專利名稱：具有產生甲基萘醌的優(yōu)異能力的菌株的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及具有產生甲基萘醌的優(yōu)異能力的菌株。
背景技術：
甲基萘醌(menaquinone)或維生素K2參與蛋白中某些谷氨酸殘基的羧化以形成Y -羧基谷氨酸殘基(縮寫為Gla-殘基)。改性殘基通常(但不總是)位于稱為Gla域的特定蛋白域中。Gla-殘基通常參與鈣的結合。Gla-殘基對所有已知的Gla-蛋白的生物活性而言均是必不可少的(Furie B,Bouchard BA,Furie BC ；Blood 93(6) :1798-808)。迄今為止，已經發(fā)現(xiàn)14個具有Gla域的人蛋白，它們在三種生理過程的調控中起著關鍵作用，例如血液凝固(凝血酶原(凝血因子II)、凝血因子VII、IX、X、蛋白C、蛋白S和蛋白Z);骨代謝(骨鈣蛋白，也稱為骨Gla-蛋白(BGP)和基質Gla蛋白(MGP);以及血管生物學。
因此，甲基萘醌缺乏癥可以誘導若干病理，例如出血、凝固機能障礙、骨質疏松癥.....。通常，被認為特別易患甲基萘醌缺乏癥的患者群體是新生兒、老年人、患有肝、膽或腸機能障礙的患者和長期用抗生素治療的患者?，F(xiàn)有技術建議了補充這些患者的甲基萘醌缺乏的若干方法。這些方法中的一種是向這些患者施用產生甲基萘醌的細菌。事實上，甲基萘醌由腸內菌叢產生，尤其由大腸桿菌(Escherichia coli)、枯草桿菌(Bacillus subtilis)和類桿菌(Bacteroides)亞種類的細菌產生。甲基萘醌也由若干乳酸菌產生，例如雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、乳酸球菌屬(Lactococcus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、腸球菌屬(Enteroccocus)和丙酸桿菌屬(Propionibacterium)。特別是,最近已經在WO 2008/040793中公開能夠比相應的野生型菌株產生更多甲基萘醌的乳酸乳球菌乳脂亞種(Lactococcus lactis subsp. cremoris)的特定變種。然而，擁有能夠產生更多量甲基萘醌的菌株是非常令人感興趣的。發(fā)明簡述本發(fā)明涉及具有產生甲基萘醌的優(yōu)異能力的菌株。事實上，本發(fā)明人在他們的研究期間發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的特定菌株具有比迄今為止已知的其他菌株更優(yōu)異的產生甲基萘醌的能力。這些菌株已經根據(jù)布達佩斯條約以以下保藏號保藏CNCM 1-4128、DSM 23476、DSM23477、DSM 23478、DSM 23479。本發(fā)明尤其涉及這些菌株及其變種在產生甲基萘醌中的用途。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及具有比迄今為止已知的其他菌株更優(yōu)異的產生甲基萘醌的能力的菌株。本發(fā)明的一個目的涉及由Danisco France SAS(20,rue de Brunei, 75017 Paris,France)根根據(jù)布達佩斯條約于2009年2月24日保藏在法國培養(yǎng)物和微生物國家保藏中心(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes)(CNCM,Institut Pasteur,25, rue du Docteur Roux, 75724 Paris cedex 15, France)的保藏號為 CNCM I-4I28 的乳酸乳球菌乳脂亞種(Lactococcus lactis subsp. cremoris)的菌株或其變種。菌株CNCM1-4128或其變種產生大量甲基萘醌。