專利名稱：用于鑒定具有獨(dú)特核糖體翻譯譜的哺乳動物細(xì)胞亞群的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及具有獨(dú)特核糖體譜，即翻譯活性的哺乳動物細(xì)胞亞群。本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于鑒定和分離這些細(xì)胞的方法、包含這些細(xì)胞的試劑盒，或利用這些哺乳動物細(xì)胞亞群的方法。
背景技術(shù)：
生物體中的正常生物活性結(jié)合了構(gòu)成個(gè)體基因組的基因響應(yīng)于外界的內(nèi)源性表達(dá)。在高級真核生物中，基因表達(dá)開始于細(xì)胞核中，其中基因組DNA轉(zhuǎn)錄為pre-mRNA或“初級”RNA轉(zhuǎn)錄物。而仍在細(xì)胞核中，pre-mRNA被修飾為包括5'帽結(jié)構(gòu)，形成異核核糖核蛋白 (hnRNP)復(fù)合體，獲得3'多聚腺苷酸尾，并經(jīng)歷剪接以去除間插RNA序列(例如內(nèi)含子)。 成熟mRNA接著輸出到細(xì)胞質(zhì)，在那里蛋白質(zhì)復(fù)合體指導(dǎo)(1)經(jīng)由5'帽結(jié)構(gòu)與核糖體的締合，稱為帽依賴性翻譯，或⑵與促進(jìn)mRNA儲存、加工或降解的胞漿RNA結(jié)合蛋白的相互作用。在核糖體驅(qū)使的翻譯之后，3'-多聚腺苷酸尾的連續(xù)縮短導(dǎo)致mRNA體轉(zhuǎn)運(yùn)至核糖核酸酶(RNAse)的復(fù)合體(稱為外來體)，其降解老化的mRNA并有效地終止蛋白質(zhì)合成。如所預(yù)期的，基因表達(dá)是必定在特定時(shí)間、以特定速率和數(shù)量產(chǎn)生所需基因產(chǎn)物 (通常是多肽)的高度調(diào)節(jié)過程。除轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)之外，轉(zhuǎn)錄后過程諸如mRNA衰變和翻譯也是基因表達(dá)中的關(guān)鍵檢查點(diǎn)。不足為奇的是，由基因突變或?qū)ν獠看碳さ漠惓７磻?yīng)所產(chǎn)生的細(xì)胞表達(dá)譜的改變會引起嚴(yán)重異常，該嚴(yán)重異常常常導(dǎo)致急性細(xì)胞死亡或慢性疾病表型的表現(xiàn)。由環(huán)境因素(諸如營養(yǎng)水平改變、細(xì)胞因子、激素和溫度變動)以及環(huán)境應(yīng)激(如低氧、低鈣血、病毒感染和組織損傷)所引起的廣泛或長時(shí)間的細(xì)胞刺激導(dǎo)致帽依賴性翻譯的快速衰減。此過程是自適應(yīng)性的，因?yàn)樗s減了立即應(yīng)激反應(yīng)和恢復(fù)所不需要的全蛋白質(zhì)合成。然而，此翻譯減弱并不完全消除核糖體活性，因?yàn)閼?yīng)激反應(yīng)和恢復(fù)基因的許多產(chǎn)物繼續(xù)由稱為非帽依賴性翻譯的替代過程來合成(評述于Guhaniyogi & Brewer，2001， Gene 265(1-2) :11-23)。非帽依賴性翻譯通過將核糖體直接募集到稱為內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)的特異性RNA結(jié)構(gòu)而發(fā)生。IRES元件已經(jīng)在許多真核生物mRNA中得到鑒定(Bormal S等， (2003)Nucleic Acids Res. 31 :427-4 )，并確保在“帽依賴性”翻譯起始受到抑制時(shí)(即， 凋亡、饑餓、Y輻射、低氧、有絲分裂或終末分化)在細(xì)胞核失活或急性細(xì)胞應(yīng)激期間蛋白質(zhì)或其片段的高效表達(dá)。忽視對5' mRNA帽結(jié)構(gòu)的需要最初被描述為不考慮感染細(xì)胞中細(xì)胞帽依賴性翻譯的幾乎完全抑制而翻譯病毒RNA的機(jī)制(Jang等，1988，J. Virol. ,62 =2636-43)。一般來說，IRES序列無法由序列同源性鑒定，并且使用功能性試驗(yàn)驗(yàn)證了充分表征的IRES元件 (Mountford 禾口 Smith, 1995, TIG, 11(5) 179-184 ;Baird 等，2006，NAR, 12(10) :1755-85)。 當(dāng)前證據(jù)顯示，IRES RNA的構(gòu)象和輔助蛋白與特異性mRNA序列的結(jié)合使核糖體能夠結(jié)合。 在真核細(xì)胞中，IRES指導(dǎo)的翻譯常常與含有特別長的熱力學(xué)穩(wěn)定的RNA二級結(jié)構(gòu)的mRNA的5'非翻譯區(qū)(5' UTR)相關(guān)聯(lián)，所述二級結(jié)構(gòu)具有多個(gè)短開放閱讀框(ORF)，其顯著抑制核糖體依賴性翻譯的起始。然而，對于許多這些5 ‘ UTR IRES元件的IRES活性的功能驗(yàn)證因存在克隆自重疊5'基因啟動子的轉(zhuǎn)錄效應(yīng)子序列而復(fù)雜化。在IRES報(bào)告載體中采用這些5' UTR元件的嘗試因這一剩余本底轉(zhuǎn)錄活性而復(fù)雜化，所述剩余本底轉(zhuǎn)錄活性掩蓋了由這些序列產(chǎn)生的任何翻譯調(diào)節(jié)。因此，非帽依賴性翻譯和它的調(diào)節(jié)仍然是未研究的領(lǐng)域， 大體上利用翻譯作為讀出工具的系統(tǒng)也如此。發(fā)明概述本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供用于鑒定所需的哺乳動物細(xì)胞亞群的方法。所述方法包括用至少一種毒素處理哺乳動物細(xì)胞亞組以形成毒素處理細(xì)胞，哺乳動物細(xì)胞用包含以下任一項(xiàng)的核酸表達(dá)盒穩(wěn)定轉(zhuǎn)化(1)編碼在受脅迫和/或垂死細(xì)胞中選擇性翻譯的mRNA 分子的TR元件，和可操作地連接到TR元件的核苷酸序列，該序列編碼報(bào)告基因并從TR元件翻譯；或( 組成型啟動子，和可操作地連接到啟動子的核苷酸序列，該序列編碼報(bào)告基因；測定相比于參照標(biāo)準(zhǔn)所表達(dá)的報(bào)告蛋白水平的毒素處理細(xì)胞中由報(bào)告基因編碼的報(bào)告蛋白的水平，以鑒定哺乳動物細(xì)胞亞組是否表現(xiàn)所需哺乳動物細(xì)胞亞群的表型；如果哺乳動物細(xì)胞的毒素處理細(xì)胞表現(xiàn)所需哺乳動物細(xì)胞亞群的表型，那么從哺乳動物細(xì)胞分離至少一個(gè)細(xì)胞以形成細(xì)胞培養(yǎng)物；使細(xì)胞培養(yǎng)物生長以形成哺乳動物細(xì)胞亞群；和任選地用至少一種毒素處理哺乳動物細(xì)胞亞群并重復(fù)所述測定、分離和生長步驟，直到鑒定出所需的哺乳動物細(xì)胞亞群。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供用于鑒定哺乳動物細(xì)胞翻譯是否對一種物質(zhì)有抗性或用于測定一種物質(zhì)對哺乳動物細(xì)胞是否有毒性的方法。所述方法包括用包含以下任一項(xiàng)的核酸表達(dá)盒穩(wěn)定轉(zhuǎn)化哺乳動物細(xì)胞以形成穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞(1)編碼在受脅迫和/或垂死細(xì)胞中選擇性翻譯的mRNA分子的TR元件，和可操作地連接到TR元件的核苷酸序列， 該序列編碼報(bào)告基因并從TR元件翻譯；或( 組成型啟動子，和可操作地連接到啟動子的核苷酸序列，該序列編碼報(bào)告基因；用至少一種毒素處理穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的哺乳動物細(xì)胞的亞組以形成毒素處理細(xì)胞；測定相比于參照標(biāo)準(zhǔn)所表達(dá)的報(bào)告蛋白水平的毒素處理細(xì)胞中由報(bào)告基因編碼的報(bào)告蛋白的水平，以鑒定穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的哺乳動物細(xì)胞亞組是否表現(xiàn)所需哺乳動物細(xì)胞亞群的表型；如果哺乳動物細(xì)胞的毒素處理細(xì)胞表現(xiàn)所需哺乳動物細(xì)胞亞群的表型，那么從穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的哺乳動物細(xì)胞分離至少一個(gè)細(xì)胞以形成細(xì)胞培養(yǎng)物；使細(xì)胞培養(yǎng)物生長以形成哺乳動物細(xì)胞亞群；任選地用至少一種毒素處理哺乳動物細(xì)胞亞群并重復(fù)所述測定、分離和生長步驟，直到鑒定出所需的哺乳動物細(xì)胞亞群；使所需的哺乳動物細(xì)胞亞群與所述物質(zhì)接觸；和所需的哺乳動物細(xì)胞亞群與所述物質(zhì)接觸后，檢測所述報(bào)告蛋白的存在或測定報(bào)告蛋白的水平，其中與未暴露于所述物質(zhì)的對照哺乳動物細(xì)胞相比，所述物質(zhì)的毒性和哺乳動物細(xì)胞翻譯對物質(zhì)的抗性和報(bào)告蛋白的存在或報(bào)告蛋白的水平增加相關(guān)， 并且與未暴露于所述物質(zhì)的對照哺乳動物細(xì)胞相比，物質(zhì)毒性的缺乏和哺乳動物細(xì)胞翻譯對物質(zhì)抗性的缺乏和不存在報(bào)告蛋白或報(bào)告蛋白水平降低相關(guān)。本發(fā)明的又一目的在于提供利用本發(fā)明的方法獲得的具有獨(dú)特核糖體譜的哺乳動物細(xì)胞亞群。與此相關(guān)，本發(fā)明進(jìn)一步提供如本文中所定義的I類、II類和III類哺乳動物細(xì)胞。本發(fā)明的再一目的是提供試劑盒，其包含用于與I類細(xì)胞或其裂解物、II類細(xì)胞或其裂解物或者替代地III類細(xì)胞或其裂解物一起使用試劑盒的說明書。本發(fā)明的另一目的在于提供用于重組表達(dá)目標(biāo)多肽的方法。所述方法包括向III 類哺乳動物細(xì)胞中引入第二核酸表達(dá)盒，該表達(dá)盒包含以下任一項(xiàng)(1)編碼在受脅迫和/ 或垂死細(xì)胞中選擇性翻譯的mRNA分子的TR元件，和可操作地連接到TR元件的核苷酸序列，該序列編碼報(bào)告基因并從TR元件翻譯；或( 組成型啟動子，和可操作地連接到啟動子的核苷酸序列，該序列編碼報(bào)告基因；使表達(dá)第二核酸表達(dá)盒的哺乳動物細(xì)胞在允許表達(dá)目標(biāo)多肽的條件下生長；和純化目標(biāo)多肽。本發(fā)明還涉及用來產(chǎn)生目標(biāo)多肽的哺乳動物細(xì)胞，目標(biāo)多肽是通過包括以下步驟的方法獲得向III類哺乳動物細(xì)胞中引入第二核酸表達(dá)盒，該表達(dá)盒包含以下任一項(xiàng) (1)編碼在受脅迫和/或垂死細(xì)胞中選擇性翻譯的mRNA分子的TR元件，和可操作地連接到TR元件的核苷酸序列，該序列編碼報(bào)告基因并從TR元件翻譯；或( 組成型啟動子，和可操作地連接到啟動子的核苷酸序列，該序列編碼報(bào)告基因；和使表達(dá)第二核酸表達(dá)盒的哺乳動物細(xì)胞在允許表達(dá)目標(biāo)多肽的條件下生長。本發(fā)明的又一目的是提供用于鑒定參與非帽依賴性翻譯的調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)的方法。 所述方法包括用至少一種毒素處理哺乳動物細(xì)胞以形成毒素處理細(xì)胞，哺乳動物細(xì)胞用包含以下項(xiàng)的核酸表達(dá)盒穩(wěn)定轉(zhuǎn)化編碼在受脅迫和/或垂死細(xì)胞中選擇性翻譯的mRNA分子的TR元件，和可操作地連接到TR元件的核苷酸序列，該序列編碼報(bào)告基因并從TR元件翻譯；由毒素處理細(xì)胞制備細(xì)胞裂解物；分離編碼TR元件的mRNA和可操作地連接到TR元件的核苷酸序列；使mRNA和來自細(xì)胞裂解物的蛋白質(zhì)接觸以形成與mRNA結(jié)合的蛋白質(zhì)；和鑒定所述與mRNA結(jié)合的蛋白質(zhì)。本發(fā)明還提供用于驗(yàn)證I類、II類或III類哺乳動物細(xì)胞保留它們的翻譯表型的方法。所述方法包括用(多種)毒素處理I類、II類或III類哺乳動物細(xì)胞的亞組；測定相比于參照標(biāo)準(zhǔn)所表達(dá)的報(bào)告蛋白水平的哺乳動物細(xì)胞亞組中由報(bào)告基因編碼的報(bào)告蛋白的水平；驗(yàn)證哺乳動物細(xì)胞保留它們的表型，其中I類細(xì)胞的特征在于報(bào)告蛋白的表達(dá)大于未曾用毒素處理的哺乳動物細(xì)胞中報(bào)告蛋白的表達(dá)高達(dá)500%，II類細(xì)胞的特征在于報(bào)告蛋白的表達(dá)大于未曾用毒素處理的哺乳動物細(xì)胞中報(bào)告蛋白表達(dá)的500%以上到 1400%，并且III類細(xì)胞的特征在于報(bào)告蛋白的表達(dá)大于未曾用毒素處理的哺乳動物細(xì)胞中報(bào)告蛋白表達(dá)的1400%以上到約75000%。本發(fā)明的再一目的在于提供用于測定一種物質(zhì)抑制哺乳動物細(xì)胞中蛋白質(zhì)翻譯的能力的方法。所述方法包括使I類、II類或III類哺乳動物細(xì)胞與所述物質(zhì)接觸；和測定相比于未曾用物質(zhì)處理的細(xì)胞所產(chǎn)生的報(bào)告蛋白的表達(dá)的與所述物質(zhì)接觸后由哺乳動物細(xì)胞所產(chǎn)生的報(bào)告蛋白的表達(dá)，其中由物質(zhì)處理細(xì)胞所產(chǎn)生的報(bào)告蛋白的表達(dá)相比于未曾用物質(zhì)處理的細(xì)胞所產(chǎn)生的報(bào)告蛋白表達(dá)的減少表明物質(zhì)抑制蛋白質(zhì)翻譯。本發(fā)明的另一目的在于提供用于恢復(fù)所需哺乳動物細(xì)胞亞群的表型的方法。所述方法包括培養(yǎng)至少一個(gè)哺乳動物細(xì)胞亞組以形成培養(yǎng)細(xì)胞，其中用核酸表達(dá)盒穩(wěn)定轉(zhuǎn)化哺乳動物細(xì)胞，該表達(dá)盒包含用于選擇標(biāo)記的核苷酸序列和以下任一項(xiàng)(1)編碼在受脅迫和/或垂死細(xì)胞中選擇性翻譯的mRNA分子的TR元件，和可操作地連接到TR元件的核苷酸序列，該序列編碼報(bào)告基因并從TR元件翻譯；或( 組成型啟動子，和可操作地連接到啟動子的核苷酸序列，該序列編碼報(bào)告基因；用選擇標(biāo)記對其提供抗性的物質(zhì)處理培養(yǎng)的細(xì)胞，使得不再含有核酸表達(dá)盒的培養(yǎng)細(xì)胞死亡；使處理細(xì)胞生長以形成哺乳動物細(xì)胞亞群；和任選地重復(fù)所述培養(yǎng)、處理和生長步驟，直到復(fù)原所需哺乳動物細(xì)胞亞群的表型。其它目的與特點(diǎn)將在下文部分顯而易見并部分指出。附圖簡述

圖1示出人HCT116細(xì)胞系對5_試驗(yàn)和15-試驗(yàn)程序的TR特異性反應(yīng)。圖IA顯示用五個(gè)單毒素試驗(yàn)測試細(xì)胞的5-試驗(yàn)柱狀圖。表3中示出這些研究中所用毒素的組成和濃度。在此柱狀圖中，將TR特異性反應(yīng)顯示為對HCT116 mTRdm-fLUC 12-16亞克隆#30細(xì)胞系重復(fù)三次(每柱三個(gè)樣本)進(jìn)行的三個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)(三個(gè)柱)。使用標(biāo)準(zhǔn)微量酶標(biāo)儀試驗(yàn)測定熒火蟲熒光素酶(fLUC)蛋白活性并表達(dá)為處理培養(yǎng)物與未處理培養(yǎng)物的比率(即，誘導(dǎo)倍數(shù))。每個(gè)柱代表超過1. 0的比率并指示表現(xiàn)TR依賴性翻譯的細(xì)胞。TPA單毒素試驗(yàn)產(chǎn)生TR調(diào)節(jié)翻譯的最顯著增加。圖IB示出由HCT116 mTRdm-fLUC 12-16亞克隆#38細(xì)胞系的三個(gè)重復(fù)樣本產(chǎn)生的TR特異性反應(yīng)的5-試驗(yàn)柱狀圖。這些結(jié)果強(qiáng)調(diào)了細(xì)胞反應(yīng)的幅度差異。圖IC示出HCTl 16 mTRdm-fLUC 12-16亞克隆#30細(xì)胞反應(yīng)的15-試驗(yàn)柱狀圖。如上所述，重復(fù)三次進(jìn)行所有試驗(yàn)。圖IC示出在組合TPA+泰素的二毒素試驗(yàn)中TR調(diào)節(jié)翻譯的極顯著增加，這在單毒素5-試驗(yàn)中未觀察到。圖ID顯示HCT116 mTRdm-fLUC 12-16亞克隆#38細(xì)胞系的15-試驗(yàn)柱狀圖。如前所述，在TPA+泰素處理的樣本中觀察到TR介導(dǎo)的翻譯的較大增加。這證實(shí)在所測試的毒素之中，使用單毒素試驗(yàn)程序，TPA或泰素產(chǎn)生最佳的TR特異性反應(yīng)。然而，在組合TPA+泰素處理中觀察到的TR反應(yīng)的較大增加證實(shí)TPA+ 泰素試驗(yàn)是所測試的二毒素組合中用于產(chǎn)生最大TR特異性翻譯增加的最佳毒素試驗(yàn)。圖2示出應(yīng)用毒素試驗(yàn)程序鑒定翻譯反應(yīng)HEK293細(xì)胞并把這些細(xì)胞指派到確定的類別。圖2A左圖示出由用mTRdm-fLUC表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的人胚腎HEK293細(xì)胞池所產(chǎn)生的TR反應(yīng)的15-試驗(yàn)柱狀圖。此圖中毒素的組成和濃度如表3中所描述。使用微量酶標(biāo)儀分析測定fLUC蛋白活性，將其表達(dá)為處理樣本與未處理樣本的比率(即，誘導(dǎo)倍數(shù))。 右圖示出表達(dá)人hTRdm-fLUC表達(dá)載體的HEK293細(xì)胞池的TR反應(yīng)的15-試驗(yàn)柱狀圖。圖2B示出由用小鼠mTRdm-fLUC (淺色柱)和人hTRdm-fLUC (深色柱)表達(dá)盒穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的HEK293細(xì)胞池產(chǎn)生的TR反應(yīng)的5-試驗(yàn)柱狀圖。這一直接比較顯示在對TR序列的幅度或毒素反應(yīng)上沒有物種特異性差異。圖2C示出對于來自HEK293 hTRdm-fLUC池的9個(gè)亞克隆的酶標(biāo)儀結(jié)果的例子。不用毒素(UNT)或用TPA單毒素試驗(yàn)(TPA)處理重復(fù)三次的樣本。對酶標(biāo)儀值求平均并表示為未處理樣本與處理樣本的比率(誘導(dǎo)倍數(shù))。對于具有統(tǒng)計(jì)上超出剩余兩個(gè)重復(fù)值的范圍的任何原始值的樣本，指派可疑反應(yīng)并在隨后試驗(yàn)中對這些樣本進(jìn)行再篩選(用問號標(biāo)注)。表現(xiàn)一致低值的樣本(處于或接近給定增益設(shè)定下的酶標(biāo)儀背景值)被視為無反應(yīng)性的并從任何繼續(xù)評估中去除(用XX標(biāo)注)。