專利名稱：一種乳酸菌發(fā)酵方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種利用植物秸稈纖維素發(fā)酵生產(chǎn)乳酸技術(shù)，特別涉及利用植物 秸稈纖維素部分酶解后作為碳源發(fā)酵生產(chǎn)乳酸的方法。
背景技術(shù)：
乳酸是重要的有機(jī)酸，乳酸、乳酸鹽及其衍生物，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于食品、飼料、醫(yī) 藥、皮革、印染、化工等領(lǐng)域。在食品工業(yè)上廣泛用作酸味劑、防腐劑和還原劑。近年來，在為 消除塑料制品所帶來的“白色污染”所造成的環(huán)境危機(jī)的研究中，開發(fā)出以L-乳酸為單體 經(jīng)化學(xué)合成的生物工程材料聚L-乳酸，是一種生物可降解塑料，可完全為生物降解吸收， 最終形成二氧化碳和水，不污染環(huán)境。由于人體只能代謝L-乳酸，世界衛(wèi)生組織提倡在食 品、醫(yī)藥領(lǐng)域廣泛使用L-乳酸，L-乳酸的需求量在不斷擴(kuò)大。乳酸可以通過化學(xué)合成法、酶法或發(fā)酵法三種方式得到，但是基于發(fā)酵法能夠?qū)?一的得到L-乳酸或D-乳酸，并且清潔無污染，因此發(fā)酵法被廣泛應(yīng)用于L-乳酸的生產(chǎn)。利 用乳酸菌發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸具有高溫發(fā)酵不易染菌，光學(xué)純度高，菌體易于發(fā)酵液分離等特 點(diǎn)，利用乳酸菌發(fā)酵成為大規(guī)模生產(chǎn)L-乳酸的趨勢。為了降低L-乳酸的制備成本，提高乳酸生產(chǎn)質(zhì)量，國內(nèi)外對乳酸生產(chǎn)過程進(jìn)行了 大量研究，主要包括低價(jià)原料的開發(fā)利用，發(fā)酵強(qiáng)度的優(yōu)化，乳酸分離提取工藝的優(yōu)化這 三個(gè)方面。目前用于L-乳酸生產(chǎn)的原料主要有淀粉、蔗糖、葡萄糖、糖蜜等。地球上每年大 約形成1000億噸植物有機(jī)物，是自然界分布最廣，含量最多，價(jià)格低廉而又可再生的資源。 開發(fā)農(nóng)作物秸稈生產(chǎn)乳酸，對于保障糧食安全，具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義和深遠(yuǎn)的歷史意 義。我國每年浪費(fèi)或低質(zhì)量利用的木質(zhì)纖維材料總共約10億噸，其中農(nóng)作物秸稈一項(xiàng)就大 約有7億多噸，其主要成分為纖維素、半纖維素、木質(zhì)素，利用纖維素酶酶解處理農(nóng)作物秸 稈制備秸稈糖，以秸稈糖作為發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的原料，具有廣闊的市場前景。目前秸稈發(fā)酵乳酸多采用分步酶解糖化發(fā)酵法纖維素酶酶解與乳酸發(fā)酵分步進(jìn) 行，缺點(diǎn)是生產(chǎn)周期長，不能消除酶解過程中生成的葡萄糖和纖維二糖對纖維素酶的反饋 抑制作用，不能消除酶解過程中生成的高濃度葡萄糖的葡萄糖效應(yīng)。

發(fā)明內(nèi)容
為解決上述問題，本發(fā)明提供一種乳酸菌的發(fā)酵方法。本發(fā)明提供的乳酸菌的發(fā)酵方法，是利用植物秸稈纖維素部分酶解后作為乳酸 菌發(fā)酵用碳源發(fā)酵生產(chǎn)乳酸，其中所述的植物秸稈纖維素部分酶解后的糖濃度為 IOwt % ο ο其中，所述的酶可選用本領(lǐng)域公知的用于分解纖維素產(chǎn)生糖類的酶，優(yōu)選為纖維素酶。其中，酶解植物秸稈纖維素的溫度為45 55°C，優(yōu)選為50°C，酶解時(shí)間為12 72 小時(shí)，優(yōu)選為M 36小時(shí)，最優(yōu)選為M小時(shí)。