特別地，本發(fā)明人顯示，當用試驗A測定時，每IOOg用所述菌株發(fā)酵的乳液中，菌株CNCM 1-4128產生至少g的甲基萘醌。通常，當用本發(fā)明試驗A測定時，每IOOg用所述變種發(fā)酵的乳液中，菌株CNCM1-4128的變種產生至少7 ii g,特別地至少8 ii g,更特別至少9 ii g,更特別至少10 u g,更特另Ij至少IlU g，最特別至少 12 y g的甲基萘醌。試驗A在實驗部分完整描述。簡言之，試驗A包括以下步驟-用5.IO4到107Cfu/mL的待測試菌株接種含有IOOmL脫脂UHT乳液的兩個燒瓶，-在不攪拌下在23°C到30°C范圍中選定的恒溫水浴中培養(yǎng)接種的燒瓶，-用CinacSystem (Ysebaert System)的pH探針測定并記錄兩個燒瓶之一的pH變化，-當pH到達4.60+/-0. I時，將沒有測定pH的燒瓶溫度冷卻到6°C以停止培養(yǎng)，-將所述燒瓶在6°C下貯存14h到20h，-手工均化乳液，-進行甲基萘醌的化學提取并根據(jù)方案P測定甲基萘醌的量。在本發(fā)明的另一個實施方式中，當用試驗B測定時，每IOOg凍干細胞中，菌株CNCM1-4128的變種產生至少200 u g，特別地至少230 u g，更特別至少260 u g的甲基萘醌。試驗B在實驗部分完整描述。簡言之，試驗B包括以下步驟-在30°C下在50ml的M17-乳糖肉湯培養(yǎng)基(BiokarBK088HA)中培養(yǎng)I. IO2至Ij
I.107cfu/ml的待測試菌株14h到20h，-使25ml的培養(yǎng)液以8000rpm離心10分鐘，-去除上清液，將沉淀物再懸浮在25ml的胰化蛋白胨鹽溶液(0.1%胰化蛋白胨，0.85%鹽)中，-使再懸浮培養(yǎng)液以8000rpm離心10分鐘，-去除上清液，將沉淀物再懸浮在10%(w/w)的25ml重構奶粉中，-將細胞懸液置于凍干機中，-獲得2到4克凍干細胞，-根據(jù)方案P進行甲基萘醌的化學提取并測定甲基萘醌的量。方案P如下由IOml發(fā)酵乳(用于試驗A)或IOml的凍干細胞在乙醇/水(50/50V/V)中的十倍稀釋液(用于試驗B)組成的樣品和5ml IN的HCl混合。然后該樣品在100 C的水浴中加熱lOmin。然后，在管中加入IOml異丙醇。將該管在配備有超聲的22°C (+/_3°C )的水浴中放置lOmin。在該管中加入5ml己燒。通過潤旋混合該管5min。以4600rpm離心懸液5min。然后收獲有機相，并再次以4600rpm離心5min。然后收獲有機相，并用高速真空系統(tǒng)濃縮，以獲得干燥產物。所述干燥產物用Iml乙醇再水合，并在0.45 iim過濾器上過濾。將該提取物注入HPLC體系中。用Hojo K.等人描述的方法“Quantitative measurement of tetrahydromenaquinone-9 cheese fermented byprop ion ibacteria^, J. dairy Science, 2007,90, 9. 4078-4083 進行甲基萘酉昆的分離和檢測。用Zn進行后置柱還原甲基萘醌后，通過熒光計進行檢測。維生素Kl用作提取/純化步驟的內標，MK-4 (Sigma V9378)用作定量的外部校準。本發(fā)明也涉及由Danisco Deutschland GmbH (Busch-Johannsen-Str. I, 25899Niebu 11, Germany)根據(jù)布達佩斯條約于2010年3月24日保藏在德國微生物菌種保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen)(DSMZ, Inhoffenstr. 7B,D-38124 Braunschweig, Germany)的保藏號為 DSM 23476 的乳脂乳酸乳球菌(Lactococcuslactis spp. cremoris)的菌株或其變種。菌株DSM 23476或其變種產生大量的甲基萘醌。當用本發(fā)明試驗C測定時，每g凍干細胞中，菌株DSM 23476的變種通常產生至少25 y g的甲基萘醌。