本實(shí)施例中，9個(gè)隨機(jī)樣本返回為6個(gè)反應(yīng)克隆(4. 1到17. 4的誘導(dǎo)倍數(shù)范圍)、2個(gè)可疑克隆和1個(gè)表現(xiàn)背景值的克隆。圖2D左表示出對于用TPA毒素試驗(yàn)處理的43個(gè)HEK293mTRdm-fLUC細(xì)胞亞克隆所觀察到的誘導(dǎo)倍數(shù)和它們的類別指派。右上圖示出43個(gè)HEK293 mTRdm-fLUC細(xì)胞亞克隆的呈等級順序(χ軸上從最低到最高)與誘導(dǎo)倍數(shù)(y軸)的函數(shù)形式的曲線圖，稱之為等級圖。右中圖示出去除了最大的異常值物種來突出具有較小翻譯反應(yīng)的反應(yīng)亞克隆的同一等級圖。右表示出使用所有等級圖結(jié)果的匯編來定義類別命名的類別指派。對于HEK293 mTRdm-fLUC細(xì)胞池，43個(gè)反應(yīng)者中有25個(gè)(58. 1% )顯示誘導(dǎo)倍數(shù)值在5. 0以下的低TR 特異性毒素反應(yīng)(稱之為I類細(xì)胞)，43個(gè)亞克隆中有13個(gè)(30.2%)表現(xiàn)II類表型(超過5.0到14.0的范圍)，而43個(gè)亞克隆中有5個(gè)(11.6%)表現(xiàn)III類表型(超過14.0 的誘導(dǎo)倍數(shù))。圖2E左表示出對于82個(gè)HEK293 hTRdm-fLUC細(xì)胞亞克隆所觀察到的誘導(dǎo)倍數(shù)和類別指派。右上圖示出82個(gè)HEK293 hTRdm-fLUC細(xì)胞亞克隆的等級圖。右表示出對于 HEK293 hTRdm-fLUC細(xì)胞池的類別指派。82個(gè)反應(yīng)者中有50個(gè)(61. 0% )顯示I類反應(yīng)， 82個(gè)亞克隆中有27個(gè)(32.9%)表現(xiàn)II類表型，并且82個(gè)亞克隆中有5個(gè)(6. 1%)表現(xiàn) III類表型。圖2F上圖是示出65個(gè)HEK293 mTRplp-fLUC亞克隆的等級圖。下表示出對于 HEK293 mTRplp-fLUC細(xì)胞池的類別指派。65個(gè)亞克隆中有51個(gè)(78.5%)是I類細(xì)胞，65 個(gè)中有13個(gè)0% )表現(xiàn)II類表型，并且65個(gè)中有1個(gè)(1. 5% )顯示III類反應(yīng)。圖2G上圖是示出39個(gè)HEK293 CMV-fLUC亞克隆反應(yīng)的等級圖。下表示出對于 HEK293 CMV-fLUC池的類別指派；39個(gè)亞克隆中有34個(gè)(87. 2% )顯示I類反應(yīng)，39個(gè)中有4個(gè)(10. 3% )表現(xiàn)II類表型，并且39個(gè)中有1個(gè)O. 6% )產(chǎn)生III類反應(yīng)。圖3示出應(yīng)用毒素試驗(yàn)程序鑒定翻譯反應(yīng)HEK293細(xì)胞并把這些細(xì)胞指派到確定的類別。圖3A上圖是由用小鼠mTRdm-gLUCfeaussia熒光素酶)表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的 HEK293細(xì)胞池在用TPA單毒素試驗(yàn)處理之后所產(chǎn)生的81個(gè)TR反應(yīng)的等級圖。下表示出對于HEK293 mTRdm-gLUC池的類別命名；81個(gè)亞克隆中有56個(gè)(69. 1% )顯示I類反應(yīng)， 81個(gè)亞克隆中有23個(gè)4% )表現(xiàn)II類表型，并且81個(gè)反應(yīng)者中有2個(gè)O. 5% )顯示 III類表型。圖;3B上圖是示出89個(gè)HEK293 hTRdm-gLUC亞克隆反應(yīng)的等級圖。下表示出對于 HEK293 hTRdm-gLUC池的類別指派；89個(gè)中有56個(gè)(62. 9% )顯示I類表型，89個(gè)中有30 個(gè)(33. 7% )顯示II類反應(yīng)，并且89個(gè)中有3個(gè)(3. 4% )表現(xiàn)III類反應(yīng)。圖3C上圖是示出來自HEK293 mTRplp-gLUC亞克隆的69個(gè)反應(yīng)的等級圖。下表示出對于HEK293 mTRplp-gLUC池的類別命名；69個(gè)中有58個(gè)(84. 1% )標(biāo)記為I類細(xì)胞， 69個(gè)中有9個(gè)(13. 0% )表現(xiàn)II類反應(yīng)，并且69個(gè)中有2個(gè)O. 9% )顯示III類表型。圖4示出應(yīng)用毒素試驗(yàn)程序鑒定翻譯反應(yīng)U20S細(xì)胞并把這些細(xì)胞指派到確定的類別。圖4A上圖是由用小鼠mTRdm-fLUC (熒火蟲熒光素酶)表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的人骨骼骨肉瘤U20S細(xì)胞池在用TPA單毒素試驗(yàn)處理之后所產(chǎn)生的106個(gè)TR反應(yīng)的等級圖。下表示出對于U20S mTRdm-fLUC池的類別命名；106個(gè)亞克隆中有95個(gè)(89.6%)顯示I類反應(yīng)，106個(gè)亞克隆中有11個(gè)(10.4%)表現(xiàn)II類表型，并且106個(gè)反應(yīng)者中有0個(gè)(0%) 顯示III類表型。圖4B上圖是示出82個(gè)U20S mTRplp-fLUC亞克隆反應(yīng)的等級圖。下表示出對于 U20S mTRplp-fLUC池的類別標(biāo)記；82個(gè)中有81個(gè)(98.8%)顯示I類表型，82個(gè)中有1個(gè)(1.2% )顯示II類反應(yīng)，并且82個(gè)中有0個(gè)(0% )表現(xiàn)III類反應(yīng)。圖4C上圖是示出來自U20S CMV-fLUC亞克隆的79個(gè)反應(yīng)的等級圖。下表示出對于U20S CMV-fLUC池的類別命名；79個(gè)中有78個(gè)(98. 7% )標(biāo)記為I類細(xì)胞，79個(gè)中有0 個(gè)(0%)展表現(xiàn)II類反應(yīng)，并且79個(gè)中有1個(gè)(1.2%)顯示III類表型。圖5顯示應(yīng)用毒素試驗(yàn)程序鑒定翻譯反應(yīng)MCF7細(xì)胞并把這些細(xì)胞指派到確定的類別。圖5A上圖是由用小鼠mTRdm-fLUC (熒火蟲熒光素酶)表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的人乳腺癌MCF7細(xì)胞池在用TPA單毒素試驗(yàn)處理之后所產(chǎn)生的11個(gè)TR反應(yīng)的等級圖。下表示出對于MCF7 mTRdm-fLUC池的類別命名；11個(gè)亞克隆中有6個(gè)(54.5%)顯示I類反應(yīng)，11 個(gè)亞克隆中有4個(gè)(36.4%)表現(xiàn)II類表型，并且11個(gè)反應(yīng)者中有1個(gè)(9. 1%)顯示III
類表型。圖5B上圖是示出36個(gè)MCF7 mTRplp-fLUC亞克隆反應(yīng)的等級圖。下表示出對于 MCF7 mTRplp-fLUC池的類別命名；36個(gè)中有31個(gè)(86. 1 % )顯示I類表型，36個(gè)中有3個(gè) (8.3% )顯示II類反應(yīng)，并且36個(gè)中有2個(gè)(5. 6% )表現(xiàn)III類反應(yīng)。圖5C上圖是示出來自MCF7 CMV-fLUC亞克隆的50個(gè)反應(yīng)的等級圖。下表示出對于MCF7 CMV-fLUC池的類別命名；50個(gè)中有45個(gè)(90.0% )標(biāo)記為I類細(xì)胞，50個(gè)中有5 個(gè)(10. 0% )表現(xiàn)II類反應(yīng)，并且79個(gè)中有0個(gè)(0% )顯示III類表型。圖5D上圖是示出由MCF7 hTRdm-fLUC亞克隆產(chǎn)生的89個(gè)反應(yīng)的等級圖。下表示出對于MCF7 hTRdm-fLUC池的類別命名；89個(gè)中有68個(gè)(76. 4% )標(biāo)記為I類細(xì)胞，89個(gè)中有17個(gè)(19.1%)表現(xiàn)II類表型，并且89個(gè)中有4個(gè)顯示III類反應(yīng)。圖5E上圖是示出由在MCF7轉(zhuǎn)染池的二次篩選中分離的MCF7mTRdm_fLUC亞克隆所產(chǎn)生的92個(gè)反應(yīng)的等級圖。下表示出對于二次MCF7 mTRdm-fLUC池的類別命名；92個(gè)中有27個(gè)09.3%)標(biāo)記為I類細(xì)胞，92個(gè)中有19個(gè)7%)表現(xiàn)II類表型，并且92 個(gè)中有46個(gè)(50. 0% )顯示III類反應(yīng)。圖6顯示應(yīng)用毒素試驗(yàn)程序鑒定翻譯反應(yīng)DU145細(xì)胞并把這些細(xì)胞指派到確定的類別。圖6A上圖是由用小鼠mTRdm-fLUC (熒火蟲熒光素酶)表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的人前列腺癌DU145細(xì)胞池的初級篩選在用TPA毒素試驗(yàn)處理之后所產(chǎn)生的22個(gè)TR反應(yīng)的等級圖。下表示出對于DU145 mTRdm-fLUC池的類別命名；22個(gè)亞克隆中有5個(gè)7% )顯示I類反應(yīng)，22個(gè)亞克隆中有13個(gè)(59. 1 % )表現(xiàn)II類反應(yīng)，并且22個(gè)反應(yīng)者中有4個(gè) (18. 2% )顯示III類表型。圖6B上圖是示出由在DU145轉(zhuǎn)染池的二次篩選中分離的DU145mTRdm_fLUC亞克隆所產(chǎn)生的65個(gè)反應(yīng)的等級圖。下表示出對于二次DU145mTRdm-fLUC池的類別命名；65個(gè)中有10個(gè)(15.4%)標(biāo)記為I類細(xì)胞，65個(gè)中有33個(gè)(50.8%)表現(xiàn)II類表型，并且65 個(gè)中有22個(gè)(33. 8% )顯示III類反應(yīng)。圖6C上圖是示出來自DU145 CMV-fLUC亞克隆的初級篩選的16個(gè)反應(yīng)的等級圖。 下表示出對于DU145 CMV-fLUC池的類別命名；16個(gè)中有14個(gè)(87. 5% )標(biāo)記為I類細(xì)胞， 16個(gè)中有2個(gè)(12. 5% )表現(xiàn)II類反應(yīng)，并且16個(gè)中有0個(gè)(0% )顯示III類表型。圖6D上圖是示出由在DU145轉(zhuǎn)染池的二次篩選中分離的DU145CMV_fLUC亞克隆所產(chǎn)生的55個(gè)反應(yīng)的等級圖。下表示出對于二次DU145CMV-fLUC池的類別命名；55個(gè)中有30個(gè)(54.5%)標(biāo)記為I類細(xì)胞，55個(gè)中有22個(gè)00.0%)表現(xiàn)II類表型，并且55個(gè)中有3個(gè)(5. 5% )顯示III類反應(yīng)。圖7顯示應(yīng)用毒素試驗(yàn)程序鑒定翻譯反應(yīng)HCTl 16細(xì)胞并把這些細(xì)胞指派到確定的類別。圖7A上圖是由用小鼠mTRdm-fLUC (熒火蟲熒光素酶)表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的人結(jié)腸直腸癌HCTl 16細(xì)胞池的初級篩選在用dbcAMP(圖7A-C)和TPA (圖7D-E)單毒素試驗(yàn)處理之后所產(chǎn)生的21個(gè)TR反應(yīng)的等級圖。下表示出對于HCT116 mTRdm-fLUC池的類別命名； 21個(gè)亞克隆中有20個(gè)(95.2%)顯示I類反應(yīng)，21個(gè)亞克隆中有1個(gè)表現(xiàn)II類表型，并且21個(gè)反應(yīng)者中有0個(gè)(0%)顯示III類表型。圖7B上圖是示出12個(gè)HCT116 mTRplp-fLUC亞克隆反應(yīng)的等級圖。下表示出對于HCT116 mTRplp-fLUC池的類別命名；12個(gè)中有11個(gè)(91.7%)顯示I類表型，12個(gè)中有0個(gè)(0% )顯示II類反應(yīng)，并且12個(gè)中有1個(gè)(8. 3% )表現(xiàn)III類反應(yīng)。圖7C上圖是示出來自HCT116 CMV-fLUC亞克隆的6個(gè)反應(yīng)的等級圖。下表示出對于HCTl 16 CMV-fLUC池的類別命名；6個(gè)中有6個(gè)(100.0%)標(biāo)記為I類細(xì)胞，6個(gè)中有 0個(gè)(0% )表現(xiàn)II類反應(yīng)，并且6個(gè)中有0個(gè)(0% )顯示III類表型。圖7D上圖是示出由在HCT116轉(zhuǎn)染池的二次篩選中分離的HCT116mTRdm_fLUC亞克隆所產(chǎn)生的39個(gè)反應(yīng)的等級圖。下表示出對于二次HCT116 mTRdm-fLUC池的類別命名； 39個(gè)中有四個(gè)(74.4%)標(biāo)記為I類細(xì)胞，39個(gè)中有8個(gè)5% )表現(xiàn)II類表型，并且 39個(gè)中有2個(gè)(5. )顯示III類反應(yīng)。圖7E上圖是示出來自HCT116 hTRdm-fLUC亞克隆的21個(gè)反應(yīng)的等級圖。下表示出對于HCTl 16 hTRdm-fLUC池的類別命名；21個(gè)中有10個(gè)07.6%)歸為I類，21個(gè)中有 7個(gè)(33. 4% )表現(xiàn)II類反應(yīng)，并且21個(gè)中有4個(gè)(19. 0% )顯示III類表型。圖8顯示應(yīng)用毒素試驗(yàn)程序鑒定翻譯反應(yīng)MDA231細(xì)胞并把這些細(xì)胞指派到確定的類別。圖8A上圖是由用小鼠mTRdm-fLUC (熒火蟲熒光素酶)表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的人乳腺癌MDA231細(xì)胞池在用dbcAMP單毒素試驗(yàn)處理之后所產(chǎn)生的9個(gè)TR反應(yīng)的等級圖。下表示出對于MDA231 mTRdm-fLUC池的類別命名；9個(gè)亞克隆中有9個(gè)(100.0% )顯示I類反應(yīng)，9個(gè)亞克隆中有0個(gè)(0% )表現(xiàn)II類反應(yīng)，并且9個(gè)反應(yīng)者中有0個(gè)(0% )顯示III
類表型。圖8B上圖是示出33個(gè)MDA231 mTRplp-fLUC亞克隆反應(yīng)的等級圖。下表示出對于MDA231 mTRplp-fLUC池的類別命名；33個(gè)中有33個(gè)(100.0%)顯示I類表型，33個(gè)中有0個(gè)(0% )顯示II類反應(yīng)，并且33個(gè)中有0個(gè)(0% )表現(xiàn)III類反應(yīng)。圖8C上圖是示出來自MDA231 CMV-fLUC亞克隆的17個(gè)反應(yīng)的等級圖。下表示出對于MDA231 CMV-fLUC池的類別命名；17個(gè)中有17個(gè)(100. 0% )標(biāo)記為I類細(xì)胞，17個(gè)中有0個(gè)(0%)表現(xiàn)II類反應(yīng)，并且17個(gè)中有0個(gè)(0%)顯示III類表型。圖9顯示應(yīng)用毒素試驗(yàn)程序鑒定翻譯反應(yīng)H印G2細(xì)胞并把這些細(xì)胞指派到確定的類別。圖9A示出由用CMV-fLUC、mTRplp-fLUC和mTRdm-fLUC表達(dá)載體(從左到右)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的人肝臟肝細(xì)胞癌HepG2細(xì)胞池在用TPA單毒素試驗(yàn)處理之后所產(chǎn)生的fLUC活性的柱狀圖。圖9B上圖是由用mTRdm-fLUC (熒火蟲熒光素酶)表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的人肝臟肝細(xì)胞癌ifepG2細(xì)胞池在用TPA單毒素試驗(yàn)處理之后所產(chǎn)生的5個(gè)TR反應(yīng)的等級圖。下表示出對于H印G2 mTRdm-fLUC池的類別命名；5個(gè)亞克隆中有0個(gè)(0%)顯示I類反應(yīng)，5個(gè)亞克隆中有3個(gè)(60. 0% )表現(xiàn)II類表型，并且5個(gè)反應(yīng)者中有2個(gè)0% )顯示III
類表型。圖9C示出由H印G2 mTRdm-fLUC#16亞克隆所產(chǎn)生的TR反應(yīng)的15-試驗(yàn)柱狀圖。 此圖中毒素的組成和濃度如表3中所描述。使用微量酶標(biāo)儀分析測定fLUC蛋白活性，將其表達(dá)為處理樣本與未處理樣本的比率(即，誘導(dǎo)倍數(shù))。在TPA+泰素的二毒素試驗(yàn)中觀察到fLUC活性的較大增加，這證實(shí)TPA+泰素處理是用于產(chǎn)生最大幅度TR特異性翻譯反應(yīng)的
