專利名稱：：調(diào)節(jié)acc合酶改善低氮條件下的植物產(chǎn)量的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明總體上涉及分子生物學領(lǐng)域，h具體來講涉及調(diào)節(jié)ACC合酶活性來改善植物產(chǎn)量和氮脅迫耐受性。
背景技術(shù)：
：許多植物的馴化已與產(chǎn)量顯著增加相關(guān)。自然群體中發(fā)生的大多數(shù)表型變異是連續(xù)的并通過多種基因影響來實現(xiàn)。對造成馴化植物中產(chǎn)量顯著不同的特定基因的鑒別已成為農(nóng)業(yè)研究的重要焦點。氮利用效率(NUE)基因影響產(chǎn)量并對改善氮在作物(特別是玉蜀黍)中的利用具有實用性。氮使用效率增加可由增加的對氮肥的吸收和同化和/或?qū)Ψe聚的氮儲備的后續(xù)再動員和再利用，以及植物對諸如低氮環(huán)境之類的脅迫情況的耐受性增加得到?；蚩捎糜诟淖冎参锏倪z傳組成，從而使得它們在當前的肥料施用標準下更高產(chǎn)或在肥料顯著減少或氮可用量顯著減少的情況下保持它們的產(chǎn)出率。在氮肥獲得受限的發(fā)展中國家和在氮使用水平保持較高的發(fā)達國家，改善玉米中的NUE都將會增加每單位投入氮肥的玉米可收獲產(chǎn)量。氮利用改善還使得能降低在農(nóng)場上的投入成本，降低對氮肥生產(chǎn)所需的非可再生能源的使用和依賴，以及減少氮肥生產(chǎn)和農(nóng)業(yè)利用的環(huán)境影響。發(fā)明概述本發(fā)明提供了改善植物產(chǎn)量的方法和組合物。在一些實施方案中，植物產(chǎn)量在脅迫，特別是非生物脅迫，例如氮限制條件下得以改善。改善植物產(chǎn)量的方法包括抑制乙烯合成途徑，例如，抑制至少一種1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸(ACC)合酶的活性。ACC合酶的活性可用本領(lǐng)域已知的任何方法來抑制，這些方法包括但不限于破壞ACC合酶基因，或者通過利用共抑制、反義、或RNA沉默或干擾來降低基因的表達。抑制植物中的至少一種ACC合酶的活性可改善植物的氮脅迫耐受性，并且這種植物可在顯著較低的氮肥投入的情況下保持它們的產(chǎn)出率和/或可表現(xiàn)出增加的氮肥吸收和同化和/或?qū)Ψe聚的氮儲備的再動員和再利用。除了產(chǎn)量的總體增加外，通過抑制ACC合酶改善氮脅迫耐受性還可導(dǎo)致根質(zhì)量和/或長度增加，穗、葉、種子和/或胚乳尺寸增加，和/或抗倒伏性改善。因此，在一些實施方案中，所述方法還包括在氮限制條件下栽培所述植物，并任選選擇表現(xiàn)出對低氮水平有較大耐受性的那些植物。另外，提供了改善非生物脅迫下的產(chǎn)量的方法和組合物，該方法包括評價耕作區(qū)的環(huán)境條件的非生物應(yīng)激源(Stressor)(例如，土壤中的低氮水平)，并在脅迫環(huán)境下栽培具有減低的乙烯合成的種子或植株，在一些實施方案中減低的乙烯合成是由于至少一種ACC合酶的活性降低引起的。本發(fā)明還提供了構(gòu)建體和表達盒，所述構(gòu)建體和表達盒包含可有效減少ACC合酶表達的核苷酸序列。附圖簡述圖1是植物(例如擬南芥屬植物)中的乙烯生物合成和信號傳導(dǎo)基因的示意圖。乙烯由確定的途徑從甲硫氨酸產(chǎn)生，該途徑涉及S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM或AdoMet)轉(zhuǎn)化為環(huán)狀氨基酸1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸(ACC)，該轉(zhuǎn)化由ACC合酶推進。ACC合酶是一種氨基轉(zhuǎn)移酶，該酶通過將S-腺苷甲硫氨酸轉(zhuǎn)化為ACC而催化乙烯的形成中的限速步驟。然后通過ACC氧化酶(也稱為乙烯形成酶)的作用氧化ACC產(chǎn)生乙烯，氰化氫為次級產(chǎn)物，由β-氰基丙氨酸合酶使氰化氫去毒。最后，乙烯通過氧化為CO2或氧化為環(huán)氧乙烷和乙二醇而被代謝。圖2的分圖A-C示出了ACS2發(fā)夾構(gòu)建體。分圖A為PHP質(zhì)粒的示意圖，該質(zhì)粒含有驅(qū)動ACS2發(fā)夾(由TRl和TR2組成的末端重復(fù)序列)的表達的泛素啟動子(UBI1ZMPRO)。RB表示農(nóng)桿菌(Agrobacterium)右邊界序列。示出了49682bp盒的4U6bp片段。分圖B給出了ZM-ACS2TRl的序列(SEQIDNO:12)，分圖C給出了ZM-ACS2TR2的序列(SEQIDNO13)。圖3的分圖A-C示出了ACS6發(fā)夾構(gòu)建體。分圖A為PHP質(zhì)粒的示意圖，該質(zhì)粒含有驅(qū)動ACS6發(fā)夾(由TRl和TR2組成的末端重復(fù)序列)的表達的泛素啟動子(UBI1ZMPRO)。RB表示農(nóng)桿菌右邊界序列。示出了49108bp盒的3564bp片段。分圖B給出了ZM-ACS6TR1的序歹丨J(SEQIDNO:14)，分圖C給出了ZM-ACS6TR2的序列(SEQIDNO15)。圖4是改良的ACS6抑制表達盒的示意圖，該表達盒在SEQIDNO57中示出。圖5示出了本發(fā)明的轉(zhuǎn)化植株在環(huán)境1中的開花脅迫下的產(chǎn)量。每根柱條表示一單獨的轉(zhuǎn)化事件。示出了轉(zhuǎn)基因陰性分離子的平均產(chǎn)量(139蒲式耳/英畝)作為對照(CN)。總計74%的事件的標稱產(chǎn)量比對照植株高。代表18個轉(zhuǎn)基因事件的植株產(chǎn)量超過對照，P<0.10。圖6示出了本發(fā)明的轉(zhuǎn)化植株在環(huán)境2的灌漿脅迫下的產(chǎn)量。每根柱條表示一單獨的轉(zhuǎn)化事件。示出了轉(zhuǎn)基因陰性分離子的平均產(chǎn)量(176蒲式耳/英畝)作為對照(CN)。有十三個事件產(chǎn)量超過CN，P<0.10。其中，八個事件還在開花脅迫下顯示出顯著的改善。圖7示出了本發(fā)明的轉(zhuǎn)化植株(由圓圈表示)以及用另選的ACS6抑制載體轉(zhuǎn)化的植株(由正方形表示)在環(huán)境3中的灌漿脅迫下的產(chǎn)量(顯示為對照的百分比)。每個數(shù)據(jù)點表示一單獨的轉(zhuǎn)化事件。NS=不顯著。對照植株為集團(bulked)轉(zhuǎn)基因陰性分離子。可以看出，相對于對照，64%的本發(fā)明事件具有顯著較好的產(chǎn)量；僅17%的另選ACS6抑制事件具有顯著的較好產(chǎn)量。圖8示出了本發(fā)明的轉(zhuǎn)化植株(由圓圈表示)以及用另選的ACS6抑制載體轉(zhuǎn)化的植株(由正方形表示)在環(huán)境4中的雨養(yǎng)條件下的產(chǎn)量(顯示為對照的百分比)。每個數(shù)據(jù)點表示一單獨的轉(zhuǎn)化事件。NS=不顯著。對照植株為集團轉(zhuǎn)基因陰性分離子?？梢钥闯?，所有表現(xiàn)出統(tǒng)計學上顯著的產(chǎn)量增加的數(shù)據(jù)點代表本文所公開的本發(fā)明事件。此外，所有表現(xiàn)出統(tǒng)計學上顯著的產(chǎn)量下降的數(shù)據(jù)點是含有另選的ACS6抑制載體的事件。具體實施例方式本發(fā)明是基于這樣一個出人意料的發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)ACC合酶(ACQ可改善植物在低氮條件下的響應(yīng)，而對正常氮條件下的植物性能無有害影響。事實上，具有ACS抑制構(gòu)建體的植物確實不僅在低氮條件下，而且還在正常氮條件下具有較好產(chǎn)量。因此，提供了通過調(diào)節(jié)乙烯合成途徑來改善植物產(chǎn)量，特別是在非生物脅迫下的植物產(chǎn)量的方法。乙烯由確定的途徑從甲硫氨酸產(chǎn)生，該途徑涉及S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM或AdoMet)轉(zhuǎn)化為環(huán)狀氨基酸1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸(ACC)，該轉(zhuǎn)化由ACC合酶推進。ACC合酶是一種氨基轉(zhuǎn)移酶，該酶通過將S-腺苷甲硫氨酸轉(zhuǎn)化為ACC而催化乙烯的形成中的限速步驟。然后通過ACC氧化酶(也稱為乙烯形成酶)的作用氧化ACC產(chǎn)生乙烯，氰化氫為次級產(chǎn)物，由氰基丙氨酸合酶使氰化氫去毒。ACC氧化酶由多基因家族編碼，其中各成員表現(xiàn)出組織特異性調(diào)節(jié)和/或響應(yīng)環(huán)境刺激和化學刺激而被誘導(dǎo)。ACC氧化酶的活性可被缺氧和鈷離子抑制。ACC氧化酶是立體特異性的，利用輔因子例如!V2、02、抗壞血酸鹽等。最后，乙烯通過氧化為二氧化碳(CO2)或氧化為環(huán)氧乙烷和乙二醇而被代謝。參見圖1。在本發(fā)明所公開的方法的一些實施方案中，對至少一種ACC合酶的活性進行調(diào)節(jié)或抑制以增強植物產(chǎn)量和改善氮脅迫耐受性。“ACC合酶”是具有氨基轉(zhuǎn)移酶活性的酶，其催化S-腺苷甲硫氨酸轉(zhuǎn)化為ACC。ACC合酶的非限制性例子包括ACS1至ACS11。在玉蜀黍中，這包括ACS2、ACS6和/或ACS7。在雙子葉植物中，ACC合酶是更大的氨基轉(zhuǎn)移酶超家族的一部分，該超家族有九個成員為ACS基因。這些基因?qū)儆谌N不同的類別，這些類別通過它們的C端結(jié)構(gòu)和它們的翻譯后調(diào)節(jié)來區(qū)分。在玉蜀黍和其他單子葉植物中，僅有3個成員，每個類別有一個成員。有關(guān)可用于本發(fā)明的某些可公開獲得的ACS序列的非限制性列表，參見實施例16中表4。術(shù)語“ACC合酶多肽”指保留催化S-腺苷甲硫氨酸轉(zhuǎn)化為ACC的功能的一種或多種氨基酸序列并且包括其片段、變體、同源物、等位基因或前體(例如前蛋白原或蛋白原)。"ACC合酶蛋白質(zhì)”包含ACC合酶多肽。除非另外說明，否則術(shù)語“ACC合酶核酸”意指包含編碼ACC合酶多肽的多核苷酸(“ACC合酶多核苷酸”)的核酸。本文所用的術(shù)語“ACC合酶活性的調(diào)節(jié)”應(yīng)理解為意指ACC合酶生物活性的任何改變，這可包括植物細胞中存在的ACC合酶水平的改變、該酶效力的改變或可影響ACC合酶與其在乙烯形成過程中將S-腺苷甲硫氨酸轉(zhuǎn)化為ACC的作用相關(guān)的生物學性質(zhì)中的一種或多種性質(zhì)的任何其他手段。因此，“ACC合酶活性的抑制”涵蓋該酶效力的降低，或植物細胞中存在的ACC合酶水平的降低，該水平的降低例如由于ACC合酶基因表達降低引起。在其它實施方案中，可對乙烯合成途徑的其他步驟進行調(diào)節(jié)來改善植物產(chǎn)量或植物的氮脅迫耐受性。例如，可增加SAM轉(zhuǎn)化為多胺的速率，或者可降低ACC氧化酶的水平或活性，或者可增加ACC的水平或活性，或者可增加SAM的水平或活性，或者乙烯合成途徑中的這些和/或其他修飾的某種組合可由于本文所描述的遺傳調(diào)節(jié)而發(fā)生。盡管不希望受任何理論的約束，但假定認為對乙烯合成的一個或多個步驟的修飾可導(dǎo)致乙烯活性的降低。在任何情況下，本發(fā)明涉及增加在非生物脅迫條件下的植物產(chǎn)量，并且在某些實施方案中，涉及改善氮脅迫耐受性，這由ACC合酶基因的受調(diào)節(jié)表達而引起的，而無論該調(diào)節(jié)對乙烯合成途徑、乙烯產(chǎn)生或乙烯活性的確切作用如何。本發(fā)明的方法提供改善的植物產(chǎn)量。本文所用的“產(chǎn)量”可包括指涉收獲時每英畝谷類作物的蒲式耳數(shù)，該值針對谷粒水分(例如，對于玉蜀黍通常是15%)進行了調(diào)整，和/或所產(chǎn)生的生物量的體積(對于飼料作物如苜蓿而言)以及植物的根尺寸(對于多種作物而言)。谷粒水分是在收獲時的谷粒中測量。谷粒的經(jīng)調(diào)整的測試重量確定為針對收獲時的谷粒水分水平進行了調(diào)整的重量，單位磅/蒲式耳。生物量測量為所產(chǎn)生的可收獲植物材料的重量。在本發(fā)明所公開的方法的一些實施方案中，對乙烯合成途徑的調(diào)節(jié)導(dǎo)致植物的氮脅迫耐受性改善。本文所用的“氮脅迫耐受性改善”的植物應(yīng)該包括但不限于與對應(yīng)的對照植物(例如非修飾植物)相比，對低氮條件耐受性改善的植物、在顯著較低的氮肥投入的情況下保持它們的產(chǎn)出率的植物、對氮肥的吸收和同化和/或?qū)Ψe聚的氮儲備的再動員和再利用改善的植物，或具有它們的任何組合的植物。本文所用的術(shù)語“低氮條件”或“氮限制條件”應(yīng)理解為意指任何其中植物可利用的氮比對于最大產(chǎn)量潛能的表達而言將為最佳的量低的環(huán)境條件。本發(fā)明的方法提供在氮限制條件下改善的植物性能。該性能可以多種方式展示，包括對根發(fā)育、苗和葉發(fā)育和/或生殖組織發(fā)育的調(diào)節(jié)。因此，提供了用于調(diào)節(jié)植物中的根發(fā)育的方法。所謂“調(diào)節(jié)根發(fā)育”意指在與對照植物比較時在氮限制條件下植物根的發(fā)育的任何改變。根發(fā)育的這種改變包括但不限于初生根的生長速率、根鮮重、側(cè)根和不定根形成的程度、維管系統(tǒng)、分生組織發(fā)育或徑向擴張度。提供了用于在氮限制條件下調(diào)節(jié)植物的根發(fā)育的方法。該方法包括調(diào)節(jié)植物中的ACC合酶多肽的水平和/或活性。在一種方法中，將ACC合酶序列抑制構(gòu)建體提供給植物。在另一種方法中，該核苷酸序列這樣提供向植物引入包含ACC合酶抑制性核苷酸序列的多核苷酸，使該核苷酸表達并從而改變低氮條件下的根發(fā)育。在另外其他的方法中，引入植物的ACC合酶抑制核苷酸構(gòu)建體被穩(wěn)定整合進植物的基因組中。ACC合酶活性的改變可導(dǎo)致當植物在氮限制條件下栽培時，對根發(fā)育的如下改變中的至少一者或多者，包括但不限于根生物量和長度的改變。本文所用的“根生長”涵蓋單子葉植物和雙子葉植物中構(gòu)成根系的不同部分在根系發(fā)育的不同階段的生長的所有方面。應(yīng)當理解，根生長增強可由其各部分(包括初生根、側(cè)根、不定根等)中的一者或多者的生長增強引起。測量根系中的這種發(fā)育改變的方法是本領(lǐng)域已知的。參見例如第2003/0074698號美國專利申請公開和W^erner等人，(2001)PNAS18:10487_10492，將這兩篇文獻以引用的方式并入本文。如本文別處所論述的，技術(shù)人員將會認識用于調(diào)節(jié)植物中的根發(fā)育的適當啟動子。用于這個實施方案的示例性啟動子包括組成型啟動子和根優(yōu)選的啟動子。示例性的根優(yōu)選的啟動子已在本文別處公開。通過降低ACC合酶多肽的活性和/或水平來在存在低氮或氮相關(guān)脅迫的情況下刺激根生長和增加根質(zhì)量，這也可用于改善植物的抗倒伏性。術(shù)語“耐倒伏性”或“抗倒伏性”指植物使其自身固定至土壤的能力。對于具有豎立或半豎立生長習性的植物，該術(shù)語還指在不利(環(huán)境)條件下保持直立位置的能力。該性狀涉及根系的尺寸、深度和形態(tài)。此外，通過改變ACC合酶多肽的水平和/或活性來在氮限制條件下刺激根生長和增加根質(zhì)量，這10還可用于促進外植體的體外繁殖。此外，較高的根生物量產(chǎn)出對產(chǎn)量具有直接影響，并且對由根細胞或轉(zhuǎn)基因根細胞或所述轉(zhuǎn)基因根細胞的細胞培養(yǎng)物產(chǎn)生的化合物的生成具有間接影響。因此，本發(fā)明還提供了與對照植物的根發(fā)育相比在氮限制條件下具有受調(diào)節(jié)的根發(fā)育的植物。在正常條件下未觀察到這種調(diào)節(jié)。還提供了用于調(diào)節(jié)植物中的苗和葉發(fā)育，特別是在氮限制條件下的這種發(fā)育的方法。所謂“調(diào)節(jié)苗和/或葉發(fā)育”其意指在氮限制條件下植物苗和/或葉的發(fā)育的任何改變。苗和/或葉發(fā)育中的這種改變包括但不限于在苗分生組織發(fā)育方面、在葉數(shù)目、葉尺寸、葉和莖維管系統(tǒng)、節(jié)間長度和葉衰老方面的改變。本文所用的“葉發(fā)育”和“苗發(fā)育”涵蓋在單子葉植物和雙子葉植物中分別構(gòu)成葉系統(tǒng)和苗系統(tǒng)的不同部分在這些系統(tǒng)發(fā)育的不同階段中的生長的所有方面。測量苗和葉系統(tǒng)中的這種發(fā)育改變的方法是本領(lǐng)域已知的。參見例如Werner等人，(2001)PNAS9810487-10492和第2003/0074698號美國專利申請公開，將這兩篇文獻各以引用的方式并入本文。用于調(diào)節(jié)植物在低氮條件下苗和/或葉發(fā)育的方法包括調(diào)節(jié)ACC合酶多肽的活性和/或水平。在一個實施方案中，可這樣來提供ACC合酶核苷酸序列向植物引入包含ACC合酶核苷酸抑制構(gòu)建體的多核苷酸，使該多核苷酸表達，從而改變在氮限制條件下的苗和/或葉發(fā)育。在其他的實施方案中，引入植物的ACC合酶抑制核苷酸構(gòu)建體被穩(wěn)定整合進植物的基因組中。ACC合酶活性的改變可導(dǎo)致在與相同條件下的對照植物比較時，在低氮條件下苗和/或葉發(fā)育的如下改變中的至少一者或多者，包括但不限于葉數(shù)目的變化、葉表面改變、維管系統(tǒng)、節(jié)間和植物生長的改變以及葉衰老的改變。如本文別處所論述的，技術(shù)人員將會認識到用于調(diào)節(jié)植物的苗和葉發(fā)育的適當啟動子。用于這個實施方案的示例性啟動子包括組成型啟動子、苗優(yōu)選的啟動子、苗分生組織優(yōu)選的啟動子和葉優(yōu)選的啟動子。示例性的啟動子已在本文別處公開。提供了用于調(diào)節(jié)生殖組織發(fā)育，特別是氮限制條件下的這種發(fā)育的方法。在一個實施方案中，提供了用于調(diào)節(jié)植物中的花發(fā)育的方法。所謂“調(diào)節(jié)花發(fā)育”其意指與其中ACC合酶多肽的活性或水平未受調(diào)節(jié)的對照植物相比，植物的生殖組織的結(jié)構(gòu)的任何改變?！罢{(diào)節(jié)花發(fā)育”還包括與其中ACC合酶多肽的活性或水平未受調(diào)節(jié)的對照植物相比，植物生殖組織發(fā)育的時間安排的任何改變(即花發(fā)育時間安排的延遲或加速)。宏觀改變可包括在環(huán)境脅迫時的如下變化繁殖器官的尺寸、形狀、數(shù)目或位置，這些結(jié)構(gòu)形成的發(fā)育時間周期，或者維持或發(fā)展經(jīng)過開花過程的能力。微觀改變可包括構(gòu)成繁殖器官的細胞的類型或形狀的改變。用于調(diào)節(jié)植物的花發(fā)育的方法包括調(diào)節(jié)植物中的ACC合酶活性。這種方法可包括將ACC合酶核苷酸序列引入植物中并改變ACC合酶多肽的活性。在一些實施方案中，引入植物的ACC合酶核苷酸構(gòu)建體被穩(wěn)定整合進植物的基因組中。改變本發(fā)明的ACC合酶序列的表達可調(diào)節(jié)脅迫期間花的發(fā)育。這種方法在本文別處進行了描述。因此，本發(fā)明還提供了與對照植物的花發(fā)育相比具有受調(diào)節(jié)的花發(fā)育的植物。組合物包括ACC合酶多肽的水平/活性改變了的以及花發(fā)育改變了的植物。組合物還包括在脅迫時ACC合酶多肽的水平/活性改變了的植物，其中該植物維持或發(fā)展經(jīng)過開花過程。如本文別處所論述的，技術(shù)人員將認識到用于調(diào)節(jié)植物的花發(fā)育或用于增加種子尺寸和/或種子重量的適當啟動子。這個實施方案的示例性啟動子包括組成型啟動子、誘導(dǎo)型啟動子、種子優(yōu)選的啟動子、胚的優(yōu)選啟動子和胚乳的優(yōu)選啟動子。因而，ACC合酶活性降低了的植物在氮限制條件下可具有如下表型中的至少一種，包括但不限于與低氮條件下的非經(jīng)修飾的植物相比時，總體植物產(chǎn)量增加、根質(zhì)量增加、根長度增加、葉尺寸增加、穗尺寸增加、種子尺寸增加、胚乳尺寸增加、抗倒伏性改善、胚和胚乳的相對尺寸改變(從而導(dǎo)致種子中的蛋白質(zhì)、油脂和/或淀粉的相對水平的變化)、花發(fā)育改變、葉數(shù)目變化、葉表面改變、維管系統(tǒng)改變、節(jié)間改變、葉衰老改變、缺少穗狀雄花、缺少帶功能性花粉的穗狀雄花或植株尺寸增加。本領(lǐng)域已知可降低或消除ACC合酶多肽的活性的任何方法均可用于改善植物的氮脅迫耐受性。在一些實施方案中，將這樣的多核苷酸引入植物中，該多核苷酸可通過防止ACC合酶信使RNA的轉(zhuǎn)錄或翻譯直接抑制ACC合酶多肽的表達，或通過編碼可抑制編碼ACC合酶多肽的ACC合酶基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯的多肽間接抑制ACC合酶多肽的表達。用于抑制或消除基因在植物中的表達的方法是本領(lǐng)域所熟知的，任何這種方法可用于本發(fā)明中來抑制ACC合酶多肽的表達。在其它實施方案中，將編碼可抑制ACC合酶多肽活性的多肽的多核苷酸引入植物中。在另外其他實施方案中，通過破壞ACC合酶基因來抑制ACC合酶的活性。有許多方法可用于減少或消除ACC合酶多肽的活性。此外，有不止一種方法可用于減少單種ACC合酶多肽的活性。在一些實施方案中，通過破壞至少一種ACC合酶基因或減少至少一種ACC合酶基因的表達來減少ACC合酶活性。本文所用的“ACC合酶基因”指編碼ACC合酶多肽的基因。ACC合酶基因可編碼一種或多種ACC合酶，并且在一些實施方案中可具有例如至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、至少約99.5%或更高的與序列SEQIDNO1(gACS2)、SEQIDNO:2(gACS6)或SEQIDNO:3(gACS7)的序列同一性。許多ACS基因是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的并且可容易通過諸如GENBANK等之類的來源獲得，實例16中的表4列出了若干。任何ACS基因的表達都可根據(jù)本發(fā)明被減少。根據(jù)本發(fā)明，如果ACC合酶的轉(zhuǎn)錄物或蛋白質(zhì)水平在統(tǒng)計學上低于未經(jīng)受遺傳修飾或未經(jīng)誘變來抑制該ACC合酶表達的植物中的相同ACC合酶的轉(zhuǎn)錄物或蛋白質(zhì)水平，則ACC合酶的表達得到抑制。在本發(fā)明的特定實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的經(jīng)修飾的植物中的ACC合酶的轉(zhuǎn)錄物或蛋白質(zhì)水平為不是突變體或未經(jīng)遺傳修飾來抑制該ACC合酶表達的植物中的相同ACC合酶的蛋白質(zhì)水平的不到95%、不到90%、不到85%、不到80%、不到75%、不至Ij70%、不至Ij60%、不至Ij50%、不至Ij40%、不至Ij30%、不至Ij20%、不至Ij10%、不至Ij5%。ACC合酶的表達水平可例如通過分析細胞或植物中表達的ACC合酶的水平來直接測量，或例如通過測量細胞或植物中的ACC合酶活性來間接測量。當ACC合酶蛋白的活性不能通過至少一種分析方法測定時，則其活性根據(jù)本發(fā)明得以消除。用于評價ACC合酶活性的方法是本領(lǐng)域已知的并且包括測量ACC或乙烯的水平，ACC或乙烯可從細胞提取物中回收并分析。例如，酸性植物提取物中的ACC的內(nèi)部濃度可通過氣相色譜-質(zhì)譜，在堿性次氯酸鹽溶液等中分解后作為乙烯進行分析。乙烯的濃度可通過例如氣相色譜-質(zhì)譜等測定。12參見例如Nagahama等人，(1991)J.Gen.Microbiol.137228122860例如，可用配備有例如基于氧化鋁的柱(如HP-PLOTA1203毛細管柱)和火焰離子化檢測器的氣相色譜儀測量乙烯。方法。在本發(fā)明的其他實施方案中，通過用這樣的表達盒轉(zhuǎn)化植物細胞來減少或消除一種或多種ACC合酶的活性，該表達盒包含編碼可抑制一種或多種ACC合酶的活性的多肽的多核苷酸。