在一個實施方式中，當用本發(fā)明試驗C測定時，每g凍干細胞中，菌株DSM 23476的變種通常產生至少30 u g,特別地至少35 u g,更特別至少40 u g,更特別至少45 u g,更特別至少50 u g，更特別至少55 u g，最特別至少60 ii g的甲基萘醌。本發(fā)明也涉及由Danisco Deutschland GmbH (Busch-Johannsen-Str. I, 25899Niebull, Germany)根據(jù)布達佩斯條約于2010年3月24日保藏在德國微生物菌種保藏中心(DSMZ, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, Germany)的保藏號為 DSM 23477 的乳脂乳酸乳球菌(Lactococcus lactis spp. cremoris)的菌株或其變種。菌株DSM 23477或其變種產生大量的甲基萘醌。當用本發(fā)明試驗C測定時，每g凍干細胞中，菌株DSM 23477的變種通常產生至少15 y g的甲基萘醌。在一個實施方式中，當用本發(fā)明試驗C測定時，每g凍干細胞中，菌株DSM 23477的變種通常產生至少20 u g，特別地至少25 u g，更特別至少30 u g，更特別至少35 u g，更特別至少40 yg的甲基萘醌。本發(fā)明也涉及由Danisco Deutschland GmbH (Busch-Johannsen-Str. I, 25899Niebull, Germany)根據(jù)布達佩斯條約于2010年3月24日保藏在德國微生物菌種保藏中心(DSMZ, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, Germany)的保藏號為 DSM 23478 的乳脂乳酸乳球菌(Lactococcus lactis spp. cremoris)的菌株或其變種。菌株DSM 23478或其變種產生大量的甲基萘醌。當用本發(fā)明試驗C測定時，每g凍干細胞中，菌株DSM 23478的變種通常產生至少30 y g的甲基萘醌。在一個實施方式中，當用本發(fā)明試驗C測定時，每g凍干細胞中，菌株DSM 23478的變種通常產生至少35 u g,特別地至少40 u g,更特別至少45 u g,更特別至少50 u g,更特別至少55 yg的甲基萘醌。簡言之，本發(fā)明試驗C包括以下步驟1)培養(yǎng)菌株1. A)貯存在低于_20°C的可存活的生理狀態(tài)中的菌株首先在30°C +/_2°C下在合成培養(yǎng)基(乳糖50g/l、酵母提取粉36g/UMnSO4 H2O lg/1,MgSO4 7 H2O lg/1)中傳代培養(yǎng)過夜；I. B)然后在25°C到35°C的溫度下、添加堿使pH范圍維持在5. 0-7. 5以及在整個步驟期間溶解的氧保持低于2%的情況下將步驟LA)后獲得的2%到5% (V/V)的第一培養(yǎng)基在合成培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)IOh到24h,2)濃縮菌株用離心分離器濃縮步驟I. B)后獲得的培養(yǎng)菌株，直到濃度為