最佳毒素試驗(yàn)。圖10示出對確定類別的細(xì)胞系應(yīng)用15-試驗(yàn)程序。圖IOA示出經(jīng)歷15-試驗(yàn)程序的U20S mTRdm-fLUC #40 (淺色柱)和#109 (深色柱)亞克隆的柱狀圖。使用單毒素試驗(yàn)在圖4中對兩個(gè)亞克隆指派II類命名，但使用如實(shí)施例中所描述的細(xì)胞計(jì)數(shù)接種程序進(jìn)行再分析。此圖中毒素的組成和濃度如表3中所描述。兩個(gè)亞克隆繼續(xù)表現(xiàn)II類反應(yīng)。應(yīng)注意，圖10中的Y軸顯示為未處理對照的誘導(dǎo)百分比，而非先前圖中的誘導(dǎo)倍數(shù)?？赏ㄟ^用百分比除以100來把誘導(dǎo)百分比變換為誘導(dǎo)倍數(shù)(例如，對照的1000%是10倍誘導(dǎo))。圖IOB示出使用細(xì)胞計(jì)數(shù)接種程序?qū)λ膫€(gè)HCT116 mTRdm-fLUC亞克隆進(jìn)行再分析的柱狀圖。使用亞最佳單毒素試驗(yàn)，先前已在圖7中對這些亞克隆指派I類命名。此柱狀圖說明由用TPA+泰素的二毒素試驗(yàn)處理的HCT116 mTRdm-fLUC 12-15、12_3、7_5和12-16 亞克隆(從左到右)在15-試驗(yàn)程序中所產(chǎn)生的增強(qiáng)TR反應(yīng)。HCT116 mTRdm-fLUC 12-15 和12-3亞克隆繼續(xù)表達(dá)I類表型，而HCT116 mTRdm-fLUC 7_5和12-16亞克隆顯示III類表型。圖IOC示出使用細(xì)胞計(jì)數(shù)接種程序?qū)θ齻€(gè)HCT116 mTRplp-fLUC亞克隆進(jìn)行再分析的柱狀圖。使用亞最佳單毒素試驗(yàn)，在圖7B中對這些細(xì)胞指派I類命名。此柱狀圖說明在15-試驗(yàn)程序中由HCTl 16 mTRplp-fLUCll-20、3-ll和3-9亞克隆(從左到右)所產(chǎn)生的增強(qiáng)TR反應(yīng)。HCT116mTRplp-fLUC 11-20亞克隆在TPA+泰素的二毒素試驗(yàn)中表達(dá)II類表型，而HCT116 mTRplp-fLUC 3_11和3_9亞克隆在TPA+泰素的二毒素試驗(yàn)中表現(xiàn)III類反應(yīng)。圖IOD示出使用細(xì)胞計(jì)數(shù)接種程序?qū)蓚€(gè)HCT116 CMV-fLUC亞克隆進(jìn)行再分析的柱狀圖，使用亞最佳單毒素試驗(yàn)已在圖7C中對所述兩個(gè)亞克隆指派I類命名。此柱狀圖說明在15-試驗(yàn)程序中由HCT116CMV-fLUC 4-1和4_20亞克隆所產(chǎn)生的fLUC活性(從左到右)。在TPA+泰素的二毒素試驗(yàn)中HCTl 16 CMV-fLUC 4_1亞克隆繼續(xù)表達(dá)I類表型，而 HCTl 16 CMV-fLUC 4_20亞克隆表現(xiàn)II類反應(yīng)。圖IOE示出使用細(xì)胞計(jì)數(shù)接種程序?qū)λ膫€(gè)MDA231 mTRdm-fLUC亞克隆進(jìn)行再分析的柱狀圖。使用亞最佳單毒素試驗(yàn)，先前在圖8A中對這些細(xì)胞指派I類命名。此柱狀圖說明在15-試驗(yàn)方案中由MDA231mTRdm-fLUC 4-23、4_8、4_7和3_1亞克隆(從左到右)所產(chǎn)生的TR反應(yīng)。在TPA+泰素的二毒素試驗(yàn)中，MDA231 mTRdm-fLUC 4-23,4-8和4_7亞克隆繼續(xù)顯示I類表型，而MDA231 mTRdm-fLUC 3-1亞克隆表現(xiàn)II類反應(yīng)。圖IOF示出使用細(xì)胞計(jì)數(shù)接種程序?qū)λ膫€(gè)MDA231 mTRplp-fLUC亞克隆進(jìn)行再分析的柱狀圖。使用亞最佳單毒素試驗(yàn)，先前在圖8B中對這些細(xì)胞指派I類命名。此柱狀圖說明在15-試驗(yàn)程序中由MDA23ImTRplp-fLUC 3_12、5_2、5_13和2_17亞克隆(從左到右) 所產(chǎn)生的TR反應(yīng)。在TPA+泰素的二毒素試驗(yàn)中，MDA231 mTRplp-fLUC 3_12、5_2和5-13 亞克隆僅表達(dá)I類表型，而MDA231 mTRplp-fLUC 2-17亞克隆表現(xiàn)II類反應(yīng)。圖IOG示出使用細(xì)胞計(jì)數(shù)接種程序?qū)θ齻€(gè)MDA231 CMV-fLUC亞克隆進(jìn)行再分析的柱狀圖。使用亞最佳單毒素試驗(yàn)，先前在圖8C中對這些細(xì)胞指派I類命名。此柱狀圖說明在15-試驗(yàn)方案中由MDA231 CMV-fLUC 1-2U2-5和1_20亞克隆(從左到右)所產(chǎn)生的 fLUC活性。雖然MDA231CMV-fLUC 1-21,2-5和1-20亞克隆表現(xiàn)增加的fLUC水平，但每個(gè)亞克隆仍表達(dá)I類表型。圖11示出用于通過集落形成和亞克隆來恢復(fù)確定類別的表型的方案。圖IlA左圖是由從II類MDA231 mTRplp-fLUC 2-17細(xì)胞系(用TPA單毒素試驗(yàn)處理)分離的113個(gè)二次亞克隆所產(chǎn)生的等級圖。如實(shí)施例中所描述分離亞克隆。等級圖示出TR反應(yīng)為等級順序(χ軸上從最低到最高)與誘導(dǎo)倍數(shù)(y軸)的函數(shù)。虛線是如圖 IOF中所示的TPA特異性TR反應(yīng)。顯著比例的亞克隆顯示相對于親代細(xì)胞系的TR反應(yīng)的增加。雖然大多數(shù)亞克隆表現(xiàn)II類TR活性，但仍有一小比例表現(xiàn)III類反應(yīng)。右圖是使用泰素單毒素試驗(yàn)對113個(gè)MDA231 mTRplp-fLUC 2_17亞克隆的分析。虛線示出來自圖IOF 的泰素特異性TR活性。如上所述，顯著比例的亞克隆顯示II類表型，但一個(gè)亞組產(chǎn)生III 類反應(yīng)。兩個(gè)箭頭指示在每個(gè)試驗(yàn)中的最大反應(yīng)亞克隆是相同細(xì)胞系。圖IlB左圖是由從III類HCT116 mTRdm-fLUC 12-16細(xì)胞系(用TPA單毒素試驗(yàn)處理)分離的70個(gè)二次亞克隆所產(chǎn)生的等級圖。虛線是如圖IOB中所示的TPA特異性TR 反應(yīng)。大部分亞克隆顯示III類TR活性，其中一小群表現(xiàn)與親代細(xì)胞相比顯著較大的TR 反應(yīng)。右圖是使用泰素單毒素試驗(yàn)對相同的70個(gè)HCTl 16 mTRdm-fLUC 12-16亞克隆的分析。虛線示出來自圖IOB的泰素特異性TR活性。所有亞克隆都顯示III類反應(yīng)，其中一個(gè)顯著比例表現(xiàn)與親代細(xì)胞系相比增強(qiáng)的TR活性。圖IlC示出從MCF7 mTRplp-fLUC#43細(xì)胞系(用泰素單毒素試驗(yàn)處理)分離的95 個(gè)二次亞克隆的等級圖。在圖5B中對MCF7 11^1^1 -江肌#43細(xì)胞系指派111類命名。虛線是在15-試驗(yàn)程序中(未顯示)由親代細(xì)胞系所產(chǎn)生的TPA特異性TR反應(yīng)。一定比例的二次亞克隆清楚地表現(xiàn)大于親代細(xì)胞系的III類表型。圖IlD示出從MCF7 mTRdm-fLUC#64細(xì)胞系(用泰素單毒素試驗(yàn)處理)分離的22 個(gè)二次亞克隆的等級圖。在圖5A中對MCF7 11^1 (1111-江肌#64細(xì)胞系給定111類命名。虛線是在15-試驗(yàn)方案中(未顯示)由親代細(xì)胞系所產(chǎn)生的泰素特異性TR反應(yīng)。大多數(shù)二次亞克隆保留III類表型，并且顯著比例顯示與親代細(xì)胞系相比增強(qiáng)的TR活性。圖12示出通過對表達(dá)盒中的抗生素抗性標(biāo)記物進(jìn)行再選擇來恢復(fù)確定類別的表型的結(jié)果。圖12A示出先前均被指派III類表型的4個(gè)HCT116亞克隆的柱狀圖。HCT116 mTRdm-fLUC 7-2 和 12-16 是初級 HCT116 分離株。HCT116mTRdm-fLUC 亞克隆 #30 和亞克隆#38是從12-16原代細(xì)胞系分離的高反應(yīng)二次亞克隆(圖11B)。淺色柱示出用TPA+泰素的二毒素試驗(yàn)處理的高傳代細(xì)胞系(P10-P20)。深色柱是用G418進(jìn)行再選擇以去除分離TR 表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)胞的相同培養(yǎng)物，其也已經(jīng)用TPA+泰素的二毒素試驗(yàn)處理過。為進(jìn)行比較， 利用最右側(cè)的柱來示出由70個(gè)二次12-16亞克隆(圖11B)產(chǎn)生的平均反應(yīng)。下表示出在再選擇之后所觀察到的TR特異性活性的高度顯著性增加。圖12B示出由用TPA單毒素試驗(yàn)處理過的所述細(xì)胞系所產(chǎn)生的TR活性的柱狀圖。 下表示出在再選擇過程之后的TR特異性反應(yīng)的高度顯著性增加。圖13示出通過機(jī)械操縱對基礎(chǔ)的非帽依賴性翻譯的調(diào)節(jié)。圖13A示出由使用匯合(淺色柱)和細(xì)胞計(jì)數(shù)(深色柱)程序接種的未處理 MDA231細(xì)胞系所產(chǎn)生的基礎(chǔ)翻譯活性的柱狀圖。把三個(gè)MDA231CMV-fLUC細(xì)胞系(1_21、
2-5、1-20)與四個(gè)mTRplp-fLUC(2-17、3-12、5-2、5-13)和四個(gè) mTRdm-fLUC 細(xì)胞系(4-23,
3-1、4-8、4-7)進(jìn)行比較。將細(xì)胞裂解，不用毒素處理進(jìn)行分析，并把酶標(biāo)儀值作為相對光單位繪圖。大體上，每種細(xì)胞系都顯示，相比于細(xì)胞計(jì)數(shù)方案(其產(chǎn)生分匯合的有絲分裂細(xì)胞培養(yǎng)物)，匯合接種程序(其使每平方厘米培養(yǎng)面積的細(xì)胞數(shù)最大化并導(dǎo)致產(chǎn)生匯合的有絲分裂后細(xì)胞培養(yǎng)物)導(dǎo)致顯著更高的基礎(chǔ)fLUC水平。圖1 示出相同未處理細(xì)胞的柱狀圖，其中去除了 CMV結(jié)果來通過圖解強(qiáng)化TR表達(dá)細(xì)胞系中的較低值。如前所述，大體趨勢是匯合接種方法把更多細(xì)胞引入試驗(yàn)中并增加了基礎(chǔ)水平的fLUC活性；然而，兩個(gè)細(xì)胞系(mTRplp-fLUC 5_2和mTRdm-fLUC 4-8)在通過細(xì)胞計(jì)數(shù)程序接種的未處理細(xì)胞中表現(xiàn)增強(qiáng)的fLUC活性。圖14示出在標(biāo)準(zhǔn)毒素試驗(yàn)中所產(chǎn)生的TR特異性報(bào)告蛋白活性與TR來源的翻譯蛋白的相關(guān)性。圖14A上圖示出由從III類HCT116 mTRdm-fLUC 7-5亞克隆制備的細(xì)胞提取物所產(chǎn)生的fLUC活性的15-試驗(yàn)柱狀圖。下圖示出用來指派III類命名的HCT116 mTRdm-fLUC 7-5細(xì)胞系的15-試驗(yàn)柱狀圖。在每個(gè)試驗(yàn)中檢驗(yàn)相等數(shù)量的細(xì)胞。圖14B示出使用抗熒火蟲熒光素酶抗體顯現(xiàn)的上述15-試驗(yàn)細(xì)胞提取物的 Western免疫印跡。在每個(gè)凝膠泳道中分析等量的總蛋白質(zhì)。圖14C示出對Western免疫印跡上的譜帶強(qiáng)度的光密度測定分析的柱狀圖。高譜帶強(qiáng)度處在X光片反應(yīng)的線性范圍之外并產(chǎn)生與直接細(xì)胞測定值相比的較低值。圖15示出TR特異性報(bào)告蛋白活性與TR來源的翻譯產(chǎn)物的相關(guān)性。圖15A示出重組fLUC蛋白濃度(Sigma)作為相對光單位的函數(shù)的劑量反應(yīng)曲線圖。對于此曲線圖，制備fLUC蛋白的連續(xù)稀釋液并使用標(biāo)準(zhǔn)酶標(biāo)儀程序進(jìn)行測定。圖15B示出使用15-試驗(yàn)程序，從III類HCT116 mTRdm-fLUC 12-16亞克隆制備的細(xì)胞提取物的表。從每個(gè)提取物中取固定細(xì)胞數(shù)(總細(xì)胞數(shù)的1/10)并在酶標(biāo)儀試驗(yàn)中測定。由每個(gè)樣本提取物產(chǎn)生的相對光單位可通過圖解與圖15A中的已知蛋白質(zhì)濃度進(jìn)行比較。對于用確定的毒素試驗(yàn)處理6小時(shí)的III類HCT116 mTRdm-fLUC 12-16細(xì)胞，使用總細(xì)胞數(shù)的1/10來確定fLUC蛋白濃度，并變換成定義為光單位/ μ g fLUC蛋白的比活性。圖15C是由用15-試驗(yàn)程序處理的HCTl 16 mTRdm-fLUC 12-16細(xì)胞所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)提取物的Western免疫印跡。譜帶強(qiáng)度(fLUC蛋白水平)與上面計(jì)算的蛋白質(zhì)濃度良好相關(guān)。在每個(gè)凝膠泳道中分析等量的總蛋白質(zhì)。
圖 16-25 分別是質(zhì)粒 pCMV-gLuc、pCMV-fLuc、phTRdm-fLuc、phTRdm-gLuc、 phTRplp-fLuc、phTRplp-gLuc、pmTdm-fLuc、pmTRdm-gLuc、pmTRplp-fLuc 禾口 pmTRplp-gLuc 的示意圖。功能性質(zhì)粒元件(限制性酶位點(diǎn)、復(fù)制起點(diǎn)、開放閱讀框等)按需要用豎線、框和箭頭表示。mDM =鼠 DM20 cDNA ；mP =鼠 PLP cDNA ；mTRd =鼠 TRdm ；mTRp =鼠 TRplp ；hDM =人 DM20 ；hP =APLP ；hTRd =人 TRdm，hTRp =人 TRpIp，fLuc =熒火蟲熒光素酶；gLuc = Gaussia焚光素酶。圖沈是鼠與人PLP/DM20編碼序列和其TR元件的序列比對圖。關(guān)鍵詞mDM =鼠 DM20 cDNA;mP =鼠 PLP cDNA ;mTRd =鼠 TRdm[SEQ ID NO 1] ；mTRp =鼠 TRplp [SEQ ID NO: 2] ；hDM=人 DM20 ；hP=人 PLP ；hTRd =人 TRdm [SEQ ID NO 3]和 hTRp =人 TRplp [SEQ ID NO 4]。因?yàn)镈M20序列省略了全長PLP編碼序列中存在的一部分序列，所以圖沈中DM20 序列的編號是不連續(xù)的，并且在省略的區(qū)段之后，DM20編號在比對序列的下面顯示為連續(xù)的。在參照圖26描述本文的序列時(shí)，在一些情況下利用對PLP/DM20核苷酸位置的雙重編碼，例如殘基560/455 ；此用法指在替代者中的PLP和DM20編碼，其中PLP編碼如比對序列上面所示，并且DM20編碼如比對序列下面所示。圖27示出應(yīng)用毒素試驗(yàn)程序來在MCF7乳腺癌細(xì)胞中區(qū)分蛋白激酶C(H(C)激活劑組(屬特異性分子靶)內(nèi)的毒素特異性影響(種特異性毒素作用)。圖27A示出劑量反應(yīng)試驗(yàn)，其中用不同劑量的TPA(劑量范圍InM到500nM)處理 MCF7 CMV-fLuc亞克隆#44和#48的三個(gè)重復(fù)樣本。在暴露于單毒素TPA試驗(yàn)6小時(shí)之后， 將細(xì)胞裂解并使用標(biāo)準(zhǔn)微量酶標(biāo)儀試驗(yàn)測定fLuc蛋白活性。對原始值求平均并表示為處理樣本與未處理樣本的比率(誘導(dǎo)倍數(shù))。兩個(gè)細(xì)胞系都顯示fLuc蛋白合成隨著TPA濃度增加的線性增加，在IOOnM TPA劑量下達(dá)到最大報(bào)告蛋白水平。隨后使用此TPA濃度作為圖27B中所示的苔蘚抑制素1和苔蘚抑制素2試驗(yàn)的對照。圖27B示出劑量反應(yīng)曲線，其中在單毒素試驗(yàn)中用IOOnM TPA，或用不同劑量的苔蘚抑制素1 (500pM到500nM的劑量范圍)(上圖)或苔蘚抑制素2 (InM到2. 5uM的劑量范圍)(下圖)處理MCF7 CMV-fLuc亞克隆#44和#48的三個(gè)重復(fù)樣本。虛線代表由IOOnM TPA單毒素試驗(yàn)所產(chǎn)生的翻譯反應(yīng)水平。苔蘚抑制素1的濃度(上圖)涵蓋圖27A中所用的TPA濃度。雖然在IOOnM苔蘚抑制素1試驗(yàn)中觀察到最大翻譯反應(yīng)，但報(bào)告蛋白活性的幅度從未達(dá)到由IOOnM TPA試驗(yàn)所產(chǎn)生的fLuc活性水平。苔蘚抑制素2劑量反應(yīng)曲線(下圖)采用更高的藥物濃度(最大測試劑量是TPA和苔蘚抑制素1最大量的5倍)。在最高測試劑量下(2. 5uM)，苔蘚抑制素2產(chǎn)生與用IOOnM TPA所觀察到的水平相一致的fLuc活性。圖27C示出劑量反應(yīng)曲線，其中用不同劑量的TPA (InM到500nM)處理MCF7 mTRdm-fLuc亞克隆#8、#27和#45的三個(gè)重復(fù)樣本以定義TR翻譯反應(yīng)。在用TPA單毒素試驗(yàn)培養(yǎng)6小時(shí)之后，將細(xì)胞裂解并使用標(biāo)準(zhǔn)微量酶標(biāo)儀試驗(yàn)測定fLuc蛋白活性。對酶標(biāo)儀值求平均并表示為處理樣本與未處理樣本的比率(誘導(dǎo)倍數(shù))。所有細(xì)胞系都顯示fLuc 蛋白活性隨著TPA濃度增加的線性增加，在IOOnM TPA劑量下達(dá)到峰值。使用此TPA濃度作為圖27D中所示的苔蘚抑制素1和苔蘚抑制素2試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)。圖27D示出劑量反應(yīng)曲線，其中在單毒素試驗(yàn)中用IOOnM TPA或用不同劑量的苔蘚抑制素1 (500pM到500nM的劑量范圍)(上圖)或苔蘚抑制素2 (InM到2. 5uM的劑量范
20圍)(下圖)處理MCF7 mTRdm-fLuc亞克隆#8、#27和#45的三個(gè)重復(fù)樣本。和圖27B — 樣，虛線代表在每個(gè)細(xì)胞系中由IOOnM TPA試驗(yàn)所達(dá)到的翻譯反應(yīng)水平。苔蘚抑制素1的濃度(上圖)涵蓋圖27C中所示的TPA劑量反應(yīng)曲線，并且在IOOnM苔蘚抑制素1試驗(yàn)中表現(xiàn)最大活性。雖然苔蘚抑制素2試驗(yàn)(下圖)覆蓋甚至更大的濃度范圍，但在相似劑量下，TR特異性表達(dá)水平與苔蘚抑制素1沒有顯著差異。苔蘚抑制素1和苔蘚抑制素2試驗(yàn)中的翻譯反應(yīng)的幅度從未達(dá)到在IOOnMTPA測試中所產(chǎn)生的fLuc活性。在此研究和其它類似工作中，IOOnM TPA、苔蘚抑制素1和苔蘚抑制素2單毒素試驗(yàn)之間的翻譯差異在非帽依賴性試驗(yàn)中比圖27B中的帽依賴性試驗(yàn)中大得多。帽依賴性試驗(yàn)與非帽依賴性試驗(yàn)之間的進(jìn)一步差異是觀察到增加的苔蘚抑制素2濃度(最大TPA劑量的5倍)從未產(chǎn)生與IOOnM TPA試驗(yàn)相當(dāng)?shù)膄LUC活性。因此，毒素試驗(yàn)程序可檢測到激活PKC活性的化合物在帽依賴性翻譯與非帽依賴性翻譯之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異。圖觀示出使用單毒素與組合毒素試驗(yàn)來在MCF7乳腺癌細(xì)胞中區(qū)分拓?fù)洚悩?gòu)酶I 抑制劑屬(喜樹堿藥物種類)內(nèi)的毒素特異性翻譯反應(yīng)。這些結(jié)果還提供不具有對蛋白質(zhì)翻譯有先前已知作用的物質(zhì)的例子，其選擇性地降低翻譯。圖28A示出用不同劑量(IOnM到IOuM的范圍)的下列拓?fù)洚悩?gòu)酶1抑制劑處理的MCF7 CMV-fLuc亞克隆#65的劑量反應(yīng)試驗(yàn)。喜樹堿、拓?fù)涮婵怠⒁亮⑻婵岛汪敱忍婵怠?在單毒素試驗(yàn)中孵育6小時(shí)之后，將細(xì)胞裂解并使用標(biāo)準(zhǔn)微量酶標(biāo)儀試驗(yàn)測定fLuc蛋白活性。對酶標(biāo)儀值求平均并表示為處理樣本與未處理樣本的比率(誘導(dǎo)倍數(shù))。虛線代表未處理細(xì)胞樣本中翻譯反應(yīng)的水平。喜樹堿和魯比替康顯示類似的劑量反應(yīng)，其中fLuc蛋白質(zhì)表達(dá)在 IuM時(shí)達(dá)到峰值，而在更高劑量下下降到基礎(chǔ)水平。相比之下，拓?fù)涮婵岛鸵亮⑻婵翟趩味舅卦囼?yàn)中都沒有顯著改變帽依賴性翻譯。圖28B示出使用組合試驗(yàn)來檢驗(yàn)拓?fù)洚悩?gòu)酶1抑制劑對帽依賴性翻譯的影響。在利用恒定的IOOnM TPA劑量的二毒素試驗(yàn)中使用不同劑量的拓?fù)洚悩?gòu)酶1抑制劑(IOnM到 IOuM的范圍)對MCF7 CMV-fLuc亞克隆#65進(jìn)行一系列劑量反應(yīng)試驗(yàn)。對酶標(biāo)儀值求平均并表示為處理樣本與未處理樣本的比率(誘導(dǎo)倍數(shù))。