如果轉(zhuǎn)化植物或細胞中的ACC合酶的活性在統(tǒng)計學上低于未經(jīng)遺傳修飾來抑制至少一種ACC合酶活性的植物中的該ACC合酶的活性，則該ACC合酶的活性根據(jù)本發(fā)明得以抑制。在本發(fā)明的特定實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的經(jīng)修飾的植物的ACC合酶活性為未經(jīng)遺傳修飾來抑制該ACC合酶的表達或活性的適當對照植物中的該ACC合酶活性的不到95%、不到90%、不到85%、不到80%、不到75%、不到70%、不到60%、不到50%、不到40%、不至Ij30%、不至Ij20%、不至Ij10%、不至Ij5%0在其它實施方案中，ACC合酶的活性可通過破壞至少一種編碼ACC合酶的基因來減少或消除。與缺少該破壞的相應(yīng)的對照植物細胞相比，該破壞抑制至少一種ACC合酶蛋白的表達或活性。在一個實施方案中，所述至少一種內(nèi)源ACC合酶基因包含兩種或更多種內(nèi)源ACC合酶基因或其亞序列(例如，ACS2、ACS6和ACS7中的任何兩種或更多種，例如ACS2和ACS6)。類似地，在另一個實施方案中，所述至少一種內(nèi)源ACC合酶基因包含三種或更多種ACC合酶基因。在某些實施方案中，與對照植物細胞相比所述破壞導(dǎo)致被敲除的植物細胞的乙烯產(chǎn)出減少或降低。所述破壞導(dǎo)致所述植物與相似條件下的對照植物相比，在低氮條件下的性能改善。在另一個實施方案中，破壞步驟包括插入一個或多個轉(zhuǎn)座子，其中所述一個或多個轉(zhuǎn)座子插入到所述至少一種內(nèi)源ACC合酶基因中。在又另一個實施方案中，破壞包括在所述至少一種內(nèi)源ACC合酶基因中的一個或多個點突變。破壞可以是在所述至少一種ACC合酶基因中的純合破壞?；蛘?，破壞是在所述至少一種ACC合酶基因中的雜合破壞。在某些實施方案中，當涉及不止一種ACC合酶基因時，存在不止一種破壞，其可包括純合破壞、雜合破壞或純合破壞和雜合破壞的組合。對表達產(chǎn)物的檢測，或者是定性地進行(通過檢測一種或多種所關(guān)注產(chǎn)物的存在與否)，或者是定量地進行(通過監(jiān)測一種或多種所關(guān)注產(chǎn)物的表達水平)。在一個實施方案中，表達產(chǎn)物為RNA表達產(chǎn)物。本發(fā)明的各方面任選包括監(jiān)測植物中或植物群體中的核酸、多肽或化學物質(zhì)(例如ACC、乙烯等)的表達水平，正如本文所指出的，用于檢測ACC合酶、乙烯產(chǎn)出、氮利用率或?qū)Φ偷獥l件的耐受性等。因而，有許多方法可用于減少或消除ACC合酶的活性。此外，有不止一種方法可用于減少單種植物ACC合酶的活性。此外，可將各方法的組合用于減少或消除兩種或更多種不同ACC合酶的活性。下面給出了減少或消除植物ACC合酶的表達的方法的非限制性例子。在本發(fā)明的一些實施方案中，將多核苷酸引入植物中，其一旦引入或表達，即可抑制本發(fā)明的ACC合酶多肽的表達。本文所用的術(shù)語“表達”指基因產(chǎn)物的生物合成，包括所述基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。例如，出于本發(fā)明的目的，能夠表達可抑制至少一種ACC合酶多肽的表達的多核苷酸的表達盒，是能夠產(chǎn)生可抑制本發(fā)明的至少一種ACC合酶多肽的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的RNA分子的表達盒。蛋白質(zhì)或多肽從DNA分子的“表達”或“產(chǎn)生”指該編碼序列轉(zhuǎn)錄和翻譯而產(chǎn)生該蛋白質(zhì)或多肽，而蛋白質(zhì)或多肽從RNA分子“表達”或“產(chǎn)生”指該RNA編碼序列翻譯而產(chǎn)生蛋白質(zhì)或多肽。另外，基因的“表達”可指該基因轉(zhuǎn)錄為非蛋白質(zhì)編碼轉(zhuǎn)錄物。本文所用的“多核苷酸”包括指涉脫氧核糖多核苷酸、核糖多核苷酸或其類似物，所述類似物在如下方面具有天然核糖核苷酸的基本性質(zhì)在嚴格雜交條件下其所雜交的核苷酸序列與天然存在的核苷酸所雜交的核苷酸序列基本上相同，和/或使得翻譯成與天然存在的核苷酸所翻譯的氨基酸相同的氨基酸。多核苷酸可以是天然或異源結(jié)構(gòu)基因或調(diào)控基因的全長序列或其亞序列。除非另外指明，否則該術(shù)語包括指涉指定的序列及其互補序列。因而，為了穩(wěn)定性或為了其他原因?qū)χ麈溸M行了修飾的DNA或RNA是“多核苷酸”(如該術(shù)語在本文所意指的)。此外，包含稀有堿基(如次黃嘌呤核苷)或修飾堿基(如三苯甲基化的堿基)(僅舉兩個例子)的DNA或RNA是多核苷酸(如該術(shù)語在本文所用的)。應(yīng)當理解，已對DNA和RNA進行了很多種修飾，這些修飾起到本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的許多有用目的。本文所用的術(shù)語多核苷酸涵蓋多核苷酸的這類經(jīng)化學修飾、酶修飾或代謝修飾的形式，以及病毒和細胞(包括特別是簡單細胞和復(fù)雜細胞)特征性的DNA和RNA的化學形式。本文所用的“核酸”包括指涉單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，并且除非另外限制，否則涵蓋在以下方面具有天然核苷酸的基本性質(zhì)的已知類似物其以與天然出現(xiàn)的核苷酸(例如肽核酸)相似的方式雜交至單鏈核酸。就指定的核酸而言，所謂“編碼”意指包含供轉(zhuǎn)錄為RNA，并且在一些實施方案中，翻譯成指定蛋白質(zhì)的信息。編碼蛋白質(zhì)的核酸可在該核酸的翻譯區(qū)內(nèi)包含非翻譯序列(例如內(nèi)含子)，或可缺少這種居間的非翻譯序列(例如，如在cDNA中)。據(jù)以編碼蛋白質(zhì)的信息是通過使用密碼子來確定的。通常，氨基酸序列由核酸利用“通用”遺傳密碼來編碼。然而，可使用如在某些植物、動物和真菌線粒體、細菌山羊支原體(Mycoplasmacapricolum)(Yamao等人，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:2306-9)或纖毛蟲大核中存在的通用密碼的變體，當用這些生物體表達該核酸時。在下面給出了可抑制ACC合酶多肽表達的多核苷酸的例子。在本發(fā)明的在一些實施方案中，ACC合酶多肽表達的抑制可通過有義抑制或共抑制獲得。對于共抑制，將表達盒設(shè)計為表達這樣的RNA分子，該RNA分子以“有義”取向?qū)?yīng)于編碼ACC合酶多肽的信使RNA的全部或部分。該RNA分子的過表達可導(dǎo)致天然基因的表達減少。因此，對用該共抑制表達盒轉(zhuǎn)化的多個植株進行篩選以鑒別那些顯示出對ACC合酶多肽表達的最大抑制的植株。用于共抑制的多核苷酸可對應(yīng)于編碼ACC合酶多肽的序列的全部或部分、ACC合酶多肽轉(zhuǎn)錄物的5'和/或3'非翻譯區(qū)的全部或部分、或者編碼ACC合酶多肽的轉(zhuǎn)錄物的編碼序列和非翻譯區(qū)二者的全部或部分。用于共抑制或其他基因沉默方法的多核苷酸可與靴序列具有99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、85%、80%或更低的序列同一性，所述靶序列在一些實施方案中為SEQIDN0:4、5或6。當所述多核苷酸(例如SEQIDN0:4、5或6)的部分用于破壞靶基因的表達時，通?？墒褂弥辽?5、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、200、300、400、450、500、550、600、650、700、750、800、900或1000個連續(xù)核苷酸或更多個連續(xù)核苷酸的序列。在其中所述多核苷酸包含ACC合酶多肽的編碼區(qū)的全部或部分的一些實施方案中，將表達盒設(shè)計用于消除多核苷酸起始密碼子，使得不會翻譯出蛋白質(zhì)產(chǎn)物。共抑制可用來抑制植物基因的表達以產(chǎn)生對于由這些基因編碼的蛋白質(zhì)而言具有不可檢測的蛋白質(zhì)水平的植物。參見(例如)Broin等人，OOOWPlantCell14:1417-1432。共抑制還可用來抑制同一植株中的多種蛋白質(zhì)的表達。參見(例如)第5，942，657號美國專利。利用共抑制來抑制植物中的內(nèi)源基因的表達的方法在如下文獻中有描述:Flavell等人，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:3490-3496Jorgensen等人，(1996)PlantMol.Biol.31:957-973Johansen和Carrington，(2001)PlantPhysiol.126:930-938；Broin等人，(2002)PlantCell14:1417-1432；Stoutjesdijk等人，(2002)PlantPhysiol.129:1723-1731;Yu等人，(2003)Phytochemistry63:753-763以及第5，034，323號、第5，283,184號和第5，942，657號美國專利，將這些參考文獻的每一個以引用的方式全文并入本文。共抑制的效率可通過在表達盒中在有義序列的3'和聚腺苷酸化信號的5'位置包括poly-dT區(qū)來提高。參見第2002/0048814號美國專利公布，將其以引用的方式并入本文。通常，這種核苷酸序列與內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄物的序列具有相當大的序列同一性，優(yōu)選的是高于約65%的序列同一性，更優(yōu)選的是高于約85%的序列同一性，最優(yōu)選的是高于約95%的序列同一性。參見第5，283,184號和第5，034，323號美國專利，將它們以引用的方式并入本文。在本發(fā)明的一些實施方案中，對ACC合酶多肽表達的抑制可通過反義抑制來獲得。對于反義抑制，將表達盒設(shè)計為表達這樣的RNA分子，該RNA分子與編碼ACC合酶多肽的信使RNA的全部或部分互補。該反義RNA分子的過量表達可導(dǎo)致天然基因的表達減少。因此，對用反義抑制表達盒轉(zhuǎn)化的多個植株進行篩選以鑒別那些顯示出對ACC合酶多肽表達的最大抑制的植株。用于反義抑制的多核苷酸可對應(yīng)于編碼ACC合酶多肽的序列的互補序列的全部或部分、ACC合酶轉(zhuǎn)錄物的5'和/或3'非翻譯區(qū)的互補序列的全部或部分、或者編碼ACC合酶多肽的轉(zhuǎn)錄物的編碼序列和非翻譯區(qū)二者的互補序列的全部或部分。此外，反義多核苷酸可與靶序列完全互補(即與靶序列的互補序列100%相同)或部分互補(即與靶序列的互補序列的同一性低于100%，包括99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、85%、80%，在一些實施方案中靶序列為SEQIDN0:4、5或6)。反義抑制還可用來抑制同一植株中的多種蛋白質(zhì)的表達。參見(例如)第5，942，657號美國專利。此外，反義核苷酸的部分可用來破壞靶基因的表達。一般來講，可使用至少50個核苷酸、100個核苷酸、200個核苷酸、300、400、450、500、550或更多個核苷酸的序列。使用反義抑制來抑制植物中的內(nèi)源基因的表達的方法在例如如下文獻中有描述:Liu等人，(2002)PlantPhysiol.1291732-1743，和第5，759，829號和第5，942，657號美國專利，將這些參考文獻的每一個以引用的方式并入本文。反義抑制的效率可通過在表達盒中在反義序列的3'和聚腺苷酸化信號的5'位置處包括poly-dT區(qū)來提高。參見第2002/0048814號美國專利申請公開，將其以引用的方式并入本文。在本發(fā)明的一些實施方案中，對ACC合酶多肽表達的抑制可通過雙鏈RNA(dsRNA)干擾來獲得。對于dsRNA干擾，有義RNA分子(如上文針對共抑制所描述)和與該有義RNA分子完全或部分互補的反義RNA分子在同一細胞中表達，從而導(dǎo)致對應(yīng)的內(nèi)源信使RNA的表達的抑制。有義和反義分子的表達可通將表達盒子設(shè)計為同時包含有義序列和反義序列來實現(xiàn)?；蛘?，可將單獨的表達盒分別用于有義序列和反義序列。對用(一個或多個)dsRNA干擾表達盒轉(zhuǎn)化的多個植株進行篩選以鑒別顯示出對ACC合酶多肽表達的最大抑制的植株。利用dsRNA干擾來抑制內(nèi)源植物基因的表達的方法在如下文獻中有描述=Waterhouse等人，(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:13959-13964,Liu等人，(2002)PlantPhysiol.129:1732-1743和WO99/49029、WO99/53050、WO99/61631以及WO00/49035，將這些參考文獻的每一個以引用的方式并入本文。在本發(fā)明的一些實施方案中，對ACC合酶多肽表達的抑制可通過發(fā)夾RNA(hpRNA)干擾或含內(nèi)含子的發(fā)夾RNA(ihpRNA)干擾來獲得。這些方法在抑制內(nèi)源基因表達方面是高度有效的。參見，Waterhouse和Helliwell,(2003)Nat.Rev.Genet.4:29-38以及其中引用的參考文獻。對于hpRNA干擾，將表達盒設(shè)計為表達這樣的RNA分子，該RNA分子自身雜交而形成包括單鏈環(huán)區(qū)和堿基配對莖的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。該堿基配對莖區(qū)包含對應(yīng)于編碼要對其表達進行抑制的基因的內(nèi)源信使RNA的全部或部分的有義序列和與該有義序列完全或部分互補的反義序列。反義序列可位于有義序列的“上游”(即反義序列可比有義序列更靠近驅(qū)動該發(fā)夾RNA的表達的啟動子)。堿基配對莖區(qū)可對應(yīng)于控制待抑制的基因的表達的啟動子序列的一部分。設(shè)計用于表達具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的RNA分子的多核苷酸包含第一核苷酸序列和屬第一核苷酸序列的互補序列的第二核苷酸序列，并且其中第二核苷酸序列相對于第一核苷酸序列處于相反取向。因而，該分子的堿基配對莖區(qū)通常確定了RNA干擾的特異性。該有義序列和該反義序列通常具有相似長度，但長度可不同。因而，這些序列可以是長度為至少10、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、50、70、90、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400、500、600、700、800、900個核苷酸，或長度為至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或101Λ的部分或片段。該表達盒的環(huán)區(qū)長度可以變化。因而，環(huán)區(qū)可長度為至少100、200、300、400、500、600、700、800、900個核苷酸，或長度為至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10kb。hpRNA分子在抑制內(nèi)源基因的表達方面是高度有效的，并且它們誘導(dǎo)的RNA干擾被植物的后代遺傳。參見(例如)Chuang和Meyerowitz，(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:4985-4990;Stoutjesdijk等人，(2002)PlantPhysiol.129:1723-1731以及Waterhouse和Helliwel1，(2003)Nat.Rev.Genet.4:29-38。利用hpRNA干擾來抑制或沉默基因的表達的方法例如在如下文獻中有描述=Chuang和Meyerowitz，(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:4985-4990;Stoutjesdijk等人，(2002)PlantPhysiol.1291723-1731；Waterhouse和Helliwell，(2003)Nat.Rev.Genet.4:29-38；Pandolfini等人，BMCBiotechnology3:7和第2003/0175965號美國專利申請公開，將這些參考文獻的每一個以引用的方式并入本文。hpRNA構(gòu)建體體內(nèi)沉默基因表達的效率的瞬時測定法已由Panstruga等人，(2003)Mol.Biol.Rep.30:135-140進行了描述，將該文獻以引用的方式并入本文。對于ihpRNA，干擾分子具有與hpRNA相同的總體結(jié)構(gòu)，但該RNA分子另外還在發(fā)夾的環(huán)區(qū)中包含內(nèi)含子，該內(nèi)含子能夠在表達ihpRNA的細胞中被剪接。內(nèi)含子的使用使得發(fā)夾RNA分子中的環(huán)區(qū)大小在剪接后最小化，這可提高干擾的效率。參見(例如)Smith等人，Q000)Nature407:319-320。事實上，Smith等人顯示使用ihpRNA介導(dǎo)的干擾100%抑制了內(nèi)源基因表達。在一些實施方案中，內(nèi)含子是ADHl內(nèi)含子1。利用ihpRNA干擾來抑制內(nèi)源植物基因的表達的方法例如在如下文獻中有描述Smith等人，O000)Nature407319-320；Wesley等人，Q001)PlantJ.27:581-590；Wang和Waterhouse，(2001)Curr.Opin.PlantBiol.5:146-150；Waterhouse禾口Helliwel1，(2003)Nat.Rev.Genet.4:29-38；Helliwell和Waterhouse,(2003)Methods30:289-295以及第2003/0180945號美國專利申請公開，將這些參考文獻的每一個以引用的方式并入本文。還可對用于hpRNA干擾的表達盒進行設(shè)計，使得有義序列和反義序列不對應(yīng)于內(nèi)源RNA。在這個實施方案中，該反義和有義序列在這樣的環(huán)序列的旁側(cè)，該環(huán)序列包含對應(yīng)于靶基因的內(nèi)源信使RNA的全部或部分的核苷酸序列。因而，是環(huán)區(qū)決定了RNA干擾的特異性。參見(例如)W002/00904;Mette等人，(2000)EMBOJ19:5194-5201；Matzke等人，(2001)Curr.Opin.Genet.Devel.11:221-227;Scheid等人，(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.，USA9913659-13662；Aufsaftz等人，O002)Proc.Nat‘1.Acad.Sci.99(4)16499-16506；Sijen等人，Curr.Biol.(2001)11:436-440)，將這些文獻以引用的方式并入本文。擴增子表達盒包含源自植物病毒的序列，該序列含有靶基因的全部或部分但通常不含有該天然病毒的基因的全部。存在于表達盒的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中的病毒序列使得該轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物能指導(dǎo)其自身的復(fù)制。由擴增子產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄物相對于靶序列(即ACC合酶多肽的信使RNA)可以是有義或反義的。利用擴增子來抑制內(nèi)源植物基因的表達的方法例如在如下文獻中有描述Angell和Baulcombe，(1997)EMBOJ.16:3675_3684、Angell和Baulcombe，(1999)PlantJ.20:357-362以及第6，635，805號美國專利，將這些參考文獻的每一個以引用的方式并入本文。在一些實施方案中，由本發(fā)明的表達盒表達的多核苷酸是ACC合酶多肽的信使RNA特異性的催化性RNA或具有ACC合酶多肽的信使RNA特異性的核酶活性。因而，該多核苷酸引起內(nèi)源信使RNA的降解，從而導(dǎo)致ACC合酶多肽表達減少。這個方法例如在第4，987，071號美國專利中進行了描述，將該專利以引用的方式并入本文。在本發(fā)明的一些實施方案中，對ACC合酶多肽的表達的抑制可通過經(jīng)由編碼微RNA(miRNA)的多核苷酸的表達進行的RNA干擾來獲得。miRNA是由約22個核糖核苷酸組成的調(diào)控劑。miRNA在抑制內(nèi)源基因的表達方面是高度有效的。參見例如Javier等人，(2003)Nature425:257力63，將該文獻以引用的方式并入本文。對于miRNA干擾，將表達盒設(shè)計成表達模仿內(nèi)源miRNA基因的RNA分子。該miRNA基因編碼可形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的RNA，該發(fā)夾結(jié)構(gòu)含有與另一內(nèi)源基因(靶序列)互補的22核苷酸序列。為了抑制ACC合酶表達的，從ACC合酶轉(zhuǎn)錄物序列選擇該22核苷酸序列，其含有有義取向的所述ACC合酶序列的22個核苷酸和與該有義序列互補的對應(yīng)反義序列的21個核苷酸。miRNA分子在抑制內(nèi)源基因的表達方面是高度有效的，并且它們誘導(dǎo)的RNA干擾被植物后代遺傳。在一些實施方案中，可將多肽或編碼多肽的多核苷酸引入植物中，其中所述多肽能夠抑制ACC合酶多肽的活性。術(shù)語“多肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”在本文中可互換使用，指氨基酸殘基的聚合物。這些術(shù)語適用于其中一個或多個氨基酸殘基為相應(yīng)的天然存在的氨基酸的人工化學類似物的氨基酸聚合物，以及適用于天然存在的氨基酸聚合物。術(shù)語“殘基”或“氨基酸殘基”或“氨基酸”在本文中可互換使用，指整合進蛋白質(zhì)、多肽或肽(統(tǒng)稱“蛋白質(zhì)”)中的氨基酸。氨基酸可以是天然存在的氨基酸，除非另外進行限制，否則可涵蓋可以以與天然存在的氨基酸類似的方式發(fā)揮功能的天然氨基酸已知類似物。在一個實施方案中，所述多核苷酸編碼鋅指蛋白，該鋅指蛋白結(jié)合至編碼ACC合酶多肽的基因，從而導(dǎo)致所述基因的表達減少。在特定實施方案中，該鋅指蛋白結(jié)合至ACC合酶基因的調(diào)控區(qū)。在其它實施方案中，該鋅指蛋白結(jié)合至編碼ACC合酶多肽的信使RNA并防止其翻譯。選擇被鋅指蛋白靶向的位點的方法已例如在第6，453，242號美國專利進行了描述，利用鋅指蛋白來抑制植物中的基因表達的方法例如在第2003/0037355號美國專利申請公開中進行了描述，將這些專利每一個以引用的方式全文并入本文。在本發(fā)明的一些實施方案中，所述多核苷酸編碼這樣的抗體，該抗體結(jié)合至少一種ACC合酶多肽并減少該ACC合酶多肽的活性。在另一個實施方案中，抗體的結(jié)合導(dǎo)致由細胞質(zhì)量控制機制進行的抗體-ACC合酶復(fù)合物的周轉(zhuǎn)增加?？贵w在植物細胞中的表達以及通過抗體表達并結(jié)合至植物細胞中的蛋白質(zhì)來抑制分子途徑是本領(lǐng)域所熟知的。參見例如Conrad和Sonnewald，(2003)NatureBiotech.21:；35_36，將該文獻以引用方式并入本文。在本發(fā)明的一些實施方案中，通過破壞編碼ACC合酶多肽的基因來減少或消除ACC合酶多肽的活性?？赏ㄟ^本領(lǐng)域已知的任何方法來破壞編碼ACC合酶多肽的基因。例如，在一個實施方案中，通過轉(zhuǎn)座子標簽法破壞所述基因。在另一個實施方案中，通過利用隨機誘變或定向誘變來對植物進行誘變處理并選擇具有減低了的氮利用活性的植物來破壞所述基因。在本發(fā)明的一個實施方案中，將轉(zhuǎn)座子標簽法用于減少或消除一種或多種ACC合酶多肽的ACC合酶活性。轉(zhuǎn)座子標簽法包括在內(nèi)源ACC合酶基因內(nèi)插入轉(zhuǎn)座子以減少或消除所述ACC合酶多肽的表達。