2.1010cfu/ml到6. 10ncfu/ml ;然后使由此獲得的濃縮液冷卻到低于12°C的溫度；3)保藏菌株將30到70% (w/w)的脫脂奶粉直接加入濃縮液中，在_55°C冷凍，?；垣@得冷凍沉淀物，并在凍干機中凍干以獲得Aw為0. 05-0. 35 (用3TE Aqualab Ltd裝置測定)，4)根據(jù)本發(fā)明方案Q提取并測定甲基萘醌的量。方案Q包括以下步驟I)提取甲基萘醌(所有提取步驟在柔和的光線下進行，以防止維生素K變質)-將0.5g凍干材料溶于IOOmL納米純水中，將IOmL上述溶液加入50mL琥珀Falcon 管(0 3Ox 115mm-Ref525-0397VWR)中，-加入100U L內標(濃度為20 u g/mL在乙醇中的維生素Kl)和5mL IN的鹽酸，-將管在100°C浴中放置lOmin， -冷卻后，加入IOmL異丙醇，-超聲處理樣品IOmin,-加入5mL己燒,振搖樣品5min,以3760g離心5min并將有機層(上層)收集在15mL 的琥珀 Falcon 管(0 17x 120mm-Ref 525-0395VWR)中，重復該步驟兩次，-收集兩份有機層后,在真空蒸發(fā)器Speed-Vac中蒸發(fā)干燥(大約30min),-將殘余物溶解在ImL乙醇中，-樣品通過Nylon0. 45 U m過濾器過濾并放入HPLC小瓶中，2)通過HPLC測定樣品中甲基萘醌的量。HPLC 分析與熒光計檢測器偶聯(lián)的高效液相色譜用于分析維生素K。不同形式的維生素K在反相柱上分離并通過后置柱還原。維生素K2的經鑒定并測定的形式
維生素 K2(MK-n) MK-4B
mk-5 ^rV
MK-7on
MK-8
MK-9
MK-IO
用作內標的維生素K1
O產物和溶液-維生素Kl，Sigma V3501-1G, CAS 84-80-0-維生素K2，(MK-4)，Sigma V9378-250MG，CAS 11032-49-8流動相
-向含有830mL甲醇和170mL乙醇的燒瓶中添加0.68g醋酸鈉、I. 36g氯化鋅和300 ii L 醋酸。-振搖混合物并超聲處理lOmin。用反相Agilent HPLC 1100和熒光檢測器進行分析。為改善維生素K的檢測靈敏性，在氫醌中分離后用鋅金屬通過化學還原法來還原維生素K。氫醌比醌更具熒光性。還原:酉昆+2e +2H. — H2Q (氫酉昆)E0 = +0. 70V氧化Zn— Zn2++2e_E0 = -0. 76V平衡醒+2H++Zn — H2Q (氧醒)+Zn2+分析條件* 柱Capcell Pak 5 U m SG_C18，250x 4. 6mm(Phenomenex)* 后置柱還原Reactor post column zinc, 20x 4mm.*流動相-83%甲醇-17% 乙醇-5mM 醋酸鈉
-IOmM ZnCl2-5mM 醋酸*流速lmL/min (等度洗脫)* 柱溫55°C* 檢測入 ex = 220nm,入 em = 436nm* 注入體積IOii L甲基萘醌定量內標(維生素Kl)用于計算各樣品制備的提取/純化產率。對于該技術的校準，獲得維生素K2，(MK-4)，Sigma V9378-250MG的校準曲線。MK-4的響應系數(shù)用于其它形式的MK。允許將用于各MK-形式的樣品中的峰值表面積轉換成MK-4當量濃度。此外，對各MK形式，通過考慮MK-4和所考慮的MK形式之間的分子量差異來計算各形式的質量濃度。例如，MK4的分子量是512g/mol，MK9的分子量是852g/mol，因此I y g的MK4的峰值表面積正好和I. 66 ii g的MK9的峰值表面積相同。該計算原則用于各MK形式。本發(fā)明涉及由Danisco Deutschland GmbH(Busch-Johannsen-Str. I,25899Niebull, Germany)根據(jù)布達佩斯條約于2010年3月24日保藏在德國微生物菌種保藏中心(DSMZ, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, Germany)的保藏號為 DSM 23479 的費氏丙酸桿菌謝氏亞種(Propionibacterium freudenreichii subsp. Shermanii)的菌株或其變種。菌株DSM 23479或其變種產生大量的甲基萘醌。當用本發(fā)明試驗D測定時，每IOOg用所述變種發(fā)酵的乳液中，菌株DSM 23479的變種通常產生至少15 y g的甲基萘醌。