載體選自包括PPIC9K和pPICZa的組，優(yōu)選 PPIC9K。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，所述克隆在PPIC9K載體上AOXl啟動(dòng)子的下游進(jìn)行。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，所述宿主選自包括畢赤酵母，甲醇畢赤酵母，季也蒙畢赤酵母和卡利比克畢赤酵母的組，優(yōu)選畢赤酵母。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，所述克隆通過同時(shí)多基因插入以及使用抗生素直接篩選以使得高拷貝數(shù)量的基因進(jìn)入宿主。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，所述發(fā)酵是在優(yōu)化的溫度范圍、通風(fēng)、細(xì)胞密度以及補(bǔ)加條件下，在改良的低鹽基本培養(yǎng)基中進(jìn)行，使得可以高水平的表達(dá)以及使容易的進(jìn)行下游工藝。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，發(fā)酵工藝和收集工藝是一起進(jìn)行的。包括連接于發(fā)酵罐的中空纖維收集組件，用于在收集過程中原位過濾培養(yǎng)液。將發(fā)酵罐中的培養(yǎng)物抽泵入中空纖維過濾盒中以分離無細(xì)胞培養(yǎng)液和細(xì)胞。過濾后的細(xì)胞與培養(yǎng)基一起再回收至發(fā)酵容器中以保持培養(yǎng)容積以及促進(jìn)培養(yǎng)物的正常生長。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，對人胰島素前體的捕獲與在固定胰蛋白酶柱中胰蛋白酶的消化和轉(zhuǎn)肽作用一起進(jìn)行。其包括將來自中空纖維過濾系統(tǒng)的無細(xì)胞培養(yǎng)液中的胰島素前體結(jié)合到裝有高結(jié)合能力合成樹脂的色譜柱上。將未結(jié)合的與新鮮培養(yǎng)基一起再次導(dǎo)回發(fā)酵容器中。結(jié)合的蛋白質(zhì)被洗脫并進(jìn)一步引入裝配有固定至基質(zhì)的TPCK胰蛋白酶的柱中。 在引入胰蛋白酶柱的過程中，洗脫的前體與必要的緩沖液混合并達(dá)到想要的PH。所述前體在柱中通過胰蛋白消化和轉(zhuǎn)肽作用轉(zhuǎn)變?yōu)橐葝u素酯。然后將所述胰島素酯從柱中洗脫并解離以轉(zhuǎn)變?yōu)槿艘葝u素并凍干。最后人胰島素通過反相色譜精制至最高的純度。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基具有的pH范圍為大約4. 0-5. 0，優(yōu)選在發(fā)酵初始階段為大約4. 75，在甘油階段大約4. 0-5. 0，優(yōu)選大約4. 8，以及在誘導(dǎo)階段
4.0-5. 0，優(yōu)選為大約4. 95。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，所述發(fā)酵溫度范圍在間歇反應(yīng)階段(batch phase) 為大約^_30°C，優(yōu)選為30°C;在甘油進(jìn)料階段大約^_30°C，優(yōu)選為大約29. 5°C;在甲醇誘導(dǎo)階段大約27- °C，優(yōu)選為大約28. 0°C。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，所述發(fā)酵通風(fēng)范圍在間歇反應(yīng)階段為大約 0. 5-1. 5VVM純凈空氣，優(yōu)選為IVVM純凈空氣；在甘油階段為大約0. 5-1. 5VVM空氣氧氣， 優(yōu)選大約1. OVVM空氣氧氣(大約90 10)；以及在甲醇階段(誘導(dǎo)階段)為大約1.5VVM 空氣氧氣，初始比率為大約85 15，最終比率為40 60，大約每五小時(shí)遞增/減少大約5。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，在發(fā)酵過程中進(jìn)行甘油補(bǔ)料以促進(jìn)細(xì)胞在誘導(dǎo)之前高密度增長，并持續(xù)至細(xì)胞密度(0D_)達(dá)到大約500，然后指數(shù)補(bǔ)料甲醇以促進(jìn)目標(biāo)蛋白表達(dá)的增加。在本發(fā)明中，從頭設(shè)計(jì)了具有修飾核苷酸序列的合成基因，用于編碼包括ΜΑΤ-α 分泌信號，間隔區(qū)，以及胰島素前體的基因。使用大量的生物信息學(xué)分析以獲得一個(gè)新型的編碼序列，基于畢赤酵母中高度表達(dá)的蛋白質(zhì)的核苷酸模式(nucleotide patterns)。所述合成基因(482bp)通過合成沈個(gè)寡核苷酸并通過裝配聚合酶鏈反應(yīng)將這沈個(gè)寡核苷酸合并構(gòu)建而成。