在這個實施方案中，通過在編碼ACC合酶多肽的基因的調(diào)控區(qū)或編碼區(qū)內(nèi)插入轉(zhuǎn)座子來減少或消除一種或多種ACC合酶多肽的表達。處于ACC合酶基因的外顯子、內(nèi)含子、5'或3'非翻譯序列、啟動子或任何其他調(diào)控序列內(nèi)的轉(zhuǎn)座子，可用于減少或消除所編碼的ACC合酶多肽的表達和/或活性。用于對植物中的特定基因進行轉(zhuǎn)座子標記的方法是本領(lǐng)域所熟知的。參見(例如)Maes等人，(1999)TrendsPlantSci.4:90-96；Dharmapuri和Sonti，(1999)FEMSMicrobiol.Lett.179:53-59；Meissner等人，(2000)PlantJ.22:265-274；Phogat等人，(2000)J.Biosci.2557-63；Walbot,(2000)Curr.Opin.PlantBiol.2:103-107；Gai等人，(2000)NucleicAcidsRes.28:94-96；Fitzmaurice等人，(1999)Genetics1531919-1928)。此外，用于選擇選定基因中的Mu插入序列的TUSC方法已在如下文獻中進行了描述Bensen等人，(1995)PlantCell7:75-84;Mena等人，(1996)Science2741537-1540和第5，962，764號美國專利，將這些參考文獻的每一個以引用的方式全文并入本文。用于降低或消除植物中的內(nèi)源基因的表達的另外方法也是本領(lǐng)域已知的，并且可類似地應(yīng)用于本發(fā)明。這些方法包括其他形式的誘變，例如甲磺酸乙酯誘導(dǎo)的誘變、缺失誘18變和快中子缺失誘變，快中子缺失誘變以反向遺傳學方式(使用PCR)用于鑒別其中內(nèi)源基因已缺失的植株。這些方法的例子參見Ohshima等人，(1998)Virology243:472-481;Okubara等人，(1994)Genetics137:867-874和Quesada等人，(2000)Genetics154421-436，將這些參考文獻的每一個以引用的方式全文并入本文。此外，一種用于篩選化學誘導(dǎo)的突變的快速且可自動化的方法TILLING(TargetingInducedLocalLesionsInGenomes(定向誘導(dǎo)基因組局部突變))也適用于本發(fā)明，該方法利用變性HPLC或者對選定的PCR產(chǎn)物的選擇性內(nèi)切核酸酶消化。參見McCallum等人，(2000)Nat.Biotechnol.18455-457，將該文獻以引用的方式并入本文。影響基因表達或干擾所編碼的蛋白質(zhì)的功能的突變是本領(lǐng)域所熟知的?；蛲怙@子中的插入突變通常導(dǎo)致無效突變體。保守殘基的突變在抑制所編碼的蛋白質(zhì)的活性方面是特別有效的。植物ACC合酶多肽的適于以消除ACC合酶活性為目標進行的誘變的保守殘基已得到描述。可根據(jù)熟知的程序分離這種突變體，并且可通過遺傳雜交對不同ACC合酶基因座中的突變進行堆疊。參見例如Gruis等人，(2002)PlantCell14:2863-2882。在本發(fā)明的另一個實施方案中，顯性突變體由于基因倒位和重復(fù)基因座的重組可用于引發(fā)RNA沉默。參見例如Kusaba等人，(2003)PlantCell15:1455-1467。本發(fā)明涵蓋另外的用于減少或消除一種或多種ACC合酶多肽的活性的方法。用于改變或突變植物中的基因組核苷酸序列的其他方法的例子是本領(lǐng)域已知的，包括但不限于使用RNA:DNA載體、RNA:DNA突變載體、RNAiDNA修復(fù)載體、混合雙鏈寡核苷酸、自互補RNA:DNA寡核苷酸以及重組工程寡核堿基(recombinogenicoligonucleobase)。這種載體和使用方法是本領(lǐng)域已知的。參見例如第5，565，350號美國專利；第5，731，181號美國專利；第5，756，325號美國專利；第5，760，012號美國專利；第5，795，972號美國專利和第5，871，984號美國專利，將這些專利中的每一個以引用的方式并入本文。另參見WO98/49350、WO99/07865、WO99/25821和Beetham等人，(1999)Proc.Natl.Acad.ki.USA96:8774-8778,將這些專利和參考文獻的每一個以引用的方式全文并入本文。在多核苷酸用于降低或抑制ACC合酶活性的情況中，則應(yīng)該認識到可對本文中所公開的示例性序列作出修飾，只要該序列起到降低或抑制相應(yīng)mRNA的表達的作用。因而，例如，可使用與本文所公開的示例性序列(例如SEQIDN0:4、5或6)具有至少70%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多核苷酸。此外，可將示例性序列的部分或片段或者與示例性序列具有特定百分比的序列同一性的多核苷酸的部分或片段用于破壞靶基因的表達。一般來講，可使用例如SEQIDNO:4、5或6的至少10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、250、260、280、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000個或更多個連續(xù)核苷酸。應(yīng)該認識到，在特定實施方案中，可以使用這類序列的互補序列。例如，發(fā)夾構(gòu)建體同時包含對應(yīng)于所關(guān)注基因的有義序列片段和互補(或反義)序列片段。反義構(gòu)建體可與所關(guān)注基因具有不到100%的序列同一性，并且可包含所關(guān)注基因的部分或片段，只要本發(fā)明的目標得到實現(xiàn)，即只要所關(guān)注基因的表達被降低?？捎糜诒景l(fā)明的ACC合酶核酸包含至少一種選自以下的ACC合酶多核苷酸(a)編碼ACC合酶多肽的多核苷酸及其保守修飾的變體和多態(tài)性變體；(b)與(a)的多核苷酸具有至少70%序列同一性的多核苷酸；(c)編碼ACC合酶多肽的多核苷酸的片段；以及(d)(a)、(b)或(C)的多核苷酸的互補序列。因而，在一些實施方案中，所述方法包括將至少一種包含ACC合酶核酸序列或其亞序列的多核苷酸序列引入植物細胞中，使得所述至少一種多核苷酸序列以有義或反義取向連接至啟動子，并且其中所述至少一種多核苷酸序列與SEQIDN0:l(gACS2)、SEQIDNO:2(gACS6)或SEQIDNO:3(gACS7)或它們的亞序列或它們的互補序列具有(例如)至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、約99.5%或更高的序列同一性。在另一個實施方案中，通過向植物細胞引入至少一種被構(gòu)造用于RNA沉默或干擾的、包含ACC合酶核酸序列的一種或多種亞序列的多核苷酸序列來實現(xiàn)破壞。在其它實施方案中，本發(fā)明的方法用包含選自以下的成員的多核苷酸來實施(a)與SEQIDNO1(gACS2)、SEQIDNO:2(gACS6)、SEQIDNO:3(gACS7)、SEQIDNO4(ACS2cDNA)、SEQIDNO:5(ACS6cDNA)或SEQIDNO:6(ACS7cDNA)或它們的亞序列或它們的保守變異體具有例如至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、約99.5%或更高的序列同一性的多核苷酸或其互補序列；(b)編碼SEQIDNO:7(ACS2),SEQIDNO:8(ACS6)或SEQIDNO:9(ACS7)的多肽序列或它們的亞序列或它們的保守變異體的多核苷酸序列或其互補序列；(c)在嚴格條件下雜交至包含SEQIDNO1(gACS2)、SEQIDNO2(gACS6)、SEQIDNO3(gACS7)、SEQIDNO4(ACS2cDNA)、SEQIDNO:5(ACS6cDNA)或SEQIDNO:6(ACS7cDNA)的至少100個連續(xù)核苷酸的多核苷酸亞序列的基本上整個長度的多核苷酸或其互補序列，或者雜交至(a)或(b)的多核苷酸序列的多核苷酸或其互補序列；以及(d)與(a)、(b)或(c)的多核苷酸序列具有至少約85%同一性的多核苷酸。在某些實施方案中，所述多核苷酸當在植物中表達時抑制乙烯產(chǎn)生。在特定實施方案中，將異源多核苷酸引入植物中，其中所述異源多核苷酸選自a)包含ACC合酶核酸的核酸；b)包含ACC合酶核酸的互補序列的至少15個連續(xù)核苷酸的核酸；以及c)編碼能夠形成雙鏈RNA(例如發(fā)夾)并介導(dǎo)對ACC合酶核酸的RNA干擾的轉(zhuǎn)錄物的核苷酸序列，其中所述核酸包含第一核苷酸序列和第二核苷酸序列，該第一核苷酸序列包含ACC合酶核酸的至少21個連續(xù)核苷酸，該第二核苷酸序列包含所述第一核苷酸序列的互補序列。在其他特定實施方案中，所述方法包括向植物引入選自以下的異源多核苷酸a)SEQIDNO:1、2、3、4、5或6中示出的核苷酸序列，或其完全互補序列；b)與SEQIDNO:1、2、3、4、5或6具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或更高的序列同一性的核苷酸序列，或其完全互補序列；c)編碼SEQIDN0:7、8或9的多肽序列的核苷酸序列；d)編碼與SEQIDNO:7、8或9具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或更高的序列同一性的多肽序列的核苷酸序列；e)包含SEQIDNO:1、2、3、4、5或6的至少15個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列；f)包含SEQIDNO:1、2、3、4、5或6的互補序列的至少15個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列；以及g)編碼能夠形成雙鏈RNA(例如發(fā)夾)并介導(dǎo)對ACC合酶核酸的RNA干擾的轉(zhuǎn)錄物的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包含SEQIDNO:1、2、3、4、5或6的至少21個連續(xù)核苷酸，以及其互補序列。在其它實施方案中，所述異源多核苷酸包含SEQIDNO:1、2、3、4、5或6的至少500個連續(xù)核苷酸以及其互補序列。在這些實施方案中的一些中，所述異源多核苷酸編碼能夠形成雙鏈RNA(例如發(fā)夾)并介導(dǎo)對ACC合酶核酸的RNA干擾的轉(zhuǎn)錄物。在這些實施方案中的一些中，植物包含由具有SEQIDNO:1、2、3、4、5或6示出的靶序列的多核苷酸編碼的mRNA。在另外的特定實施方案中，所述方法包括向植物引入異源多核苷酸，所述異源多核苷酸包含編碼具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄物的序列，其中所述序列包含第一核苷酸序列和第二核苷酸序列，該第一核苷酸序列具有SEQIDNO:14中示出的序列，該第二核苷酸序列具有SEQIDNO:15中示出的序列。在其它實施方案中，包含編碼具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄物的序列的異源多核苷酸包含具有SEQIDNO:51中示出的序列的第一核苷酸序列和具有SEQIDN0:52中示出的序列的第二核苷酸序列。在其它實施方案中，所述方法包括向植物引入包含SEQIDNO:53,54,55,56或57的構(gòu)建體。提供了用于改善在低氮條件下的產(chǎn)量的方法，該方法包括在具有氮限制條件的耕作區(qū)中種植具有至少一種ACC合酶的減低了的活性的種子或植物。在具有氮限制條件的耕作區(qū)中種植種子或植物之前，可對該環(huán)境進行評價以確定是否存在氮限制條件，包括測量土壤中的氮或氮肥的量。本文所用的“耕作區(qū)”包括期望在其中栽培植物的任何區(qū)域。這種耕作區(qū)包括但不限于在其中栽培植物的田地(如作物田、草地、樹林地、生產(chǎn)林、用于栽培水果和蔬菜的田地等等)、溫室、生長室等等。本發(fā)明提供利用(特別是)包含ACC合酶多核苷酸的RNA、DNA、其同源物、旁系同源物和直系同源物和/或嵌合體的分離核酸等的方法。這包括所述序列的天然存在的以及合成的變體和同源物。術(shù)語“分離的”或“分離的核酸”或“分離的蛋白質(zhì)”指諸如核酸或蛋白質(zhì)之類的物質(zhì)，該物質(zhì)實質(zhì)上或基本上不含在其天然存在的環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的通常與其相伴隨或與其相互作用的組分。分離的物質(zhì)任選包含未發(fā)現(xiàn)在其天然環(huán)境中與其一起的物質(zhì)。優(yōu)選地，“分離的”核酸不含在該核酸的來源生物體的基因組DNA中，天然處于該核酸旁側(cè)的序列(即位于該核酸的5'和3'端的序列)(優(yōu)選蛋白質(zhì)編碼序列)。例如，在各個實施方案中，分離的核酸分子可含有少于約51Λ、41Λ、31Λ、21Λ、11Λ、0.51Λ或0.Ikb的在該核酸的來源細胞的基因組DNA中天然處于該核酸分子的旁側(cè)的核苷酸序列。源自玉蜀黍、擬南芥(Arabidopsisthaliana)或源自所選擇的其他植物的、與本文提供的序列同源即與之具有顯著的序列同一性或相似性的序列，也可用于本發(fā)明的方法中。同源序列可源自任何植物，包括單子葉植物和雙子葉植物，特別是農(nóng)業(yè)上重要的植物物種，包括但不限于作物類如大豆、小麥、玉米(玉蜀黍)、馬鈴薯、棉花、水稻、油菜、油籽油菜(包括卡諾拉)、向日葵、苜蓿、三葉草、甘蔗和草皮，或水果和蔬菜類如香蕉、黑莓、藍莓、草莓和樹莓、香瓜、胡蘿卜、菜花、咖啡、黃瓜、茄子、葡萄、香蜜瓜、萵苣、芒果、甜瓜、洋蔥、木瓜、豌豆、胡椒、菠蘿、南瓜、菠菜、西葫蘆、甜玉米、煙草、番茄、青番茄(tomatillo)、西瓜、薔薇科水果(如蘋果、桃、梨、櫻桃和李子)和蕓苔屬蔬菜(如西蘭花、卷心菜、花椰菜、芽甘藍和苤藍)。其表型可以改變并且其包含同源序列的其他作物(包括水果和蔬菜)包括大麥；黑麥；小米；高粱；黑醋栗；鱷梨；柑橘類水果如橙、檸檬、柚子和橘子、洋薊、櫻桃；堅果如胡桃和花生；菊苣；韭蔥；根類蔬菜如竹芋、甜菜、木薯、蕪菁、蘿卜、薯蕷和甘薯以及豆類。所述同源序列還可源于木本物種，如松樹、楊樹和桉樹或者薄荷或其他唇形科植物。此外，同源序列可源自在進化上與作物相關(guān)，但可能還仍未用作作物的植物。例子包括顛茄(Atropabelladona)，其與番茄相關(guān)；曼陀羅(Daturastrommium)，其與佩奧特掌相關(guān)，以及墨西哥玉蜀黍(玉蜀黍?qū)傥锓N)，其與玉米(玉蜀黍)相關(guān)。上述同源序列可包含直系同源序列和旁系同源序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知有若干不同方法用于鑒別和定義這些功能上同源的序列。描述了用于定義直系同源物和旁系同源物的三種一般方法；可通過下述方法中的一種或多種來鑒別直系同源物、旁系同源物或同源物。直系同源物和旁系同源物是具有類似序列和類似功能的進化上相關(guān)的基因。直系同源物是由于物種形成事件而衍生的不同物種中的結(jié)構(gòu)上相關(guān)的基因。旁系同源物是由于復(fù)制事件而衍生的單種物種內(nèi)的結(jié)構(gòu)上相關(guān)的基因。在單種植物物種內(nèi)，基因復(fù)制可導(dǎo)致兩個拷貝的特定基因，從而產(chǎn)生兩種或更多種稱為旁系同源物的具有相似序列以及通常有相似功能的基因。因而旁系同源物為相同物種內(nèi)的復(fù)制而形成的相似基因。當用諸如CLUSTAL)(Thompson等人，(1994)NucleicAcidsRes.22:4673-4680；Higgins等人，(1996)MethodsEnzymo1.266:383-402)之類的程序分析基因家族演化發(fā)展時，旁系同源物通常聚類在一起或聚類在相同進化枝(一組相似基因)中。還可用雙序列BLAST(pair-wiseBLAST)分析(Feng和Doolittle，(1987)J.Mol.Evo1.25:351-360)來鑒別相似基因的群組。例如，來自擬南芥屬的一枝十分相似的MADS域轉(zhuǎn)錄因子全部在花期中具有共同功能(fcitcliffe等人，(2001)PlantPhysiol.1122-132)，來自擬南芥屬的一組十分相似的AP2域轉(zhuǎn)錄因子涉及植物對冷凍的耐受性(Gilmour等人，(1998)PlantJ.16433-442)。對處于一個進化枝內(nèi)的具有相似功能的相似基因的群組進行分析，可得到該進化枝特有的亞序列。這些亞序列(稱為共有序列)不僅可用于限定每個進化枝內(nèi)的該序列，而且還可用于限定這些基因的功能；進化枝內(nèi)的基因可含有具有相同功能的旁系序列或直系同源序列(另參見例如Mount，(2001),BioinformaticsSequenceandGenomeAnalysisColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.,第543頁)。物種形成(從母物種產(chǎn)生新物種)也可產(chǎn)生兩種或更多種具有相似序列和相似功能的基因。這些基因(稱為直系同源物)通常在它們的宿主植株內(nèi)具有相同的功能，并且還可在物種之間交換而不會喪失功能。因為植物具有共同的祖先，任何植物物種內(nèi)的許多基因?qū)⒃谄渌参镂锓N中具有相應(yīng)的直系同源基因。一旦已用諸如CLUSTAL(Thompson等人，(1994)NucleicAcidsRes.22:4673-4680；Higgins等人，(1996)(同上))之類的程序構(gòu)建一個物種的基因家族的系統(tǒng)發(fā)生樹后，可將潛在的直系同源序列放入該系統(tǒng)發(fā)生樹中并可確定它們與來自所關(guān)注物種的基因的關(guān)系。還可通過交互式BLAST(reciprocalBLAST)策略鑒別直系同源序列。一旦已鑒別直系同源序列，則可從參比序列的已鑒別功能推斷出該直系同源物的功能。來自不同生物體的直系同源基因具有高度保守的功能，常常是基本相同的功能(Lee等人，(2002)GenomeRes.12:493-502;Remm等人，(2001)J.Mol.Biol.3141041-1052)。旁系基因(其通過基因復(fù)制而趨異)可保留所編碼蛋白質(zhì)的相似功能。在這種情形中，就本發(fā)明的某些實施方案(例如，編碼序列的轉(zhuǎn)基因表達)來說旁系同源物可互換使用。ACC合酶多核苷酸(例如本文所公開的那些)可用于分離同源物、旁系同源物或直系同源物。這樣，可將諸如PCR、雜交等之類的方法用于基于這類序列與ACC合酶多核苷酸的序列同源性來鑒別這類序列。在PCR方法中，可設(shè)計寡核苷酸引物用于PCR反應(yīng)來從提取自任何所關(guān)注的植物的cDNA或基因組DNA擴增相應(yīng)的DNA序列。用于設(shè)計PCR引物或PCR克隆的方法是本領(lǐng)域公知的，在Sambrook等人，(1989)MolecularCloning:ALaboratoryManual(第2版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,Plainview,NewYork)中有公開。另參見Innis等人(編輯)，(1990)PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplications(AcademicPress,NewYork)；Innis和Gelfand(編輯)(1995)PCRStrategies(AcademicPress,NewYork)；以及Innis禾口Gelfand(編輯)，(1999)PCRMethodsManual(AcademicPress,NewYork)。己知的PCR方法包括但不限于利用成對引物、巢式引物、單一特異引物、簡并引物、基因特異性引物、載體特異性引物、部分錯配引物等的方法。所謂“擴增”意指構(gòu)造核酸序列的多個拷貝或與該核酸序列互補的多個拷貝，構(gòu)建是利用所述核酸序列中的至少一個作為模板進行。擴增系統(tǒng)包括聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)系統(tǒng)、連接酶鏈反應(yīng)(LCR)系統(tǒng)、基于核酸序列的擴增(NASBA,Cangene,Mississauga,Ontario)、Q-β復(fù)制酶系統(tǒng)、基于轉(zhuǎn)錄的擴增系統(tǒng)(TAS)和鏈置換擴增(SDA)。參見例如DiagnosticMolecularMicrobiologyprinciplesandApplications,Persing等人(編輯)，AmericanSocietyforMicrobiology,Washington,DC(1993)。擴增的產(chǎn)物稱為擴增子。在雜交技術(shù)中，已知的多核苷酸的全部或部分被用作探針，該探針選擇性雜交至一群克隆的基因DNA片段或cDNA片段(即基因組或cDNA文庫)中存在的包含相應(yīng)核苷酸序列的其他核酸。雜交探針可以是基因組DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其他寡核苷酸，并且可用諸如32P之類的可檢測基團或任何其他可檢測標記物進行標記。因而，例如，用于雜交的探針可通過標記基于本文所公開的ACC合酶序列的合成寡核苷酸來制備。制備雜交探針和構(gòu)造cDNA文庫和基因組文庫的方法是本領(lǐng)域已知的，在Sambrook等人，(1989)MolecularCloning:ALaboratoryManual(第2版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,Plainview,NewYork)中有公開。例如，可將本文所公開的整個ACC合酶序列或其一個或多個部分用作能夠特異性雜交至相應(yīng)ACC合酶序列和信使RNA的探針。為了在多種條件下實現(xiàn)特異性雜交，這種探針包括各ACC合酶序列當中獨特的序列并且長為至少約10、12、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、50、60、70、80、90或更多個核苷酸。這種探針可用于通過PCR從選定的植物擴增出相應(yīng)的ACC合酶序列。該技術(shù)可用于從所需植物分離出另外的編碼序列或用作診斷測定法以確定編碼序列在植物中的存在。雜交技術(shù)包括對涂布的核酸(例如DNA)文庫(噬菌斑或菌落)的雜交篩選，參見例如Sambrook等人，(1989)MolecularCloningALaboratoryManual(第2版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,Plainview,NewYork)。所謂“核酸文庫”意指分離的DNA或RNA分子的集合，它們包含且實質(zhì)上代表指定生物體的基因組的整個被轉(zhuǎn)錄的部分。示例性的核酸文庫(例如基因組文庫和cDNA文庫)的構(gòu)造在例如如下的標準分子生物學參考文獻中有教導(dǎo)=Bergei^nKimmel,(1987)GuideToMolecularCloningTechniques,MethodsinEnzymology系列，第152卷，AcademicPress,Inc.,SanDiego,CA；Sambrook^Α(1989)MolecularCloning:ALaboratoryManual,第2版，第1-3卷；以及CurrentProtocolsinMolecularBiology,Ausubel等人(編輯)，CurrentProtocols,ajointventurebetweenGreenePublishingAssociates,Inc.andJohnWiley&Sons,Inc.(1994年增補本)；這類序列的雜交可在嚴格條件下進行。術(shù)語“嚴格條件”或“嚴格雜交條件”包括指涉探針與其靶序列雜交的程度將比它與其他序列雜交的程度可檢測地更高(例如，至少2倍于背景)的條件。嚴格條件是序列依賴性的，在不同的環(huán)境中將會不同。通過控制雜交和/或洗滌條件的嚴格性，可鑒別與探針可最高達100%互補的靶序列(同源探測)。或者，可調(diào)節(jié)嚴格性條件以允許序列中有一些錯配，以使得檢測到較低程度的相似性(異源探測)。