在一個實施方式中，當用本發(fā)明試驗D測定時，每IOOg用所述變種發(fā)酵的乳液中，菌株DSM 23479的變種通常產生至少15 u g，特別地至少20 u g，更特別至少25 y g的甲基萘醌。本發(fā)明試驗D包括以下步驟-用5.IO4到107Cfu/mL的待測試菌株接種含有IOOmL脫脂UHT乳液的兩個燒瓶，所述乳液補充有I. 6mL的純D-L乳酸和0. 2%的酵母提取粉并在110°C下熱處理20分鐘，-在不攪拌下在23°C到30°C范圍中選定的恒溫水浴中培養(yǎng)接種的燒瓶，-用CinacSystem (Ysebaert System)的pH探針測定并記錄兩個燒瓶之一的pH變化，-當pH到達4.60+/-0. I時，將沒有測定pH的燒瓶溫度冷卻到6°C以停止培養(yǎng)，-將所述燒瓶在6°C下貯存14h到20h，
-手工均化乳液，-進行甲基萘醌的化學提取并根據(jù)本發(fā)明方案P測定甲基萘醌的量。根據(jù)本發(fā)明，“變種”意指-本發(fā)明菌株的天然變種，即由本發(fā)明菌株在選定培養(yǎng)基中培養(yǎng)后自發(fā)獲得的變種。因此天然變種不通過操縱基因(operator)的任何遺傳操縱而僅通過菌株的天然突變和菌株在適當培養(yǎng)基中的選擇而獲得，或-本發(fā)明菌株的變種在其基因組中含有至少一個突變，所述突變由遺傳工程誘導，例如通過定向誘變或隨機誘變誘導。例如，可用紫外輻射或致突變化合物例如亞硝酸、甲磺酸乙酯、N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍、N-乙基-N-亞硝基脲、吖啶橙、普羅黃素進行隨機誘變。根據(jù)本發(fā)明，“突變”意指本發(fā)明菌株的基因組中至少一個核苷酸的增加、缺失或替換。因此，本發(fā)明或其變種的菌株就健康利益而言以及就市場而言是非常令人感興趣的。例如,在歐洲，當一種產品的每一份食物大小(更具體地每IOOg或每IOOmL產品)包含至少11. g的甲基萘醌時，它可被標記為維生素K2 “源”。本發(fā)明的另一目的涉及本發(fā)明菌株或其變種在產生甲基萘醌中的用途。本發(fā)明的一種應用是利用本發(fā)明菌株及其變種的優(yōu)異性質產生工業(yè)規(guī)模的大量甲基萘醌。因此甲基萘醌可從本發(fā)明菌株的培養(yǎng)液中提取并用于各種制劑，例如用于藥物制劑、飼料和食品制劑例如乳制品或膳食補充劑。因此本發(fā)明也涉及用于產生甲基萘醌的方法，包括在基質中培養(yǎng)本發(fā)明菌株或其變種的步驟。所述基質可以選自本領域技術人員已知的任何適當基質。適當基質的例子是乳基質，特別是選自天然或重構乳、脫脂乳或乳基介質和基于乳液來源產品的培養(yǎng)基。本發(fā)明的另一目的是本發(fā)明菌株或其變種在治療人或動物體的方法中的用途。通常，本發(fā)明菌株或其變種可用于治療與甲基萘醌缺乏有關的疾病，例如骨骼、血管和/或皮膚健康疾病，例如骨質疏松癥、心血管疾病、血壓機能障礙、血液凝固、皮膚彈性喪失。因此本發(fā)明涉及治療選自以下的疾病的方法骨骼疾病，例如骨質疏松癥；血管疾病，例如心血管疾病、血壓機能障礙和血液凝固；和皮膚病,例如皮膚彈性喪失；所述方法包括將治療有效量的本發(fā)明菌株或其變種給藥于需要其的患者的步驟。本發(fā)明也涉及提高鈣固定在骨骼上的方法、維持或改善骨骼構造和/或抵抗力的方法，和/或改善骨骼生長的方法，所述方法包括將治療有效量的本發(fā)明菌株或其變種給藥于需要其的患者的步驟?；蛘撸景l(fā)明涉及將本發(fā)明菌株或其變種用于提高鈣固定在骨骼上的方法、維持或改善骨骼構造和/或抵抗力的方法，和/或改善骨骼生長的方法。
本發(fā)明使用的術語“治療(treating) ”或“治療(treatment) ”意指逆轉、緩和、抑制該術語適用的疾病或病癥的發(fā)展，或預防該術語適用的疾病或病癥。如本發(fā)明所使用，“患者”意指可能從給藥本發(fā)明所述的菌株或其變種中受益的人或動物?！爸委熡行Я俊钡南惹懊枋龅木昊蚱渥兎N，其意指以適用于任何醫(yī)療的合理的利益/風險率治療疾病的足夠量。在本發(fā)明治療方法的具體實施方式