虛線代表未處理樣本中翻譯反應(yīng)的水平。按照類似方式，喜樹堿和魯比替康與TPA協(xié)同作用來增加fLUC蛋白活性直到IuM劑量，但在更高濃度下僅表現(xiàn)fLUC活性的最低增加，而伊立替康未產(chǎn)生TPA特異性翻譯反應(yīng)的任何顯著變化，拓?fù)涮婵祪H在高劑量(即，5uM和IOuM)顯示TPA抑制作用。圖28C示出使用單毒素試驗(yàn)來在MCF7細(xì)胞中測定拓?fù)洚悩?gòu)酶1抑制劑對非帽依賴性翻譯的影響。用不同濃度(IOnM到IOuM的范圍)的拓?fù)洚悩?gòu)酶1抑制劑(喜樹堿、魯比替康、伊立替康和拓?fù)涮婵?處理MCF7mTRdm-fLuc亞克隆#27的三個(gè)重復(fù)樣本。對酶標(biāo)儀值求平均并表示為處理樣本與未處理樣本的比率(誘導(dǎo)倍數(shù))。虛線代表未處理對照中翻譯反應(yīng)的水平。四種化合物均在低劑量下(IOnM和IOOnM)刺激非帽依賴性翻譯，但只有喜樹堿、魯比替康和拓?fù)涮婵翟谳^高劑量下(5uM和IOuM)表現(xiàn)降低的fLUC活性。具體來說，在高濃度喜樹堿和魯比替康試驗(yàn)中的fLUC活性導(dǎo)致蛋白質(zhì)水平低于未處理的對照細(xì)胞(< 100% )。這些結(jié)果與伊立替康在所有測試濃度下都表現(xiàn)恒定量的fLUC活性形成對比。圖28D示出對用IOOnM TPA加不同劑量(IOnM到IOuM的范圍)的拓?fù)洚悩?gòu)酶1 抑制劑處理的MCF7 mTRdm-fLuc亞克隆#27使用二毒素組合試驗(yàn)。對酶標(biāo)儀值求平均并表示為處理樣本與未處理樣本的比率(誘導(dǎo)倍數(shù))。虛線代表未處理樣本中翻譯反應(yīng)的水平。 四種抑制劑在IOnM 二毒素試驗(yàn)中均與TPA協(xié)同作用來增加蛋白質(zhì)活性。然而在較高的抑制劑濃度下，喜樹堿、魯比替康和拓?fù)涮婵缔卓筎PA活性并表現(xiàn)降低的fLUC表達(dá)。對于喜樹堿和魯比替康，在IOuM 二毒素試驗(yàn)中的這一拮抗作用導(dǎo)致fLUC蛋白水平低于未處理對照細(xì)胞(<100% )。在最高劑量下，拓?fù)涮婵当憩F(xiàn)基礎(chǔ)水平的表達(dá)。相比之下，伊立替康二毒素試驗(yàn)顯示與TPA的協(xié)同作用以及在所有測試劑量下增強(qiáng)的fLUC活性。這些結(jié)果顯示，除了它們對拓?fù)洚悩?gòu)酶1的已知作用之外，高劑量的這些藥物會抑制蛋白質(zhì)合成，其中最大幅度的變化發(fā)生于毒素刺激的TR表達(dá)細(xì)胞系中。圖四示出應(yīng)用單毒素試驗(yàn)來在HEK293胚腎細(xì)胞中區(qū)分微管破壞劑藥物種類內(nèi)的藥物特異性表型。動態(tài)細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)對于正常細(xì)胞功能具有重要性。在微管的情況下，干擾微管蛋白亞單位蛋白的重塑會通過阻斷細(xì)胞周期進(jìn)程而產(chǎn)生顯著的抗增殖活性。然而， 破壞微管的藥物在微管蛋白結(jié)合之后表現(xiàn)顯著的生物學(xué)差異。例如，諾考達(dá)唑和秋水仙堿結(jié)合不全相同的重疊蛋白序列下的微管，但兩種化合物都阻斷防止聚合和促進(jìn)解聚的微管組裝位點(diǎn)。長春花生物堿(諸如長春新堿與長春花堿)結(jié)合微管蛋白并誘導(dǎo)微管蛋白聚集形成防止微管組裝的不溶性晶體。最后，泰素結(jié)合微管并使完整微管穩(wěn)定，這干擾了它們在細(xì)胞分裂期間的解組裝。圖29A示出使用單毒素試驗(yàn)來測定微管破壞劑對用不同劑量(5nM到5uM的范圍) 的下列試劑處理的HEK293 CMV-fLuc亞克隆#3的影響諾考達(dá)唑、秋水仙堿、長春新堿和泰素。在暴露6小時(shí)后，將細(xì)胞裂解并使用標(biāo)準(zhǔn)微量酶標(biāo)儀試驗(yàn)測定fLuc蛋白活性。對酶標(biāo)儀值求平均并表示為處理樣本與未處理樣本的比率(誘導(dǎo)倍數(shù))。諾考達(dá)唑、秋水仙堿和長春新堿在IOOnM與5uM的濃度之間表現(xiàn)報(bào)告蛋白活性增加。相比之下，僅在最高泰素劑量下(2. 5uM和5uM)觀察到fLUC表達(dá)的顯著變化。圖29B示出用不同濃度(5nM到5uM的范圍)的圖29A中所列微管破壞劑處理的 HEK293 hTRdm-fLuc #53 (上圖)和HEI^93 mTRdm_fLuc#12 (下圖)亞克隆的劑量反應(yīng)曲線。對酶標(biāo)儀值求平均并表示為處理樣本與未處理樣本的比率(誘導(dǎo)倍數(shù))。由人OiTRdm， 上圖)和小鼠(mTRdm，下圖)TR盒產(chǎn)生高度類似的TR表達(dá)譜。如同圖29A中的帽依賴性試驗(yàn)，秋水仙堿和長春新堿在大于IOOnM的所有劑量表現(xiàn)增加的報(bào)告蛋白活性。相比之下，僅在高于250nM的諾考達(dá)唑濃度下才觀察到報(bào)告蛋白活性的顯著增加。如同帽依賴性試驗(yàn)， 僅在2. 5uM和5uM劑量下觀察到泰素特異性報(bào)告蛋白增加。盡管秋水仙堿和長春新堿在帽依賴性試驗(yàn)與非帽依賴性試驗(yàn)中展示了類似的翻譯反應(yīng)，但諾考達(dá)唑產(chǎn)生了獨(dú)特的非帽依賴性反應(yīng)。即使在兩個(gè)試驗(yàn)中都在高泰素劑量下觀察到了顯著的翻譯增加，但這種藥物仍產(chǎn)生所有測試的微管破壞劑藥物中最小的反應(yīng)譜，這與它的獨(dú)特活性相一致。圖30示出人HEK293細(xì)胞系對更新的15-試驗(yàn)方案的TR特異性反應(yīng)。圖30A示出由HEK293 CMV-fLuc亞克隆#3產(chǎn)生的帽依賴性翻譯反應(yīng)的15-試驗(yàn)柱狀圖。這些研究中所用的毒素的組成和濃度如表3中所示。虛線代表未處理樣本中翻譯反應(yīng)的水平。除了 TPA+拓?fù)涮婵?高劑量或HD) 二毒素試驗(yàn)之外，在所有其它TPA組合試驗(yàn)中觀察到顯著的帽依賴性fLuc產(chǎn)生。圖30B示出由HEK293 mTRdm-fLuc亞克隆#13產(chǎn)生的TR翻譯反應(yīng)的15-試驗(yàn)柱狀圖。使用標(biāo)準(zhǔn)微量酶標(biāo)儀試驗(yàn)測定fLUC蛋白活性并表示為處理培養(yǎng)物與未處理培養(yǎng)物的比率(即，誘導(dǎo)倍數(shù))。虛線代表未處理樣本中翻譯反應(yīng)的水平。除了 TPA+拓?fù)涮婵?HD) 的二毒素試驗(yàn)，在其它所有組合TPA試驗(yàn)中觀察到TR調(diào)節(jié)翻譯的高度顯著性增加。圖30C示出由HEK293 hTRdm-gLuc亞克隆#79產(chǎn)生的TR翻譯反應(yīng)的15-試驗(yàn)柱狀圖。如前所述，在藥物施用6小時(shí)后在條件培養(yǎng)基中測定分泌性Gaussia熒光素酶(gLUC) 活性并將蛋白質(zhì)活性表示為處理樣本與未處理樣本的比率(誘導(dǎo)倍數(shù))。虛線代表未處理細(xì)胞中的翻譯反應(yīng)。雖然fLuc蛋白是一種經(jīng)受胞內(nèi)蛋白降解系統(tǒng)的胞漿蛋白并且gLuc是一種逃脫胞內(nèi)降解并在細(xì)胞外累積的分泌性蛋白，但在圖30B與圖30C中的非帽依賴性表達(dá)譜強(qiáng)烈相關(guān)并表現(xiàn)與圖30A中帽依賴性試驗(yàn)類似的差異。在TPA+卡西霉素二毒素試驗(yàn)中的非帽依賴性反應(yīng)顯示15-試驗(yàn)組中的最大翻譯增加，這與在圖30A的帽依賴性試驗(yàn)中觀察到的最小誘導(dǎo)形成對比。此外，拓?fù)涮婵?HD)的抑制作用在所有單毒素與二毒素試驗(yàn)中是明顯的，其中在TPA+拓?fù)涮婵?HD)試驗(yàn)中觀察到最大變化。圖31顯示使用21-毒素試驗(yàn)程序來表征未知或先前未確定的物質(zhì)對人HEK293胚腎細(xì)胞的影響。和在標(biāo)準(zhǔn)15-毒素試驗(yàn)中一樣，21-試驗(yàn)配置采用5種毒素的單個(gè)和配對組合應(yīng)用，并加入第六種物質(zhì)。包括進(jìn)第六種化合物需要把試驗(yàn)組擴(kuò)增到21個(gè)單毒素與二毒素試驗(yàn)的總數(shù)。各種毒素的組成和濃度如表3中所描述。在本實(shí)施例中，先前未確定的物質(zhì)是泰素。在此試驗(yàn)之前，未曾在HEK293細(xì)胞中于更新的15-毒素試驗(yàn)方案中測定組合泰素反應(yīng)。圖31A示出由HEK293 CMV-fLuc亞克隆#3產(chǎn)生的帽依賴性翻譯反應(yīng)的21-毒素柱狀圖。在暴露于化合物6小時(shí)之后，將細(xì)胞裂解并使用標(biāo)準(zhǔn)微量酶標(biāo)儀試驗(yàn)測定fLuc蛋白活性。對三個(gè)重復(fù)的酶標(biāo)儀值求平均并表示為處理樣本與未處理樣本的比率(誘導(dǎo)倍數(shù))。虛線代表未處理樣本中翻譯反應(yīng)的水平。雖然泰素在單毒素試驗(yàn)中(未知的)對帽依賴性flue蛋白產(chǎn)生具有最小影響，但TPA+泰素的二毒素試驗(yàn)(TPA+未知的)表現(xiàn)協(xié)同相互作用以及此組中最大的翻譯反應(yīng)。在二毒素試驗(yàn)中未觀察到其它顯著變化。圖31B示出由表達(dá)fLUC報(bào)告蛋白的HEK293 hTRdm-fLuc亞克隆#13所產(chǎn)生的TR 特異性翻譯反應(yīng)的21-毒素柱狀圖。虛線代表由未處理細(xì)胞樣本所產(chǎn)生的翻譯反應(yīng)。在此組中，泰素(未知)在單毒素以及秋水仙堿+泰素、卡西霉素+泰素、硼替佐米+泰素的二毒素試驗(yàn)中表現(xiàn)fLUC活性的較小協(xié)同增加，但在TPA+泰素或拓?fù)涮婵?泰素試驗(yàn)中沒有。圖31C示出由表達(dá)gLUC報(bào)告蛋白的HEK293 hTRdm-gLuc亞克隆#79所產(chǎn)生的 21-試驗(yàn)柱狀圖。在培養(yǎng)6小時(shí)之后，使用標(biāo)準(zhǔn)微量酶標(biāo)儀試驗(yàn)在條件培養(yǎng)基中測定分泌性 gLuc活性并表示為處理樣本與未處理樣本的比率(誘導(dǎo)倍數(shù))。虛線代表未處理樣本中翻譯反應(yīng)的水平。已知gLuc蛋白被分泌到培養(yǎng)基中，它逃脫了作用于fLUC蛋白的胞漿蛋白周轉(zhuǎn)過程。因此，表觀TR反應(yīng)的任何差異可能是報(bào)告蛋白合成、分泌或降低的蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)方面的差異的結(jié)果。然而，盡管在fLuc與gLuc蛋白加工中存在差異，但由HEK293 hTRdm-fLuc 亞克隆#13和HEK293 hTRdm-gLuc亞克隆#79產(chǎn)生的反應(yīng)譜顯示強(qiáng)相關(guān)性。在秋水仙堿+ 泰素的二毒素試驗(yàn)中觀察到最顯著的變化，這可能是因兩種微管蛋白結(jié)合藥物對微管的組合作用而引起的蛋白質(zhì)分泌改變的結(jié)果。圖32示出使用21-試驗(yàn)程序來檢測與!fepG2肝細(xì)胞癌和HEK293胚腎細(xì)胞的抗生素治療相關(guān)的任何慢性影響。支原體去除試劑(MRA)或4-氧喹啉-3-羧酸衍生物是普遍應(yīng)用于培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞以治療支原體污染的抗生素。MRA表現(xiàn)最低的毒性并且可應(yīng)用較長的培養(yǎng)時(shí)期。本實(shí)施例中，在21-試驗(yàn)程序之前將MRA處理細(xì)胞(+MRA)與 150nM MRA 一起孵育7天。雖然把+MRA細(xì)胞維持在補(bǔ)充抗生素的培養(yǎng)基中，但將另一 MRA劑量用作未知化合物。未處理的-MRA培養(yǎng)物從未暴露于抗生素。標(biāo)準(zhǔn)毒素的名稱和濃度在表3中給出。圖32Α示出!fepG2細(xì)胞中持續(xù)MRA暴露的影響，而圖32Β示出HEK 293細(xì)胞中MRA的影響。圖32A上圖示出由H印G2 mTRdm-fLuc亞克隆#16產(chǎn)生的TR反應(yīng)的21-試驗(yàn)柱狀圖，所述亞克隆#16用 150nM MRA處理7天(淺色柱)或未用 150nM MRA處理(深色柱)。在用標(biāo)準(zhǔn)毒素處理6小時(shí)后，將細(xì)胞裂解并使用標(biāo)準(zhǔn)微量酶標(biāo)儀試驗(yàn)測定fLuc蛋白活性。對酶標(biāo)儀值求平均并表示為處理樣本與未處理樣本的比率(誘導(dǎo)倍數(shù))。下圖示出相同數(shù)據(jù)組，其中去除了 TPA試驗(yàn)以突出在其它試驗(yàn)中觀察到的反應(yīng)。與單毒素和二毒素 TPA試驗(yàn)相比而言，抗生素處理的IfepG2細(xì)胞表現(xiàn)fLUC活性的最小差異。對于TPA試驗(yàn)，在每個(gè)測試中觀察到顯著的拮抗作用，并在TPA+秋水仙堿的二毒素試驗(yàn)中觀察到fLUC表達(dá)的極大減少，其中與-MRA細(xì)胞相比，+MRA培養(yǎng)物表現(xiàn)fLUC活性約減少到1/2. 5。圖32B示出由HEK293 mTRdm-fLuc亞克隆#45產(chǎn)生的非帽依賴性翻譯反應(yīng)的 21-試驗(yàn)柱狀圖，所述亞克隆#45用 150nM MRA處理7天(淺色柱)或未用 150nM MRA 處理(深色柱)。與圖32A中的H印G2細(xì)胞相比而言，HEK293細(xì)胞的慢性MRA暴露在21-試驗(yàn)方案中導(dǎo)致fLUC表達(dá)的近似均勻降低。然而，如圖32A中一樣，在TPA單毒素與二毒素試驗(yàn)中觀察到最大幅度降低。這些結(jié)果支持以下理論對抗生素氟喹諾酮的長時(shí)暴露會以可測定的程度影響TR試驗(yàn)，具體地說，檢測到了強(qiáng)的拮抗毒素特異性表型，涉及TPA毒素。圖33示出應(yīng)用毒素試驗(yàn)程序來鑒定HEK293細(xì)胞中與翻譯抑制劑相關(guān)的毒素特異性和細(xì)胞特異性影響。圖33A示出劑量反應(yīng)柱狀圖，其中用各種濃度(劑量范圍IOnM到25uM)的下列翻譯抑制劑處理HEK293 CMV-fLUC亞克隆#3 (上圖)、hTRdm-fLUC亞克隆#13 (中圖)和 mTRdm-fLUC亞克隆#45 (下圖)放線菌酮、茴香霉素、嘌呤霉素和吐根堿。在足夠大的劑量下，這些抑制劑立即停止蛋白質(zhì)翻譯，并且所得蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)使報(bào)告蛋白水平降低到未處理細(xì)胞水平以下(< 100%對照)。翻譯抑制劑對帽依賴性翻譯(HEK293 CMV-fLUC亞克隆#3數(shù)據(jù)，上圖)和非帽依賴性翻譯(HEK293 hTRdm-fLUC #13和mTRdm-fLUC #45亞克隆，中圖和下圖)表現(xiàn)一些類似影響。例如，250nM濃度的每種抑制劑足以把蛋白質(zhì)合成降低到對照細(xì)胞水平以下。此外，抑制劑劑量的額外增加(高至25uM，或100X)僅產(chǎn)生報(bào)告蛋白活性的最小額外降低。另外，嘌呤霉素需要2. 5uM的濃度來把報(bào)告蛋白水平降低到與其它三種抑制劑可比較的水平。與這些相似性形成對比，茴香霉素和吐根堿在HEK293CMV-fLUC#3 (上圖)與mTRdm_fLUC#45 (下圖)亞克隆中表現(xiàn)明顯不同的活性。在這些細(xì)胞中，低劑量的茴香霉素( 25nM)和吐根堿(IOOnM)足以把報(bào)告蛋白水平降低到未處理對照細(xì)胞的水平以下。最后，在單毒素25uM 試驗(yàn)中fLUC蛋白活性下降30-40%表明，fLUC蛋白在HEK293細(xì)胞中表現(xiàn)超過6小時(shí)的半衰期。圖3!3B示出用IOOnM TPA與各種濃度(劑量范圍IOnM到25uM)的圖33A所列翻譯抑制劑相組合的二毒素試驗(yàn)處理的HEK293 CMV-fLUC#3 (上圖)、hTRdm_fLUC#13 (中圖) 和mTRdm-fLUC#45 (下圖)亞克隆的劑量反應(yīng)柱狀圖。對于HEK293 CMV-fLUC #3 (上圖)和mTRdm-fLUC#45(下圖)亞克隆，茴香霉素和吐根堿在最低測試劑量下(IOnM)拮抗TPA 反應(yīng)并且與TPA單毒素試驗(yàn)相比降低報(bào)告蛋白水平50-300 %。這與嘌呤霉素形成對比，在三個(gè)細(xì)胞系中嘌呤霉素都需要250nM的濃度Q5X)來起初把蛋白質(zhì)合成降低到TPA單毒素試驗(yàn)水平以下。單毒素結(jié)果暗示，嘌呤霉素需要相當(dāng)高的劑量來把報(bào)告蛋白水平降低到與其它三種抑制劑可比較的水平。例如，CMV-fLUC #3亞克隆需要2. 5uM的嘌呤霉素劑量來與其它抑制劑相關(guān)聯(lián)，這與hTRdm-fLUC #13和mTRdm-fLUC #45亞克隆需要25uM嘌呤霉素濃度(10X增加)形成對比。如圖33A中一樣，在二毒素試驗(yàn)中于25uM抑制劑濃度下報(bào)告蛋白水平下降40%支持fLUC半衰期估計(jì)值為約6小時(shí)。圖 3!3B 中在HEI^93 hTRdm-fLUC #13 與HEI^93 mTRdm_fLUC#45 亞克隆之間觀察到明顯的細(xì)胞特異性差異，而在最高測試劑量下05uM)觀察到另一顯著差異。為突出這一差異，圖33C示出僅在25uM抑制劑劑量下對于HEI^93 hTRdm-fLUC #13和冊以93 mTRdm-fLUC #45亞克隆的單毒素與二毒素試驗(yàn)的反應(yīng)柱狀圖。與在兩個(gè)試驗(yàn)中顯示相當(dāng)?shù)膱?bào)告蛋白水平的HEK293 hTRdm-fLUC #13亞克隆形成對比，HEK293mTRdm_fLUC #45亞克隆對于在此劑量下的放線菌酮、嘌呤霉素和吐根堿，所表現(xiàn)的降低很少或沒有低于未處理對照細(xì)胞水平。 統(tǒng)計(jì)分析(下表)確認(rèn)在二毒素試驗(yàn)中兩個(gè)亞克隆之間的這一差異的顯著性。因?yàn)閷τ?HEK293 mTRdm-fLUC #45亞克隆的單毒素試驗(yàn)顯示此細(xì)胞系對此劑量下的這三種抑制劑敏感，所以這一結(jié)果與暴露于TPA之后在這些細(xì)胞中的蛋白質(zhì)代謝改變相一致。整個(gè)附圖中對應(yīng)的參考字符表示對應(yīng)的部分。定義術(shù)語“基因”指包含對于產(chǎn)生多肽或前體或RNA(例如，tRNA、siRNA、rRNA等)所必需的編碼序列的核酸(例如DNA)序列。多肽可由全長編碼序列或由編碼序列的任何部分編碼，只要保留全長或片段的所需活性或功能性質(zhì)(例如，酶活性、配體結(jié)合、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等)即可。本術(shù)語還涵蓋結(jié)構(gòu)基因的編碼區(qū)和在5'與3'端兩者上與編碼區(qū)相鄰的序列， 使得所述基因?qū)?yīng)于全長mRNA的長度。