已知使用甲醇可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子的畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)有非常高的表達(dá)水平。蛋白質(zhì)可以分泌蛋白的形式進(jìn)行表達(dá)，因此其純化變得簡單。酵母菌株的倍增時(shí)間容易控制，最小的生長需求，可使用常規(guī)的載體、宿主系統(tǒng)和篩選方法，使畢赤酵母成為研究中理想的和具有吸引力的系統(tǒng)。能在基本礦物培養(yǎng)基中達(dá)到高的細(xì)胞密度和易于誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)增加了使用本系統(tǒng)進(jìn)行重組蛋白表達(dá)的便利性。通過裝配聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)得到的胰島素前體融合蛋白質(zhì)基因通過DNA測序進(jìn)行證實(shí)(圖5)并克隆進(jìn)畢赤酵母表達(dá)載體PPIC9K。該載體在線性化后通過電擊法轉(zhuǎn)化進(jìn)畢赤GS115菌株。表達(dá)盒通過同源重組整合進(jìn)畢赤宿主系統(tǒng)中。通過抗生素篩選挑出具有高拷貝數(shù)插入片段的克隆。挑出顯示出對抗生素慶大霉素(G418)的最大抗性的克隆并篩選它們表達(dá)和分泌胰島素前體至培養(yǎng)基中的能力。有希望的克隆通過7升容量的發(fā)酵容器進(jìn)性評估。胰島素前體的發(fā)酵產(chǎn)量大約為1.5gm/升。通過對工藝額外的優(yōu)化可進(jìn)一步提高該發(fā)酵產(chǎn)量。從培養(yǎng)液中捕獲該分泌胰島素前體、經(jīng)純化以及酶修飾獲得人胰島素。最終產(chǎn)物在調(diào)節(jié)血糖方面的生物活性已在大鼠及小鼠上得到證實(shí)，并且發(fā)現(xiàn)與商購的治療用重組人胰島素制品的活性相當(dāng)。因此，已在多個(gè)步驟優(yōu)化該工藝，其產(chǎn)生了累加效果并導(dǎo)致產(chǎn)量的提高。一些該系統(tǒng)中主要的優(yōu)化參數(shù)的名稱為，整個(gè)編碼區(qū)的“密碼子配對序列”，mRNA的穩(wěn)定性、多拷貝的插入、優(yōu)化培養(yǎng)基成分及生長及誘導(dǎo)參數(shù)。表達(dá)盒整體進(jìn)入宿主基因組確保在重復(fù)子代培養(yǎng)后重組菌株的性能和穩(wěn)定性。畢赤酵母系統(tǒng)中多拷貝基因表達(dá)的可能性使得將細(xì)胞的表達(dá)、折疊及分泌的能力開發(fā)至最大成為可能。人胰島素作為單鏈蛋白質(zhì)的表達(dá)使得能夠形成合適的二硫化物橋鍵，導(dǎo)致合適的折疊使得分子具有生物活性。進(jìn)一步的本發(fā)明的工藝，其在體外進(jìn)行而且危險(xiǎn)化學(xué)品的使用保持最低，是理想的用于大規(guī)模以及商業(yè)生產(chǎn)重組人胰島素的方法。發(fā)酵的產(chǎn)量顯著高于已報(bào)道的文獻(xiàn)以及未報(bào)道的市場數(shù)據(jù)。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，發(fā)酵產(chǎn)量較高。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，使用高效合成聚合樹脂進(jìn)行捕獲和純化工藝使得使用最小單元操作獲得提高的回收和純度，如以下實(shí)施例所述。合成樹脂的使用提高了工藝的穩(wěn)定性，嚴(yán)格的衛(wèi)生條例以及易于規(guī)?；沟迷摴に囋谡w上是技術(shù)經(jīng)濟(jì)可行的。通過以下實(shí)施例進(jìn)一步詳述本發(fā)明。然而，這些實(shí)施例不應(yīng)視為對本發(fā)明范圍的限制。實(shí)施例實(shí)施例1 基因構(gòu)建以及克隆產(chǎn)生設(shè)計(jì)并自行合成用于編碼融合蛋白質(zhì)“Mat-α -胰島素前體”的沈個(gè)寡核苷酸[如 SEQ3所述]。這些寡核苷酸通過裝配聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)進(jìn)行組裝。所述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶BamHI和NotI (圖4)進(jìn)行雙酶切，并使用T4DNA連接酶連入經(jīng)相同處理的載體PPIC9K中(圖03)。裝配聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)