中，所述菌株或其變種可以以活的或以特定保藏狀態(tài)被使用。當所述菌株或其變種以保藏狀態(tài)使用時，優(yōu)選預先培養(yǎng)所述菌株以富集其甲基萘醌含量?！氨２貭顟B(tài)”意指例如干燥、凍干或冷凍的菌株。所述菌株或其變種也可在例如通過熱處理、化學處理和/或本領域技術人員已知的其他處理滅活后使用。
本發(fā)明的另一方面涉及使用本發(fā)明菌株或其變種制備富含甲基萘醌的產品。因此這些產品可特別用于補充需要其的患者中發(fā)生的任何甲基萘醌缺乏。這種甲基萘醌缺乏例如發(fā)生在新生兒、患有肝損傷或疾病(即酒精性)的個體、患有囊性纖維化、炎癥性腸病或最近做過腹部外科手術的人中。可能患有次級維生素K缺乏癥的群體包括易饑癥，進行嚴格飲食的人和攝入抗凝血劑的人。因此，本發(fā)明涉及本發(fā)明菌株或其變種在制備產品中的用途。所述產品通常選自下組膳食補充劑、藥物制劑、食品制劑和飼料制劑。在一個具體實施方式
中，在這些產品中，所述菌株或其變種可以以活的或以特定保藏狀態(tài)被使用。當所述菌株或其變種以保藏狀態(tài)使用時，優(yōu)選預先培養(yǎng)所述菌株以富集其甲基萘醌含量?！氨２貭顟B(tài)”意指例如干燥、凍干或冷凍的菌株。所述菌株或其變種也可在例如通過熱處理、化學處理和/或本領域技術人員已知的其他處理滅活后使用。本發(fā)明也涉及通常選自下組的產品膳食補充劑、藥物制劑、食品制劑和飼料制齊U，其中所述產品包含本發(fā)明菌株或其變種。根據(jù)本發(fā)明，“膳食補充劑”意指旨在補充人或動物的飲食的產品或組合物。本發(fā)明的膳食補充劑通常旨在丸劑、膠囊、片劑或液體形式中攝取。根據(jù)本發(fā)明，“藥物制劑”意指旨在用于治療人或動物體的方法中的制劑。在本發(fā)明上下文中，此處使用的術語“治療”意指逆轉、減緩、抑制疾病或病癥的發(fā)展，或預防疾病或病癥。通常，本發(fā)明藥物制劑包含本發(fā)明菌株或其變種和藥學可接受的載體。根據(jù)本發(fā)明，“食品制劑”意指旨在喂養(yǎng)人的制劑。根據(jù)本發(fā)明，“飼料制劑”意指旨在喂養(yǎng)動物的制劑。在本發(fā)明一個具體實施方式
中，所述產品是食品制劑。更具體地，所述食品制劑是乳制品。在本發(fā)明含義內，“乳制品”意指發(fā)酵奶、酸奶、熟化奶油、奶酪、清爽干酪、奶飲料、乳制品濃縮物、加工奶酪、奶油甜點、農家干酪或嬰兒奶。通常，本發(fā)明乳制品包括動物和/或植物來源的奶。本發(fā)明的另一方面涉及本發(fā)明菌株和其變種用于富集產品的甲基萘醌含量。因此，本發(fā)明涉及用于富集產品的甲基萘醌含量的方法，所述產品選自膳食補充劑、藥物制齊U、食品制劑和飼料制劑，所述方法包括將本發(fā)明所述菌株或其變種添加到所述產品中的步驟。在本方法的一個具體的實施方式中，所述菌株或其變種可以以活的或以特定保藏狀態(tài)被使用。當所述菌株或其變種以保藏狀態(tài)使用時，優(yōu)選預先培養(yǎng)所述菌株以富集其甲基萘醌含量?！氨２貭顟B(tài)”意指已經例如干燥、凍干或冷凍的菌株。所述菌株或其變種也可在例如通過熱處理、化學處理和/或本領域技術人員已知的其他處理滅活后使用。通過以下實施例更好地說明本發(fā)明。這些實施例僅作為本發(fā)明主題的示例給出，它們決不構成限制。
具體實施例方式實施例I :根據(jù)試驗B測定由菌株CNCM 1-4128產生甲基萘醌菌株CNCM 1-4128已經和屬于乳酸乳球菌屬的23種其他菌株進行了產生甲基萘醌的比較(根據(jù)試驗B)。對于各菌株，進行以下方案-在30°C下在50ml的M17-乳糖肉湯培養(yǎng)基(BiokarBK088HA)中培養(yǎng)I. IO2至Ij·