優(yōu)選地，探針長為大約500個核苷酸，但長度可變化很大，從小于500個核苷酸到等于靶序列的整個長度。通常，嚴格條件將為其中鹽濃度低于約1.5M鈉離子，通常為約0.01至1.0M鈉離子濃度(或其他鹽)，PH為7.O至8.3，對短探針(例如，10至50個核苷酸)而言溫度為至少30°C，對長探針(例如超過50個核苷酸)而言溫度為至少約60°C的那些條件。嚴格條件還可通過添加去穩(wěn)定劑如甲酰胺或Denhardt's來實現(xiàn)。示例性的低嚴格性條件包括在37°C下用30至35%甲酰胺、IMNaCl、1%SDS(十二烷基硫酸鈉)的緩沖溶液雜交，并在50至55°C下在IX至2XSSC(20XSSC=3.OMNaCl/0.3M檸檬酸三鈉)中洗滌。示例性的中等嚴格性條件包括37°C下在40至45%甲酰胺、IMNaClU%SDS中雜交，并在55至60°C下在0.5X至IXSSC中洗滌。示例性的高嚴格性條件包括37°C下在50%甲酰胺、IMNaClU%SDS中雜交，并在60至65°C下在0.IXSSC中洗滌。特異性通常決定于雜交后的洗滌，關(guān)鍵因素為最終洗滌溶液的離子強度和溫度。對于DNA-DNA雜交體，可根據(jù)Meinkoth和Wahl，(1984)Anal.Biochem.，138:267-84的公式估計Tm:Tm=81.5°C+16.6(logΜ)+0.41(%GC)-0.61(%form)-500/L，其中M為單價陽離子的摩爾濃度，％GC為DNA中鳥嘌呤核苷酸和胞嘧啶核苷酸的百分比，％form為雜交溶液中甲酰胺的百分比，L為雜交體的長度(單位為堿基對)。Tm為50%的互補靶序列雜交至完全匹配的探針時的溫度。每錯配，Tffl減少約1°C，因而，可調(diào)節(jié)Tm、雜交和/或洗滌條件以雜交至所需同一性的序列。例如，如果尋求具有>90%同一性的序列，則可將Tm降低10°C。通常，將嚴格條件選擇為比特定序列及其互補序列在確定的離子強度和PH下的熱解鏈溫度(Tm)低約5°C。然而，極嚴格條件可采用在低于熱解鏈溫度001、2、3或41下雜交和/或洗滌；中等嚴格條件可采用在低于熱解鏈溫度(Tm)6、7、8、9或10°C下雜交和/或洗滌；低嚴格條件可采用在低于熱解鏈溫度0011、12、13或14、15或201下雜交和/或洗滌。利用該公式，雜交和洗滌組成以及所需的Tm，普通技術(shù)人員將認識到，雜交和/或洗滌溶液的嚴格性的變化固有地得到了描述。如果所需的錯配程度導(dǎo)致Tm低于45°C(水溶液)或32°C(甲酰胺溶液)，則優(yōu)選增加SSC濃度以使得可使用較高的溫度。有關(guān)核酸雜交的詳盡指導(dǎo)可在如下文獻中找到TijSSen，LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology-HybridizationwithNucleicAcidProbes,第I部分，第2章,“Overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidprobeassays,"Elsevier,NewYork(1993)；禾口CurrentProtocolsinMolecularBiology,第2章，Ausubel等人(編輯)，GreenePublishingandffiley-Interscience,NewYork(1995)除非另外指明，否則在本專利申請中，高嚴格性定義為在65°C下在4XSSC、5XDenhardt's(500ml水中的5gFicoll，5g聚乙烯吡咯烷酮、5g牛血清白蛋白)、0.lmg/ml煮沸鮭精DNA和25mM磷酸鈉中雜交，并在65°C下在0.IXSSC,0.1%SDS中洗滌。術(shù)語“選擇性雜交”包括指涉在嚴格雜交條件下核酸序列與指定的核酸靶序列雜交的程度比其與非靶序列雜交的程度可檢測地更高(例如，至少2倍于背景)，并且實質(zhì)上排除非靶核酸。選擇性雜交的序列通常相互具有約至少40%的序列同一性，優(yōu)選60-90%的序列同一性，最優(yōu)選100%的序列同一性(即互補性)。術(shù)語“雜交復(fù)合物”包括指涉由相互選擇性雜交的兩條單鏈核酸序列形成的雙鏈核酸結(jié)構(gòu)。本文所用的“基本上由組成”意指包括目標多核苷酸以外的額外序列，其中該額外序列在嚴格雜交條件下不選擇性雜交至所述多核苷酸所雜交的同一cDNA，并且其中雜交條件包括在65°C下在0.IXSSC和0.十二烷基硫酸鈉中的洗滌步驟。ACC合酶核苷酸序列可用于產(chǎn)生變體核苷酸序列，該變體核苷酸序列具有與初始核苷酸序列具有大約70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%、98%和99%同一性的5'-非翻譯區(qū)、3'-非翻譯區(qū)或啟動子區(qū)的核苷酸序列。然后將這些變體與種質(zhì)中的與NUE相關(guān)的組成性狀的天然變異相關(guān)聯(lián)。該相關(guān)聯(lián)的變體用作標志單倍型來選擇所期望的性狀。產(chǎn)生出ACC合酶多肽的變體氨基酸序列。在這個實例中，對一個或多個氨基酸進行變更。具體而言，觀察開放閱讀框以確定適當?shù)陌被嶙兏?。要改變的氨基酸的選擇是通過參考蛋白質(zhì)比對(與其他直向同源物和來自不同物種的其他基因家族成員的比對)進行的。選擇出這樣的氨基酸，其被認為不處在高選擇壓力下(不高度保守)，且相當容易地被具有相似的化學特性(即相似的功能側(cè)鏈)的氨基酸置換。利用蛋白質(zhì)比對，可對適當?shù)陌被徇M行改變。一旦鑒定出目標氨基酸，即遵循本文所述的程序。使用這個方法產(chǎn)生出具有約70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%或更高核酸序列同一性的變體。然后將這些變體與種質(zhì)中的與NUE相關(guān)的組成性狀的天然變異相關(guān)聯(lián)。該相關(guān)聯(lián)的變體用作標志單倍型來選擇所期望的性狀。本發(fā)明還包括為在不同生物體中表達而經(jīng)優(yōu)化的多核苷酸。例如，對于多核苷酸在玉蜀黍植物中的表達，可變更該序列以解決特定的密碼子偏好性和改變GC含量，如根據(jù)Murray等人(同上)所述。關(guān)于來自玉蜀黍植物的觀種基因的玉蜀黍密碼子用法在Murray等人(同上)的表4中列出。術(shù)語“保守修飾的變體”同時適用于氨基酸序列和核酸序列。就特定核酸序列而言，保守修飾的變體指編碼氨基酸序列的相同的或保守修飾的變體的那些核酸。由于遺傳密碼的簡并性，大量功能上相同的核酸編碼任何給定蛋白質(zhì)。例如，密碼子GCA、GCC、GCG和GCU全部編碼丙氨酸這種氨基酸。因而，在每個由密碼子規(guī)定丙氨酸的位置，可將該密碼子變更為所描述的相應(yīng)密碼子的任一種而不會改變所編碼的多肽。這種核酸變異為“沉默變異”，代表保守修飾的變異的一種。編碼多肽的本文每種核酸序列還描述了該核酸的每種可能的沉默變異。普通技術(shù)人員將認識到，可修飾核酸中的每種密碼子(AUG除外，其通常為甲硫氨酸的唯一密碼子；一個例外是紅色微球菌(Micrococcusrubens)，對于其來說GTG是甲硫氨酸密碼子(Ishizuka等人，(1993)J.Gen.Microbiol.139:425-32)以產(chǎn)生功能上相同的分子。因此，編碼本發(fā)明多肽的核酸的每種沉默變異均隱含在每種所描述的多肽序列中并以引用的方式并入本文。對于氨基酸序列，技術(shù)人員將認識到，對核酸、肽、多肽或蛋白質(zhì)序列作出的會改變、添加或缺失所編碼的序列中的單個氨基酸或一小部分氨基酸的各個置換、缺失或添加，在該變更導(dǎo)致氨基酸為化學類似的氨基酸所置換時，為“保守修飾的變體”。因而，還可變更選自1至15的整數(shù)的任何數(shù)目的氨基酸殘基。因而，例如，可作出1、2、3、4、5、7或10個變更。保守修飾的變體通常提供與它們所源自的未經(jīng)修飾的多肽序列類似的生物活性。例如，對于其天然底物而言，底物特異性、酶活性或配體/受體結(jié)合通常為天然蛋白質(zhì)的至少30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%，優(yōu)選60-90%。提供功能上相似的氨基酸的保守置換表是本領(lǐng)域所熟知的。下面的六個組各含有對彼此而言是保守置換的氨基酸1)丙氨酸(A)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、賴氨酸(K)；5)異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、纈氨酸(V)；和6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。Creighton,Proteins,W.H.FreemanandCo.(1984)。以下術(shù)語用來描述兩個或更多個核苷酸或多肽之間的序列關(guān)系(a)“參比序列”，(b)“比較窗口”，(c)“序列同一性”，(d)“序列同一性百分比”和(e)“實質(zhì)相同”。本文所用的“參比序列”是用作序列比較的基礎(chǔ)的確定的序列。參比序列可為指定的序列的子集或全部；例如作為全長cDNA或基因序列的區(qū)段或者該完全cDNA或基因序列。本文所用的“比較窗口，，意指包括指涉多核苷酸序列的連續(xù)和指定的區(qū)段，其中該比較窗口中的該多核苷酸序列相比于參比序列(不包含添加或缺失)可包含添加或缺失(即空位)，以便兩個多核苷酸的最佳比對。通常，比較窗口長度為至少20個連續(xù)的核苷酸，任選地可為30、40、50、100個或更長。本領(lǐng)域技術(shù)人員認識到，為避免由于在多核苷酸序列中加入空位所致的與參比序列的高度相似性，通常引入空位罰分并從匹配數(shù)扣除空位罰分。將核苷酸和氨基酸序列進行比對以作比較的方法是本領(lǐng)域公知的。Smith和Waterman，(1981)Adv.App1.Math2:482的局部同源算法(BESTFIT)可對用于比較的序列進行最佳比對；通過Needleman和Wunsch,(1970)J.Mol.Biol.48443-53的同源比對算法(GAP)；通過Pearson和Lipman，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:2444的相似性搜索算法(Tfasta和i^asta)；通過這些算法的計算機化執(zhí)行，包括但不限于dntelligenetics(MountainView,California)的PC/Gene程序中的CLUSTAL、WisconsinGeneticsSoftwarePackage第8版(可得自GeneticsComputerGroup(GCG程序(Accelrys,Inc.，SanDiego,CA))中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA禾口TFASTA如下文獻詳細描述了CLUSTAL程序Higgins和Sharp，(1988)Gene73:237-44；Higgins和Sharp,(1989)CABIOS5:151-3;Corpet等人，(1988)NucleicAcidsRes.16:10881-90；Huang等人，(1992)ComputerApplicationsintheBiosciences8:155-65以及Pearson等人，(1994)Meth.MOl.BiOl.M:307-31。用于多序列的最佳全局比對的優(yōu)選程序是PileUp(Feng和Doolittle,(1987)J.Mol.Evol.,25:351_60，其類似于Higgins和Sharp,(1989)CABIOS5151-53描述的方法，藉此以引用的方式將其并入本文)。可用于數(shù)據(jù)庫相似性搜索的BLAST程序家族包括用于核苷酸查詢序列對核苷酸數(shù)據(jù)庫序列的BLASTN；用于核苷酸查詢序列對蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫序列的BLASTX；用于蛋白質(zhì)查詢序列對蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫序列的BLASTP；用于蛋白質(zhì)查詢序列對核苷酸數(shù)據(jù)庫序列的TBLASTN和用于核苷酸查詢序列對核苷酸數(shù)據(jù)庫序列的TBLASTX。參見CurrentProtocolsinMolecularBiology，第19章，Ausubel等人(編輯)，GreenePublishingandffiley-Interscience,NewYork(1995)。GAP利用Needleman和mmsch(同上)的算法來尋找兩個完整序列的比對，該比對使匹配數(shù)最大而使空位數(shù)最小。GAP會考慮所有可能的比對和空位位置，并產(chǎn)生具有最大數(shù)目的匹配堿基和最少的空位的比對。其允許提供以匹配堿基數(shù)為單位的空位產(chǎn)生罰分和空位延伸罰分。GAP對于其插入的每個空位，都必須利用匹配的空位產(chǎn)生罰分數(shù)。如果選擇大于零的空位延伸罰分，GAP對于每個插入的空位必須另外利用空位長度乘以空位延伸罰分。WisconsinGeneticsSoftwarePackage第10版中的默認空位產(chǎn)生罰分值和空位延伸罰分值分別為8和2。空位產(chǎn)生和空位延伸罰分可以以選自0-100的整數(shù)來表示。因而，例如，空位產(chǎn)生和空位延伸罰分可以是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50或更大。GAP給出最好的比對的群體中的一個成員。這個群體可能存在許多成員，但其他成員沒有更好的質(zhì)量。GAP顯示關(guān)于比對的四個品質(zhì)因素品質(zhì)(quanlity)、比率(ratio)、同一性(identity)和相似性(similarity).質(zhì)量是為了比對序列而被最大化的指標(metric)。比率是品質(zhì)除以較短區(qū)段中的堿基數(shù)。同一性百分數(shù)是實際匹配的符號的百分數(shù)。相似性百分數(shù)是相似的符號的百分數(shù)。將對應(yīng)于空位的符號忽略。當一對符號的打分矩陣值大于或等于0.50(相似性閾值)時，對相似性打分。WisconsinGeneticsSoftwarePackage版本10中所用的打分矩陣為BL0SUM62(參見Henikoff和Henikoff，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915)。除非另外指明，否則本文所提供的序列同一性/相似性值指用BLAST2.O程序包，采用默認參數(shù)獲得的值(Altschul等人，(1997)NucleicAcidsRes.25:3389-402)。如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將會理解的，BLAST搜索假定蛋白質(zhì)可被模擬為隨機序列。然而，許多真實蛋白質(zhì)包含非隨機序列區(qū)，該非隨機序列可為同聚段、短周期重復(fù)或富含一種或多種氨基酸的區(qū)域。這種低復(fù)雜性區(qū)域可在不相關(guān)的蛋白質(zhì)之間比對，盡管該蛋白質(zhì)的其他區(qū)域完全不相似。可采用多種低復(fù)雜性過濾程序來減少這種低復(fù)雜性比對。例如，SEG(Wooten和Federhen,(1993)Comput.Chem.17:149-63)和XNU(Claverie和States,(1993)Comput.Chem.17:191-201)低復(fù)雜性過濾器可單獨使用或聯(lián)合使用。在兩個多核苷酸或多肽序列的情形中，本文所用的“序列同一性”或“同一性”是指當在指定的比較窗口上進行比對以獲得最大對應(yīng)時兩個序列中相同的殘基。當序列同一性百分數(shù)針對蛋白質(zhì)使用時，應(yīng)認識到，不相同的殘基位置往往差別在于保守氨基酸置換，其CN102395674A說明書22/66中氨基酸殘基被其他具有相似的化學性質(zhì)(例如電荷或疏水性)的氨基酸殘基置換，因此不會改變分子的功能性質(zhì)。如果序列差別在于保守置換，則可上調(diào)百分比序列同一性以校正置換的保守性質(zhì)。差異在于這種保守置換的序列被稱為具有“序列相似性”或“相似性”。作出這個調(diào)整的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。通常，這涉及將保守置換打分為部分錯配而不是完全錯配，從而提高序列同一性百分數(shù)。因而，例如，如果相同的氨基酸給予1分，非保守置換給予0分，則保守置換給予0至1之間的分數(shù)。例如，根據(jù)Meyers和Miller,(1988)ComputerApplic.Biol.Sci.4:11-17的算法計算保守置換的分數(shù)，例如如在程序PC/GENE(Intelligenetics,MountainView,California,USA)中所執(zhí)行的。本文所用的“序列同一性百分數(shù)”意指通過在比較窗口上比較兩個最佳比對的序列所確定的數(shù)值，其中多核苷酸序列在比較窗口中的部分與參比序列(不包含添加或缺失)相比包含添加或缺失(即空位)，以便兩個序列的最佳比對。該百分數(shù)是這樣計算的確定在兩個序列中出現(xiàn)相同核酸堿基或氨基酸殘基的位置的數(shù)目以得到匹配的位置的數(shù)目，將匹配的位置的數(shù)目除以比較窗口中的位置的總數(shù)目，然后將結(jié)果乘以100以得到序列同一性百分數(shù)。術(shù)語多核苷酸序列的“實質(zhì)同一性”意指利用所描述的比對程序之一采用標準參數(shù)與參考序列比較時，多核苷酸包含具有50-100%之間的序列同一性，優(yōu)選至少50%的序列同一性，優(yōu)選至少60%的序列同一性，優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少90%且最優(yōu)選至少95%序列同一性的序列。技術(shù)人員將會認識到，可通過考慮密碼子簡并性、氨基酸相似性、閱讀框定位等等適當調(diào)整這些值以確定兩個核苷酸序列所編碼的蛋白質(zhì)的相應(yīng)同一性。用于這些目的的氨基酸序列的實質(zhì)同一性通常意指55-100%之間的序列同一性，優(yōu)選至少55%，優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少70%、80%、90%，最優(yōu)選至少95%。核苷酸序列實質(zhì)同一性的另一指示是兩個核酸分子在本文別處所描述的嚴格條件下是否彼此雜交。然而，遺傳密碼的簡并性允許多種編碼相同氨基酸的、導(dǎo)致核苷酸序列的多樣化的核酸置換，因而有可能該DNA序列可編碼相同多肽但在嚴格條件下不彼此雜交。例如，當利用遺傳密碼所允許的最大密碼子簡并性產(chǎn)生一個核酸拷貝時，這可能會發(fā)生。兩條核酸序列是實質(zhì)上相同的一個指示是，第一核酸編碼的多肽與第二核酸所編碼的多肽發(fā)生免疫交叉反應(yīng)。在肽的情形中術(shù)語“實質(zhì)同一性”指肽包含在指定比較窗口上與參考序列具有55-100%之間的序列同一性；在一些實施方案中與參考序列具有至少55%的序列同一性、60%、70%、80%、至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性的序列。在一些實施方案中，利用Needleman和mmsch(同上)的同源比對算法進行最佳比對。兩條肽序列是實質(zhì)上相同的指示是，一種肽可與針對第二種肽產(chǎn)生的抗體發(fā)生免疫反應(yīng)。因而，例如，如果某種肽與第二種肽差別僅在于保守置換的話，則這兩種肽實質(zhì)上相同。此外，當某種肽與第二種肽差別在于非保守變化時，如果抗體識別的表位實質(zhì)上相同，則它們實質(zhì)上相同?！盎鞠嗨频摹彪墓灿腥缟纤龅男蛄?，例外的是不相同的殘基位置差別可在于保守氨基酸變化。用于本公開的方法中的核酸可用(a)標準重組方法，(b)合成技術(shù)或它們的組合來制備。在一些實施方案中，本發(fā)明的多核苷酸將從真菌或細菌克隆、擴增或以其他方式構(gòu)建。便利的是核酸可包含除在本發(fā)明方法中有用的多核苷酸之外的序列。例如，可將包含一個或多個內(nèi)切核酸酶限制性位點的多克隆位點插入核酸中以幫助分離該多核苷酸。另外，可插入可翻譯序列以幫助分離翻譯了的在本發(fā)明方法中有用的多核苷酸。例如，六組氨酸標志物序列提供了便捷的手段來純化在本發(fā)明方法中有用的蛋白質(zhì)。本發(fā)明方法中可用的核酸(排除所述多核苷酸序列)任選為用于本發(fā)明的多核苷酸的克隆和/或表達的載體、銜接子或接頭?？蓪⒘硗獾男蛄刑砑又吝@種克隆和/或表達序列來優(yōu)化它們在克隆和/或表達中的功能，以助于分離所述多核苷酸，或改善所述多核苷酸向細胞內(nèi)的導(dǎo)入。通常，用于本發(fā)明方法的核酸的長度減去其本發(fā)明多核苷酸的長度為不到20千堿基對，通常不到151Λ，常常不到101Λ?？寺≥d體、表達載體、銜接子和接頭的使用是本領(lǐng)域已知的。示例性的核酸包括諸如如下的載體M13、λZAPExpress、λZAPII、λgtlO、λgtll、pBK-CMV、pBK-RSV、pBluescriptII、λDASHII、AEMBL3、AEMBL4、pWE15、SuperCosUSurfZap,Uni-ZAP,pBC、pBS+/-、pSG5、pBK、pCR-Script、pET、pSPUTK、p3'SS、pGEM、pSK+/-、pGEX、pSPORTI禾口II、pOPRSVICAT、p0PI3CAT、pXTl、pSG5、pPbac、pMbac、pMClneo、p0G44、p0G45、pFRTβGAL、pNEOβGAL、pRS403、pRS404、pRS405、pRS406、pRS413、pRS414、pRS415、pRS416、XMOSSlox和AMOSElox。本發(fā)明的任選載體包括但不限于λZAPII和pGEX。有關(guān)各種核酸的描述，參見例如StratageneCloningSystems,Catalogs1995，1996，1997(LaJolla,CA)禾口AmershamLifeSciences,Inc,Catalog'97(ArlingtonHeights,IL)。用于本發(fā)明方法中的核酸還可用諸如如下的方法通過直接化學合成來制備Narang等人，(1979)Meth.Enzymol.6890-9的磷酸三酯法；Brown等人，(1979)Meth.Enzymol.68:109-51的磷酸二酯法；Beaucage等人，(1981)iTetra.Letts.22(20):1859-62的二乙基亞膦酰胺法；Beaucage等人(同上)描述的固相亞磷酰胺三酯法，使用自動合成儀，例如，如Needham-VanDevanter等人，(1984)NucleicAcidsRes.12:6159-68中所描述的，以及第4，458，066號美國專利的固相載體法。化學合成通常產(chǎn)生單鏈寡核苷酸。這可通過與互補序列雜交或通過將該單鏈作為模板用DNA聚合酶進行聚合來轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈DNA。技術(shù)人員將會認識到，雖然DNA的化學合成局限于約100個堿基的序列，但可通過連接較短的序列來獲得較長的序列。通常，已發(fā)現(xiàn)翻譯效率受RNA的5'非編碼或非翻譯區(qū)(5'UTR)中的特定序列元件的調(diào)控。正序列基序包括翻譯起始共有序列(Kozak，(1987)NucleicAcidsRes.158125)和5<G>7甲基GpppGRNA帽結(jié)構(gòu)(Drummond等人，(1985)NucleicAcidsRes.137375)。負元件包括穩(wěn)定的分子內(nèi)5，UTR莖-環(huán)結(jié)構(gòu)(Muesing等人，(1987)Cell48:691)和5'UTR中的AUG序列或前面有適當AUG的短開放閱讀框(Kozak(同上)、Rao等人，(1988)Mol.andCell.Biol.8:284)。因此，本發(fā)明提供了用于調(diào)節(jié)異源編碼序列的翻譯的5'和/或3'UTR區(qū)。