專利名稱：一種糖化酶固定化的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種糖化酶固定化的方法，屬生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
交聯(lián)酶聚集體CLEAs是2000年荷蘭Delfe大學(xué)的Sheldon小組提出的，主要利用誘導(dǎo)劑將酶形成物理凝集，然而其活性位點(diǎn)并不遭到破壞，蛋白質(zhì)形成了超分子結(jié)構(gòu)，底物通過聚集體的中間空隙與酶的活性位點(diǎn)作用，從而酶的活性位點(diǎn)避免與外界的微環(huán)境的直接作用。目前國內(nèi)對(duì)CLEAs的研究較少，而國外研究較多。交聯(lián)酶聚集體固定化方法具有以下特點(diǎn)a)對(duì)酶的純度要求不高、不需要結(jié)晶等復(fù)雜步驟，理論上能被沉淀下來的酶或蛋白都可用該法制成交聯(lián)酶(蛋白)聚集體，因而操作更加簡便，應(yīng)用范圍更廣；b)獲得的固定化酶穩(wěn)定性好、活性高，與游離酶相比，某些脂酶的交聯(lián)酶聚集體活性甚至可提高10倍以上；c)成本低廉，設(shè)備簡單，一般實(shí)驗(yàn)室都可以實(shí)行，易于推廣；d)無需其他載體，因而單位體積活性大、空間效率高。因此，CLEAs技術(shù)是一種很有發(fā)掘潛力的酶固定化方法。糖化酶是一種十分重要的酶制劑，大量應(yīng)用于糧食加工、食品工業(yè)、釀造、發(fā)酵、紡織品工業(yè)和醫(yī)藥行業(yè)等。它占了整個(gè)酶制劑市場份額的25%左右，使用多以游離酶為主。 目前工業(yè)生產(chǎn)上都以微生物發(fā)酵法大規(guī)模生產(chǎn)糖化酶。糖化酶分布主要是在霉菌中，主要有德氏根霉、黑曲霉、擬內(nèi)孢霉、米曲霉、臭曲霉、雪根霉等。其國際酶學(xué)分類編號(hào)為EC. 3. 2. 1.3，糖化酶(葡萄糖淀粉酶)是一種外切酶，它是從淀粉分子的非還原性末端依次水解α "I. 4糖苷鍵切下葡萄糖，它也可水解麥芽糖的α-1.4鍵和支鏈淀粉分支點(diǎn)的α-1.6鍵，但是水解速度極慢，所以從理論上講，葡糖糖淀粉酶能將淀粉100%水解成葡萄糖，故大量用作淀粉的糖化劑。糖化酶的固定化目前應(yīng)用較多的方法有磁性殼聚糖包埋、微囊包埋法固定、海藻酸鋁吸附、蒙脫石K-IO吸附、二氧化硅雜化膜吸附，然而這些吸附交聯(lián)或者是包埋固定化的酶的量都很小，酶的活性損失都比較嚴(yán)重，即使有的酶活回收率達(dá)到80%但是消耗的成本太高，另外包埋之后影響底物與酶活性位點(diǎn)的接觸，也同時(shí)增大了位阻，酶的半衰期及存活時(shí)間都比較短，導(dǎo)致很難在工業(yè)化生中使用。采用交聯(lián)酶聚集體固定糖化酶使得固定后的酶活性最高只能達(dá)到游離酶活性的40. 4% (見中國釀造“交聯(lián)糖化酶聚集體的制備” 2008年第23期67-69頁)，難以工業(yè)化應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服以往交聯(lián)固定化方法成本高、制備過程復(fù)雜的缺點(diǎn)，提供一種糖化酶固定化的方法。本發(fā)明的糖化酶固定化的方法，是交聯(lián)酶聚集體固定化方法的改進(jìn)，其步驟如下a.將糖化酶的粗酶加入相對(duì)酶溶液體積的1/3的lOOmM，PH7. 0磷酸緩沖液溶解攪拌，制得粗的糖化酶溶液；或?qū)l(fā)酵液IOOOOrpm離心15分鐘，除去菌體，取上清液；b.向a中得到的粗酶液中加入固體硫酸銨，使得硫酸銨在總液體中的質(zhì)量百分比為80%，300rpm室溫?cái)嚢?0min，邊攪拌每10分鐘取上清液離心測定蛋白質(zhì)含量，使95 % 以上的酶沉淀后，10000rpm4°C離心15min，去上清液，添加純化前等體積的pH 7. 0，IOOmM 的磷酸緩沖液溶解純化后的酶；C.取b中酶液1. 6ml，緩慢加入固體硫酸銨，使得硫酸銨在總液體中的質(zhì)量百分比為40-80 %，300rpm室溫或冰水浴中邊加邊攪拌直到95 %以上的糖化酶沉淀下來，持續(xù)攪拌30min，生成糖化酶聚集體；d.