位于編碼區(qū)的5'端并存在于mRNA上的序列稱為 5'非翻譯序列。位于編碼區(qū)的3'端或編碼區(qū)下游并存在于mRNA上的序列稱為3'非翻譯序列。術(shù)語“基因”涵蓋基因的cDNA與基因組形式?；虻幕蚪M形式或克隆含有編碼區(qū)，其可穿插有稱為“內(nèi)含子”或“間插區(qū)”或“間插序列”的非編碼序列。內(nèi)含子從細(xì)胞核或初級轉(zhuǎn)錄物去除或“剪接掉”，并因此在信使RNA(mRNA)轉(zhuǎn)錄物中不存在。mRNA在翻譯期間起作用來指定新生多肽中氨基酸的次序或順序。術(shù)語“表達(dá)載體”指包含核酸表達(dá)盒的病毒和非病毒載體。術(shù)語“表達(dá)盒”用來定義含有可操作地連接到編碼序列的調(diào)節(jié)元件的核苷酸序列， 所述調(diào)節(jié)元件導(dǎo)致編碼序列在細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄與翻譯。“哺乳動物啟動子”指在哺乳動物細(xì)胞中起作用或來源于哺乳動物細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄啟動子，或二者兼而有之。“哺乳動物最小啟動子”指經(jīng)由RNA聚合酶結(jié)合來正確起始轉(zhuǎn)錄所必需的‘核心’DNA序列，但其在不存在任何可操作地連接的轉(zhuǎn)錄效應(yīng)子序列時(shí)僅表現(xiàn)象征性的轉(zhuǎn)錄活性。用語“開放閱讀框”或“編碼序列”指編碼多肽或蛋白質(zhì)的核苷酸序列。在真核生物中編碼區(qū)在5'側(cè)鄰接編碼起始子甲硫氨酸的核苷酸三聯(lián)體“ATG”，而在3'側(cè)鄰接指定終止密碼子的三個(gè)三聯(lián)體(即，TAA、TAG和TGA)之一?！翱刹僮鞯剡B接”定義為意指使核酸與另一核酸序列處于功能關(guān)系。例如，如果啟動子或增強(qiáng)子影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄則將其可操作地連接到該編碼序列；或者如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)的定位以便于翻譯則將其可操作地連接到編碼序列。一般來說，“可操作地連接”意指所連接的DNA序列是鄰接的。不過，增強(qiáng)子并不必需是鄰接的。連接是通過在便利的限制性位點(diǎn)處的接合來完成。如果這類位點(diǎn)不存在，那么根據(jù)常規(guī)實(shí)踐使用合成性的寡核苷酸銜接子或接頭。“重組的”指方法、試劑和實(shí)驗(yàn)室操縱的結(jié)果，其中將核酸或其它生物分子用酶學(xué)方法、化學(xué)方法或生物學(xué)方法裂解、合成、組合或以其它方式離體操縱以在細(xì)胞或其它生物系統(tǒng)中產(chǎn)生所需產(chǎn)物。術(shù)語“重組DNA”指由借助于分子生物學(xué)技術(shù)接連在一起的DNA片段構(gòu)成的DNA分子。“轉(zhuǎn)染”是用來描述向真核細(xì)胞中引入外源物質(zhì)(諸如外源DNA)的術(shù)語。它與“轉(zhuǎn)化”和“轉(zhuǎn)導(dǎo)”可交換地使用，但后一術(shù)語在它的更狹窄范圍內(nèi)指通過病毒(充當(dāng)載體)向細(xì)胞中引入DNA的過程。因此，經(jīng)歷轉(zhuǎn)染的細(xì)胞稱為“轉(zhuǎn)染的”、“轉(zhuǎn)化的”或“轉(zhuǎn)導(dǎo)的”細(xì)胞。本文中使用的術(shù)語“質(zhì)?！敝窪NA的獨(dú)立復(fù)制小片。它通常是圓形的和雙鏈的?！皥?bào)告基因”指可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)檢測或測定其表達(dá)的任何基因。術(shù)語“調(diào)節(jié)元件”或“效應(yīng)子元件”指轉(zhuǎn)錄啟動子、增強(qiáng)子、沉默子或終止子，以及指任何翻譯調(diào)節(jié)元件、聚腺苷酸化位點(diǎn)等等?？膳帕姓{(diào)節(jié)元件和效應(yīng)子元件使得它們允許、 增強(qiáng)或便于選擇性產(chǎn)生經(jīng)它們調(diào)節(jié)的成熟編碼序列。術(shù)語“載體”指外源DNA片段可插入其中的DNA分子。一般來說，它們含有目標(biāo)調(diào)節(jié)序列和編碼序列。術(shù)語載體包括但不限于質(zhì)粒、粘粒、噬菌粒、病毒載體和穿梭載體?！按┧蟆陛d體是能夠進(jìn)行原核復(fù)制但不含有真核復(fù)制序列的質(zhì)粒載體。在此復(fù)制缺陷型穿梭載體內(nèi)含有的病毒DNA序列指導(dǎo)在真核宿主細(xì)胞內(nèi)的重組以產(chǎn)生感染性病毒顆粒。本文中使用的術(shù)語“物質(zhì)”指具有明確的化學(xué)組成的物質(zhì)。它在本文中與術(shù)語“化合物”可交換地使用。 術(shù)語“病毒載體”指含有外源遺傳物質(zhì)以供遞送到它感染的細(xì)胞中的病毒。“復(fù)制缺陷型”病毒載體不能夠在“野生型”或以其它方式未操縱的哺乳動物細(xì)胞中復(fù)制。大量此類病毒的產(chǎn)生要求生產(chǎn)細(xì)胞系用輔助病毒共轉(zhuǎn)染或以其它方式修飾來提供或補(bǔ)充缺失的功能?！皬?fù)制競爭型”病毒載體是能夠感染細(xì)胞并經(jīng)歷DNA復(fù)制、病毒包裝和從被感染細(xì)胞釋放的載體。本文中使用的“條件復(fù)制型，，病毒載體是設(shè)計(jì)成在特定細(xì)胞類型中選擇性表達(dá)使得避免非所需廣譜感染的復(fù)制競爭型載體。條件復(fù)制可通過在載體中包括可操作地連接到早期病毒基因的組織特異性、腫瘤特異性或細(xì)胞類型特異性或其它選擇性誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)性控制序列來實(shí)現(xiàn)。術(shù)語“應(yīng)激”和“毒性”用來指代對細(xì)胞天然的生物化學(xué)和生物物理穩(wěn)態(tài)的干擾。 然而應(yīng)激一般導(dǎo)致細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的恢復(fù)，而毒性反應(yīng)最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。
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優(yōu)選實(shí)施方案的描述本發(fā)明涉及表現(xiàn)獨(dú)特核糖體譜的哺乳動物細(xì)胞亞群，這通過不同的翻譯活性來證明。一旦哺乳動物細(xì)胞或細(xì)胞系用本文中描述的表達(dá)盒穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，就可鑒定出所需的細(xì)胞亞群。重要的是，可操縱這些細(xì)胞亞群來表現(xiàn)帽依賴性翻譯或非帽依賴性翻譯。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明是針對用于鑒定所需的哺乳動物細(xì)胞亞群的方法。方法包括以下步驟。用至少一種毒素處理哺乳動物細(xì)胞亞組以形成毒素處理細(xì)胞，哺乳動物細(xì)胞用包含以下任一項(xiàng)的核酸表達(dá)盒穩(wěn)定轉(zhuǎn)化(1)編碼在受脅迫和/或垂死細(xì)胞中選擇性翻譯的mRNA分子的TR元件，和可操作地連接到TR元件的核苷酸序列，該序列編碼報(bào)告基因并從TR元件翻譯；或( 組成型啟動子，和可操作地連接到啟動子的核苷酸序列，該序列編碼報(bào)告基因。測定相比于參照標(biāo)準(zhǔn)所表達(dá)的報(bào)告蛋白水平的毒素處理細(xì)胞中由報(bào)告基因編碼的報(bào)告蛋白的水平，以鑒定哺乳動物細(xì)胞亞組是否表現(xiàn)所需哺乳動物細(xì)胞亞群的表型。如果哺乳動物細(xì)胞的毒素處理細(xì)胞表現(xiàn)所需哺乳動物細(xì)胞亞群的表型，那么從哺乳動物細(xì)胞分離至少一個(gè)細(xì)胞以形成細(xì)胞培養(yǎng)物。使細(xì)胞培養(yǎng)物生長以形成哺乳動物細(xì)胞亞群。任選地，用至少一種毒素處理哺乳動物細(xì)胞亞群，并重復(fù)測定、分離和生長步驟直到鑒定出所需的哺乳動物細(xì)胞亞群。本發(fā)明中所采用的翻譯調(diào)節(jié)(TR)序列(又稱為“TR元件”)是IRES元件，其可通過(a)它的核酸序列文本和(b)調(diào)節(jié)翻譯的細(xì)胞活性(第2006/0173168號美國公布的專利申請，其以引用的方式并入本文)與5' UTR IRES相區(qū)別。這兩個(gè)特點(diǎn)相結(jié)合形成用于可操作地連接到此IRES序列的下游編碼序列在受脅迫和/或垂死哺乳動物細(xì)胞中選擇性翻譯的基礎(chǔ)。因此，本發(fā)明涵蓋任何哺乳動物IRES作為TR元件的用途，所述TR元件在受脅迫和/或垂死細(xì)胞中選擇性表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的IRES元件具有非帽依賴性翻譯活性，其位于哺乳動物蛋白脂質(zhì)蛋白(PlP)基因的ORF內(nèi)。在其天然環(huán)境中，pip IRES活性存在于含有數(shù)個(gè)上游0RF(〃 uORF")的多順反子RNA內(nèi)，所述數(shù)個(gè)上游ORF有效阻斷正常細(xì)胞中對內(nèi)部AUG 密碼子的核糖體掃描。然而，將細(xì)胞暴露給毒劑導(dǎo)致核糖體結(jié)合和從特異性內(nèi)部RNA序列的翻譯使得內(nèi)部氨基酸序列從pip ORF的3'端翻譯(例如，PIRP-M和PIRP-L肽)。在另一實(shí)施方案中，TR元件來源于DM20變體。 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的TR元件來源于pip基因的外顯子1-7。盡管不受具體理論的束縛，但仍認(rèn)為外顯子1到4足以基于突變分析數(shù)據(jù)來編碼功能IRES活性。此外， 認(rèn)為TR調(diào)節(jié)系統(tǒng)(其參與應(yīng)激/死亡特異性翻譯)位于外顯子6和/或7內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，TR元件來源于小鼠。與US 2006/0173168中公開的在垂死細(xì)胞中表達(dá)的IRES元件相比，本發(fā)明的來源于PLP/DM20的小鼠來源TR元件在所有以下特點(diǎn)方面有所不同1)核苷酸1(在SEQ ID Nos. 1和2中)由A突變?yōu)門以去除髓鞘蛋白脂質(zhì)蛋白 PLP和DM20 cDNA中指導(dǎo)全長PLP和DM20的合成的野生型AUG起始密碼子以阻止這種合成發(fā)生；2)核苷酸4由G突變?yōu)锳以便在PLP和DM20 cDNA的第二可能閱讀框中產(chǎn)生終止密碼子來阻止其全長合成；3)核苷酸6、7和8分別由C突變?yōu)門、由T突變?yōu)镚和由T突變?yōu)锳以在PLP和
27DM20 cDNA的第三可能閱讀框中產(chǎn)生終止密碼子來阻止全長PLP和DM20的合成；4)核苷酸17和18分別由G突變?yōu)锳和由T突變?yōu)镚以在PLP和DM20 cDNA的主要(第一)開放閱讀框中產(chǎn)生第一終止密碼子來阻止它們的全長合成；5)核苷酸21由T突變?yōu)锳以便在PLP和DM20 cDNA的主要(第一)開放閱讀框中產(chǎn)生第二終止密碼子來阻止其全長合成；6)核苷酸27由A突變?yōu)門以便從PLP和DM20 cDNA的第三可能閱讀框中去除AUG 密碼子從而在不存在野生型AUG密碼子時(shí)阻止框外(out-of frame)翻譯起始；和7)從PLP和DM20 cDNA中缺失終止密碼子以減少對下游開放閱讀框的翻譯的干擾。如下面所討論，本發(fā)明的來源于鼠PLP/DM20的TR元件不=指導(dǎo)PIRP-M或PIRP-L 肽的翻譯。除以上變化之外，也將下列突變引入來自cDNA的DM 20變體的TR元件中1)核苷酸511由A突變?yōu)門以便去除DM20變體中指導(dǎo)PIRP-M蛋白合成的第一框內(nèi)(in-frame)內(nèi)部AUG起始密碼子來阻止這種合成發(fā)生；和2)核苷酸598由A突變?yōu)門以去除DM20變體中指導(dǎo)PIRP-L蛋白質(zhì)合成的第二框內(nèi)內(nèi)部AUG起始密碼子以便阻止這種合成發(fā)生。類似地，將下列突變弓I入來自cDNA的鼠PLP變體的TR元件中1)核苷酸616由A突變?yōu)門以便去除PLP變體中指導(dǎo)PIRP-M蛋白質(zhì)合成的第一框內(nèi)內(nèi)部AUG起始密碼子來阻止這種合成發(fā)生；和2)核苷酸703由A突變?yōu)門以去除PLP變體中指導(dǎo)PIRP-L蛋白質(zhì)合成的第二框內(nèi)內(nèi)部AUG起始密碼子以便阻止這種合成發(fā)生。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，TR元件選自人或小鼠TR元件。更優(yōu)選地，TR元件選自鼠序列 TRdm(SEQ ID NO 1)和 TRplp(SEQ ID NO 2).TRdm核酸序列(SEQ ID NO 1)來源于小鼠蛋白脂質(zhì)蛋白基因1的DM20剪接變體 cDNA，但在核苷酸位置1、4、6、7、8、17、18、21、27、511和598處進(jìn)行了修飾。此外，編碼終止密碼子的最后3個(gè)核苷酸被去除。TRplp核酸序列(SEQ ID NO 2)來源于小鼠蛋白脂質(zhì)蛋白基因1的PLP剪接變體 cDNA，并且它在核苷酸位置1、4、6、7、8、17、18、21、27、616和703處含有修飾。TRplp與TRdm 的不同之處在于存在核苷酸349-453。編碼終止密碼子的最后3個(gè)核苷酸被去除。在一些實(shí)施方案中，TR元件來源于人。舉例來說(但不限于)，IRES元件來源于人PLP/DM20序列。更優(yōu)選地，來自人PLP序列的TR元件具有核酸序列SEQ ID N0:3，而來自人DM20序列的TR元件具有核酸序列SEQ ID NO :4。在一些實(shí)施方案中，TR元件包含與參照序列的突變變體相同的核苷酸序列，其中參照序列包含A)對應(yīng)于圖沈PLP序列的至少核苷酸1-831并且與其具有至少62%序列同一性的PLP核苷酸序列，或B)對應(yīng)于圖沈DM20序列的至少核苷酸1_726并且與其具有至少62%序列同一性的DM20核苷酸序列；并且參照序列包含C)在圖 26 PLP 核苷酸位置 41_48、50-56、75_81、150-156、200-205、227_244、 251-257和563-570，或在與其對應(yīng)位置上的多聚嘧啶束(polypyrimidine tract),
D)在圖26 PLP核苷酸位置1-3、616-618、703_705和811-813，或在與其對應(yīng)位置上的ATG序列，E)在圖 26 PLP 核苷酸位置 130-133、142-145、190-193、220-223 和 305-308，或在與其對應(yīng)位置上的GNRA序列，和F)在圖沈PLP核苷酸位置503-512，或在與其對應(yīng)位置上的18S rRNA結(jié)合位點(diǎn)； 其中(G)突變變體(1)包含參照序列的突變，所述突變(a)消除 ATG1、ATG616 和 ATG703，和(b)在圖洸PLP核苷酸位置2-4、6-8、16_18和19-21，或在與其對應(yīng)位置上引入終止密碼子序列；和(2)保留多聚嘧啶束(C)、GNRA序列(E)和18S rRNA結(jié)合位點(diǎn)(F)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，(A)或(B)的序列同一性為至少或約70%，并且更優(yōu)選地為至少或約80%。 在另一實(shí)施方案中，突變(Gl)通過將每一 ATG轉(zhuǎn)變?yōu)門TG來消除ATG1、ATG616和ATG703。 在一個(gè)實(shí)施方案中，參照序列是脊椎動物PLP共有核苷酸序列(SEQ ID NO 5)或脊椎動物 DM20共有序列，后者包含從其中缺失核苷酸349-453的所述脊椎動物PLP共有序列。在另一實(shí)施方案中，參照序列是哺乳動物PLP共有核苷酸序列(SEQ ID N0:10)或哺乳動物DM20 共有序列，后者包含從其中缺失核苷酸349-453的所述哺乳動物PLP共有序列。在哺乳動物序列中，對核苷酸使用下列標(biāo)準(zhǔn)縮寫m是a或(、！~是3或8、《是3或18是(或g、y