另外，可修飾用于本發(fā)明的多核苷酸的多肽編碼區(qū)段以改變密碼子用法?？刹捎酶淖兞说拿艽a子用法，來改變翻譯效率和/或優(yōu)化編碼序列在所需宿主中的表達或為了在玉蜀黍中表達而優(yōu)化異源序列中的密碼子用法。在本發(fā)明方法中有用的多核苷酸的編碼區(qū)中的密碼子用法可用可商購獲得的軟件包(如可得自UniversityofWisconsinGeneticsComputerGroup的“CodonPreference")進行統(tǒng)計分析。參見，Devereaux等人，(1984)NucleicAcidsRes.12:387-395)；或MacVector4.1(EastmanKodakCo.,NewHaven,Conn.)。因而，本發(fā)明提供了在本發(fā)明方法中有用的多核苷酸中的至少一種的編碼區(qū)特征性的密碼子用法頻率。可用于確定密碼子用法頻率的多核苷酸的數(shù)目(每個氨基酸3個核苷酸)可以為從3至本文所提供的本發(fā)明多核苷酸的數(shù)目的任何整數(shù)。任選地，多核苷酸將為全長序列。用于統(tǒng)計分析的序列的示例性數(shù)目可以為至少1、5、10、20、50或100。當通過合成法制備或改變核酸時，可利用將在其中表達核酸的預(yù)期宿主的已知密碼子偏好性。例如，盡管本發(fā)明的核酸序列在單子葉植物物種和雙子葉植物物種中都可表達，但可對序列進行修飾以解決單子葉植物或雙子葉植物的特定密碼子偏好性和GC含量偏好性，因為這些偏好性已被證實不同(Murray等人，(1989)NucleicAcidsRes.17477-98，將其以引用的方式并入本文)。因而，具體氨基酸的玉蜀黍優(yōu)選密碼子可由來自玉蜀黍的已知基因序列得出。關(guān)于來自玉蜀黍植物的觀種基因的玉蜀黍密碼子用法在Murray等人(同上)的表4中列出。用于本發(fā)明方法的多核苷酸可使用ACC合酶編碼多核苷酸通過序列改組(sequenceshuffling)獲得。序列改組在第96/19256號PCT公開中有描述。另參見^iang等人，(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA94:4504-9和Zhao等人，(1998)NatureBiotech16:258-61。一般來講，序列改組提供出用于產(chǎn)生具有所需特性的多核苷酸的文庫的手段，該文庫可被進行選擇或篩選。從一群相關(guān)序列多核苷酸產(chǎn)生重組多核苷酸的文庫，所述相關(guān)序列多核苷酸包含具有實質(zhì)序列同一性并可在體外或體內(nèi)進行同源重組的序列區(qū)。序列重組的多核苷酸的群體包含具有所需的或有利的特性并且可通過合適的選擇或篩選方法來選擇的多核苷酸的亞群。所述特性可以為任何能夠在篩選系統(tǒng)中被選擇或檢測的性質(zhì)或?qū)傩?，可包括所編碼的蛋白質(zhì)、轉(zhuǎn)錄元件、控制轉(zhuǎn)錄的序列、RNA加工、RNA穩(wěn)定性、染色質(zhì)構(gòu)象、基因或轉(zhuǎn)基因的翻譯或其他表達性質(zhì)、復(fù)制元件、蛋白質(zhì)結(jié)合元件等等的性質(zhì)，例如賦予可選擇或可檢測性質(zhì)的任何特征。在一些實施方案中，選擇的特性將為相對于本文所提供的野生型蛋白質(zhì)而言改變了的1和/或K。at。在其它實施方案中，序列改組所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)或多核苷酸具有的配體結(jié)合親和力將比非改組的野生型多核苷酸的高。在另外其它實施方案中，與非改組的野生型多核苷酸相比，序列改組所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)或多核苷酸將具有改變了的最佳PH。這類性質(zhì)的提高可以為野生型值的至少110%、120%,130^^140%或高于150%。用于實施本發(fā)明方法的組件包括在帶有說明資料的試劑盒中，該試劑盒包含編碼ACC合酶的多核苷酸或它們的互補序列或構(gòu)造用于ACC合酶的RNA干擾的核酸，用于改善植物在低氮條件下的產(chǎn)量。在這些實施方案中的一些中，試劑盒包含具有SEQIDNO:1,2,3,4、5或6的序列的核酸或其完全互補序列；與SEQIDNO:1、2、3、4、5或6具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或更高序列同一性的核酸或其完全互補序列；編碼SEQIDNO:8的多肽序列或與SEQIDNO:8具有70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或更高序列同一性的多肽序列的核酸；或構(gòu)造用于RNA沉默或干擾的核酸，其中所述核酸包含具有SEQIDN0:l、2、3、4、5或6的至少19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500個或更多個連續(xù)核苷酸的多核苷酸和所述多核苷酸的互補序列。本發(fā)明還提供了重組表達盒的用途，該表達盒包含在本發(fā)明方法中可用的核酸。本文所用的“重組表達盒”是核酸構(gòu)建體，通過重組法或合成法產(chǎn)生，具有一系列規(guī)定的核酸元件，其允許特定核酸在靶細胞中的轉(zhuǎn)錄?？蓪⒅亟M表達盒摻入到質(zhì)粒、染色體、線粒體DNA、質(zhì)體DNA、病毒或核酸片段中。通常，除了別的序列以外，表達載體的重組表達盒部分還包含待轉(zhuǎn)錄的核酸和啟動子。編碼在本發(fā)明方法中可用的所需多核苷酸或多肽的核酸序列，例如編碼可減少ACC合酶基因的表達的核酸的多核苷酸，可用于構(gòu)建可引入到所需宿主細胞中的重組表達盒。重組表達盒將通常包含可操作連接至轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控序列的在本發(fā)明方法中有用的多核苷酸，所述轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控序列將引導(dǎo)所述多核苷酸在預(yù)定的宿主細胞(例如轉(zhuǎn)化植物的組織)中的轉(zhuǎn)錄。例如，植物表達載體可包含(1)處于5'和3'調(diào)控序列的轉(zhuǎn)錄控制下的克隆植物基因和(2)顯性選擇性標志物。如果需要，這種植物表達載體還可含有啟動子調(diào)控區(qū)(例如，賦予誘導(dǎo)型表達或組成型表達，由環(huán)境或發(fā)育調(diào)節(jié)的表達，或細胞或組織特異性/選擇性表達的啟動子調(diào)控區(qū))、轉(zhuǎn)錄起始位點、核糖體結(jié)合位點、RNA加工信號、轉(zhuǎn)錄終止位點和/或多腺苷酸化信號。本文所用的“可操作連接”包括指涉第一序列(如啟動子)和第二序列之間的功能性連接，其中啟動亞序列起始或介導(dǎo)對應(yīng)第二序列的DNA的轉(zhuǎn)錄。一般來講，可操作連接意指被連接的核酸序列是連續(xù)的，并且如果有必要連接兩個蛋白質(zhì)編碼區(qū)的話，是連續(xù)的且在相同的閱讀框內(nèi)。本文所用的“啟動子”包括指涉DNA的在轉(zhuǎn)錄起始的上游并涉及RNA聚合酶和其他蛋白質(zhì)的識別和結(jié)合以起始轉(zhuǎn)錄的區(qū)域?！爸参飭幼印笔悄軌蛞l(fā)在植物細胞中的轉(zhuǎn)錄的啟動子。示例性的植物啟動子包括但不限于從植物、植物病毒和包含在植物細胞中表達的基因的細菌獲得的那些啟動子，所述細菌如農(nóng)桿菌或根瘤菌屬(Miizobium)。例子為優(yōu)先起始在某些組織，例如葉、根、種子、纖維、木質(zhì)部導(dǎo)管、管胞或厚壁組織中的轉(zhuǎn)錄的啟動子。這種啟動子稱為“組織優(yōu)選的”。“細胞類型”特異性啟動子主要驅(qū)動在一種或多種器官中的某些細胞類型(例如，根或葉中的維管細胞)中的表達?！罢T導(dǎo)型”或“調(diào)控型”啟動子是處于環(huán)境控制下的啟動子?？蓪崿F(xiàn)通過誘導(dǎo)型啟動子進行的轉(zhuǎn)錄的環(huán)境條件的例子包括無氧條件或光的存在。另一類型的啟動子是發(fā)育調(diào)節(jié)啟動子，例如在花粉發(fā)育過程中驅(qū)動表達的啟動子。組織優(yōu)選的、細胞類型特異性的、發(fā)育調(diào)節(jié)的和誘導(dǎo)型的啟動子構(gòu)成了“非組成型”啟動子類別?！敖M成型”啟動子是在大多數(shù)環(huán)境條件下活躍的啟動子。組成型啟動子被分類為可提供一系列組成型表達。因而，某些是弱組成型啟動子，而另一些是強組成型啟動子。一般來講，所謂“弱啟動子”意指驅(qū)動編碼序列以低水平表達的啟動子。所謂“低水平”意指處于約1/10，000個轉(zhuǎn)錄物至約1/100，000個轉(zhuǎn)錄物至約1/500，000個轉(zhuǎn)錄物的水平。相反，“強啟動子”驅(qū)動編碼序列以“高水平”或約1/10個轉(zhuǎn)錄物至約1/100個轉(zhuǎn)錄物至約1/1,000個轉(zhuǎn)錄物進行表達。可采用會指導(dǎo)在本發(fā)明方法中有用的多核苷酸在再生植物的所有組織中的表達的植物啟動子片段。這種啟動子在本文中稱為“組成型”啟動子并且在大多數(shù)環(huán)境條件和發(fā)育或細胞分化狀態(tài)下是活躍的。組成型啟動子的例子包括Rsyn7啟動子的核心啟動子及在WO99/43838和美國專利No.6，072，050中公開的其他組成型啟動子；源于根瘤農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)的T-DNA的1‘-或2‘-啟動子、Smas啟動子、肉桂基醇脫氫酶啟動子(第5，633，439號美國專利)、Nos啟動子、rubisco啟動子、GRP1-8啟動子、來自花椰菜花葉病毒(CaMV)的35S啟動子，如Odell等人，(1985)Nature313:810-2中所述；水稻肌動蛋白啟動子(McElroy等人，(1990)PlantCell163-171)；泛素啟動子(Christensen等人，(1992)PlantMol.Biol.12:619-632和Christensen等人，(1992)PlantMol.Biol.18:675-89)；pEMU(Last等人，(1991)Theor.Appl.Genet.81:581-8)；MAS(Velten等人，(1984)EMBOJ.3:2723-30)和玉蜀黍H3組蛋白啟動子(L印etit等人，(1992)Mol.Gen.Genet.231:276-85和Atanassvoa等人，(1992)PlantJournal2(3)=291-300)；ALS啟動子，如第WO96/30530號PCT申請中所述，以及技術(shù)人員知道的來自多種植物基因的其他轉(zhuǎn)錄起始區(qū)。其他組成型啟動子包括(例如)美國專利No.5，608，149；No.5，608，144；No.5，604，121；No.5，569，597；No.5，466，785；No.5，399，680；No.5，268，463；No.5，608,142；和No.6，177，611。在一些實施方案中，泛素啟動子用于單子葉植物中的表達?；蛘?，植物啟動子可指導(dǎo)本發(fā)明的多核苷酸在特定組織中的表達或者可另外在更精確的環(huán)境或發(fā)育控制下。這種啟動子在這里稱為“誘導(dǎo)型”啟動子?？蓪崿F(xiàn)通過誘導(dǎo)型啟動子進行的轉(zhuǎn)錄的環(huán)境條件包括病原體攻擊、無氧條件或光的存在。誘導(dǎo)型啟動子的例子是Adhl啟動子(其可通過低氧或寒冷脅迫誘導(dǎo))、Hsp70啟動子(其可通過熱脅迫誘導(dǎo))和PPDK啟動子(其可通過光誘導(dǎo))。一般來講，從誘導(dǎo)型啟動子，特別是從病原體誘導(dǎo)型啟動子表達基因?qū)怯欣?。這種啟動子包括來自發(fā)病相關(guān)蛋白O3R蛋白)的那些，所述蛋白在病原體感染后誘導(dǎo)，例如I3R蛋白、SAR蛋白、β-1，3-葡聚糖酶、殼多糖酶等等。參見(例如)Redolfi等人，(1983)Neth.J.PlantPathol.89:245-254；Uknes等人，(1992)PlantCell4:645-656；和VanLoon(1985)PlantMol.Virol.4:111_116。另參見WO99/43819，將該文獻以引用的方式并入本文。在病原體感染位點處或附近局部表達的啟動子值得關(guān)注。參見(例如)MarineaU等人，(1987)PlantMol.Biol.9:335-342；Matton等人，(1989)MolecularPlant-MicrobeInteractions2:325-331；Somsischφ人，(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA832427-2430；Somsisch等人，(1988)Mol.Gen.Genet.2:93-98；和Yang(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:14972-14977。另參見Chen等人，(1996)PlantJ.10:955-966；Zhang等人，(1994)Proc.Natl.Acad.ki.USA91:2507-2511;Warner等人，(1993)PlantJ.3191-201;Siebertz等人，(1989)PlantCell1:961-968；美國專利No.5，750，386(線蟲誘導(dǎo)型)；以及其中引用的參考文獻。玉蜀黍PRms基因的誘導(dǎo)型啟動子特別值得關(guān)注，該基因的表達是由病原體串珠鐮孢(Fusariummoniliforme)誘導(dǎo)(參見例如Cordero等人，(199Physiol.Mol.PlantPath.41:189-200)。另外，因為病原體可通過傷口或昆蟲損傷進入植物中，可將傷口誘導(dǎo)型啟動子用于本發(fā)明的構(gòu)建體中。這種傷口誘導(dǎo)型啟動子包括馬鈴薯蛋白酶抑制劑(PinII)基因(Ryan(1990)Ann.Rev.Phytopath.28:425-449；Duan等人，(1996)NatureBiotechnology14:494-498)；wunl和wun2，美國專利No.5，428，148；winl和win2(Stanford等人，(1989)Mol.Gen.Genet.215:200-208)；systemin(McGurl等人，(1992)Science225:1570-1573)；32WIPl(Rohmeier等人，(1993)PlantMol.Biol.22:783-792;Eckelkamp等人，(1993)FEBSLetters323:73-76)；MPI基因(Corderok等人，(1994)PlantJ.6(2):141-150)；等等，將這些文獻以引用的方式并入本文?？蓪⒒瘜W調(diào)節(jié)啟動子用于通過施加外源化學調(diào)節(jié)劑來調(diào)控基因在植物中的表達。取決于目標，啟動子可以是化學誘導(dǎo)型啟動子，其中施用化學物質(zhì)可誘導(dǎo)基因表達，或者是化學抑制型啟動子啟動子，其中施用化學物質(zhì)可抑制基因表達。化學誘導(dǎo)型啟動子是本領(lǐng)域已知的，包括但不限于玉蜀黍In2-2啟動子(其通過苯磺酰胺除草劑安全劑激活)、玉蜀黍GST啟動子(其通過用作前突生(pre-emergent)除草劑的疏水性親電化合物激活)和煙草PR-Ia啟動子(其通過水楊酸激活)。其他所關(guān)注化學調(diào)節(jié)啟動子包括留類化合物響應(yīng)性啟動子(參見例如，Schena等人，(1991)Proc.Natl.Acad.ki.USA88:10421-10425和McNellis等人，(1998)PlantJ.14(2):247-257中的糖皮質(zhì)素誘導(dǎo)型啟動子)和四環(huán)素誘導(dǎo)型和四環(huán)素抑制型啟動子(參見例如，Gatz等人，(1991)Mol.Gen.Genet.227=229-237和美國專利No.5，814，618和No.5，789，156)，將這些文獻以引用的方式并入本文。在發(fā)育控制下的啟動子的例子包括僅僅或優(yōu)先在某些組織(如葉、根、果實、種子或花)中起始轉(zhuǎn)錄的啟動子。取決于啟動子在基因組的位置，啟動子的操作也可以變化。因而，誘導(dǎo)型啟動子在某些位置可變?yōu)橥耆虿糠纸M成型的。可將組織優(yōu)選的啟動子用于靶向在本發(fā)明方法中有用的多核苷酸在特定植物組織內(nèi)的表達。組織優(yōu)選的啟動子包括Yamamoto等人，(1997)PlantJ.12(2)=255-265；Kawamata等人，(1997)PlantCellPhysiol.38(7):792-803;Hansen等人，(1997)Μο1·GenGenet.254(3):337-343；Russell等人，(1997)TransgenicRes.6(2):157-168;Rinehart等人，(1996)PlantPhysiol.112(3):1331-1341；VanCamp等人，(1996)PlantPhysiol.112(2):525-535；Canevascini等人，(1996)PlantPhysiol.112(2):513-524;Yamamoto等人，(1994)PlantCellPhysiol.35(5):773-778；Lam(1994)ResultsProb1.CellDiffer.20:181-196；Orozco等人，(1993)PlantMolBiol.23(6):1129-1138;Matsuoka等人，(1993)ProcNatl.Acad.Sci.USA90(20):9586-9590；禾口Guevara—Garcia等人，(1993)PlantJ.4(3):495_505。如有必要，可對這種啟動子進行修飾以用于弱表達。葉優(yōu)選的啟動子是本領(lǐng)域已知的。參見例如Yamamoto等人，(1997)PlantJ.12(2):255-265；Kwon等人，(1994)PlantPhysiol.105:357-67；Yamamoto等人，(1994)PlantCellPhysiol.35(5):773-778;Gotor等人，(1993)PlantJ.3:509-18；Orozco^人，(1993)PlantMol.Biol.23(6):1129-1138；andMatsuoka等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90(20):9586_9590。根優(yōu)選的啟動子是已知的，可選自許多可從文獻得到的啟動子，或者從多種相容物種從頭分離。參見例如Hire等人，(1992)PlantMol.Biol.20(2):207-218(大豆根特異性谷氨酰胺合成酶基因)；Keller和Baumgartner(1991)PlantCell3(10):1051-1061(菜豆GRP1.8基因中的根特異性控制元件)；Sanger等人，(1990)PlantMol.Biol.14(3)433-443(根瘤農(nóng)桿菌的甘露氨酸合酶(MAQ基因的根特異性啟動子)；和Miao等人，(1991)PlantCell3(1):11-22(編碼胞質(zhì)谷氨酰胺合成酶(GS)的全長cDNA克隆，該酶在大豆的根或根瘤中表達)。另參見Bogusz等人，(1990)PlantCell2(7):633_641，其中描述了從來自固氮非豆科榆科山黃麻(Parasponiaandersonii)和相關(guān)的非固氮非豆科山麻黃(Trematomentosa)的血紅蛋白基因分離的兩種根特異性啟動子。將這些基因的啟動子連接至β-葡糖醛酸酶報道基因并引入非豆科植物煙草(Nicotianatabacum)和豆科植物百脈根(Lotuscorniculatus)二者中，在這兩種情況中根特異性啟動子活性得以保持。Leach和Aoyagi(1991)描述了他們對毛根農(nóng)桿菌(Agrobacteriumrhizogenes)的高度表達的rolC和rolD根誘導(dǎo)基因的分析(參見PlantScience(Limerick)79(1)69-76)。他們得出結(jié)論認為，增強子和組織組織優(yōu)選的DNA決定子在那些啟動子中是分離的。Teeri等人(1989)使用與IacZ的基因融合顯示，編碼章魚氨酸合酶的農(nóng)桿菌T-DNA基因在根尖的表皮中特別活躍，且TR2'基因在完整植物中是根特異性的并且通過葉中的創(chuàng)傷刺激，這是用于殺昆蟲或殺幼蟲基因的特別理想的特性組合(參見EMBOJ.8(2)343-350)。與nptll(新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II)融合的TRl'基因顯示了相似的特性。另外的根優(yōu)選的啟動子包括VfEN0D-GRP3基因啟動子(Kuster等人，(1995)PlantMol.Biol.29(4)759-772)；和rolB啟動子(Capana等人，(1994)PlantMol.Biol.25(4):681-691)。另參見美國專利No.5,837，876；No.5，750，386；No.5,633，363；No.5,459，252；No.5,401,836；No.5，110，732；和No.5，023，179。“種子優(yōu)選的”啟動子包括“種子特異性”啟動子(那些啟動子在種子發(fā)育期間活躍，例如種子貯藏蛋白的啟動子)以及“種子萌發(fā)”啟動子(那些啟動子在種子萌發(fā)期間活躍)。參見Hiompson等人，(1989)BioEssays10108，將該文獻以引用的方式并入本文。這種種子優(yōu)選的啟動子包括但不限于Ciml(細胞分裂素誘導(dǎo)信息基因啟動子)；CZ19B1(玉蜀黍19kDa玉米素基因啟動子)；milps(肌醇-1-磷酸合成酶基因啟動子)(參見WO00/11177和美國專利No.6，225，529；將這兩篇文獻以引用的方式并入本文)。Y-玉米醇溶蛋白基因啟動子是胚乳特異性啟動子。球蛋白I(Glb-I)基因啟動子是代表性的胚芽特異性啟動子。對于雙子葉植物而言，種子特異性啟動子包括但不限于菜豆菜豆素基因啟動子、油菜籽蛋白(napin)基因啟動子、β_伴球蛋白基因啟動子、大豆凝集素基因啟動子、十字花科蛋白基因啟動子等。對于單子葉植物而言，種子特異性啟動子包括但不限于玉蜀黍15kDa玉米素基因啟動子、22kDa玉米素基因啟動子、27kDa玉米素基因啟動子、Y-玉米醇溶蛋白基因啟動子、糯質(zhì)基因啟動子、超甜基因(shrunken)1啟動子、超甜基因2啟動子、球蛋白1基因啟動子等等。另參見WO00/12733，其中公開了來自endl和end2基因的種子優(yōu)選啟動子；將該文獻以引用的方式并入本文。調(diào)控區(qū)(即啟動子、轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)和翻譯終止區(qū))和/或ACC合酶多核苷酸對宿主細胞而言或彼此之間而言可以是天然的/同功的?；蛘?，調(diào)控區(qū)和/或ACC合酶多核苷酸對宿主細胞而言或彼此之間而言可以是異源的。本文所用的針對序列所謂的“異源”為起源于外來物種的序列，或者，如果起源于相同物種的話，則通過有意的人為干預(yù)對其天然形式在組成和/或基因座方面進行實質(zhì)性修飾的序列。例如，可操作連接至異源多核苷酸的啟動子來自與該多核苷酸所源自的物種不同的物種，或者，如果來源于相同/類似物種，一者或二者在它們的初始形式上進行了實質(zhì)修飾，或者該啟動子對該可操作連接的多核苷酸而言不是天然啟動子。同樣，異源蛋白質(zhì)可起源于外來物種，或者，如果起源于相同物種，則通過有意的人為干預(yù)對其天然形式進行了實質(zhì)修飾。如果多肽表達是所需的，則通常期望在多核苷酸編碼區(qū)的3'端包括多腺苷酸化區(qū)。該多腺苷酸化區(qū)可源于多種植物基因，或源于T-DNA。待添加的3'端序列可源于(例如)胭脂氨酸合酶或章魚氨酸合酶基因，或作為另一種選擇，源于另一植物基因，或較不優(yōu)選地，源自任何其他真核基因。這種調(diào)控元件的例子包括但不限于3'終止和/或多腺苷酸化區(qū)如根瘤農(nóng)桿菌胭脂氨酸合酶(nos)基因的那些(Bevan等人，(198NucleicAcidsRes.12:369-85)；馬鈴薯蛋白酶抑制劑II(PINII)基因(Keil等人，(1986)NucleicAcidsRes.14:5641-50和An等人，(1989)PlantCell1:115-22)和CaMV19S基因(Mogen等人，(1990)PlantCell2:1261-72)。