寡核苷酸的主儲液重懸于水中并且保存在Bioserve的原瓶中，并保持在-20°C。 寡核苷酸的重懸使得各寡核苷酸的濃度為IOOpm/ μ 1(1 UM= Ip mole/ μ 1)。裝配聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)需要的各寡核苷酸的濃度為0. 1 μ Μ。將10 μ 1的各寡核苷酸稀釋至200 μ 1 (20 倍)得到5 μ M的溶液。將1 μ 1各稀釋的寡核苷酸在裝配聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)前加入PCR主混合物中。
權(quán)利要求
1.一種如SEQ ID NO :2所述的多核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的序列，其中所述多核苷酸編碼一種包含重組人胰島素前體和信號肽的融合多肽。
3.一種如SEQ ID NO :1所述的多肽序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的序列，其中該多肽是一種包含重組人胰島素前體和信號肽的融合多肽。
5.根據(jù)權(quán)利要求3的序列，其中該多肽序列對應(yīng)于如SEQID NO :2所述的多核苷酸序列，其中該多核苷酸經(jīng)轉(zhuǎn)錄后修飾和密碼子優(yōu)化以獲得相應(yīng)的如SEQ ID NO :1所述的多肽。
6.一種用于獲得具有如SEQ ID NO :1所述的多肽序列的重組胰島素前體分子的方法， 所述方法包括以下步驟a)通過裝配聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)合并SEQID NO 3至28的沈個(gè)寡核苷酸來合成如SEQ ID NO 2所述的多核苷酸序列，并將合成的序列插入至載體中，b)使用所述載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，然后通過抗生素篩選宿主選擇，以及c)發(fā)酵所選擇的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞并原位捕獲胰島素前體分子以獲得具有如SEQID NO :1所述的多肽序列的前體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中該多肽是一種包含重組人胰島素前體和信號肽的融合多肽。
8.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中合成的多核苷酸以及載體經(jīng)過限制性內(nèi)切酶酶切將所述多核苷酸插入所述表達(dá)載體中，并且其中所述限制性內(nèi)切酶選自包括BamHI，N0tI，SaCI， BgIII和hell或其任意組合的組。
9.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述載體選自包括pPIC9K和pPICZa的組，優(yōu)選 PPIC9K，以及其中宿主選自包括畢赤酵母，甲醇畢赤酵母，季也蒙畢赤酵母和卡利比克畢赤酵母的組，優(yōu)選畢赤酵母。
10.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中通過中空纖維收集系統(tǒng)和離子交換色譜柱進(jìn)行前體分子的原位捕獲以獲得所述前體。
11.一種用于在發(fā)酵過程中原位捕獲蛋白質(zhì)前體分子的下游工藝方法，所述方法包括以下步驟a)將在發(fā)酵過程中獲得的發(fā)酵產(chǎn)物同步泵入中空纖維收集系統(tǒng)中以獲得滲析物和滯留物，b)將滯留物回收入發(fā)酵罐中，以及c)使?jié)B析物通過離子交換色譜柱，然后用TRIS洗脫緩沖液洗脫以獲得所述蛋白質(zhì)前體分子。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中該滲析物包括澄清的無細(xì)胞培養(yǎng)液以及包括濃縮細(xì)胞的所述滯留物。
13.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中該滯留物直接和新鮮培養(yǎng)基一起返回發(fā)酵罐中，并且該滲析物通過離子交換色譜柱以捕獲所述蛋白質(zhì)前體。
14.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中所述蛋白質(zhì)前體選擇性地結(jié)合到離子交換色譜柱的聚合物基體上，并被洗脫緩沖液洗脫。
15.一種用于原位轉(zhuǎn)換蛋白質(zhì)前體分子為功能蛋白質(zhì)分子的下游工藝方法，所述方法包括a)通過超濾膜包濃縮前體分子，并將所述濃縮物與有機(jī)溶液混合以獲得滯留物反應(yīng)混合物，b)將所述反應(yīng)混合物通過TPCK胰蛋白酶固定柱進(jìn)行培養(yǎng)以獲得蛋白酯，以及c)將酯加入解封閉緩沖液中，然后通過疏水相互作用色譜柱獲得所述功能蛋白質(zhì)分子。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中將所述前體分子濃縮至大約100mg/ml至200mg/ml 的范圍。