η是a或c或g或t。在某些實(shí)例中，可操作地連接到TR序列的序列元件可能干擾由TR表達(dá)盒所展示的選擇性翻譯活性或表現(xiàn)次佳的翻譯活性。為減輕所連接ORF對TR活性的任何影響，本發(fā)明提供所公開核苷酸序列的密碼子使用變體(codon-usage variant)，其采用不改變所表達(dá)多肽的多肽序列(因而不影響其生物活性)的替代密碼子。這些變體是基于遺傳密碼的簡并性，借此幾種氨基酸由不止一個(gè)密碼子三聯(lián)體來編碼。一個(gè)例子是密碼子CGT、CGG、CGC 和CGA，其均編碼氨基酸精氨酸(R)。因此，一種蛋白質(zhì)可由精確序列不同但仍編碼具有相同氨基酸序列的多肽的變體核酸序列來編碼?；诿艽a子利用/偏好，可對密碼子進(jìn)行選擇來優(yōu)化ORF的翻譯效率，而不影響由TR表達(dá)盒進(jìn)行的調(diào)節(jié)翻譯。定點(diǎn)誘變是一種用于通過改變一個(gè)或多個(gè)所需位置上的核苷酸序列來產(chǎn)生序列變體的特別有用的方法。定點(diǎn)(或位點(diǎn)特異性)誘變使用包含具有所需突變以及足夠數(shù)目的相鄰核苷酸的DNA序列的寡核苷酸序列來提供具有足夠尺寸和復(fù)雜度的序列以在所提議突變的兩側(cè)上形成穩(wěn)定雙鏈體。通常，優(yōu)選的是長約20到25個(gè)核苷酸的合成引物，其中在序列中所提議突變的兩側(cè)上的約5到10個(gè)殘基被改變。適用于定點(diǎn)誘變的典型載體包括所公開的載體，以及任何商業(yè)上或?qū)W術(shù)上可利用的質(zhì)粒載體。一般來說，通過使適當(dāng)?shù)?DNA寡核苷酸序列與靶DNA退火并通過本領(lǐng)域中已知的PCR程序擴(kuò)增靶序列來引入核苷酸取代。本發(fā)明涵蓋在編碼序列中使用每個(gè)可能的密碼子以用于產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明使用的所需 ORF序列。可使用定向進(jìn)化技術(shù)來制備具有改進(jìn)TR功能的序列變體。在定向進(jìn)化技術(shù)中，可從含TR的多核苷酸開始，進(jìn)行至少一輪核酸突變或核酸剪接或同源重組。突變、剪接和同源重組可按定向或隨機(jī)方式進(jìn)行。例如，可設(shè)計(jì)一個(gè)或多個(gè)寡核苷酸用于如上所述的TR元件的定點(diǎn)誘變，或者可使一個(gè)或多個(gè)隨機(jī)產(chǎn)生的寡核苷酸與起始的含TR多核苷酸模板接觸。替代地或此外，可在允許誤差的條件和/或易錯的聚合酶下進(jìn)行起始模板的PCR擴(kuò)增以允許引入突變，這種技術(shù)稱為“錯誤傾向”PCR(" sloppy" PCR)。類似地，可按定向或隨機(jī)方式對一組同源的含TR元件的多核苷酸進(jìn)行剪接或重組。例如，可使用一種或多種限制性核酸內(nèi)切酶來隨機(jī)地或按預(yù)定方式消化同源多核苷酸模板，并接著將所得片段接合在一起。替代地或此外，可在體外或體內(nèi)，將這組含TR元件的多核苷酸在有助于它們之間的同源重組的條件下合并并處理。特別是，可在數(shù)目上組合或擴(kuò)增對于TR特異性翻譯效率較為重要的調(diào)節(jié)序列，使得產(chǎn)生含有多個(gè)拷貝的序列。對此工作，可采用突變和剪接或重組技術(shù)的任何組合。這些技術(shù)中的任一項(xiàng)可進(jìn)行一輪或不止一輪。在一輪或多輪突變、剪接和/或重組之后，接著測試所得的多核苷酸以針對TR活性進(jìn)行篩選。通常，這可通過將報(bào)告分子編碼序列置于已經(jīng)產(chǎn)生的一個(gè)或多個(gè)TR變體的可操作控制之下來進(jìn)行。接著使所得構(gòu)建體在置于可發(fā)生TR翻譯的條件(諸如應(yīng)激條件) 之下的細(xì)胞中表達(dá)。所述測試可用來檢測在TR元件功能方面的所需改進(jìn)。例如，在TR元件翻譯對應(yīng)激條件的特異性、TR元件激活對細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)的敏感性(例如，在細(xì)胞應(yīng)激和 /或死亡之前的生物化學(xué)變化)或在TR元件激活之后翻譯起始的效率(即，幅度)的方面中任一方面的改進(jìn)可以是所述試驗(yàn)的焦點(diǎn)?；谠囼?yàn)結(jié)果，可選擇一個(gè)或多個(gè)改進(jìn)的TR元件來使用或進(jìn)一步開發(fā)；在一些實(shí)施方案中，選定的改進(jìn)TR元件核酸可用作另一輪或另外數(shù)輪定向進(jìn)化的一個(gè)起始多核苷酸或一組起始多核苷酸。在本文的各個(gè)實(shí)施方案中，TR元件可包含或可通過PLP/DM20多核苷酸的突變制得，所述突變包含以下堿基或?qū)?yīng)于以下堿基的堿基圖沈鼠或人PLP/DM20 DNA序列的約27到約615/510 ；并且這可進(jìn)一步包含以下堿基或?qū)?yīng)于以下堿基的堿基約616/511 到約702/597的堿基、約703/598到約772/666的堿基和/或約773/667到約810/705的堿基。例如，TR元件可包含或可通過PLP/DM20多核苷酸的突變制得，所述突變包含約27 到約810/705的堿基或?qū)?yīng)于堿基約27到約810/705的堿基，其中省略或不省略堿基約 616/511到約702/597，參照圖26編號。在PLP/DM20編碼序列和其TR元件或由其構(gòu)建的TR元件中，可在對應(yīng)于參照圖 26陳述的下列PLP/DM20位置的一個(gè)或多個(gè)位置上進(jìn)行突變，但對TR元件功能無不利影響，即位置:01、02、03、04到21(包括此片段全部或一部分缺失)、25、26、314、332、560/455、 614/509,622/518到696/591 (包括此片段全部或一部分缺失，其去除外顯子5)、616/511、 703/598、806/701、811/706、817/712、818/713 和 827/722。在各個(gè)實(shí)施方案中，除前述以外的其它核堿基在PLP/DM20編碼序列中可為保守的。例如，在各個(gè)實(shí)施方案中，PLP/DM20 編碼序列的核堿基序列由此可在對應(yīng)于PLP核苷酸位置41-48、50-56、75-81、150-156、 200-205,227-244,251-257和563-570的核苷酸位置上包含多聚嘧啶基序。在一些實(shí)施方案中，這種序列可進(jìn)一步在PLP位置270-274、299-303、490-494、578-582、597-601中的一個(gè)或多個(gè)上包含多聚嘧啶基序；而在一些實(shí)施方案中，還在PLP位置626-632、642-648、 669-674、707-712、755-761、767-771和800-804中的一個(gè)或多個(gè)位置上包含多聚嘧啶基
3序。類似地，在各個(gè)實(shí)施方案中，PLP/DM20編碼序列的核堿基序列由此可在對應(yīng)于 PLP 核苷酸位置 130-133、142-145、190-193、220-223、305-308 的核苷酸位置上包含 GNRA基序；并且在一些實(shí)施方案中進(jìn)一步在635-638上包含GNRA基序；以及在其它實(shí)施方案中， 進(jìn)一步在位置3四-332、343-346和572-575中的一個(gè)或多個(gè)位置上包含GNRA基序；而又在一些實(shí)施方案中，進(jìn)一步在位置650-653和683-686中的一個(gè)或多個(gè)位置上包含GNRA基序。然而，如上文所述，可在下列位置進(jìn)行突變而無不利影響并且在一些情況下具有增強(qiáng)作用:01、04、06、07、08、17、18、21、27。在一些實(shí)施方案中，這些突變可為以下中的一個(gè)或多個(gè):01t、04a、06t、07g、08a、17a、18g、21a* 27t。可進(jìn)行突變但對功能無不利影響的其它位置包括在以下PLP位置中的一個(gè)或多個(gè)位置25、26、314、332、560/455、616/511、 703/598、806/701、811/706、817/712、818/713 和 827/722。在一些實(shí)施方案中，這些可為以下中的一個(gè)或多個(gè):25g、26c、314g、332g、560/455c、616/511t、703/598t、806/701g、 811/706t、817/712a、818/713a 和 827/722g。此外，可在 PLP 位置 614/509 上插入例如多達(dá)或約5個(gè)核苷酸，而對功能無不利影響。此外，與位置831/726的融合，例如報(bào)告基因或其它靶基因編碼序列與其的框內(nèi)融合，未表現(xiàn)對TR元件功能的任何不利影響。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的TR元件來源于脊椎動物PLP或DM20序列而非人或小鼠。在一些實(shí)施方案中，這可以是靈長類、馬、牛、羊、豬、犬、貓、兔、有袋類、鳥類、魚類、兩棲類或爬蟲類動物序列。在各個(gè)實(shí)施方案中，脊椎動物序列可為天然序列，野生型的或是變異的；在一些實(shí)施方案中，脊椎動物序列可為野生型序列。本文中關(guān)于PLP/DM20序列所使用的“脊椎動物共有序列”指DNA序列SEQ ID NO :5?！凹棺祫游锾禺愋孕蛄小敝笇俜N智人(Homo sapiens)、猩猩(Pongo pygmaeus)、黑 MM (Pan troglodytes) > $^ (Macaca mulatta) >(Macaca fascicularis) > 豬(Sus scrofa)、小鼠(Mus musculus)、大鼠(Rattus norvegicus)、負(fù)鼠(Monodelphis domestica)、兔(Oryctolagus cuniculus)、牛(Bos taurus)、狗(Canis familiaris) (GalIus gallus)、斑胸草雀(Taeniopygia guttata)、壁虎(Gekko japonicus)、非洲爪蟾 (Xenopus laevis)和腔棘魚(Latimeria chalumnae)的PLP或DM20序列。在一些實(shí)施方案中，脊椎動物特異性序列可包含或編碼具有以下基因庫編號的氨基酸序列中的任一序列 P60201 (人)、Q5R6E6 (猩猩)、XP_001140782 (黑猩猩)、XP_001088537 (獼猴)、Q8HXW7 (食蟹獼猴)、NP_999139 (豬)、NP_035253 (小鼠)、NP_112252 (大鼠)、ΧΡ_001374483 (負(fù)鼠)、P47789 (兔)、CAA08909 (牛)、39025 (狗)、CAA43839 (雞)、P47790 (斑胸草雀)、 AAW79015 (壁虎)、CAA79582 (蛙)或 BAA^2O7 (腔棘魚)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員通過在http萬維網(wǎng)ncbi. nlm. nih. gov/sites/entrez網(wǎng)站上的核苷酸菜單中檢索NCBI基因庫，可容易獲得編碼這些的DNA序列。例如，有用的DNA 序列包括列在以下基因庫登錄號之下的那些序列AJ006976(人)、CR860432(猩猩)、 XM_001140782(黑猩猩)、ΧΜ_001088537 (獼猴)、AB083324 (食蟹獼猴)、NM_213974 (豬)、 NM_011123(小鼠)、NlLO3O99O (大鼠)、XM_001374446(負(fù)鼠)、NM_001082328 (兔)、 AJOO99I3 (牛)、X553I7 (狗)、X6166U 雞)、NM_001076703(殘基 113-946，斑胸草雀)、 AY880400 (壁虎)、Z19522 (蛙)和 ABO25938 (腔棘魚)。
本發(fā)明的TR元件在受脅迫和/或垂死細(xì)胞中表現(xiàn)選擇性翻譯。術(shù)語在受脅迫和 /或垂死細(xì)胞中“選擇性地翻譯”或“選擇性翻譯”意指在翻譯活性的峰值處，例如在用誘導(dǎo)細(xì)胞應(yīng)激和/或死亡的急性毒劑處理之后的約6到約18小時(shí)內(nèi)，在用本發(fā)明的TR表達(dá)盒轉(zhuǎn)化的任何細(xì)胞系的95%以上的細(xì)胞中觀察到mRNA翻譯活性，以及意指本發(fā)明表達(dá)盒的第一 ORF的翻譯水平上升到在用所述急性毒劑處理之后由缺乏可操作地連接的TR元件的相同表達(dá)盒轉(zhuǎn)錄和翻譯時(shí)同一 ORF表達(dá)水平的至少50%。例如，在用濃度為5 μ M的鈣離子載體Α23187處理之后的約9小時(shí)內(nèi)，本發(fā)明表達(dá)盒內(nèi)的TR元件在受脅迫和/或垂死細(xì)胞中表現(xiàn)選擇性翻譯，其中在用表達(dá)盒轉(zhuǎn)化的ΗΕΚ293細(xì)胞系的95%以上的細(xì)胞中觀察到 mRNA翻譯，并且表達(dá)盒的第一 ORF的翻譯水平是在處理之后由缺乏可操作地連接的TR元件的相同表達(dá)盒轉(zhuǎn)錄和翻譯時(shí)同一 ORF的翻譯水平的至少50%。在一些實(shí)例中，在用濃度為 5μΜ的鈣離子載體Α23187處理之后的約6到約9小時(shí)內(nèi)，本發(fā)明表達(dá)盒內(nèi)的TR元件在受脅迫和/或垂死細(xì)胞中表現(xiàn)選擇性翻譯，其中在用表達(dá)盒轉(zhuǎn)化的ΗΕΚ293細(xì)胞系的約96%、 97 %、98 %、99 %、99. 5 %或99. 9 %的細(xì)胞中觀察到mRNA翻譯，并且表達(dá)盒的第一 ORF的翻譯水平是在處理之后由缺乏可操作地連接的TR元件的相同表達(dá)盒轉(zhuǎn)錄和翻譯時(shí)同一 ORF 的翻譯水平的約 55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或 95%。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，TR元件是pip IRES元件，其不指導(dǎo)PIRP-M或PIRP-L 的翻譯。在其它實(shí)施方案中，TR元件不是來源于pip IRES。在一些實(shí)施方案中，哺乳動物細(xì)胞用核酸表達(dá)盒穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，所述核酸表達(dá)盒包含組成型啟動子和可操作地連接到啟動子的核苷酸序列，該序列編碼報(bào)告基因。用這種表達(dá)盒轉(zhuǎn)化允許鑒定出表現(xiàn)不同翻譯譜的所需的哺乳動物細(xì)胞亞群。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，這種細(xì)胞亞群表現(xiàn)不同的帽依賴性翻譯譜?？墒褂迷诓溉閯游锛?xì)胞中可操作的任何組成型啟動子。在一些實(shí)施方案中，組成型啟動子選自由勞斯肉瘤病毒(RSV)長末端重復(fù) (LTR)啟動子、巨細(xì)胞病毒即刻早期基因(CMV)啟動子、猿猴病毒40早期(SV40E)啟動子、 細(xì)胞質(zhì)β-肌動蛋白啟動子、腺病毒主要晚期啟動子和磷酸甘油激酶(PGK)啟動子組成的群組。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，組成型啟動子選自由SV40E啟動子、CMV啟動子和細(xì)胞質(zhì) β-肌動蛋白啟動子組成的群組。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，組成型啟動子是細(xì)胞質(zhì)β-肌動蛋白啟動子。在又一優(yōu)選實(shí)施方案中，組成型啟動子是CMV啟動子。本發(fā)明的核酸表達(dá)盒在5'到3'方向上具有以下元件編碼在受脅迫和/或垂死細(xì)胞中選擇性翻譯的mRNA分子的TR元件，和可操作地連接到TR元件的核苷酸序列，該序列編碼報(bào)告基因并從TR元件翻譯；或( 組成型啟動子，和可操作地連接到啟動子的核苷酸序列，該序列編碼報(bào)告基因。另外，表達(dá)盒還可包括以下元件TR元件5'端的至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄效應(yīng)子序列；含有本領(lǐng)域中常見的限制性酶位點(diǎn)的側(cè)接TR元件的3'序列；和/或聚腺苷酸化序列。在一些所述實(shí)施方案中，本發(fā)明的表達(dá)盒包含調(diào)節(jié)基因表達(dá)的上游轉(zhuǎn)錄效應(yīng)子序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)錄效應(yīng)子序列是哺乳動物啟動子。此外，轉(zhuǎn)錄效應(yīng)子還可包括額外啟動子序列和/或轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子，諸如增強(qiáng)子和沉默子或其組合。這些轉(zhuǎn)錄效應(yīng)子序列可包括已知與細(xì)胞組分結(jié)合的部分，該細(xì)胞組分調(diào)節(jié)任何可操作地連接的編碼序列的轉(zhuǎn)錄。 例如，增強(qiáng)子或沉默子序列可包括與已知細(xì)胞組分(諸如轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白)結(jié)合的序列。轉(zhuǎn)錄效應(yīng)子序列可選自任何適合的核酸，諸如基因組DNA、質(zhì)粒DNA、病毒DNA、mRNA或cDNA，或任何適合的生物體(例如，病毒、細(xì)菌、酵母、真菌、植物、昆蟲或哺乳動物)。基于所利用的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯系統(tǒng)來選擇適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄效應(yīng)子序列在本領(lǐng)域的技能范圍之內(nèi)。任何個(gè)別調(diào)節(jié)序列都可按野生型排列(如按天然基因組的順序存在)或按人工排列來排列在轉(zhuǎn)錄效應(yīng)子元件內(nèi)。例如，經(jīng)過修飾的增強(qiáng)子或啟動子序列可包括調(diào)節(jié)序列的重復(fù)單元使得來自載體的轉(zhuǎn)錄活性通過這些變化而修飾。在一個(gè)實(shí)施方案中，含TR的表達(dá)盒中所使用的啟動子選自組成型、組織特異性和腫瘤特異性啟動子。組成型啟動子可選自例如勞斯肉瘤病毒(RSV)長末端重復(fù)(LTR)啟動子、巨細(xì)胞病毒即刻早期基因(CMV)啟動子、猿猴病毒40早期(SV40E)啟動子、細(xì)胞質(zhì) β-肌動蛋白啟動子、腺病毒主要晚期啟動子和磷酸甘油激酶(PGK)啟動子。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，組成型啟動子是CMV啟動子。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，組成型啟動子是SV40E啟動子。組織特異性啟動子可選自例如轉(zhuǎn)鐵蛋白(TF)、酪氨酸酶(TYR)、白蛋白(ALB)、肌肌酸激酶(CKM)、髓磷脂堿性蛋白(MBP)、神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)和突觸蛋白I(SYNl)啟動子。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，組織特異性啟動子是突觸蛋白I(SYm)啟動子。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，組織特異性啟動子是ALB啟動子。腫瘤特異性啟動子包括但不限于用于血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、VEGF受體(即， KDR、E-選擇素或endoglin)、α -甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、erbB2 (v-erb_b2成紅細(xì)胞白血病病毒同源癌基因幻、骨鈣素(骨Y-羧基谷氨酸蛋白；BGLAP)、SLP1 (分泌性白細(xì)胞蛋白酶抑制劑或抗白細(xì)胞蛋白酶1)、低氧反應(yīng)元件(HRE)、L-plastin(淋巴細(xì)胞胞漿蛋白1)和己糖激酶II(HK2)的啟動子。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，腫瘤特異性啟動子是α -甲胎蛋白(AFP)啟動子。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，腫瘤特異性啟動子是SLPl啟動子。在一些實(shí)施方案中，分離特異性轉(zhuǎn)錄效應(yīng)子元件并且然后可操作地連接到最小啟動子以產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄活性依賴于單一類型或有限類型細(xì)胞反應(yīng)(例如，熱休克反應(yīng)或金屬調(diào)節(jié)元件)的表達(dá)盒。在附加的實(shí)施方案中，表達(dá)盒可包含物種特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列。這種DNA調(diào)節(jié)序列可基于表達(dá)盒將會插入其中的細(xì)胞類型來選擇，并且可從原核或真核細(xì)胞(包括但不限于細(xì)菌、酵母、植物、昆蟲、哺乳動物細(xì)胞)分離或從病毒分離。