可將內(nèi)含子序列添加至部分編碼序列的5'非翻譯區(qū)或編碼序列以增加胞質(zhì)溶膠中積聚的成熟信息的量。在植物表達構(gòu)建體和動物表達構(gòu)建體二者中的轉(zhuǎn)錄單位中包括可剪接內(nèi)含子，已證實能在mRNA水平和蛋白質(zhì)水平二者上使基因表達增加高達1000倍(Buchman和Berg，(1988)Mol.CellBiol.8:4395-4405；Callis等人，(1987)GenesDev.11183-200)。當設(shè)置在接近轉(zhuǎn)錄單位的5'端時，這種基因表達的內(nèi)含子增強通常是最大的。玉蜀黍內(nèi)含子Adhl-S內(nèi)含子1、2和6、BronZe-l內(nèi)含子的使用是本領(lǐng)域已知的。主要參見TheMaizeHandbook，第116章，F(xiàn)reeling和Walbot(編輯)，Springer，NewYork(1994)植物信號序列，包括但不限于將蛋白質(zhì)靶向植物細胞的細胞外基質(zhì)的信號肽編碼DNA/RNA序列(Dratewka-Kos等人，(1989)J.Biol.Chem.264:4896-900)，如皺葉煙草(Nicotianaplumbaginifolia)擴展基因(DeLoose等人，(1991)Gene99:95-100)；將蛋白質(zhì)靶向液泡的信號肽,如甘薯sporamin基因(Matsuka等人，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88834)和大麥凝集素基因(Wilkins等人，(1990)PlantCell,2:301-13)；引起蛋白質(zhì)分泌的信號肽，如PRIb的信號肽(Lind等人，(1992)PlantMol.Biol.18:47-53)或大麥α淀粉酶(BAA)的信號肽(Rahmatullah等人，(1989)PlantMol.Biol.12:119，藉此將該文獻以引用的方式并入本文)或?qū)⒌鞍踪|(zhì)靶向質(zhì)體的信號肽如油菜籽烯酰-Acp還原酶的信號肽(Verwaert等人，(1994)PlantMol.Biol.洸189-202)，在本發(fā)明中是有用的。包含來自在本發(fā)明方法中有用的多核苷酸的序列的載體將通常包含標志物基因，該標志物基因可給植物細胞賦予選擇性表型。通常，選擇性標志物基因?qū)⒕幋a抗生素抗性，合適的基因包括編碼對壯觀霉素這種抗生素的抗性的基因(例如aada基因)、編碼鏈霉素抗性的鏈霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(SPT)基因、編碼卡那霉素或遺傳霉素抗性的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(NPTII)基因、編碼潮霉素抗性的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(HPT)基因、編碼對起到抑制乙酰乳酸合酶(ALS)的作用的除草劑，特別是磺酰脲類除草劑的抗性的基因(例如含有導(dǎo)致這種抗性的突變特別是S4和/或Hra突變的乙酰乳酸合酶(ALQ基因)、編碼對起到抑制谷氨酰胺合酶的作用的除草劑如草胺膦或basta的抗性的基因(例如bar基因)，或本領(lǐng)域已知的其他這種基因。bar基因編碼對除草劑kista的抗性，ALS基因編碼對除草劑氯磺隆的抗性。可使用其他賦予對除草化合物如草銨膦、溴苯腈、咪唑啉酮類和2，4_二氯苯氧乙酸0，4-D)的抗性的基因。另外的選擇性標志物包括表型標志物如半乳醣苷酶和熒光蛋白如綠熒光蛋白(GFP)(Su等人，(2004)BiotechnolBioeng85:610-9和Fetter等人，(2004)PlantCell16:215-28)、青色熒光蛋白(CYP)(Bolte等人，(2004)J.CellScience117:943-54和Kato等人，(2002)PlantPhysiol1:913-42)和黃色熒光蛋白(來自Evrogen的PhiYFP,參見Bolte等人，(2004)J.CellScience117:943-54)。對于另外的選擇性標志物，一般可參見Yarranton(1992)Curr.Opin.Biotech.3:506-511；Christopherson等人，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:6314-6318；Yao等人，(1992)Cell71:63-72；Reznikoff(1992)Mol.Microbiol.6:2419-2422；Barkley等人，(1980)TheOperon，第177-220頁；Hu等人，(1987)Cell48:555-566;Brown等人，(1987)Cell49:603-612;Figge等人，(1988)Cell52:713-722;Deuschle等人，(1989)Proc.Natl.Acad.Aci.USA86:5400-5404；Fuerst等人，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:2549-2553；Deuschleφ人，(1990)Science248:480-483；Gossen(1993)Ph.D.Thesis,UniversityofHeidelberg;Reines等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:1917-1921；Labowψ人，(1990)Mol.Cell.Biol.10:3343-3356；Zambretti等人，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:3952-3956；Baim等人，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:5072-5076；Wyborski等人，(1991)NucleicAcidsRes.19:4647-4653；Hillenand-ffissman(1989)TopicsMol.Struc.Biol.10:143-162；Degenkolbφ人，(1991)Antimicrob.AgentsChemother.351591-1595；Kleinschnidtψ人，(1988)Biochemistry271094-1104;Bonin(1993)Ph.D.Thesis,UniversityofHeidelberg;Gossen等人，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:5547-5551；Oliva等人，(1992)Antimicrob.AgentsChemother.36:913-919；Hlavka等人’(1985)HandbookofExperimentalPharmacology,第78卷(Springer-Verlag,Berlin)；Gill等人，(1988)Nature334:721-724。將這些公開內(nèi)容以引用的方式并入本文。上面關(guān)于選擇性標志物基因的列表并不意指是限制性的。任何選擇性標志物基因均可用于本發(fā)明?？捎糜诨蛟诟叩戎参镏械谋磉_的典型載體是本領(lǐng)域所熟知的，包括源于根瘤農(nóng)桿菌的腫瘤誘導(dǎo)(Ti)質(zhì)粒的載體，這類載體由Rogers等人，(1987)，Meth.Enzymol.153253-77進行了描述。這些載體是植物整合型載體，因為在轉(zhuǎn)化時，這些載體將載體DNA的一部分整合進宿主植物的基因組中?？捎糜诒景l(fā)明的示例性根瘤農(nóng)桿菌載體等人，(1987)Gene61:1-11和Berger等人，(1989)Proc.Natl.Acad.ki.USA，86:8402-6的質(zhì)粒pKYLX6和pKYLX7。本發(fā)明中可用的另一種載體是質(zhì)粒ρΒΙΙΟΙ.2，其可得自CL0NTECHLaboratories,Inc.(PaloAlto,CA)0本文所用的“載體”包括指涉用于轉(zhuǎn)染宿主細胞并可在其中插入多核苷酸的核酸。載體常常是復(fù)制子。表達載體允許插入其中的核酸轉(zhuǎn)錄，如本文別處描述的。可以在重組工程化細胞如細菌、酵母、昆蟲、哺乳動物或優(yōu)選植物細胞中表達蛋白質(zhì)。這類細胞在非天然條件下(例如，在數(shù)量、組成、位置和/或時間方面)產(chǎn)生蛋白質(zhì)，因為它們已通過人為干預(yù)被遺傳改變成在非天然條件下產(chǎn)生蛋白質(zhì)。所謂“宿主細胞”意指包含本發(fā)明的異源核酸序列的、含有載體并支持該表達載體的復(fù)制和/或表達的細胞。宿主細胞可以是原核細胞如大腸桿菌，或真核細胞如酵母、昆蟲、植物、兩棲動物或哺乳動物細胞。優(yōu)選地，宿主細胞是單子葉植物細胞或雙子葉植物細胞，包括但不限于玉蜀黍、高粱、向日葵、大豆、小麥、苜蓿、水稻、棉花、甘蔗、卡諾拉、草坪草、大麥、小米和番茄。在一些實施方案中，單子葉宿主細胞是玉蜀黍宿主細胞。本文所用的“重組的”包括指涉已通過引入異源核酸進行修飾的細胞或載體，或者源于經(jīng)這樣修飾過的細胞的細胞。因而，例如，重組細胞表達不以天然(非重組)形式的細胞內(nèi)的相同形式存在的基因，或因為有意人為干預(yù)而表達原本異常表達、表達不足或根本不表達的天然基因，或可具有減低的或消除的天然基因表達。本文所用的術(shù)語“重組的”不涵蓋通過天然發(fā)生的事件(例如自發(fā)突變、天然轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)導(dǎo)/轉(zhuǎn)座)進行的細胞或載體的變更，所述事件如在沒有有意人為干預(yù)的情況下發(fā)生的那些。預(yù)期的是，本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道多種可用于表達編碼在本發(fā)明方法中有用的蛋白質(zhì)的核酸的表達體系。無意于詳細描述已知用于在原核生物或真核生物中表達蛋白質(zhì)的各種方法。簡單概括而言，編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的分離核酸的表達通常將通過使例如DNA或cDNA可操作連接至啟動子(組成型或誘導(dǎo)型)，然后整合進表達載體中來實現(xiàn)。該載體可適合于在原核生物或真核生物中復(fù)制和整合。如上所述，典型的表達載體含有可用于調(diào)節(jié)編碼在本發(fā)明方法中有用的蛋白質(zhì)的DNA的表達的轉(zhuǎn)錄和翻譯終止子、起始序列和啟動子。為了獲得克隆基因的高水平表達，期望構(gòu)建表達載體，該表達載體在最低程度上含有用以指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的強啟動子(如泛素啟動子)、用于翻譯起始的核糖體結(jié)合位點和轉(zhuǎn)錄/翻譯終止子。技術(shù)人員將認識到，可對本發(fā)明方法中有用的蛋白質(zhì)進行修飾而不減少其生物活性。可進行某些修飾以有利于目標分子的克隆、表達或摻入進融合蛋白中。這種修飾是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，包括例如在氨基末端添加甲硫氨酸以提供起始位點，或在任一端設(shè)置額外的氨基酸(例如多聚His)以產(chǎn)生便利地定位的限制性位點或終止密碼子或純化序列。原核細胞可用作表達的宿主。原核生物最通常由大腸桿菌的多種菌株代表；然而，也可使用其他微生物株。在本文中定義為包括用于轉(zhuǎn)錄起始的啟動子(任選具有操縱子)以及核糖體結(jié)合位點序列的常用原核控制序列，包括諸如內(nèi)酰胺酶(青霉素酶)啟動子系統(tǒng)和乳糖(Iac)啟動子系統(tǒng)(Chang等人，(1977)Nature198:1056)、色氨酸(trp)啟動子系統(tǒng)(Goeddel等人，(1980)NucleicAcidsRes.8:4057)和λ衍生PL啟動子之類的常用啟動子和N-基因核糖體結(jié)合位點(Shimatake等人，(1981)Nature292128)0在轉(zhuǎn)染進大腸桿菌中的DNA載體中包含選擇標志物也是有用的。這種標志物的例子包括規(guī)定對氨芐青霉素、四環(huán)素或氯霉素的抗性的基因。選擇載體以使得將所關(guān)注基因引入到適當?shù)乃拗骷毎?。細菌載體通常是質(zhì)粒或噬菌體起源的。將適當?shù)募毦毎檬删w載體顆粒轉(zhuǎn)染或用裸噬菌體載體DNA轉(zhuǎn)染。如果使用質(zhì)粒載體，則將細菌細胞用質(zhì)粒載體DNA轉(zhuǎn)染。用于表達在本發(fā)明方法中有用的蛋白質(zhì)的表達系統(tǒng)可用芽孢桿菌屬(Bacillussp.)和沙門氏菌屬(Salmonella)提供(Palva等人，(1983)Gene22:229-35；Mosbach等人，(1983)Nature302:543-5)。來自Pharmacia的pGEX-4T-l質(zhì)粒載體是本發(fā)明的優(yōu)選大腸桿菌表達載體。多種真核表達系統(tǒng)如酵母、昆蟲細胞系、植物和哺乳動物細胞是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。如下面簡單解釋的，本發(fā)明可在這些真核系統(tǒng)中表達。在一些實施方案中，將轉(zhuǎn)化的/轉(zhuǎn)染的植物細胞(如下文所論述的)用作表達系統(tǒng)，用于產(chǎn)生本發(fā)明的蛋白質(zhì)。異源蛋白質(zhì)在酵母中的合成是眾所周知的。Sherman等人，(1982)MethodSinYeastGenetics,ColdSpringHarborLaboratory是描述多種可用于在酵母中產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法的廣泛認可的著作。兩種廣泛采用的用于產(chǎn)生真核蛋白質(zhì)的酵母是釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)。用于在酵母屬(Saccharomyces)和畢赤酵母屬(Pichia)中表達的載體、菌株和方法是本領(lǐng)域已知的并可從商業(yè)來源(例如hvitrogen)獲得。根據(jù)需要，合適的載體通常具有表達控制序列，例如啟動子(包括3-磷酸甘油酸激酶或醇氧化酶啟動子)和復(fù)制起始區(qū)、終止序列等等。在本發(fā)明方法中有用的蛋白質(zhì)，一旦表達，可通過裂解細胞并向溶胞產(chǎn)物或沉淀物應(yīng)用標準蛋白質(zhì)分離技術(shù)來從酵母分離?？赏ㄟ^使用蛋白質(zhì)印記技術(shù)或其他標準免疫測定技術(shù)的放射免疫測定法來完成對純化過程的監(jiān)測。還可將編碼在本發(fā)明方法中有用的蛋白質(zhì)的序列連接至多種用于轉(zhuǎn)染例如哺乳動物、昆蟲或植物起源的細胞培養(yǎng)物的表達載體。哺乳動物細胞系統(tǒng)通常會是單層細胞的形式，但也可使用哺乳動物細胞懸浮液。本領(lǐng)域已開發(fā)了多種能夠表達完整蛋白質(zhì)的合適宿主細胞系，包括HEK293、BHK21和CHO細胞系。用于這些細胞的表達載體可包括表達控制序列，如復(fù)制起始區(qū)、啟動子(例如CMV啟動子、HSVtk啟動子或pgk(磷酸甘油酸激酶)啟動子)、增強子(Queen等人，(1986)Immunol.Rev.89:49)和必要的加工信息位點如核糖體結(jié)合位點、RNA剪接位點、多腺苷酸化位點(例如SV40大TAgpolyA添加位點)和轉(zhuǎn)錄終止子序列?？捎糜诋a(chǎn)生本發(fā)明蛋白質(zhì)的其他動物細胞可從(例如)美國典型培養(yǎng)物保藏中(AmericanTypeCultureCollection)CatalogueofCellLinesandHybridomas(M7版，1992)獲得。用于在昆蟲細胞中表達本發(fā)明的蛋白質(zhì)的適當載體通常源于SF9桿狀病毒。合適的昆蟲細胞系包括蚊幼蟲、蠶、行軍蟲、蛾和果蠅屬(Drosophila)細胞系如khneider細胞系(參見例如Schneider,(1987)J.Embryo1.Exp.Morpho1.27:353-65)。如使用酵母一樣，當采用高等動物或植物宿主細胞時，通常將多腺苷酸化或轉(zhuǎn)錄終止子序列整合進載體中。終止子序列的例子是來自牛生長激素基因的多聚腺苷酸化序列。還可包括用于轉(zhuǎn)錄物的精確剪接的序列。剪接序列的例子是來自SV40的VPl內(nèi)含子(Sprague等人，(1983)J.Virol.45:773-81)。另外，可將控制在宿主細胞中的復(fù)制的基因序列整合進載體(如牛乳頭瘤病毒類型的載體中存在的那些)(Saveria-Campo，“BovinePapillomaVirusDNAaEukaryoticCloningVector,"DNACloning:APracticalApproach，第II卷，Glover(編輯)，IRLPress，Arlington，VA，第213-38頁(1985))。另外，可將布置在適當植物表達載體中的ACC合酶多核苷酸用于轉(zhuǎn)化植物細胞。然后可從植物愈傷組織分離多肽或可將轉(zhuǎn)化的細胞用于再生轉(zhuǎn)基因植物。可收獲這種轉(zhuǎn)基因植物，將適當?shù)慕M織(例如，種子或葉)進行大規(guī)模蛋白質(zhì)提取和純化技術(shù)。有多種用于將外來多核苷酸引入植物中的方法是已知的，并且可用于將ACC合酶多核苷酸插入植物宿主中，包括生物學或物理植物轉(zhuǎn)化方案在內(nèi)。參見例如Miki等人，“ProcedureforIntroducingForeignDNAintoPlants”，MethodsinPlantMolecularBiologyandBiotechnology,Glick禾口Thompson(編輯)，CRCPress，Inc.，BocaRaton，第67-88頁(199。所選擇的方法隨宿主植物而變化，包括化學轉(zhuǎn)染方法如磷酸鈣介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移、微生物介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移如農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移(Horsch等人，Science22712四-31(1985))、電穿孔、顯微注射和基因槍轟擊。在將核酸插入細胞的語境中的術(shù)語“引入”，意指“轉(zhuǎn)染”或“轉(zhuǎn)化”或“轉(zhuǎn)導(dǎo)”，包括指涉核酸摻入進真核或原核細胞中，其中該核酸可摻入進細胞的基因組(例如染色體、質(zhì)粒、質(zhì)體或線粒體DNA)中，轉(zhuǎn)化成自主復(fù)制子或瞬時表達(例如，轉(zhuǎn)染的mRNA)。當將多核苷酸或多肽引入植物中時，“引入”旨在表示以使得序列能夠進入植物細胞的內(nèi)部的方式將38多核苷酸或多肽給予植物。本發(fā)明的方法不取決于將序列引入植物中的具體方法，只要多核苷酸或多肽可進入植物的至少一個細胞的內(nèi)部即可。將多核苷酸或多肽引入植物中的方法是本領(lǐng)域已知的，包括但不限于穩(wěn)定轉(zhuǎn)化方法、瞬時轉(zhuǎn)化方法和病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法。用于植物細胞或組織轉(zhuǎn)化和植物再生的表達盒和載體以及體外培養(yǎng)方法是已知的并可獲得。參見例如Gruber等人，"VectorsforPlantTransformation",MethodsinPlantMolecularBiologyandBiotechnology(同上)，第89—119頁?？赏ㄟ^一種或多種通常用于直接遞送進細胞的技術(shù)將多核苷酸或多肽引入植物中。取決于要進行基因修飾的生物體、細胞、植物或植物細胞的類型(即單子葉植物或雙子葉植物)，這種方案可不同。轉(zhuǎn)化植物細胞的合適方法包括顯微注射(Crossway等人，(1986)Biotechniques4:320_3；34和第6，300，543號美國專利)、電穿孔(Riggs等人，(1986)Proc.Natl.Acad.ki.USA83:5602-5606)、直接基因轉(zhuǎn)移(Paszkowski等人，(1984)EMBOJ.3:2717-2722)和彈道顆粒加速(參見例如Sanford等人，第4，945，050號美國專利；WO91/10725和McCabe等人，(1988)Biotechnology6:923-926)另參見Tomes等人，"DirectDNATransferintoIntactPlantCellsViaMicroprojectileBombardment，，·第197-213頁，PlantCell,TissueandOrganCulture,FundamentalMethods.Gamborg禾口Phillips(編輯)，Springer-VerlagBerlinHeidelbergNewYork,1995；第5，736，369號美國專利(meristem)；Weissinger等人，(1988)Ann.Rev.Genet.22:421-477；Sanford等人’(1987)ParticulateScienceandTechnology5:27-37(洋蔥)；Christou等人，(1988)PlantPhysiol.87:671-674(大豆)；Datta等人，(1990)Biotechnology8:736-740(稻)；Klein等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:4305-4309(玉蜀黍)；Klein等人，(1988)Biotechnology6:559-563(玉蜀黍)；WO91/10725(玉蜀黍)；Klein等人，(1988)PlantPhysiol.91:440-444(玉蜀黍)；Fromm等人，(1990)Biotechnology8:833-839和Gordon-Kamm等人，(1990)PlantCell2603-618(玉蜀黍)；Hooydaas-VanSlogteren禾口Hooykaas，(1984)Nature(London)311763-764;Bytebierm等人，(1987)Proc.Natl.Acad.ki.USA84:5345-5349(百合科(Liliaceae))；DeWet^Α(1985)TheExperimentalManipulationofOvuleTissues,Chapman等人(編輯)，第197-209頁，Longman,NY(花粉)；Kaeppler等人，(1990)PlantCellReports9:415-418;以及Ka印pier等人，(1992)Theor.Appl.Genet.84560-566(晶須介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化)；第5，693，512號美國專利(超聲處理)；D'Halluin等人，(1992)PlantCell41495-1505(電穿孔)；Li等人，(1993)PlantCellReports12:250-255以及Christou和Ford，(1995)AnnalsofBotany75:407-413(水稻)；Osjoda等人，(1996)NatureBiotech.14:745-750；農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉蜀黍轉(zhuǎn)化(第5，981，840號美國專利)；碳化硅晶須法(Frame等人，(1994)PlantJ.6:941-948)；激光法(Guo等人，(1995)PhysiologiaPlantarum93:19-24)；超聲處理法(Bao等人，(1997)UltrasoundinMedicine&Biology23:953-959;Finer禾口Finer，(2000)LettApplMicrobiol.30406-10;Amoah等人，Q001)JExpBot52:1135-42)；聚乙二醇法(Krens等人，(1982)Nature296:72-77)；可利用電穿孔轉(zhuǎn)化單子葉植物和雙子葉植物細胞的原生質(zhì)體(Fromm等人，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:5824-5828)和顯微注射(Crossway等人，(1986)Mol.Gen.Genet.202:179-185)，將上述所有文獻以引用的方式并入本文。