17.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中所述有機(jī)溶液包括溶解在1 1 ν/ν的二甲基亞砜 (DMSO)甲醇中的O-叔丁基-L-蘇氨酸-叔丁基酯醋酸鹽和包含色氨酸和三氟乙酸組合的解封閉緩沖液。
18.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中所述TPCK柱使用CaCl2和醋酸進(jìn)行平衡，并且所述疏水相互作用色譜柱使用醋酸和硫酸銨的組合進(jìn)行平衡。
19.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中所述培養(yǎng)的時(shí)間范圍為大約1.5小時(shí)至大約3小時(shí)， 而且所述培養(yǎng)的溫度范圍為大約15°C至大約25°C。
20.一種用于從具有如SEQ ID NO :1所述的多肽序列的前體分子獲得重組胰島素分子的方法，所述方法包括以下步驟a)通過裝配聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)合并SEQID NOS :3至28的沈個(gè)寡核苷酸來合成如SEQ ID NO :2所述的多核苷酸序列，b)將合成的序列插入至載體中，并使用所述載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，然后通過抗生素篩選宿主選擇，c)發(fā)酵所選擇的宿主細(xì)胞，然后通過下游工藝原位捕獲所述胰島素前體，以及d)原位轉(zhuǎn)變具有如SEQID NO :1所述的多肽序列的胰島素前體分子為重組胰島素分子。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中所述多肽是一種包含重組人胰島素前體和信號肽的融合多肽。
22.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中所述合成的多核苷酸和所述載體經(jīng)限制性內(nèi)切酶切將所述多核苷酸插入所述表達(dá)載體中，并且其中所述限制性內(nèi)切酶選自包括BamHI，NotI, SacI, BgIII和hell或其任意組合的組。
23.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中載體選自包括pPIC9K和pPICZa的組，優(yōu)選pPIC9K， 并且其中宿主選自包括畢赤酵母，甲醇畢赤酵母，季也蒙畢赤酵母和卡利比克畢赤酵母的組，優(yōu)選畢赤酵母。
24.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中通過中空纖維收集系統(tǒng)和離子交換色譜柱進(jìn)行前體分子的原位捕獲以獲得所述前體。
25.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中通過將所述前體分子通過超濾膜包和TPCK胰蛋白酶固定柱進(jìn)行前體分子的轉(zhuǎn)變以獲得蛋白酯。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中該蛋白酯加入解封閉緩沖液中，然后通過疏水相互作用色譜柱獲得所述重組胰島素分子。
27.一種重組載體，包含如SEQ ID NO :2所述的多核苷酸序列。
28.根據(jù)權(quán)利要求27的載體，其中所述載體選自包括pPIC9K和pPICZa的組，優(yōu)選 PPIC9K。
29.一種重組宿主細(xì)胞，通過引入包含SEQ ID NO :2所述的多核苷酸序列的載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
30.根據(jù)權(quán)利要求四的宿主細(xì)胞，其中所述宿主選自包括畢赤酵母，甲醇畢赤酵母，季也蒙畢赤酵母和卡利比克畢赤酵母的組，優(yōu)選畢赤酵母，并且所述載體選自包括PPIC9K及 pPICZa 的組，優(yōu)選 pPIC9K。
全文摘要
本發(fā)明涉及重組DNA療法的領(lǐng)域。其涉及生物-信息學(xué)設(shè)計(jì)、包括前導(dǎo)肽編碼序列的人胰島素前體的人工基因的合成，在表達(dá)載體的克隆以及在有機(jī)體內(nèi)的表達(dá)，優(yōu)選畢赤酵母。本發(fā)明也涉及獲得蛋白質(zhì)前體分子以及后續(xù)的前體分子向功能蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)變的下游工藝方法。
文檔編號C12N15/17GK102439154SQ201080020419
公開日2012年5月2日 申請日期2010年3月12日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月12日
發(fā)明者基魯巴卡納·納文·庫馬爾, 文卡塔·拉馬錢德拉·拉奧·瓦薩瑪塞蒂伊, 皮拉里斯蒂·文卡塔·蘇巴拉奧, 穆拉克卡普爾斯·納拉亞南·馬努基, 錢德拉塞卡爾·巴斯卡拉·奈爾, 馬杜胡里·巴利加 申請人:比格科技私人有限公司