I.107cfu/ml 的菌株 18h，-使25ml的培養(yǎng)基以8000rpm離心10分鐘，-去除上清液，將沉淀物再懸浮在25ml的胰化蛋白胨鹽溶液(0.1%胰化蛋白胨，0.85%鹽)中，-使再懸浮培養(yǎng)基以8000rpm離心10分鐘，-去除上清液，將沉淀物再懸浮在10%(w/w)的25ml重構奶粉中，-將細胞懸液置于凍干機中，-獲得2到4克凍干細胞。根據(jù)以下方案進行甲基萘醌的化學提取并進行其含量測定由試驗B獲得的凍干細胞在乙醇/水(50/50V/V)中稀釋十倍。IOmL的該稀釋液和5mL IN的HCl混合。該樣品在100°C的水浴中加熱lOmin。然后，在管中加入IOml異丙醇。將該管在配備有超聲的22°C (+/-3°C )的水浴中放置lOmin。在該管中加入5ml己烷。通過潤旋混合該管5min。以4600rpm離心懸液5min。然后收獲有機相，并再次以4600rpm離心5min。然后收獲有機相，并用高速真空系統(tǒng)濃縮，以獲得干燥產物。所述干燥產物用Iml乙醇再水合，并在0. 45 ii m過濾器上過濾。將該提取物注入HPLC體系中。用Hojo K.等人“Quantitativemeasurement of tetrahydromenaquinone-9 cheese fermented by propionibacteria，，，J. dairy Science，2007，90，9. 4078-4083描述的方法進行甲基萘醌的分離和檢測。用Zn進行后置柱還原甲基萘醌后，通過熒光計進行檢測。維生素Kl用作提取/純化步驟的內標，MK-4(Sigma V9378)用作定量的外部校準。結果列于表I，其顯示CNCM 1-4128和屬于乳酸乳球菌種(其是乳酸乳球菌乳脂亞種或乳酸乳球菌乳酸亞種菌株)的23種其他菌株產生甲基萘醌的差異。數(shù)據(jù)以y克/100克凍干細胞表示。
權利要求
1.選自下組的菌株在制備甲基萘醌中的用途 -根據(jù)布達佩斯條約于2009年2月24日以保藏號CNCM 1-4128保藏在CNCM的菌株或其變種； -根據(jù)布達佩斯條約于2010年3月24日以保藏號DSM 23476保藏在DSMZ的菌株或其變種； -根據(jù)布達佩斯條約于2010年3月24日以保藏號DSM 23477保藏在DSMZ的菌株或其變種； -根據(jù)布達佩斯條約于2010年3月24日以保藏號DSM 23478保藏在DSMZ的菌株或其變種；和 -根據(jù)布達佩斯條約于2010年3月24日以保藏號DSM 23479保藏在DSMZ的菌株或其 變種。
2.選自下組的菌株用于人或動物體的治療方法 -根據(jù)布達佩斯條約于2009年2月24日以保藏號CNCM 1-4128保藏在CNCM的菌株或其變種； -根據(jù)布達佩斯條約于2010年3月24日以保藏號DSM 23476保藏在DSMZ的菌株或其變種； -根據(jù)布達佩斯條約于2010年3月24日以保藏號DSM 23477保藏在DSMZ的菌株或其變種； -根據(jù)布達佩斯條約于2010年3月24日以保藏號DSM 23478保藏在DSMZ的菌株或其變種；和 -根據(jù)布達佩斯條約于2010年3月24日以保藏號DSM 23479保藏在DSMZ的菌株或其變種。
3.權利要求2所述的菌株或其變種，其中所述治療方法是治療選自下組的疾病的方法骨骼疾病，例如骨質疏松癥；血管疾病，例如心血管疾病、血壓機能障礙和血液凝固；和皮膚病，例如皮膚彈性喪失。
4.選自下組的菌株在制備選自膳食補充劑、藥物制劑、食品制劑和飼料制劑的產品中的用途 -根據(jù)布達佩斯條約于2009年2月24日以保藏號CNCM 1-4128保藏在CNCM的菌株或其變種； -根據(jù)布達佩斯條約于2010年3月24日以保藏號DSM 23476保藏在DSMZ的菌株或其變種； -根據(jù)布達佩斯條約于2010年3月24日以保藏號DSM 23477保藏在DSMZ的菌株或其變種； -根據(jù)布達佩斯條約于2010年3月24日以保藏號DSM 23478保藏在DSMZ的菌株或其變種；和 -根據(jù)布達佩斯條約于2010年3月24日以保藏號DSM 23479保藏在DSMZ的菌株或其變種。