39最廣泛使用的將表達載體引入植物中的方法是基于農(nóng)桿菌的天然轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。根瘤農(nóng)桿菌和毛根農(nóng)桿菌是植物病原性土壤細菌，其能遺傳轉(zhuǎn)化植物細胞。根瘤農(nóng)桿菌和毛根農(nóng)桿菌各自的Ti和Ri質(zhì)粒攜帶負責植物的遺傳轉(zhuǎn)化的基因。參見例如Kado，(1991)Crit.Rev.Plantki.10:1。如下文獻提供了有關(guān)用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移的農(nóng)桿菌載體系統(tǒng)和方法的描述=Gruber等人(同上)；Miki等人(同上)和Moloney等人，(1989)PlantCellReports8:238。相似地，可將基因插入源于根瘤農(nóng)桿菌或毛根農(nóng)桿菌各自的Ti或Ri質(zhì)粒的T-DNA區(qū)。因而，可使用這些質(zhì)粒，如上構(gòu)建表達盒。已知有許多控制序列，其在偶聯(lián)至異源編碼序列并轉(zhuǎn)化進宿主生物體中時，在初始編碼序列的組織/器官特異性方面顯示出基因表達的保真性。參見例如Benfey和Chua，(1989)Science244:174-81。用于這些質(zhì)粒中的特別合適的控制序列是用于基因在各種靶植物中的組成型葉特異性表達的啟動子。其他可用的控制序列包括來自胭脂氨酸合酶基因(N0Q的啟動子和終止子。NOS啟動子和終止子存在于質(zhì)粒pARC2中，該質(zhì)粒可得自美國典型培養(yǎng)物保藏中心，指定的ATCC存放號為67238。如果使用這樣一種系統(tǒng)，則來自Ti或Ri質(zhì)粒的毒力(vir)基因也必須存在，或者與T-DNA部分一起，或者通過其中vir基因存在于單獨載體上的雙元系統(tǒng)。用于本發(fā)明的這類系統(tǒng)、載體以及轉(zhuǎn)化植物細胞的方法在如下文獻中進行了描述第4，658，082號美國專利；1993年11月16日提交的第5，沈2，306號美國專利中引用的、1986年10月1提交的系列號為913，914的美國專利申請以及Simpson等人，(1986)PlantMol.Biol.6:403-15(也在'306專利中引用)，將所有上述參考文獻以引用的方式全文并入本文。一旦構(gòu)建，可將這些質(zhì)粒置于毛根農(nóng)桿菌或根瘤農(nóng)桿菌中并將這些載體用于轉(zhuǎn)化植物物種的細胞，所述植物物種的細胞通常對鐮孢屬(Fusarium)或鏈格孢屬(Alternaria)感染而言是易感的。本發(fā)明還可以想到若干其他轉(zhuǎn)基因植物，包括但不限于大豆、玉米、高粱、苜蓿、水稻、三葉草、卷心菜、香蕉、咖啡、芹菜、煙草、豇豆、棉花、甜瓜和胡椒。根瘤農(nóng)桿菌或者毛根農(nóng)桿菌的選擇將取決于用其轉(zhuǎn)化的植物。通常，根瘤農(nóng)桿菌是用于轉(zhuǎn)化的優(yōu)選生物體。多大數(shù)雙子葉植物、一些裸子植物和少數(shù)單子葉植物(例如百合目(Liliales)和天南星目(Arales)的某些成員)對根瘤農(nóng)桿菌感染是易感的。毛根農(nóng)桿菌也具有廣泛的宿主范圍，涵蓋大多數(shù)雙子葉植物和一些裸子植物，其包括豆科(Leguminosae)、菊科(Compositae)和藜科(Chenopodiaceae)的成員。單子葉植物現(xiàn)在可以一定的成功率進行轉(zhuǎn)化。第604662Al號歐洲專利申請公開了用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化單子葉植物的方法。第672752Al號歐洲專利申請公開了使用未成熟胚的盾片用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化單子葉植物的方法。Ishida等人論述了通過使未成熟胚暴露于根瘤農(nóng)桿菌來轉(zhuǎn)化玉蜀黍的方法(NatureBiotechnology14:745-50(1996))。一旦轉(zhuǎn)化，可將這些細胞用于再生轉(zhuǎn)基因植物。本文所用的“轉(zhuǎn)基因植物”包括指涉在其基因組內(nèi)包含異源多核苷酸的植物。一般來講，異源多核苷酸穩(wěn)定地整合在基因組內(nèi)使得該多核苷酸得以傳遞到連續(xù)世代?？蓪愒炊嗪塑账釂为氄线M基因組中或作為重組表達盒的一部分整合進基因組中。“轉(zhuǎn)基因”在本文中用于包括其基因型已因異源核酸的存在而改變的任何細胞、細胞系、愈傷組織、組織、植株部分或植株，包括那些那種最初經(jīng)如此改變的轉(zhuǎn)基因植物以及通過有性雜交或無性繁殖從最初的轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生的那些。本文所用的術(shù)語“轉(zhuǎn)基因”不涵蓋通過常規(guī)植物育種方法或通過諸如隨機異花受精、非重組病毒感染、非重組細菌轉(zhuǎn)化、非重組轉(zhuǎn)座或自發(fā)突變之類的自然發(fā)生事件導(dǎo)致的基因組(染色體基因組或染色體外基因組)的改變。例如，整個植株可通過使該植株產(chǎn)生傷口，然后將載體引入該傷口位點來用這些載體進行感染?？墒怪仓甑娜魏尾糠之a(chǎn)生傷口，包括葉、莖和根?；蛘撸蓪⑼庵搀w形式的植物組織如子葉組織或葉圓片用這些載體接種，并在可促進植物再生的條件下培養(yǎng)?？蓪⑼ㄟ^用毛根農(nóng)桿菌或根瘤農(nóng)桿菌(含有編碼伏馬毒素降解酶的基因)接種植物組織而轉(zhuǎn)化的根或苗用作植物來源，以通過體細胞胚胎發(fā)生或器官發(fā)生來再生伏馬毒素抗性轉(zhuǎn)基因植物。用于再生植物組織的這類方法的例子在如下文獻中有所公開Jhahin，(1985)Theor.App1.Genet.69:235-40；第4，658，082號美國專利；Simpson等人(同上)和在1993年11月16日提交的第5，沈2，306號美國專利中引用的均于1986年10月1日提交的系列號為913，913和913，914的美國專利申請，將上述文獻的全部公開內(nèi)容以引用的方式并入本文。盡管農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化的宿主范圍廣泛，但一些主要的谷類作物物種和裸子植物總體上對該基因轉(zhuǎn)移模式而言是頑拗的，盡管最近已在稻中獲得了一定的成功(Hiei等人，(1994)ThePlantJournal6:271-82)。已開發(fā)了幾種植物轉(zhuǎn)化的方法(統(tǒng)稱為直接基因轉(zhuǎn)移)作為對農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化的替代。一般適用的植物轉(zhuǎn)化方法是微拋射體(microprojectile)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，其中DNA攜帶在約1至4μπι的微拋射體的表面上。用基因槍裝置將表達載體引入植物組織中，該基因槍裝置將微拋射體加速至300至600m/s的速度，該速度足以穿透植物細胞壁和膜(Sanford等人，(1987)Part.Sci.Technol.5:27；Sanford,(1988)TrendsBiotech6:299；Sanford,(1990)Physiol.Plant79:206和Klein等人，(1992)Biotechnology10:268)。物理遞送DNA至植物的另一種方法是如^ing等人，(1991)BioTechnology9:996中所述的對靶細胞的超聲處理?；蛘?，脂質(zhì)體或原生質(zhì)球融合已用于將表達載體引入植物中。參見例如Deshayes等人，(1985)EMBOJ.4:2731和Christou等人，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:3962。利用CaCl2沉淀、聚乙烯醇或poly-L-鳥氨酸直接將DNA攝入原生質(zhì)體中已有報道。參見例如Hain等人，(1985)Mol.Gen.Genet.199:161和Draper等人，(1982)PlantCellPhysiol.23:451。原生質(zhì)體和完整細胞和組織的電穿孔也已有描述。參見例如Dorm等人，(1990)AbstractsoftheVIIthInt‘1.CongressonPlantCellandTissueCultureIAPTC,A2-38，第53頁；D'Halluin等人，(1992)PlantCell4:1495-505和Spencer等人，(1994)PlantMol.Biol.24:51_61。除了調(diào)節(jié)乙烯合成，本發(fā)明的方法可連同可改變植物中的另外的表型的序列或方法一起使用。有多種表型變化是值得關(guān)注的，包括修飾植物中的脂肪酸組成、改變植物的氨基酸含量、改變植物的病原體防御機制等等。這些結(jié)果可通過在植物中表達異源產(chǎn)物或增加內(nèi)源產(chǎn)物的表達來實現(xiàn)?；蛘撸@些結(jié)果可通過在植物中減少一種或多種內(nèi)源產(chǎn)物(特別是酶或輔因子)的表達來實現(xiàn)。這些改變導(dǎo)致轉(zhuǎn)化植物的表型變化。所關(guān)注基因反映了作物開發(fā)的參與者的商業(yè)市場和利益。所關(guān)注作物和市場在變化，并且隨著發(fā)展中國家開放了世界市場，也將會出現(xiàn)新的作物和技術(shù)。另外，隨著我們對農(nóng)學性狀和特性如產(chǎn)量和雜種優(yōu)勢的理解的增加，對用于轉(zhuǎn)化的基因的選擇將會相應(yīng)變化。所關(guān)注基因的大體類別包括例如涉及信息的那些基因(如鋅指)、涉及通信的那些基因(如激酶)和涉及看家的那些基因(如熱休克蛋白)。轉(zhuǎn)基因的更具體類別例如包括編碼對農(nóng)學、昆蟲抗性、病害抗性、除草劑抗性、不育性、谷粒特征和商業(yè)產(chǎn)品重要的性狀的基因。一般而言，所關(guān)注基因包括涉及油脂、淀粉、碳水化合物或營養(yǎng)物質(zhì)代謝的那些以及影響仁大小、蔗糖載量等的那些。在某些實施方案中，可將本發(fā)明的核酸序列與所關(guān)注的其他多核苷酸序列聯(lián)合(“堆疊”)使用，以便產(chǎn)生具有所需表型的植物。生成的組合可包括所關(guān)注多核苷酸中的任何一者或多者的多個拷貝。本發(fā)明的多核苷酸可與任何基因或基因的組合堆疊以產(chǎn)生具有多種所需性狀組合的植物，包括但不限于對動物飼料而言理想的性狀如高油脂基因(例如第6，232，529號美國專利)；平衡的氨基酸(例如hordothionin類(第5，990，389號；第5，885，801號；第5，885，802號和第5，703，049號美國專利)；大麥高賴氨酸(Williamson等人，(1987)Eur.J.Biochem.165:99-106和WO98/20122)和高甲硫氨酸蛋白質(zhì)(Pedersen等人，(1986)J.Biol.Chem.:6279；Kirihara等人，(1988)Gene71:359和Musumura等人，(1989)PlantMol.Biol.12:123))；增加的消化率(例如經(jīng)修飾的貯藏蛋白(于2001年11月7日提交的系列號為10/053，410的美國專利申請)和硫氧還蛋白(于2001年12月3日提交的系列號為10/005，4的美國專利申請))，將上述文獻的公開內(nèi)容以引用的方式并入本文。本發(fā)明的多核苷酸還可與對昆蟲、病害或除草劑抗性而言理想的性狀堆疊(例如，蘇蕓金芽胞桿菌(Bacillusthuringiensis)毒蛋白(第5，366，892號；第5，747，450號；第5，736，514號；第5，723，756號；第5，593，881號美國專利；Geiser等人，(1986)Gene48109)；凝集素(VanDamme等人，(1994)PlantMol.Biol.24:825)；伏馬毒素解毒基因(第5，792，931號美國專利)；毒力和病害抗性基因(Jones等人，(1994)Science266:789；Martin等人，(1993)Science2621432;Mindrinos等人，(1994)Cell78:1089)；導(dǎo)致除草劑抗性的乙酰乳酸合酶(ALQ突變體如S4和/或Hra突變；谷氨酰胺合酶的抑制劑如草胺膦或basta(例如bar基因)；以及草甘膦抗性(EPSPS基因))，以及對加工或工藝產(chǎn)品而言理想的性狀如高油脂(例如第6，232，529號美國專利)；經(jīng)修飾的油脂(例如脂肪酸去飽和酶基因(第5，952，544號美國專利；WO94/11516))；經(jīng)修飾的淀粉(例如ADPG焦磷酸化酶(AGP酶)、淀粉合酶(SS)、淀粉分支酶(SBE)和淀粉脫支酶(SDBE))和聚合物或生物塑料(例如第5.602，321號美國專利；促進聚羥基鏈烷酸酯(PHA)表達的β-酮硫解酶、聚羥基丁酯合酶和乙酰乙酰輔酶A還原酶(khubert等人，(1988)J.Bacteriol.1705837-5847))，將上述文獻的公開內(nèi)容以引用的方式并入本文。還可以將本發(fā)明的多核苷酸與影響諸如雄性不育(例如參見第5，583，210號美國專利)、莖稈強度、開花時間之類的農(nóng)學性狀或諸如細胞周期調(diào)控或基因打靶(例如WO99/61619；WO00/17364；WO99/25821)之類的轉(zhuǎn)化技術(shù)性狀的多核苷酸組合，將上述文獻以引用的方式并入本文。在一個實施方案中，所關(guān)注序列可改善植物生長和/或作物產(chǎn)量。例如，所關(guān)注序列包括可導(dǎo)致初生根系或側(cè)根系改善的農(nóng)學上重要的基因。這類基因包括但不限于營養(yǎng)物質(zhì)/水轉(zhuǎn)運蛋白和生長誘導(dǎo)。這類基因的例子包括但不限于玉蜀黍質(zhì)膜H+-ATP酶(ΜΗΑ2)(Frias等人，(1996)PlantCell8:1533-44)；AKT1，擬南芥屬中鉀攝取器的組件，(Spalding等人，(1999)JGenPhysiol113:909-18)；RML基因，其激活根頂端細胞中的細胞分裂周期(Cheng等人，(1995)PlantPhysiol108:881)；玉蜀黍谷氨酰胺合成酶基因(Sukanya等人，(1994)PlantMolBiol26:1935-46)和血紅蛋白(Duff等人，(1997)J.Biol·Chem27:16749-16752;Arredondo_Peter等人，(1997)PlantPhysiol.1151259-U66;Arredondo-Peter等人，(1997)PlantPhysiol114:493-500以及其中引用的參考文獻)。所關(guān)注序列還可用于表達負面影響根發(fā)育的基因的反義核苷酸序列。另外，除了利用傳統(tǒng)的育種方法外，還可遺傳改變諸如油脂、淀粉和蛋白質(zhì)含量之類的農(nóng)學上重要的性狀。修飾包括增加油酸、飽和或不飽和油的含量、增加賴氨酸或硫的水平、提供必需氨基酸以及修飾淀粉。第5，703，049號、第5，885，801號、第5，885，802號和第5，990，389號美國專利中描述了Hordothionin蛋白修飾，將這些文獻以引用的方式并入本文。另外的例子是第5，850，016號美國專利中描述的由大豆2S白蛋白編碼的富含賴氨酸和/或硫的種子蛋白質(zhì)和Williamson等人，(1987)Eur.J.Biochem.165:99-106中描述的來自大麥的胰凝乳蛋白酶抑制劑，將上述參考文獻的公開內(nèi)容以引用的方式并入本文?？赏ㄟ^定點誘變產(chǎn)生編碼序列的衍生物來增加預(yù)選氨基酸在所編碼的多肽中的水平。例如，編碼大麥高賴氨酸多肽的基因(BHL)源于大麥胰凝乳蛋白酶抑制劑，參見于1996年11月1日提交的系列號為08/740，682的美國專利申請和WO98/20133，將這兩篇文獻的公開內(nèi)容以引用的方式并入本文。其他蛋白質(zhì)包括富含甲硫氨酸的植物蛋白質(zhì)如來自向日葵籽(Lilley等人，(1989)ProceedingsoftheWorldCongressonVegetableProteinUtilizationinHumanFoodsandAnimalFeedstuffs,Applewhite(編輯)(AmericanOilChemistsSociety,Champaign，Illinois)，第497-502頁，將該文獻以引用的方式并入本文)；玉米(Pedersen等人，(1986)J.Biol.Chem.261:6279;Kirihara等人，(1988)Gene71:359，將這兩篇文獻均以引用的方式并入本文)和水稻(Musumura等人，(1989)PlantMol.Biol.12123，將該文獻以引用的方式并入本文)。其他農(nóng)學上重要的基因編碼膠乳、Floury2、生長因子、種子貯藏因子和轉(zhuǎn)錄因子。昆蟲抗性基因可編碼針對會導(dǎo)致產(chǎn)量大跌的害蟲(如根蟲、切根蟲、歐洲玉米螟等)的抗性。這類基因包括例如蘇蕓金芽胞桿菌毒蛋白基因(第5，366，892號；第5，747，450號；第5，736，514號；第5，723，756號；第5，593，881號美國專利和Geiser等人，(1986)Gene48:109)等等。編碼病害抗性性狀的基因包括解毒基因，如對抗伏馬毒素的基因(第5，792，931號美國專利)；毒力(avr)和病害抗性(R)基因(Jones等人，(1994)Science266:789;Martin等人，(1993)Science2621432和Mindrinos等人，(1994)Cell78:1089)等等。除草劑抗性性狀可包括編碼針對起到抑制乙酰乳酸合酶(ALQ作用的除草劑(特別是磺酰脲類除草劑)的抗性的基因(例如含有導(dǎo)致這種抗性的突變，特別是34和/或Hra突變的乙酰乳酸合酶(ALQ基因)、編碼針對起到抑制谷氨酰胺合酶作用的除草劑如草胺膦或basta的抗性的基因(例如bar基因)，或本領(lǐng)域已知的其他這類基因。bar基因編碼針對除草劑basta的抗性，nptll基因編碼針對抗生素卡那霉素和遺傳霉素的抗性，ALS基因突變編碼針對除草劑氯磺隆的抗性。不育基因也可編碼在表達盒中，為物理去雄提供另選方案?？梢赃@類方式使用的基因的例子包括雄性組織優(yōu)選的基因和具有雄性不育表型的基因如QM，其在第5，583，210號美國專利中進行了描述。其他基因包括激酶和編碼對雄性或雌性配子體發(fā)育有毒的化合物的那些。谷粒品質(zhì)反映在諸如飽和和非飽和的油的水平和類型、必需氨基酸的品質(zhì)和數(shù)量以及纖維素的水平之類的性狀中。在玉米中，修飾的hordothionin蛋白在第5，703，049號、第5，885，801號、第5，885，802號和第5，990，389號美國專利中進行了描述。還可在(一種或多種)基因上編碼商業(yè)性狀，所述基因可增加例如用于乙醇生產(chǎn)的淀粉，或提供蛋白質(zhì)的表達。轉(zhuǎn)化植物的另一重要的商業(yè)用途是生產(chǎn)聚合物和生物塑料，如在第5，602，321號美國專利中描述的。諸如β-酮硫解酶、PHB酶(聚羥基丁酸酯合酶)和乙酰乙酰輔酶A還原酶之類的基因(參見khubert等人，(1988)J.Bacteriol.1705837-5847)可促進聚羥基鏈烷酸酯(PHA)的表達。外源產(chǎn)物包括植物酶和產(chǎn)物以及來自包括原核生物和其他真核生物在內(nèi)的其他來源的那些。這類產(chǎn)物包括酶、輔因子、激素等等?？稍黾拥鞍踪|(zhì)，特別是具有改善的氨基酸分布以改善植物營養(yǎng)價值的修飾蛋白質(zhì)的水平。這可通過表達具有提高的氨基酸含量的這類蛋白質(zhì)來實現(xiàn)。可根據(jù)常規(guī)方式將已轉(zhuǎn)化的細胞培育成植株。參見例如McCormick等人，(1986)PlantCellReports5:81_84。然后可栽培這些植株并用相同的轉(zhuǎn)化株授粉或用不同的株系授粉；然后可鑒別具有所需表型特性的所得子代?？膳嘤齼纱蚋啻源_保所需表型特性得以穩(wěn)定保持和遺傳，然后采集種子以確保已獲得展現(xiàn)出所需表型特性的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體。這樣，本發(fā)明提供了轉(zhuǎn)化種子(也稱為“轉(zhuǎn)基因種子”)，該轉(zhuǎn)化種子具有穩(wěn)定整合進它們的基因組中的本發(fā)明的核酸構(gòu)建體，例如本發(fā)明的表達盒。本文所用的術(shù)語“植物”包括指涉整個植株、植物器官(例如葉、莖、根等)、種子和植物細胞和它們的子代。術(shù)語植物還包括植物原生質(zhì)體、植物愈傷組織和植物塊。本文所用的植物細胞包括但不限于存在于或來自種子、懸浮培養(yǎng)物、胚、分生組織區(qū)、愈傷組織、葉、根、苗、配子體、孢子體、花粉和小孢子的細胞。植物細胞可以是完整植株的部分或植株部分，如胚、花粉、胚珠、種子、葉、花、枝、果實、仁、穗、穗軸、殼、莖、根、根尖、花粉囊等。谷粒旨在表示商業(yè)種植者出于栽培或繁殖物種之外的目的生產(chǎn)的成熟種子。再生的植物的子代、變體和突變體也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)，條件是這些部分包含所引入的多核苷酸。本發(fā)明可用于任何植物物種(包括但不限于單子葉植物和雙子葉植物)的轉(zhuǎn)化。所關(guān)注的植物物種的例子包括但不限于玉米(Zeamays)；蕓苔屬物種(Brassicasp.)(例如甘藍型油菜(B.napus)、蕪菁(B.rapa)、芥菜(B.jimcea))，特別是可用作種子油來源的那些蕓苔屬物種；苜蓿(Medicagosativa)、水稻(Oryzasativa)、黑麥(Secalecereale)、高梁(Sorghumbicolor,Sorghumvulgare)、小米(例如珍珠粟(Pennisetumglaucum)、^^(Panicummiliaceum)^1^1(Setariaitalica)(Eleusinecoracana))；(日葵(Helianthusannuus)；紅花(Carthamustinctorius)；小麥(Triticumaestivum)、大豆(Glycinemax)、煙草(Nicotianatabacum)、馬鈴薯(Solanumtuberosum)、落花生(Arachishypogaea)、棉花(海島棉(Gossypiumbarbadense)、陸地棉(Gossypiumhirsutum))；甘暮(Ipomoeabatatus)；木暮(Manihotesculenta)；叻[1啡(Coffeaspp.)；椰子(Cocosnucifera)；菠蘿(Ananascomosus)；柑橘(Citrusspp.)；可可(Theobromacacao)；茶(Camelliasinensis)；香蕉(Musaspp.)；魚萼梨(Perseaamericana)；無花果(Ficuscasica)；番石槽(Psidiumguajava)；芒果(Mangiferaindica)；撤攬(Oleaeuropaea)；H(Caricapapaya)；^(Anacardiumoccidentale)；Hti^IlM胃(Macadamiaintegrifolia)5-^(Prunusamygdalus)；HM舌甘胃(Betavulgaris)；(Saccharumspp.)；燕麥；大麥；蔬菜；觀賞植物和針葉樹。在本發(fā)明公開的方法的特定實施方案中，所述植物是玉米。蔬菜包括番(Lycopersiconesculentum)、萵苣(例如Lactucasativa)、青豆(Phaseolusvulgaris)、利馬豆(Phaseoluslimensis)、豌豆(Lathyrusspp.)