在此類例子中，將選擇哺乳動物啟動子以在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)所選的核酸。用于報(bào)告蛋白的開放閱讀框序列置于表達(dá)盒中TR元件或組成型啟動子的3'端。 用于報(bào)告蛋白的核酸序列可為全基因組序列(例如，包括內(nèi)含子)、合成核酸或編碼報(bào)告蛋白的基因的cDNA拷貝。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，報(bào)告蛋白的cDNA序列由于通過去除mRNA 剪接位點(diǎn)使基因組復(fù)雜度降低而用于本發(fā)明的目的。如本文所述，報(bào)告基因編碼賦予細(xì)胞可檢測的生物化學(xué)或可視覺觀察的(例如， 熒光)表型的產(chǎn)物。報(bào)告蛋白還可包括融合或雜合多肽，其中另一多肽在所述多肽或其片段的N末端或C末端融合。通過將編碼一種多肽的核酸序列(或其一部分)與編碼另一多肽的核酸序列(或其一部分)一起在框內(nèi)克隆來產(chǎn)生融合多肽。用于產(chǎn)生融合多肽的技術(shù)在本領(lǐng)域是已知的，并且包括接合編碼多肽的編碼序列使得它們是框內(nèi)的，并且融合多肽的翻譯處在TR盒的控制之下或它的轉(zhuǎn)錄處在組成型啟動子的控制之下。例如，將pip ORF與增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP) ORF 一起在框內(nèi)克隆產(chǎn)生融合蛋白，其被用于監(jiān)測所述融合蛋白在培養(yǎng)細(xì)胞中的表達(dá)、亞細(xì)胞定位和生物效應(yīng)((Candour S等Gli乂200 40 (3) 300-11 ；Boucher S 等 J Neurosci(2002)22(5) :1772-83)。一種常用類型的報(bào)告基因編碼酶或其它生物化學(xué)標(biāo)志物，其在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)時(shí)引起細(xì)胞或細(xì)胞環(huán)境中的可視變化。這種變化可被直接觀察，可涉及添加被轉(zhuǎn)化成可檢測產(chǎn)物的適當(dāng)?shù)孜?，或者涉及代謝示蹤劑的添加和結(jié)合。這些報(bào)告基因的例子有編碼 β-半乳糖苷酶(β-gal)的細(xì)菌IacZ基因、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)、熒火蟲熒光素酶(鞘翅目甲蟲)、海腎熒光素酶(海腎)、GaUSSia熒光素酶、單純皰疹病毒1胸苷激酶(HSVl-TK) 和突變的單純皰疹病毒1胸苷激酶(HSVl-sr39tk)基因。在β-gal的情況下，用鹵素衍生化半乳糖孵育表達(dá)細(xì)胞產(chǎn)生可用組織化學(xué)方法或熒光法檢測和定量的著色或熒光產(chǎn)物。 在CAT的情況下，用放射性標(biāo)記的氯霉素或另一乙?；w分子諸如乙酰輔酶A孵育細(xì)胞裂解物，并用色譜分析法測定乙?；穆让顾禺a(chǎn)物。其它有用的報(bào)告基因編碼天然發(fā)熒光的蛋白質(zhì)，包括綠色熒光蛋白(GFP)、增強(qiáng)型黃色熒光蛋白(EYFP)或單體紅色熒光蛋白 (mRFPl)。如以上可見，示例性報(bào)告基因可選自熒光素酶、GFP、EYFP, mRFPl、β -Gal和CAT， 但也可使用本領(lǐng)域中已知的任何其它的報(bào)告基因。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，報(bào)告基因是熒火蟲熒光素酶。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，報(bào)告基因是海腎熒光素酶。在又一優(yōu)選的實(shí)施方案中，報(bào)告基因是Gaussia熒光素酶?？捎糜诒景l(fā)明中的另一報(bào)告蛋白是G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)，它是一種將激素或配體結(jié)合轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞內(nèi)信號的整合膜蛋白。在所有動物、昆蟲和植物中都發(fā)現(xiàn)有GPCR。GPCR 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在調(diào)節(jié)多種生理功能(包括光轉(zhuǎn)導(dǎo)、嗅覺、神經(jīng)傳遞、血管張力、心輸出量、消化、 疼痛和體液與電解質(zhì)平衡)中起作用。盡管GPCR參與多種生理功能，但它們共享許多共同的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。它們含有七個(gè)膜域，其通過交替的胞內(nèi)環(huán)與胞外環(huán)和可變長度的胞內(nèi)羧基末端尾來橋接。GPCR的羧基末端尾開始于跨膜7之后，并且在許多GPCR中，它在緊接標(biāo)志第七個(gè)跨膜域的末端的保守NPXXY基序之后開始。羧基末端尾可較長(大約數(shù)幾十到幾百個(gè)氨基酸)、較短(大約幾十個(gè)氨基酸)或幾乎不存在(少于大約十個(gè)氨基酸)。它還可含有 (多個(gè))棕櫚?；陌腚装彼釟埢Ｈ魏蜧蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)都可用于本發(fā)明的方法中，諸如已知的GPCR、未知的或孤兒GPCR，和嵌合的或修飾的GPCR，但優(yōu)選是對其存在已知配體或針對受體的抗體的 GPCR0可與本發(fā)明一起使用的已知GPCR的非限制性列表示出在表1。表1
類型配體數(shù)目組織生理機(jī)能
權(quán)利要求
1.一種用于鑒定所需的哺乳動物細(xì)胞亞群的方法，其中所述方法包括用至少一種毒素處理哺乳動物細(xì)胞亞組以形成毒素處理細(xì)胞，用包含以下任一項(xiàng)的核酸表達(dá)盒穩(wěn)定轉(zhuǎn)化所述哺乳動物細(xì)胞(1)編碼在受脅迫和/或垂死細(xì)胞中選擇性翻譯的 mRNA分子的TR元件，和可操作地連接到所述TR元件的核苷酸序列，該序列編碼報(bào)告基因并從所述TR元件翻譯；或( 組成型啟動子和可操作地連接到所述啟動子的核苷酸序列，該序列編碼報(bào)告基因；測定相比于參照標(biāo)準(zhǔn)所表達(dá)的所述報(bào)告蛋白水平的所述毒素處理細(xì)胞中由所述報(bào)告基因編碼的報(bào)告蛋白的水平，以鑒定所述哺乳動物細(xì)胞亞組是否表現(xiàn)所述所需哺乳動物細(xì)胞亞群的表型；如果所述哺乳動物細(xì)胞的所述毒素處理細(xì)胞表現(xiàn)所述所需哺乳動物細(xì)胞亞群的表型， 那么從所述哺乳動物細(xì)胞分離至少一個(gè)細(xì)胞以形成細(xì)胞培養(yǎng)物；使所述細(xì)胞培養(yǎng)物生長以形成哺乳動物細(xì)胞亞群；和任選地，用所述至少一種毒素處理所述哺乳動物細(xì)胞亞群，并重復(fù)所述測定、分離和生長步驟直到鑒定出所述所需的哺乳動物細(xì)胞亞群。
2.一種用于鑒定哺乳動物細(xì)胞翻譯是否對一種物質(zhì)有抗性或用于測定一種物質(zhì)是否對哺乳動物細(xì)胞有毒性的方法，所述方法包括用包含以下任一項(xiàng)的核酸表達(dá)盒穩(wěn)定轉(zhuǎn)化所述哺乳動物細(xì)胞以形成穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞 (1)編碼在受脅迫和/或垂死細(xì)胞中選擇性翻譯的mRNA分子的TR元件，和可操作地連接到所述TR元件的核苷酸序列，該序列編碼報(bào)告基因并從所述TR元件翻譯；或( 組成型啟動子和可操作地連接到所述啟動子的核苷酸序列，該序列編碼報(bào)告基因；用至少一種毒素處理穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的哺乳動物細(xì)胞的亞組以形成毒素處理細(xì)胞；測定相比于參照標(biāo)準(zhǔn)所表達(dá)的所述報(bào)告蛋白水平的所述毒素處理細(xì)胞中由所述報(bào)告基因編碼的報(bào)告蛋白的水平，以鑒定所述穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的哺乳動物細(xì)胞亞組是否表現(xiàn)所述所需哺乳動物細(xì)胞亞群的表型；如果所述哺乳動物細(xì)胞的所述毒素處理細(xì)胞表現(xiàn)所述所需哺乳動物細(xì)胞亞群的表型， 那么從所述穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的哺乳動物細(xì)胞分離至少一個(gè)細(xì)胞以形成細(xì)胞培養(yǎng)物；使所述細(xì)胞培養(yǎng)物生長以形成哺乳動物細(xì)胞亞群；任選地，用所述至少一種毒素處理所述哺乳動物細(xì)胞亞群，并重復(fù)所述測定、分離和生長步驟直到鑒定出所述所需的哺乳動物細(xì)胞亞群；使所述所需的哺乳動物細(xì)胞亞群與所述物質(zhì)接觸；和所述所需的哺乳動物細(xì)胞亞群與所述物質(zhì)接觸后，檢測所述報(bào)告蛋白的存在或測定所述報(bào)告蛋白的水平，其中與未暴露于所述物質(zhì)的對照哺乳動物細(xì)胞相比，所述物質(zhì)的毒性和哺乳動物細(xì)胞翻譯對所述物質(zhì)的抗性和所述報(bào)告蛋白的存在或所述報(bào)告蛋白的水平增加相關(guān)，并且與未暴露于所述物質(zhì)的對照哺乳動物細(xì)胞相比，所述物質(zhì)毒性的缺乏和哺乳動物細(xì)胞翻譯對所述物質(zhì)抗性的缺乏和不存在所述報(bào)告蛋白或所述報(bào)告蛋白的水平降低相關(guān)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述組成型啟動子選自由CMV、PGK和 β-肌動蛋白組成的組。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述組成型啟動子是CMV啟動子。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的方法，其中在mRNA翻譯活性處于它的峰值時(shí)測定所述哺乳動物細(xì)胞亞群中所述報(bào)告蛋白的水平。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中在用所述至少一種毒素處理所述哺乳動物細(xì)胞后至少6小時(shí)時(shí)測定所述哺乳動物細(xì)胞亞群中所述報(bào)告蛋白的水平。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中在用所述至少一種毒素處理所述哺乳動物細(xì)胞后 6小時(shí)到約30小時(shí)的時(shí)間點(diǎn)測定所述哺乳動物細(xì)胞亞群中所述報(bào)告蛋白的水平。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述哺乳動物細(xì)胞亞群是I類細(xì)胞，其特征在于所述報(bào)告蛋白的水平大于所述參照標(biāo)準(zhǔn)中所述報(bào)告蛋白水平高達(dá)500%，所述參照標(biāo)準(zhǔn)是用所述核酸表達(dá)盒穩(wěn)定轉(zhuǎn)化而未用所述至少一種毒素處理的哺乳動物細(xì)胞。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述哺乳動物細(xì)胞亞群是II類細(xì)胞， 其特征在于所述報(bào)告蛋白的水平大于所述參照標(biāo)準(zhǔn)中所述報(bào)告蛋白水平的500%以上且不超過1，400%，所述參照標(biāo)準(zhǔn)是用所述核酸表達(dá)盒穩(wěn)定轉(zhuǎn)化而未用所述至少一種毒素處理的哺乳動物細(xì)胞。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述哺乳動物細(xì)胞亞群是III類細(xì)胞，其特征在于所述報(bào)告蛋白的水平大于所述參照標(biāo)準(zhǔn)中所述報(bào)告蛋白水平的1，400%以上且不超過75，000%，所述參照標(biāo)準(zhǔn)是用所述核酸表達(dá)盒穩(wěn)定轉(zhuǎn)化而未用所述至少一種毒素處理的哺乳動物細(xì)胞。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的方法，其中用至少兩種毒素的組合來處理所述哺乳動物細(xì)胞。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述至少兩種毒素的組合選自由cAMP、TPA、紫杉醇、MG132、毒胡蘿卜素、諾考達(dá)唑、長春花堿、鈣離子載體A23167、秋水仙堿、硼替佐米、和美新和4-氧喹啉-3-羧酸衍生物抗生素組成的組。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的方法，其中用至少三種毒素的組合來處理所述哺乳動物細(xì)胞。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述至少三種毒素的組合選自由cAMP、TPA、紫杉醇、MG132、毒胡蘿卜素、諾考達(dá)唑、長春花堿、鈣離子載體A23167、秋水仙堿、硼替佐米、和美新和4-氧喹啉-3-羧酸衍生物抗生素組成的組。
15.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的方法，其中用至少五種毒素的組合來處理所述哺乳動物細(xì)胞。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述至少五種毒素的組合選自由cAMP、TPA、紫杉醇、MG132、毒胡蘿卜素、諾考達(dá)唑、長春花堿、鈣離子載體A23167、秋水仙堿、硼替佐米、和美新和4-氧喹啉-3-羧酸衍生物抗生素組成的組。
17.根據(jù)權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述哺乳動物細(xì)胞是癌細(xì)胞或癌干細(xì)胞。
18.根據(jù)權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述哺乳動物細(xì)胞是人原代細(xì)胞或鼠原代細(xì)胞。
19.根據(jù)權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述哺乳動物細(xì)胞選自由HEK293、 HT1080、NTERA-2D、HeLa, Caco2、H印G2、HCT116、MDA231、U2 OS、DU145、LNCaP, LoVo, MiaPaCa2、AsPCl、MCF-7、PC3、Capan-2、C0L0201、C0L0205、H4、HuTu80 和 SK-N-MC 組成的組。
20.根據(jù)權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述哺乳動物細(xì)胞是胚胎干細(xì)胞。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述胚胎干細(xì)胞是鼠胚胎干細(xì)胞mES或人胚胎干細(xì)胞hES。
22.根據(jù)權(quán)利要求1-21中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述報(bào)告基因選自由EGFP、GFP、 EYFP、熒火蟲熒光素酶、Gaussia熒光素酶、海腎熒光素酶、LacZ, CAT、TK和TKsr39組成的組。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述報(bào)告基因是熒火蟲熒光素酶。
24.根據(jù)權(quán)利要求1-23中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述TR元件是鼠源的或人源的。
25.根據(jù)權(quán)利要求對所述的方法，其中所述TR元件選自由SEQID N0:1(小鼠pip TR)、SEQ ID NO 2(小鼠 dm TR)、SEQ ID NO :3 (人 pip TR)和 SEQ ID NO :4 (人 dm TR)組成的組。
26.根據(jù)權(quán)利要求1-25中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述毒素選自由cAMP、TPA、紫杉醇、 MG132、毒胡蘿卜素、諾考達(dá)唑、長春花堿、鈣離子載體A23167、秋水仙堿、硼替佐米、和美新和4-氧喹啉-3-羧酸衍生物抗生素組成的組。
27.根據(jù)權(quán)利要求116中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述篩選包括微量酶標(biāo)儀分析、熒光顯微鏡技術(shù)、免疫組織化學(xué)、ELISA、光度計(jì)、FACS或分光光度計(jì)。
28.根據(jù)權(quán)利要求1-27中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述哺乳動物細(xì)胞亞群的分離包括通過亞克隆的單集落分離。
29.一種哺乳動物細(xì)胞亞群，其通過根據(jù)權(quán)利要求1或346中任一項(xiàng)所述的方法所獲得。
30.一種I類哺乳動物細(xì)胞，其通過根據(jù)權(quán)利要求8或11- 中任一項(xiàng)所述的方法所獲得。
31.一種II類哺乳動物細(xì)胞，其通過根據(jù)權(quán)利要求9或11- 中任一項(xiàng)所述的方法所獲得。
32.—種III類哺乳動物細(xì)胞，其通過根據(jù)權(quán)利要求10-28中任一項(xiàng)所述的方法所獲得。
33.一種適用于毒性試驗(yàn)的試劑盒，其包含通過根據(jù)權(quán)利要求9或11- 中任一項(xiàng)所述的方法所獲得的II類哺乳動物細(xì)胞或其細(xì)胞裂解物；和所述試劑盒的使用說明書。
34.一種適用于毒性試驗(yàn)的試劑盒，其包含通過根據(jù)權(quán)利要求10-28中任一項(xiàng)所述的方法所獲得的III類哺乳動物細(xì)胞或其細(xì)胞裂解物；和所述試劑盒的使用說明書。
35.一種用于重組表達(dá)目標(biāo)多肽的方法，所述方法包括向根據(jù)權(quán)利要求32所述的III類哺乳動物細(xì)胞中引入第二核酸表達(dá)盒，所述表達(dá)盒包含以下任一項(xiàng)(1)編碼在受脅迫和/或垂死細(xì)胞中選擇性翻譯的mRNA分子的TR元件，和可操作地連接到所述TR元件的核苷酸序列，該序列編碼報(bào)告基因并從所述TR元件翻譯；或 (2)組成型啟動子和可操作地連接到所述啟動子的核苷酸序列，該序列編碼報(bào)告基因；使表達(dá)所述第二核酸表達(dá)盒的所述哺乳動物細(xì)胞在允許表達(dá)所述目標(biāo)多肽的條件下生長；和純化所述目標(biāo)多肽。