根據(jù)本發(fā)明，用于酶解植物秸稈纖維素的酶的用量為10 30U/g植物秸稈纖維 素，優(yōu)選為20U/g植物秸稈纖維素。根據(jù)本發(fā)明，植物秸稈可以用本領(lǐng)域公知的任何農(nóng)作物的秸稈，優(yōu)選包括麥秸稈、 稻秸稈、玉米秸稈或其他作物秸稈。其中，所述的植物秸稈纖維素在酶解前，優(yōu)選將植物秸稈纖維素按如下方式進(jìn)行 處理1)粗粉碎將植物秸稈粗粉碎后10目過篩；2)純堿煮1 2小時(shí)，然后水洗并中和；3)酸解在90°C，6% HCl酸解1小時(shí)，然后水洗并中和；4)脫水，干燥，最后細(xì)粉碎60目過篩，得到植物秸稈纖維素粉。在本發(fā)明的發(fā)酵培養(yǎng)基中，植物秸稈纖維素的用量為10-20 %重量百分比，優(yōu)選為 15%的重量百分比。本發(fā)明的有益效果同現(xiàn)有技術(shù)將植物纖維素原料徹底酶解(70 80小時(shí))相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明縮短了植物纖維素的酶解時(shí)間。酶解M小時(shí)左右，葡萄糖濃度在3_5%，余 下的纖維素在酶解過程中繼續(xù)酶解。而將植物纖維素徹底酶解需要70-80小時(shí)，葡萄糖濃 度達(dá)到10-15%，而高濃度的葡萄糖對乳酸發(fā)酵具有抑制作用，因而本發(fā)明不但縮短了酶解 時(shí)間，同時(shí)有效解除了高濃度葡萄糖對乳酸菌發(fā)酵乳酸的抑制作用。由于本發(fā)明植物纖維素酶解時(shí)間短，產(chǎn)生的葡萄糖和纖維二糖少，大大減弱了酶 解過程中生成的葡萄糖和纖維二糖對纖維素酶的反饋抑制作用。同現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明乳酸生產(chǎn)周期由136小時(shí)縮短到64小時(shí)，(所述的生產(chǎn) 周期為酶解時(shí)間和發(fā)酵時(shí)間的總和，下同)發(fā)酵水平由3. 6wt%提高到6. 8wt% (發(fā)酵液中 乳酸的質(zhì)量百分比)。此外，本發(fā)明利用植物秸稈做發(fā)酵原料，變廢為寶，降低環(huán)境污染，對 保證糧食安全具有積極意義。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例11)斜面培養(yǎng)將乳酸菌(LactcAaciIlus 1. 2131)(購自中科院微生物所)無菌條 件下接種到斜面培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)40小時(shí)。2)搖瓶種子培養(yǎng)步驟1)培養(yǎng)獲得的乳酸菌菌種接種到種子液體培養(yǎng)基中， 400C，200rpm厭氧培養(yǎng)20小時(shí)。3)發(fā)酵培養(yǎng)將步驟2~)培養(yǎng)獲得的乳酸菌種子接種到乳酸菌發(fā)酵培養(yǎng)液中培養(yǎng)， 接種量為10% (v/v)，40°C，200rpm，厭氧培養(yǎng)。其中，步驟1)使用的培養(yǎng)基方法為秸稈水解糖Iwt %，酵母膏0. 5wt %，蛋白胨0. 5wt %，瓊脂2wt %，自來水配制。其中，步驟2)使用的培養(yǎng)基配方為 秸稈水解糖3wt %，酵母膏0. 5wt %，蛋白胨0. 15wt%,玉米漿0. 5wt %，磷酸二氫鉀0. 05wt %，硫酸鎂0. 06wt %，硫酸錳0. 003wt %，自來水配制。其中，步驟3)使用的培養(yǎng)基配方為秸稈纖維素粉15wt %、酵母膏0. 2wt %，玉米漿wtl %，豆餅粉wtO. 5 %，磷酸氫二 鉀wtO. 05%，硫酸銨wtO. 05%，磷酸二氫鉀wtO. 15%,pH6. O,自來水配制，滅菌后添加纖維 素酶20單位每克秸稈粉，將上述培養(yǎng)基在50°C下酶解M小時(shí)。M小時(shí)后，培養(yǎng)基中糖濃 度為5wt%，接種乳酸菌。發(fā)酵培養(yǎng)過程包括40°C，轉(zhuǎn)速為200rpm，發(fā)酵40小時(shí)，生產(chǎn)周期為64小時(shí)，生產(chǎn) 周期包括酶解M小時(shí)，發(fā)酵40小時(shí)，發(fā)酵水平為6. 8wt %。實(shí)施例21)斜面培養(yǎng)將乳酸菌(LactcAaciIlus 1. 2131)(購自中科院微生物所)無菌條 件下接種到斜面培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)40小時(shí)。