向生成的糖化酶聚集體中加入體積百分比-8%糊精溶液作為底物保護(hù)劑， 使得糊精在反應(yīng)溶液中最終體積百分比達(dá)到0. 5-4%，再加入固體硫酸銨使得反應(yīng)液中硫酸銨的質(zhì)量百分比為40-80%，300rpm室溫?cái)嚢?0min，然后加入體積百分比50%的戊二醛溶液，使溶液中戊二醛的最終體積百分比為0. 5% -1. 5%，持續(xù)攪拌1. 5-2. 5小時(shí)，生成交聯(lián)酶聚集體；以上糊精的加入并沒有先后順序；e.向交聯(lián)糖化酶聚集體中加入IOOmM最終體積百分比為3%-6%的硼氫化鈉溶液，持續(xù)攪拌，置于-2到8°C冰箱中靜置3-M小時(shí)，進(jìn)一步形成交聯(lián)酶聚集體沉淀；f.將得到的交聯(lián)酶聚集體，12000rpml5min離心洗滌4次除鹽和交聯(lián)劑，每次加入 IOOmM, PH 7.0的磷酸緩沖液細(xì)1，直到上清液中蛋白質(zhì)含量低于5%?；蛘呦礈熘筮M(jìn)行真空干燥，30°C真空干燥30min，測定固定化后的糖化酶的活性，與原酶液活力對(duì)比，計(jì)算酶的酶活力回收率。備用。本發(fā)明采用交聯(lián)酶聚集體固定糖化酶的方法，較其他固定化方法操作簡單，交聯(lián)糖化酶聚集體水解糊精的能力和原酶液能力相當(dāng)，在對(duì)抗外界環(huán)境的穩(wěn)定性方面都遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于游離酶液，并且能反復(fù)使用，使用時(shí)間超過兩個(gè)月。通過改良及優(yōu)化使得交聯(lián)酶的顆粒硬度活性都得到很好的提高，而且有利于回收再利用。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于操作簡單，成本低廉，固定的糖化酶熱穩(wěn)定性好，儲(chǔ)存穩(wěn)定性高，有廣譜的PH適應(yīng)性，其活性達(dá)到游離酶活性的60%以上。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1:將糖化酶的粗酶加入相對(duì)酶溶液體積的1/3的磷酸緩沖液(100mM，PH7. 0)溶解攪拌，制得粗的糖化酶溶液(或?qū)l(fā)酵液IOOOOrpm離心15分鐘，除去菌體，取上清液)；緩慢向酶液中加入固體硫酸銨，使得硫酸銨在總液體中的質(zhì)量百分比為80%， 300rpm攪拌30min，邊攪拌每10分鐘取上清液離心測定蛋白質(zhì)含量，使95%以上的酶沉淀后，10000rpm4°C離心15分鐘得到粗酶制品，加入與離心前等體積的磷酸緩沖液(pH7. 0， IOOmM)溶解粗酶形成純化后的粗酶液。取粗酶液1. 6ml加入1/4體積的磷酸buffer (lOOmM，PH 7. 0)，然后加入硫酸銨固體，使得固體硫酸銨在總液體中的質(zhì)量百分比為80%，300rpm室溫?cái)嚢?0min，務(wù)必要均勻，邊加入邊攪拌，每十分鐘取上清液測定蛋白質(zhì)含量，直到95%以上的蛋白質(zhì)被沉淀下來，向聚集體溶液中加入質(zhì)量百分比為的糊精溶液2ml使得總?cè)芤旱暮罱K體積百分比為0. 5%，向溶液中緩慢添加固體硫酸銨，此時(shí)使用的固體硫酸銨的質(zhì)量約為總?cè)芤后w積的80%，300rpm攪拌10分鐘，讓其充分溶解在緩沖液中，再攪拌20分鐘待聚集體顆粒均勻；向溶液中添加體積百分比為50%的戊二醛溶液使得總液體中的戊二醛最終體積百分比為0. 5%，室溫下300rpm持續(xù)攪拌1. 5h，形成交聯(lián)酶聚集體；將交聯(lián)好的聚集體中加入最終體積百分比為3%的硼氫化鈉(IOOmM)，攪拌 15min，放在_2°C的冰箱里靜置3小時(shí)，取出制備好的交聯(lián)酶聚集體12000rpm離心15min， 棄上清液，加入細(xì)1的磷酸buffer (lOOmM，PH 7.0)洗滌4次，直到上清液中蛋白質(zhì)含量小于5%為止。測定固定化后的糖化酶的活性，與原酶液活力對(duì)比，計(jì)算酶的酶活力回收率。實(shí)施例2 將糖化酶的粗酶加入相對(duì)酶溶液體積的1/3的磷酸緩沖液(100mM，PH7. 