5.產品，包含選自下組的菌株 -根據(jù)布達佩斯條約于2009年2月24日以保藏號CNCM 1-4128保藏在CNCM的菌株或其變種； -根據(jù)布達佩斯條約于2010年3月24日以保藏號DSM 23476保藏在DSMZ的菌株或其變種； -根據(jù)布達佩斯條約于2010年3月24日以保藏號DSM 23477保藏在DSMZ的菌株或其變種； -根據(jù)布達佩斯條約于2010年3月24日以保藏號DSM 23478保藏在DSMZ的菌株或其變種；和 -根據(jù)布達佩斯條約于2010年3月24日以保藏號DSM 23479保藏在DSMZ的菌株或其變種。
6.權利要求5所述的產品，其中所述產品選自下組膳食補充劑、藥物制劑、食品制劑 和飼料制劑。
7.權利要求5或6所述的產品，其中所述產品是乳制品，選自下組發(fā)酵奶、酸奶、熟化奶油、奶酪、清爽干酪、奶飲料、乳制品超濾滯留物、加工奶酪、奶油甜點、農家干酪或嬰兒奶。
8.權利要求7所述的產品，其中所述乳制品包括動物和/或植物來源的奶。
9.富集產品中甲基萘醌含量的方法，包括將選自下組的菌株添加至所述產品中的步驟 -根據(jù)布達佩斯條約于2009年2月24日以保藏號CNCM 1-4128保藏在CNCM的菌株或其變種； -根據(jù)布達佩斯條約于2010年3月24日以保藏號DSM 23476保藏在DSMZ的菌株或其變種； -根據(jù)布達佩斯條約于2010年3月24日以保藏號DSM 23477保藏在DSMZ的菌株或其變種； -根據(jù)布達佩斯條約于2010年3月24日以保藏號DSM 23478保藏在DSMZ的菌株或其變種；和 -根據(jù)布達佩斯條約于2010年3月24日以保藏號DSM 23479保藏在DSMZ的菌株或其變種。
10.權利要求9所述的方法，其中所述產品選自下組膳食補充劑、藥物制劑、食品制劑和飼料制劑。
11.選自下組的菌株用于提高鈣固定在骨骼上、維持或改善骨骼構造和/或抵抗力，和/或改善骨骼生長的方法 -根據(jù)布達佩斯條約于2009年2月24日以保藏號CNCM 1-4128保藏在CNCM的菌株或其變種； -根據(jù)布達佩斯條約于2010年3月24日以保藏號DSM 23476保藏在DSMZ的菌株或其變種； -根據(jù)布達佩斯條約于2010年3月24日以保藏號DSM 23477保藏在DSMZ的菌株或其變種； -根據(jù)布達佩斯條約于2010年3月24日以保藏號DSM 23478保藏在DSMZ的菌株或其變種；和-根據(jù)布達佩斯條約于2010年3月24日以保藏號DSM 23479保藏在DSMZ的菌株或其變種。
12.根據(jù)布達佩斯條約于2009年2月24日以保藏號CNCM1-4128保藏在CNCM的乳酸乳球菌乳脂亞種(Lactococcus lactis subsp. cremoris)的菌株或其變種。
13.權利要求12所述的菌株或其變種，其中當用試驗A測定時，每IOOg用所述菌株或其變種發(fā)酵的乳液中，所述變種產生至少7 y g，特別地至少9 y g，更特別至少Ily g的甲基萘醌。
14.權利要求12或13所述的菌株或其變種，其中當用試驗B測定時，每IOOg凍干細胞中，所述變種產生至少200ii g，特別地至少230ii g，更特別至少260 ii g的甲基萘醌。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有產生甲基萘醌的優(yōu)異能力的菌株及其用途。
文檔編號C12R1/01GK102753678SQ201080017300
公開日2012年10月24日 申請日期2010年4月15日 優(yōu)先權日2009年4月15日
發(fā)明者帕斯卡爾·富爾卡謝, 帕特里克·布瓦亞瓦爾, 菲利普·霍瓦特 申請人:丹尼斯科公司