2)搖瓶種子培養(yǎng)步驟1)培養(yǎng)獲得的乳酸菌菌種接種到種子液體培養(yǎng)基中， 400C，200rpm厭氧培養(yǎng)20小時(shí)。3)發(fā)酵培養(yǎng)將步驟2~)培養(yǎng)獲得的乳酸菌種子接種到乳酸菌發(fā)酵培養(yǎng)液中培養(yǎng)， 接種量為10% (請選擇定值)(V/V)，40°C，200rpm，厭氧培養(yǎng)。其中，步驟1)使用的培養(yǎng)基方法為秸稈水解糖Iwt %，酵母膏0. 5wt %，蛋白胨0. 5wt %，瓊脂2wt %，自來水配制。其中，步驟2)使用的培養(yǎng)基配方為秸稈水解糖3wt %，酵母膏0. 5wt %，蛋白胨0. 15wt%,玉米漿0. 5wt %，磷酸二氫 鉀0. 05wt %，硫酸鎂0. 06wt %，硫酸錳0. 003wt %，自來水配制。其中，步驟3)使用的培養(yǎng)基配方為秸稈纖維素粉15wt%、酵母膏0. 2wt%，玉米漿wtl%，豆餅粉wtO. 5%，磷酸氫二 鉀wtO. 05%，硫酸銨wtO. 05%，磷酸二氫鉀wtO. 15%,pH6. O,自來水配制，滅菌后添加纖維 素酶20單位每克秸稈粉，將上述培養(yǎng)基在50°C下酶解12小時(shí)。12小時(shí)后，培養(yǎng)基中糖濃 度為Iwt%，接種乳酸菌。發(fā)酵培養(yǎng)過程包括40°C，轉(zhuǎn)速為200rpm，發(fā)酵120小時(shí)。生產(chǎn)周期為132小時(shí)， 生產(chǎn)周期包括酶解12小時(shí)，發(fā)酵120小時(shí)，發(fā)酵水平為4. 2wt%。實(shí)施例31)斜面培養(yǎng)將乳酸菌(LactcAaciIlus 1. 2131)(購自中科院微生物所)無菌條 件下接種到斜面培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)40小時(shí)。2)搖瓶種子培養(yǎng)步驟1)培養(yǎng)獲得的乳酸菌菌種接種到種子液體培養(yǎng)基中， 400C，200rpm厭氧培養(yǎng)20小時(shí)。3)發(fā)酵培養(yǎng)將步驟2~)培養(yǎng)獲得的乳酸菌種子接種到乳酸菌發(fā)酵培養(yǎng)液中培養(yǎng)， 接種量為10% (v/v)，40°C，200rpm，厭氧培養(yǎng)。其中，步驟1)使用的培養(yǎng)基方法為秸稈水解糖lwt%，酵母膏0. 5wt%，蛋白胨0. 5wt%，瓊脂2wt%，自來水配制。其中，步驟2)使用的培養(yǎng)基配方為秸稈水解糖3wt%，酵母膏0. 5wt%，蛋白胨0. 15wt%，玉米漿0. 5wt%，磷酸二氫 鉀0. 05wt %，硫酸鎂0. 06wt %，硫酸錳0. 003wt %，自來水配制。
其中，步驟3)使用的培養(yǎng)基配方為秸稈纖維素粉15wt %、酵母膏0. 2wt %，玉米漿wtl %，豆餅粉wtO. 5 %，磷酸氫二 鉀wtO. 05%，硫酸銨wtO. 05%，磷酸二氫鉀wtO. 15%,pH6. O,自來水配制，滅菌后添加纖維 素酶20單位每克秸稈粉，將上述培養(yǎng)基在50°C下酶解36小時(shí)。36小時(shí)后，培養(yǎng)基中糖濃 度為7. 5wt%，接種乳酸菌。發(fā)酵培養(yǎng)過程包括40°C，轉(zhuǎn)速為200rpm，發(fā)酵44小時(shí)，生產(chǎn)周期為80小時(shí)，生產(chǎn) 周期包括酶解36小時(shí)，發(fā)酵44小時(shí)，發(fā)酵水平為5. Iwt%。實(shí)施例41)斜面培養(yǎng)將乳酸菌(LactcAaciIlus 1. 2131)(購自中科院微生物所)無菌條 件下接種到斜面培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)40小時(shí)。2)搖瓶種子培養(yǎng)步驟1)培養(yǎng)獲得的乳酸菌菌種接種到種子液體培養(yǎng)基中， 40 "C，200rpm厭氧培養(yǎng)20小時(shí)。