36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中所述組成型啟動子選自由CMV、PGK和β-肌動蛋白組成的組。
37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中所述組成型啟動子是CMV啟動子。
38.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中兩個(gè)表達(dá)盒中的所述TR元件是相同的。
39.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中兩個(gè)表達(dá)盒中的所述TR元件是不同的。
40.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中用哺乳動物病毒載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化或感染所述第二表達(dá)盒。
41.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中所述第二表達(dá)盒被穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。
42.根據(jù)權(quán)利要求35-41中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述TR元件選自由SEQID NO=U SEQ ID NO :2、SEQ ID NO 3 和 SEQ ID NO 4 組成的組。
43.根據(jù)權(quán)利要求35-42中任一項(xiàng)所述的方法，其中使所述哺乳動物細(xì)胞生長的所述步驟包括將所述III類哺乳動物細(xì)胞暴露于至少一種毒素。
44.根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其中所述毒素選自由cAMP、TPA、紫杉醇、MG132、毒胡蘿卜素、諾考達(dá)唑、長春花堿、鈣離子載體A23167、秋水仙堿、硼替佐米、和美新和4-氧喹啉-3-羧酸衍生物抗生素組成的組。
45.根據(jù)權(quán)利要求35-42中任一項(xiàng)所述的方法，其中使所述哺乳動物細(xì)胞生長的所述步驟包括將所述III類哺乳動物細(xì)胞暴露于至少兩種毒素的組合。
46.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中所述至少兩種毒素的組合選自由cAMP、TPA、紫杉醇、MG132、毒胡蘿卜素、諾考達(dá)唑、長春花堿、鈣離子載體A23167、秋水仙堿、硼替佐米、和美新和4-氧喹啉-3-羧酸衍生物抗生素組成的組。
47.根據(jù)權(quán)利要求35-42中任一項(xiàng)所述的方法，其中使所述哺乳動物細(xì)胞生長的所述步驟包括在至少五種毒素的組合的存在下培養(yǎng)所述III類哺乳動物細(xì)胞。
48.根據(jù)權(quán)利要求47所述的方法，其中所述至少五種毒素的組合選自由cAMP、TPA、紫杉醇、MG132、毒胡蘿卜素、諾考達(dá)唑、長春花堿、鈣離子載體A23167、秋水仙堿、硼替佐米、和美新和4-氧喹啉-3-羧酸衍生物抗生素組成的組。
49.一種用于鑒定在非帽依賴性翻譯的調(diào)節(jié)中所涉及的蛋白質(zhì)的方法，所述方法包括用至少一種毒素處理哺乳動物細(xì)胞以形成毒素處理細(xì)胞，用包含以下項(xiàng)的核酸表達(dá)盒穩(wěn)定轉(zhuǎn)化所述哺乳動物細(xì)胞編碼在受脅迫和/或垂死細(xì)胞中選擇性翻譯的mRNA分子的 TR元件，和可操作地連接到所述TR元件的核苷酸序列，該序列編碼報(bào)告基因并從所述TR元件翻譯；從所述毒素處理細(xì)胞制備細(xì)胞裂解物；分離編碼所述TR元件和可操作地連接到所述TR元件的所述核苷酸序列的mRNA ； 使所述mRNA和來自所述細(xì)胞裂解物的蛋白質(zhì)接觸以形成與所述mRNA結(jié)合的蛋白質(zhì)；和鑒定與所述mRNA結(jié)合的所述蛋白質(zhì)。
50.根據(jù)權(quán)利要求49所述的方法，其中所述哺乳動物細(xì)胞是通過根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法鑒定的細(xì)胞。
51.根據(jù)權(quán)利要求49所述的方法，其中所述哺乳動物細(xì)胞是通過根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法鑒定的細(xì)胞。
52.根據(jù)權(quán)利要求49所述的方法，其中所述哺乳動物細(xì)胞是通過根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法鑒定的細(xì)胞。
53.根據(jù)權(quán)利要求49-52中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述鑒定蛋白質(zhì)的方法包括 Southernffestern免疫印跡、Western免疫印跡、蛋白質(zhì)提取、抗體超遷移試驗(yàn)或微質(zhì)譜測序。
54.一種用來產(chǎn)生目標(biāo)多肽的哺乳動物細(xì)胞，所述目標(biāo)多肽通過包括以下步驟的方法獲得向根據(jù)權(quán)利要求32所述的III類哺乳動物細(xì)胞中引入第二核酸表達(dá)盒，所述表達(dá)盒包含以下任一項(xiàng)(1)編碼在受脅迫和/或垂死細(xì)胞中選擇性翻譯的mRNA分子的TR元件，和可操作地連接到所述TR元件的核苷酸序列，該序列編碼報(bào)告基因并從所述TR元件翻譯；或 (2)組成型啟動子和可操作地連接到所述啟動子的核苷酸序列，該序列編碼報(bào)告基因；和使表達(dá)所述第二核酸表達(dá)盒的所述哺乳動物細(xì)胞在允許表達(dá)所述目標(biāo)多肽的條件下生長。
55.根據(jù)權(quán)利要求M所述的哺乳動物細(xì)胞，其中所述組成型啟動子選自由CMV、PGK和 β-肌動蛋白組成的組。
56.根據(jù)權(quán)利要求55所述的哺乳動物細(xì)胞，其中所述組成型啟動子是CMV啟動子。
57.根據(jù)權(quán)利要求Μ-56中任一項(xiàng)所述的哺乳動物細(xì)胞，其中所述報(bào)告基因是熒火蟲熒光素酶。
58.根據(jù)權(quán)利要求Μ-57中任一項(xiàng)所述的哺乳動物細(xì)胞，其中兩個(gè)表達(dá)盒中的所述TR 元件是相同的。
59.根據(jù)權(quán)利要求Μ-57中任一項(xiàng)所述的哺乳動物細(xì)胞，其中兩個(gè)表達(dá)盒中的所述TR 元件是不同的。
60.根據(jù)權(quán)利要求Μ-59中任一項(xiàng)所述的哺乳動物細(xì)胞，其中所述第二表達(dá)盒被瞬時(shí)轉(zhuǎn)化。
61.根據(jù)權(quán)利要求Μ-59中任一項(xiàng)所述的哺乳動物細(xì)胞，其中所述第二表達(dá)盒被瞬時(shí)轉(zhuǎn)化。
62.根據(jù)權(quán)利要求Μ-61中任一項(xiàng)所述的哺乳動物細(xì)胞，其中所述TR元件是鼠源的或人源的。
63.根據(jù)權(quán)利要求62所述的哺乳動物細(xì)胞，其中所述TR元件選自由SEQID NO=USEQ ID NO :2、SEQ ID NO 3 和 SEQ ID NO 4 組成的組。
64.一種用于驗(yàn)證I類、II類或III類哺乳動物細(xì)胞保留它們的表型的方法，所述方法包括用至少一種毒素處理根據(jù)權(quán)利要求四-32中任一項(xiàng)所述的哺乳動物細(xì)胞的亞組； 測定相比于參照標(biāo)準(zhǔn)所表達(dá)的所述報(bào)告蛋白水平的所述哺乳動物細(xì)胞亞組中由所述報(bào)告基因編碼的報(bào)告蛋白的水平；驗(yàn)證所述哺乳動物細(xì)胞保留它們的表型，其中所述I類細(xì)胞的特征在于所述報(bào)告蛋白的表達(dá)大于未曾用所述毒素處理的所述哺乳動物細(xì)胞中所述報(bào)告蛋白表達(dá)高達(dá)500%，所述II類細(xì)胞的特征在于所述報(bào)告蛋白的表達(dá)大于未曾用所述毒素處理的所述哺乳動物細(xì)胞中所述報(bào)告蛋白表達(dá)的500%以上到1400%，并且所述III類細(xì)胞的特征在于所述報(bào)告蛋白的表達(dá)大于未曾用所述毒素處理的所述哺乳動物細(xì)胞中所述報(bào)告蛋白表達(dá)的1400% 以上到約75000% ο
65.一種用于測定一種物質(zhì)抑制哺乳動物細(xì)胞中蛋白質(zhì)翻譯的能力的方法，其中所述方法包括使根據(jù)權(quán)利要求30-32中任一項(xiàng)所述的哺乳動物細(xì)胞與所述物質(zhì)接觸；和測定相比于未曾用所述物質(zhì)處理的所述細(xì)胞所產(chǎn)生的所述報(bào)告蛋白表達(dá)的與所述物質(zhì)接觸后由所述哺乳動物細(xì)胞所產(chǎn)生的所述報(bào)告蛋白的表達(dá)，其中由所述物質(zhì)處理細(xì)胞所產(chǎn)生的所述報(bào)告蛋白的表達(dá)相比于未曾用所述物質(zhì)處理的所述細(xì)胞所產(chǎn)生的所述報(bào)告蛋白表達(dá)的減少表明所述物質(zhì)抑制蛋白質(zhì)翻譯。
66.一種用于測定一種物質(zhì)抑制哺乳動物細(xì)胞中蛋白質(zhì)翻譯的能力的方法，其中所述方法包括用至少一種毒素處理哺乳動物細(xì)胞亞組以形成毒素處理細(xì)胞，用包含以下任一項(xiàng)的核酸表達(dá)盒穩(wěn)定轉(zhuǎn)化所述哺乳動物細(xì)胞(1)編碼在受脅迫和/或垂死細(xì)胞中選擇性翻譯的 mRNA分子的TR元件，和可操作地連接到所述TR元件的核苷酸序列，該序列編碼報(bào)告基因并從所述TR元件翻譯；或( 組成型啟動子和可操作地連接到所述啟動子的核苷酸序列，該序列編碼報(bào)告基因；測定相比于參照標(biāo)準(zhǔn)所表達(dá)的所述報(bào)告蛋白水平的所述毒素處理細(xì)胞中由所述報(bào)告基因編碼的報(bào)告蛋白的水平，以鑒定所述哺乳動物細(xì)胞亞組是否表現(xiàn)所述所需哺乳動物細(xì)胞亞群的表型；如果所述哺乳動物細(xì)胞的所述毒素處理細(xì)胞表現(xiàn)所述所需哺乳動物細(xì)胞亞群的表型， 那么從所述哺乳動物細(xì)胞分離至少一個(gè)細(xì)胞以形成細(xì)胞培養(yǎng)物；使所述細(xì)胞培養(yǎng)物生長以形成哺乳動物細(xì)胞亞群；和任選地，用所述至少一種毒素處理所述哺乳動物細(xì)胞的亞群，并重復(fù)所述測定、分離和生長步驟直到鑒定出所述所需的哺乳動物細(xì)胞亞群；使所述所需的哺乳動物細(xì)胞亞群與所述物質(zhì)接觸；和測定相比于未曾用所述物質(zhì)處理的所述細(xì)胞所產(chǎn)生的所述報(bào)告蛋白表達(dá)的與所述物質(zhì)接觸后由所述所需的哺乳動物細(xì)胞亞群所產(chǎn)生的所述報(bào)告蛋白的表達(dá)，其中由所述物質(zhì)處理細(xì)胞所產(chǎn)生的所述報(bào)告蛋白的表達(dá)相比于未曾用所述物質(zhì)處理的所述細(xì)胞所產(chǎn)生的所述報(bào)告蛋白表達(dá)的減少表明所述物質(zhì)抑制蛋白質(zhì)翻譯。
67.根據(jù)權(quán)利要求65-66中任一項(xiàng)所述的方法，其中用包含以下項(xiàng)的核酸表達(dá)盒穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的所述哺乳動物細(xì)胞被用來測定所述物質(zhì)抑制非帽依賴性翻譯的能力編碼在受脅迫和/或垂死細(xì)胞中選擇性翻譯的mRNA分子的TR元件，和可操作地連接到所述TR元件的核苷酸序列，該序列編碼報(bào)告基因并從所述TR元件翻譯。
68.根據(jù)權(quán)利要求65-66中任一項(xiàng)所述的方法，其中用包含以下項(xiàng)的核酸表達(dá)盒穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的所述哺乳動物細(xì)胞被用來測定所述物質(zhì)抑制帽依賴性翻譯的能力組成型啟動子和可操作地連接到所述啟動子的核苷酸序列，該序列編碼報(bào)告基因。
69.根據(jù)權(quán)利要求65、66或68中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述組成型啟動子選自由 CMV、PGK和β -肌動蛋白組成的組。
70.根據(jù)權(quán)利要求69所述的方法，其中所述組成型啟動子是CMV啟動子。
71.一種用于恢復(fù)所需哺乳動物細(xì)胞亞群的表型的方法，其中所述方法包括培養(yǎng)所述哺乳動物細(xì)胞的至少一個(gè)亞組以形成培養(yǎng)細(xì)胞，其中用核酸表達(dá)盒穩(wěn)定轉(zhuǎn)化所述哺乳動物細(xì)胞，該表達(dá)盒包含選擇標(biāo)記的核苷酸序列和以下任一項(xiàng)(1)編碼在受脅迫和/或垂死細(xì)胞中選擇性翻譯的mRNA分子的TR元件，和可操作地連接到所述TR元件的核苷酸序列，該序列編碼報(bào)告基因并從所述TR元件翻譯；或( 組成型啟動子和可操作地連接到所述啟動子的核苷酸序列，該序列編碼報(bào)告基因；用所述選擇標(biāo)記對其提供抗性的物質(zhì)處理所述培養(yǎng)細(xì)胞，使得不再含有所述核酸表達(dá)盒的所述培養(yǎng)細(xì)胞死亡；使所述處理細(xì)胞生長以形成哺乳動物細(xì)胞亞群；和任選地重復(fù)所述培養(yǎng)、處理和生長步驟，直到恢復(fù)所述所需哺乳動物細(xì)胞亞群的所述表型。
72.根據(jù)權(quán)利要求71所述的方法，其中所述選擇標(biāo)記選自由新霉素、氨芐青霉素、卡那霉素、四環(huán)素、氯霉素、潮霉素B、滅瘟素和G418組成的組。
73.根據(jù)權(quán)利要求71-72中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述組成型啟動子選自由CMV、PGK 和β-肌動蛋白組成的組。
74.根據(jù)權(quán)利要求73所述的方法，其中所述組成型啟動子是CMV啟動子。
75.根據(jù)權(quán)利要求71-74中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述哺乳動物細(xì)胞亞群是I類細(xì)胞，其特征在于所述報(bào)告蛋白的水平大于參照標(biāo)準(zhǔn)中所述報(bào)告蛋白水平高達(dá)500%，所述參照標(biāo)準(zhǔn)是用所述核酸表達(dá)盒穩(wěn)定轉(zhuǎn)化而未用所述至少一種毒素處理的哺乳動物細(xì)胞。
76.根據(jù)權(quán)利要求71-74中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述哺乳動物細(xì)胞亞群是II類細(xì)胞，其特征在于所述報(bào)告蛋白的水平大于參照標(biāo)準(zhǔn)中所述報(bào)告蛋白水平的500%以上且不超過1，400%，所述參照標(biāo)準(zhǔn)是用所述核酸表達(dá)盒穩(wěn)定轉(zhuǎn)化而未用所述至少一種毒素處理的哺乳動物細(xì)胞。
77.根據(jù)權(quán)利要求71-74中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述哺乳動物細(xì)胞亞群是III類細(xì)胞，其特征在于所述報(bào)告蛋白的水平大于參照標(biāo)準(zhǔn)中所述報(bào)告蛋白水平的1，400%且不超過75000%，所述參照標(biāo)準(zhǔn)是用所述核酸表達(dá)盒穩(wěn)定轉(zhuǎn)化而未用所述至少一種毒素處理的哺乳動物細(xì)胞。
78.根據(jù)權(quán)利要求71-77中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述哺乳動物細(xì)胞是癌細(xì)胞或癌干細(xì)胞。
79.根據(jù)權(quán)利要求71-77中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述哺乳動物細(xì)胞是人原代細(xì)胞或鼠原代細(xì)胞。
80.根據(jù)權(quán)利要求71-77中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述哺乳動物細(xì)胞選自由ΗΕΚ293、 ΗΤ1080、NTERA-2D、HeLa, Caco2、H印G2、HCT116、MDA231、U2 OS、DU145、LNCaP, LoVo, MiaPaCa2、AsPCl、MCF-7、PC3、Capan-2、C0L0201、C0L0205、H4、HuTu80 和 SK-N-MC 組成的組。
81.根據(jù)權(quán)利要求71-77中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述哺乳動物細(xì)胞是胚胎干細(xì)胞。
82.根據(jù)權(quán)利要求81所述的方法，其中所述胚胎干細(xì)胞是鼠胚胎干細(xì)胞mES或人胚胎干細(xì)胞hES。
83.根據(jù)權(quán)利要求71-82中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述報(bào)告基因選自由EGFP、GFP、 EYFP、熒火蟲熒光素酶、Gaussia熒光素酶、海腎熒光素酶、LacZ, CAT、TK和TKsr39組成的組。
84.根據(jù)權(quán)利要求83所述的方法，其中所述報(bào)告基因是熒火蟲熒光素酶。
85.根據(jù)權(quán)利要求71-73和75-84中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述TR元件是鼠源的或人源的。
86.根據(jù)權(quán)利要求85所述的方法，其中所述TR元件選自由SEQID N0:1(小鼠pip TR)、SEQ ID NO 2(小鼠 dm TR)、SEQ ID NO :3 (人 pip TR)和 SEQ ID NO :4 (人 dm TR)組成的組。
全文摘要
本發(fā)明大體上涉及具有獨(dú)特核糖體翻譯譜，即翻譯活性的哺乳動物細(xì)胞亞群。本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于鑒定和分離這些細(xì)胞的方法、包含這些細(xì)胞的試劑盒，或利用這些哺乳動物細(xì)胞亞群的不同翻譯活性的方法。
文檔編號C12N15/63GK102395685SQ201080016414
公開日2012年3月28日 申請日期2010年2月18日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月18日
發(fā)明者L·卡洛克, M·齊普赫爾 申請人:韋恩州立大學(xué)