禾口黃瓜屬(Cucumis)的成員如黃瓜(C.sativus)、香瓜(C.cantalupensis)和甜瓜(C.melo)。觀賞植物包括才土胃$#(Rhododendronspp.)^AyIlljit(MacrophyIlahydrangea)>^IS(Hibiscusrosasanensis)、攻瑰(Rosaspp·)、郁金香(Tulipaspp.)、7jC仙花(Narcissusspp·)、ΜΦΨ^(Petuniahybrida)>7β(Dianthuscaryophyllus)>一(紅(Euphorbiapulcherrima)禾口菊花?？捎糜趯嵤┍景l(fā)明的針葉樹包括例如松樹如火炬松(Pinustaeda)、濕地松(Pinuselliotii)、美國黃松(Pinusponderosa)、美國黑松(Pinuscontorta)和輻射松(Pinusradiata)；花方萁松(Pseudotsugamenziesii)；力口拿大鐵杉(Tsugacanadensis)；北美云杉(Piceaglauca)；紅杉(Sequoiasempervirens)；真冷杉如銀揪(Abiesamabilis)和香脂冷杉(Abiesbalsamea)；和雪松如西岸紅雪松(Thujaplicata)和黃扁柏(Chamaecyparisnootkatensis)。在具體的實施方案中，本發(fā)明的植物是作物植物(例如玉米、苜猜、向日葵、蕓苔、大豆、棉花、紅花、花生、高粱、小麥、小米、煙草等等)。在其它實施方案中，玉米和大豆以及甘蔗植物是優(yōu)選的，在另外的實施方案中玉米植物是優(yōu)選的。所關(guān)注的其他植物包括提供所關(guān)注的種子的谷物植物、油料種子植物和豆科植物。所關(guān)注的種子包括谷物種子，如玉米、小麥、大麥、水稻、高粱、黑麥等等。油料植物包括玉米、大豆、紅花、向日葵、蕓苔、玉蜀黍、苜蓿、棕櫚、椰子等等。豆科植物包括莢果類和豌豆。莢果類包括瓜爾豆、槐豆、胡蘆巴、大豆、四季豆、豇豆、綠豆、利馬豆、蠶豆、小扁豆、鷹嘴XL寸寸。除非另外指明，否則本發(fā)明的實施將采用植物學、微生物學、組織培養(yǎng)、分子生物學、化學、生物化學和重組DNA技術(shù)的常規(guī)技術(shù)，這些技術(shù)處于本領(lǐng)域技能范圍內(nèi)。這類技術(shù)在文獻中有完全的解釋。參見例如Langenheim和Thimann，(1982)BotanyPlantBiologyandItsRelationtoHumanAffairs,JohnWiley；CellCultureandSomaticCellGeneticsofPlants，第1卷，Vasil(編輯)(1984)jtanier等人，(1986)TheMicrobialWorld,第5版，Prentice-Hall；Dhringra禾口Sinclair,(1985)BasicPlantPathologyMethods,CRCPress；Maniatis等人，(1982)MolecularCloning:ALaboratoryManual；DNACloning，第I和第II卷，Glover(編輯)(1985)；OligonucleotideSynthesis,Gait(編輯)(1984)；NucleicAcidHybridization,Hames和Higgins(編輯)(1984)以及MethodsinEnzymology系列，Colowick禾口Kaplan(編輯)，AcademicPress,Inc.,SanDiego,CA0單位、前綴和符號可以它們SI接受的形式表示。除非另外指明，否則分別地，核酸以5'至3'取向從左向右書寫；氨基酸序列以氨基向羧基取向從左向右書寫。數(shù)值范圍包括限定該范圍的數(shù)字。氨基酸在本文中可通過它們通常知道的三字母符號表示或通過IUPAC-IUB生化命名委員會(IUPAC-IUBBiochemicalNomenclatureCommission)推薦的單字母符號表示。同樣，核苷酸可通過它們通常接受的單字母密碼表示。應(yīng)該指出，術(shù)語“一個”或“一種”實體指一(個)種或多(個)種該實體；例如45“一種多肽”理解為表示一種或多種多肽。同樣地，術(shù)語“一個”(或“一種”)、“一(個)種或多(個)種”和“至少一(個)種”在本文中可互換使用。在本說明書和權(quán)利要求書全文中，措辭“包含”、“含有”和“包括”以非排他的意義使用，除非其中語境中有別的要求。本文所用的術(shù)語“約”當指值時，意在涵蓋偏離指定的量達，在一些實施方案中，士50%的偏差，在一些實施方案中，士20%的偏差，在一些實施方案中，士10%的偏差，在一些實施方案中，士5%的偏差，在一些實施方案中，士的偏差，在一些實施方案中，士0.5%的偏差，在一些實施方案中，士0.的偏差，只要這種偏差適于執(zhí)行所公開的方法或采用所公開的組合物。另外，在量、濃度或其他值或參數(shù)以范圍(優(yōu)選范圍)或上限優(yōu)選值和下限優(yōu)選值列表給出時，這應(yīng)該理解為具體地公開了由任何范圍上限或上限優(yōu)選值和任何范圍下限或下限優(yōu)選值的任何配對形成的所有范圍，而無論是否單獨公開了這些范圍。如果本文中敘述了數(shù)值的范圍，除非另外指明，否則該范圍旨在包括它們的端點，以及該范圍內(nèi)的所有整數(shù)和分數(shù)。當限定范圍時，無意于使本公開的主題的范圍受限于所敘述的具體值。參考如下非限制性實施例可更好地理解本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，可在不脫離本文所公開的并受權(quán)利要求書保護的發(fā)明的精神和范圍的情況下實施本發(fā)明的其他實施方案。實施例^MM1.誦i寸發(fā)夾RNA表汰講行的ACC合_高祁佘如先前指出的，可例如通過引入構(gòu)建用于RNA沉默或干擾的ACC合酶多核苷酸序列，來產(chǎn)生敲除植物細胞和植物。本實施例描述了用于例如在玉蜀黍中改善植物氮利用表型的發(fā)夾RNA表達盒。如先前指出的，ACC合酶的敲除(例如通過hpRNA表達)可導(dǎo)致一種或多種ACC合酶的表達減少(最高至并且包括無可檢測的表達)的植物或植物細胞。對ACC合酶基因的區(qū)域(例如，啟動子、其他非翻譯區(qū)或編碼區(qū))有特異性的發(fā)夾RNA(hpRNA)分子在植物中表達可改變該植物的氮利用潛能，例如通過RNA干擾和/或沉默。ACS2和ACS6的hpRNA構(gòu)建體通過將泛素啟動子連接至ACS2或ACS6基因的編碼序列的一部分的反向重復(fù)序列來產(chǎn)生(參見圖2和幻。使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化技術(shù)將每種構(gòu)建體轉(zhuǎn)化進玉蜀黍中。用于制備構(gòu)建體和轉(zhuǎn)化玉蜀黍的核酸分子和方法是如以前所描述的和本領(lǐng)域已知的，并且如本文所描述的。對ACS2或ACS6編碼序列有特異性的hpRNA的表達導(dǎo)致在營養(yǎng)生長和繁殖生長中不顯示出異常的玉蜀黍植物。針對ACS2發(fā)夾構(gòu)建體和ACS6發(fā)夾構(gòu)建體，分別產(chǎn)生了總共36和40個單獨的玉蜀黍轉(zhuǎn)基因事件。每種hpRNA構(gòu)建體選擇大約10低拷貝數(shù)事件用于另外的回交和轉(zhuǎn)基因評價。對包含hpRNA轉(zhuǎn)基因的回交系評價氮利用潛能表型，例如，如本文所述(例如，在正常條件下或在氮耗竭、干旱或其他脅迫條件下，通過目視檢查、測量光合作用活性、測定葉綠素或蛋白質(zhì)含量、谷粒產(chǎn)量等等)。將含有抑制構(gòu)建體的玉米雜交體和無效對照(null)在氮脅迫條件和正常氮條件下在田間種植。種植密度為36，000株植株/英畝，對植物進行充分灌溉。在正常氮條件下，栽培前以尿素硝酸銨(UAN)的形式施用IOOlbs氮/英畝，然后在發(fā)育的V6階段將1501bs/英畝的UAN作為側(cè)施肥施用。通過在不添加氮的情況下種植玉米兩年耗竭土壤氮儲備來實現(xiàn)氮脅迫。在耗竭的每一季后，將玉米粒和稿稈移除以耗竭氮的通過礦化作用得到的有機物質(zhì)來源。監(jiān)測土壤硝酸鹽儲備來評估耗竭水平。為了實現(xiàn)目標脅迫水平，通過在V2和VT之間加肥灌溉來施用UAN，達到總共1501bs氮。將來自構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因事件與無效對照一起嵌套，以使得田間變異的空間效應(yīng)最小。將含有轉(zhuǎn)基因的事件的谷粒產(chǎn)量與轉(zhuǎn)基因無效對照的產(chǎn)量進行比較。進行統(tǒng)計分析來評估與轉(zhuǎn)基因無效對照相比產(chǎn)量是否存在顯著改善，行和列的空間效應(yīng)考慮在內(nèi)?！鎏幚淼偷?LN)和正常N(NN)■嵌套設(shè)計，6個重復(fù)樣本在LN中，4個重復(fù)樣本在NN中下表1示出了具有RNAi抑制構(gòu)建體m^i:ACS6的7個事件和野生型對照的產(chǎn)量數(shù)據(jù)(每英畝蒲式耳數(shù))。表1.權(quán)利要求1.一種改善植物中的氮脅迫耐受性的方法，所述方法包括a)通過向植物引入異源多核苷酸來抑制植物中的乙烯合成，所述異源多核苷酸具有在所述異源多核苷酸表達時降低ACC合酶或ACC氧化酶的活性的手段；b)在氮限制條件下栽培所述植物，從而所述異源多核苷酸得以表達并且與對照植物相比較所述植物展示出改善的氮脅迫耐受性。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述異源多核苷酸在所述異源多核苷酸表達時降低ACC合酶的表達。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述異源多核苷酸包含選自以下的核酸a)包含ACC合酶核酸的核酸；b)包含ACC合酶核酸的互補序列的至少15個連續(xù)核苷酸的核酸；以及c)編碼能夠形成雙鏈RNA并介導(dǎo)對ACC合酶核酸的RNA干擾的轉(zhuǎn)錄物的核酸，其中所述核酸包含i)包含ACC合酶核酸的至少21個連續(xù)核苷酸的第一核苷酸序列；和)包含所述第一核苷酸序列的互補序列的第二核苷酸序列。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述異源多核苷酸包含選自以下的核苷酸序列a)SEQIDNO:1、2、3、4、5或6中示出的核苷酸序列，或其完全互補序列;b)與SEQIDN0:l、2、3、4、5或6具有至少90%的序列同一性的核苷酸序列，或其完全互補序列；c)編碼SEQIDNO:7、8或9的多肽序列的核苷酸序列或其完全互補序列；d)編碼與SEQIDNO:7、8或9具有至少95%的同一性的多肽序列的核苷酸序列或其完全互補序列；e)包含SEQIDNO:1、2、3、4、5或6的互補序列的至少15個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列；以及f)編碼能夠形成雙鏈RNA并介導(dǎo)對ACC合酶核酸的RNA干擾的轉(zhuǎn)錄物的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包含SEQIDN0:l、2、3、4、5或6的至少21個連續(xù)核苷酸及其互補序列。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述植物是玉蜀黍植物。6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述植物包含由具有SEQIDN0:l、2、3、4、5或6中示出的靶序列的多核苷酸編碼的mRNA，其中所述異源多核苷酸的表達抑制所述mRNA的表達。7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述異源多核苷酸包含選自以下的核苷酸序列a)SEQIDNO:2或5中示出的核苷酸序列，或其完全互補序列；b)與SEQIDNO:2或5具有至少90%的序列同一性的核苷酸序列，或其完全互補序列；c)編碼SEQIDNO8的多肽序列的核苷酸序列或其完全互補序列；d)編碼與SEQIDNO:8具有至少95%的同一性的多肽序列的核苷酸序列或其完全互補序列；e)包含SEQIDNO:2或5的互補序列的至少15個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列；以及f)編碼能夠形成雙鏈RNA并介導(dǎo)對ACC合酶核酸的RNA干擾的轉(zhuǎn)錄物的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包含SEQIDNO:2或5的至少21個連續(xù)核苷酸及其互補序列。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述植物是玉蜀黍植物。9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述植物包含由具有SEQIDNO:2或5中示出的靶序列的多核苷酸編碼的mRNA，其中所述異源多核苷酸的表達抑制所述mRNA的表達。10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述ACC合酶選自ACC合酶2、ACC合酶6和ACC合酶7。11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述較于對照植物而言改善的氮脅迫耐受性包含至少一種選自以下的表型a)產(chǎn)量增加；b)根質(zhì)量增加；c)根長度增加；d)葉尺寸增加；e)穗尺寸增加；f)種子尺寸增加；g)胚乳尺寸增加；以及h)抗倒伏性改善。12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述異源多核苷酸可操作連接至在植物中起作用的啟動子。13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述在植物中起作用的啟動子是組織優(yōu)選啟動子、組織特異性啟動子或誘導(dǎo)型啟動子。14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述異源多核苷酸通過選自以下其中一種的方法導(dǎo)入電穿孔、微粒轟擊和農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移。15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述植物是單子葉植物。16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述單子葉植物是玉蜀黍、小麥、水稻、大麥、高粱、甘蔗或黑麥。17.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述植物是雙子葉植物。18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述雙子葉植物是大豆、卡諾拉、蕓苔屬植物或向日葵。19.一種用于改善在低氮條件下的氮脅迫耐受性的方法，所述方法包括a)針對氮限制條件評價耕作區(qū)的環(huán)境條件；以及b)在具有氮限制條件的耕作區(qū)栽培其至少一種ACC合酶或ACC氧化酶的活性降低的轉(zhuǎn)基因種子或轉(zhuǎn)基因植物。20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述植物或種子用異源多核苷酸穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，所述異源多核苷酸具有在所述異源多核苷酸表達時降低ACC合酶或ACC氧化酶的活性的手段。21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述異源多核苷酸在所述異源多核苷酸表達時降低ACC合酶的表達。22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述異源多核苷酸包含選自以下的核酸a)包含ACC合酶核酸的核酸；b)包含ACC合酶核酸的互補序列的至少15個連續(xù)核苷酸的核酸；以及c)編碼能夠形成雙鏈RNA并介導(dǎo)對ACC合酶核酸的RNA干擾的轉(zhuǎn)錄物的核酸，其中所述核酸包含i)包含ACC合酶核酸的至少21個連續(xù)核苷酸的第一核苷酸序列；和)包含所述第一核苷酸序列的互補序列的第二核苷酸序列。23.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述異源多核苷酸包含選自以下的核苷酸序列a)SEQIDN0:l、2、3、4、5或6中示出的核苷酸序列，或其完全互補序列;b)與SEQIDN0:l、2、3、4、5或6具有至少90%的序列同一性的核苷酸序列，或其完全互補序列；c)編碼SEQIDNO:7、8或9的多肽序列的核苷酸序列或其完全互補序列；d)編碼與SEQIDNO:7、8或9具有至少95%的同一性的多肽序列的核苷酸序列；e)包含SEQIDNO:1、2、3、4、5或6的互補序列的至少15個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列；以及f)編碼能夠形成雙鏈RNA并介導(dǎo)對ACC合酶核酸的RNA干擾的轉(zhuǎn)錄物的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包含SEQIDN0:l、2、3、4、5或6的至少21個連續(xù)核苷酸及其互補序列。24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述植物是玉蜀黍植物。25.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述植物包含由具有SEQIDNO:1、2、3、4、5或6中示出的靶序列的多核苷酸編碼的mRNA，其中所述異源多核苷酸的表達抑制所述mRNA的表達。26.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述異源多核苷酸包含選自以下的核苷酸序列a)SEQIDNO:2或5中示出的核苷酸序列，或其完全互補序列；b)與SEQIDNO:2或5具有至少90%的序列同一性的核苷酸序列，或其完全互補序列；c)編碼SEQIDNO8的多肽序列的核苷酸序列或其完全互補序列；d)編碼與SEQIDNO8具有至少95%的同一性的多肽序列的核苷酸序列；e)包含SEQIDNO:2或5的互補序列的至少15個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列；以及f)編碼能夠形成雙鏈RNA并介導(dǎo)對ACC合酶核酸的RNA干擾的轉(zhuǎn)錄物的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包含SEQIDNO:2或5的至少21個連續(xù)核苷酸及其互補序列。27.根據(jù)權(quán)利要求沈所述的方法，其中所述植物是玉蜀黍植物。28.根據(jù)權(quán)利要求沈所述的方法，其中所述植物包含由具有SEQIDNO:2或5中示出的靶序列的多核苷酸編碼的mRNA，其中所述異源多核苷酸的表達抑制所述mRNA的表達。29.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述ACC合酶選自ACC合酶2、ACC合酶6和ACC合酶7。30.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述較于對照植物而言改善的氮脅迫耐受性包含至少一種選自以下的表型a)產(chǎn)量增加；b)根質(zhì)量增加；c)根長度增加；d)葉尺寸增加；e)穗尺寸增加；f)種子尺寸增加；g)胚乳尺寸增加；以及h)抗倒伏性改善。31.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述異源多核苷酸可操作連接至在植物中起作用的啟動子。32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中所述在植物中起作用的啟動子是組織優(yōu)選啟動子、組織特異性啟動子或誘導(dǎo)型啟動子。33.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述植物是單子葉植物。34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中所述單子葉植物是玉蜀黍、小麥、水稻、大麥、高粱、甘蔗或黑麥。35.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述植物是雙子葉植物。36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中所述雙子葉植物是大豆、卡諾拉、蕓苔屬植物或向日葵。37.一種表達盒，所述表達盒包含可操作連接至包含SEQIDN0:51和SEQIDNO52中的至少一者的多核苷酸的、在植物中起作用的啟動子。38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的表達盒，其中所述啟動子是組成型啟動子。39.一種構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包含選自以下的核苷酸序列a)SEQIDNO:53中示出的核苷酸序列；b)SEQIDNO54中示出的核苷酸序列；c)SEQIDNO55中示出的核苷酸序列；d)SEQIDNO56中示出的核苷酸序列；以及e)SEQIDNO:57中示出的核苷酸序列。40.一種植物細胞，所述植物細胞包含被構(gòu)造用于RNA沉默或干擾的異源多核苷酸，其中所述異源多核苷酸包含SEQIDNO51和SEQIDNO52中的至少一者。41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的植物細胞，其中所述異源多核苷酸可操作連接至在植物中起作用的啟動子。42.根據(jù)權(quán)利要求40所述的植物細胞，其中所述異源多核苷酸具有選自以下的核苷酸序列a)SEQIDNO:53中示出的核苷酸序列；b)SEQIDNO54中示出的核苷酸序列；c)SEQIDNO55中示出的核苷酸序列；d)SEQIDNO56中示出的核苷酸序列；以及e)SEQIDNO:57中示出的核苷酸序列。43.根據(jù)權(quán)利要求40所述的植物細胞，其中所述植物細胞來自雙子葉植物或單子葉植物。44.根據(jù)權(quán)利要求43所述的植物細胞，其中所述雙子葉植物或單子葉植物是玉米、小麥、水稻、高粱、大麥、燕麥、草坪草、黑麥、大豆、甘蔗、蕓苔屬植物或向日葵。45.一種植物，所述植物從根據(jù)權(quán)利要求40所述的植物細胞再生而來。46.一種抑制植物中的乙烯產(chǎn)生的方法，所述方法包括通過向所述植物引入異源多核苷酸來抑制所述植物中的一種或多種ACC合酶基因的表達，所述異源多核苷酸具有選自以下的核苷醛序列a)SEQIDNO:51中示出的核苷酉堯序列b)SEQIDNO:52中示出的核苷酉堯序列c)SEQIDNO:53中示出的核苷酉堯序列d)SEQIDNO:54中示出的核苷酉堯序列e)SEQIDNO:55中示出的核苷酉堯序列f)SEQIDNO:56中示出的核苷酉堯序列g(shù))SEQIDNO:57中示出的核苷酉堯序列以及h)SEQIDNO:51和52中示出的核苷酸序列。全文摘要本發(fā)明提供了用于改善植物產(chǎn)量，特別是氮限制條件下的植物產(chǎn)量的方法。根據(jù)本發(fā)明，申請人已發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)植物中的ACC合酶活性可改善植物的產(chǎn)量，即使是在低氮條件下栽培也是如此。相同的植物，在展示出產(chǎn)量較非經(jīng)修飾的植物有改善的同時，在正常氮條件下未表現(xiàn)出有害的效果。本發(fā)明還提供了使用重組表達盒、宿主細胞和轉(zhuǎn)基因植物的方法。文檔編號C12N9/88GK102395674SQ201080016450公開日2012年3月28日申請日期2010年4月14日優(yōu)先權(quán)日2009年4月14日發(fā)明者H·R·拉菲特,J·E·哈本,K·雷曼,N·J·貝特,S·T·科林森申請人:先鋒國際良種公司