3)發(fā)酵培養(yǎng)將步驟2~)培養(yǎng)獲得的乳酸菌種子接種到乳酸菌發(fā)酵培養(yǎng)液中培養(yǎng)， 接種量為10% (v/v)，40°C，200rpm，厭氧培養(yǎng)。其中，步驟1)使用的培養(yǎng)基方法為秸稈水解糖Iwt %，酵母膏0. 5wt %，蛋白胨0. 5wt %，瓊脂2wt %，自來水配制。其中，步驟2)使用的培養(yǎng)基配方為秸稈水解糖3wt %，酵母膏0. 5wt %，蛋白胨0. 15wt%,玉米漿0. 5wt %，磷酸二氫 鉀0. 05wt %，硫酸鎂0. 06wt %，硫酸錳0. 003wt %，自來水配制。其中，步驟3)使用的培養(yǎng)基配方為秸稈纖維素粉IOwt %、酵母膏0. 2wt%，玉米漿wtl%，豆餅粉wtO. 5%，磷酸氫二 鉀wtO. 05%，硫酸銨wtO. 05%，磷酸二氫鉀wtO. 15%,pH6. O,自來水配制，滅菌后添加纖維 素酶30單位每克秸稈粉，將上述培養(yǎng)基在55°C下酶解40小時(shí)。40小時(shí)后，培養(yǎng)基中糖濃 度為9wt%，接種乳酸菌。發(fā)酵培養(yǎng)過程包括40°C，轉(zhuǎn)速為200rpm，發(fā)酵46小時(shí)，生產(chǎn)周期為86小時(shí)，生產(chǎn) 周期包括酶解40小時(shí)，發(fā)酵46小時(shí)，發(fā)酵水平為4. 8wt%。實(shí)施例51)斜面培養(yǎng)將乳酸菌(LactcAaciIlus 1. 2131)(購自中科院微生物所)無菌條 件下接種到斜面培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)40小時(shí)。2)搖瓶種子培養(yǎng)步驟1)培養(yǎng)獲得的乳酸菌菌種接種到種子液體培養(yǎng)基中， 400C，200rpm厭氧培養(yǎng)20小時(shí)。3)發(fā)酵培養(yǎng)將步驟2~)培養(yǎng)獲得的乳酸菌種子接種到乳酸菌發(fā)酵培養(yǎng)液中培養(yǎng)， 接種量為10% (v/v)，40°C，200rpm，厭氧培養(yǎng)。其中，步驟1)使用的培養(yǎng)基方法為秸稈水解糖Iwt %，酵母膏0. 5wt %，蛋白胨0. 5wt %，瓊脂2wt %，自來水配制。其中，步驟2)使用的培養(yǎng)基配方為秸稈水解糖3wt %，酵母膏0. 5wt %，蛋白胨0. 15wt%,玉米漿0. 5wt %，磷酸二氫 鉀0. 05wt %，硫酸鎂0. 06wt %，硫酸錳0. 003wt %，自來水配制。其中，步驟3)使用的培養(yǎng)基配方為
秸稈纖維素粉20wt%、酵母膏0. 2wt%，玉米漿wtl%，豆餅粉wtO. 5%，磷酸氫二 鉀wtO. 05%，硫酸銨wtO. 05%，磷酸二氫鉀wtO. 15%,pH6. 0,自來水配制，滅菌后添加纖維 素酶10單位每克秸稈粉，將上述培養(yǎng)基在45°C下酶解40小時(shí)。50小時(shí)后，培養(yǎng)基中糖濃 度為IOwt%，接種乳酸菌。發(fā)酵培養(yǎng)過程包括40°C，轉(zhuǎn)速為200rpm，發(fā)酵52小時(shí)，生產(chǎn)周期為102小時(shí)，生 產(chǎn)周期包括酶解50小時(shí)，發(fā)酵46小時(shí)，發(fā)酵水平為4. 5wt%。比較例11)斜面培養(yǎng)將乳酸菌(LactcAaciIlus 1. 2131)(購自中科院微生物所)無菌條 件下接種到斜面培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)40小時(shí)。2)搖瓶種子培養(yǎng)步驟1)培養(yǎng)獲得的乳酸菌菌種接種到種子液體培養(yǎng)基中， 400C，200rpm厭氧培養(yǎng)20小時(shí)。3)發(fā)酵培養(yǎng)將步驟2~)培養(yǎng)獲得的乳酸菌種子接種到乳酸菌發(fā)酵培養(yǎng)液中培養(yǎng)， 接種量為10% (v/v)，40°C，200rpm，厭氧培養(yǎng)。其中，步驟1)使用的培養(yǎng)基方法為秸稈水解糖Iwt %，酵母膏0. 5wt %，蛋白胨0. 5wt %，瓊脂2wt %，自來水配制。其中，步驟2)使用的培養(yǎng)基配方為秸稈水解糖3wt%，酵母膏0. 5wt%，蛋白胨0. 15wt%，玉米漿0. 5wt%，磷酸二氫 鉀0. 05wt %，硫酸鎂0. 06wt %，硫酸錳0. 003wt %，自來水配制。其中，步驟3)使用的培養(yǎng)基配方為秸稈纖維素粉15wt %、酵母膏0. 2wt %，玉米漿wtl %，豆餅粉wtO. 5 %，磷酸氫二 鉀wtO. 05%，硫酸銨wtO. 05%，磷酸二氫鉀wtO. 15%,pH6. O,自來水配制，滅菌后添加纖維 素酶20單位每克秸稈粉，將上述培養(yǎng)基在50°C下酶解72小時(shí)。72小時(shí)后，培養(yǎng)基中糖濃 度為12wt%接種乳酸菌。發(fā)酵培養(yǎng)過程包括40°C，轉(zhuǎn)速為200rpm，發(fā)酵64小時(shí)，生產(chǎn)周期為136小時(shí)，生 產(chǎn)周期包括酶解72小時(shí)，發(fā)酵64小時(shí)，發(fā)酵水平為3. 6wt%。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾 也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種乳酸菌發(fā)酵方法，其特征在于，利用植物秸稈纖維素部分酶解后作為乳酸菌發(fā) 酵用碳源發(fā)酵生產(chǎn)乳酸，所述的植物秸稈纖維素部分酶解后的糖濃度為 10wt%。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的酶為纖維素酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的酶的用量為10 30U/g植物 秸稈纖維素。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的酶的用量為20U/g植物秸稈纖維素ο
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的植物秸稈纖維素在發(fā)酵液中的含 量為10-20%的質(zhì)量百分比。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述的植物秸稈纖維素在發(fā)酵液中的含 量為15%的質(zhì)量百分比。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶解的酶解溫度為45 55°C。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述酶解的酶解溫度為50°C。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶解的酶解時(shí)間為12 70小時(shí)。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述酶解的酶解時(shí)間為M 36小時(shí)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種乳酸菌發(fā)酵的方法。本發(fā)明利用植物秸稈纖維素部分酶解后作為乳酸菌發(fā)酵用碳源發(fā)酵生產(chǎn)乳酸，其中，所述的植物秸稈纖維素部分酶解后的糖濃度為1wt％～10wt％，所述的部分酶解是將植物秸稈纖維素在45～55℃，用纖維素酶酶解12～72小時(shí)，使發(fā)酵液中既含有酶解糖，又含有未酶解的纖維素，從而可以邊酶解邊發(fā)酵生產(chǎn)乳酸。同現(xiàn)有技術(shù)相比生產(chǎn)周期由136小時(shí)縮短到64小時(shí)，解除了高濃度葡萄糖對乳酸菌發(fā)酵乳酸的抑制作用，發(fā)酵水平由3.6wt％提高到6.8wt％。本發(fā)明利用植物秸稈做發(fā)酵原料，變廢為寶，降低環(huán)境污染，對保證糧食安全具有積極意義。
文檔編號C12P7/56GK102134581SQ201010609278
公開日2011年7月27日 申請日期2010年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月20日
發(fā)明者尚海濤, 崔剛, 李榮杰 申請人:安徽豐原發(fā)酵技術(shù)工程研究有限公司