0)溶解攪拌，制得粗的糖化酶溶液(或?qū)l(fā)酵液IOOOOrpm離心15分鐘，除去菌體，取上清液)；緩慢向酶液中加入固體硫酸銨，使得固體硫酸銨在總液體中的質(zhì)量百分比為 80%, 300rpm室溫?cái)嚢?0min，邊攪拌每10分鐘取上清液離心測定蛋白質(zhì)含量，使95%以上的酶沉淀后，10000rpm4°C離心15分鐘得到粗酶制品，加入與離心前等體積的磷酸緩沖液 (pH 7. O, IOOmM)溶解粗酶形成純化后的粗酶液。取粗酶液1. 6ml加入1/4體積的磷酸buffer (lOOmM, PH 7. 0)然后加入硫酸銨固體，使得固體硫酸銨在總液體中的質(zhì)量百分比為65%，300rpm室溫?cái)嚢?0min，務(wù)必要均勻，邊加入邊攪拌，每十分鐘取上清液測定蛋白質(zhì)含量，直到95%以上的蛋白質(zhì)被沉淀下來，向聚集體溶液中加入質(zhì)量百分比為5%的糊精溶液2ml使得總?cè)芤旱暮罱K體積百分比為2. 5%，向溶液中緩慢添加固體硫酸銨，此時(shí)使用的固體硫酸銨的質(zhì)量約為總?cè)芤后w積的65%，300rpm攪拌10分鐘，讓其充分溶解在緩沖液中，再攪拌20分鐘待聚集體顆粒均勻；向溶液中添加體積百分比為50%的戊二醛溶液使得總液體中的戊二醛最終體積百分比為1%，室溫下300rpm持續(xù)攪拌2h，形成交聯(lián)酶聚集體；將交聯(lián)好的聚集體中加入最終體積百分比為4. 5%的硼氫化鈉(IOOmM),攪拌 15min，放在4°C的冰箱里靜置14小時(shí)，取出制備好的交聯(lián)酶聚集體12000rpm離心15min， 棄上清液，加入細(xì)1的磷酸buffer (lOOmM，PH7. 0)洗滌4次，直到上清液中蛋白質(zhì)含量小于 5%為止。測定固定化后的糖化酶的活性，與原酶液活力對(duì)比，計(jì)算酶的酶活力回收率實(shí)施例3 將糖化酶的粗酶加入相對(duì)酶溶液體積的1/3的磷酸緩沖液(100mM，PH7. 0)溶解攪拌，制得粗的糖化酶溶液(或?qū)l(fā)酵液IOOOOrpm離心15分鐘，除去菌體，取上清液)；緩慢向酶液中加入固體硫酸銨，使得固體硫酸銨在總液體中的質(zhì)量百分比為 80%, 300rpm室溫?cái)嚢?0min，邊攪拌每10分鐘取上清液離心測定蛋白質(zhì)含量，使95%以上的酶沉淀后，10000rpm4°C離心15分鐘得到粗酶制品，加入與離心前等體積的磷酸緩沖液 (pH 7. O, IOOmM)溶解粗酶形成純化后的粗酶液。取粗酶液1. 6ml加入1/4體積的磷酸buffer然后加入硫酸銨固體，使得固體硫酸銨在總液體中的質(zhì)量百分比為40%，300rpm冰水浴中攪拌30min，務(wù)必要均勻，邊加入邊攪拌，每十分鐘取上清液測定蛋白質(zhì)含量，直到95%以上的蛋白質(zhì)被沉淀下來，向聚集體溶液中加入質(zhì)量百分比為8%的糊精溶液2ml使得總?cè)芤旱暮罱K體積百分比為4%，向溶液中緩慢添加固體硫酸銨，此時(shí)使用的固體硫酸銨的質(zhì)量約為總?cè)芤后w積的40%，300rpm冰水浴中攪拌10分鐘，讓其充分溶解在緩沖液中，再攪拌20分鐘待聚集體顆粒均勻；向溶液中添加體積百分比為50%的戊二醛溶液使得總液體中的戊二醛最終體積百分比為1. 5%，冰水浴下300rpm持續(xù)攪拌2. 5h，形成交聯(lián)酶聚集體；將交聯(lián)好的聚集體中加入最終體積百分比為6%的硼氫化鈉(IOOmM)，攪拌 15min，放在8°C的冰箱里靜置M小時(shí)，取出制備好的交聯(lián)酶聚集體12000rpm離心15min， 棄上清液，加入細(xì)1的磷酸buffer (lOOmM，PH 7.0)洗滌4次，直到上清液中蛋白質(zhì)含量小于5%為止。將多余的磷酸buffer吸出，置入真空泵中30°C抽出水分形成干燥的粉末，用時(shí)約 30分鐘；加入1. 6ml的緩沖液溶解粉末，放到磁力攪拌機(jī)上300rpm攪拌15分鐘，使得交聯(lián)糖化酶顆粒分布均勻，放入4°C冰箱中保存?zhèn)溆?。在酶的干燥環(huán)節(jié)中，可以使用冷凍干燥法、隊(duì)吹干法等方法替代。
權(quán)利要求
1. 一種糖化酶固定化的方法，是交聯(lián)酶聚集體固定化方法的改進(jìn)，其特征在于a.采用酶底物保護(hù)劑進(jìn)行保護(hù)，保護(hù)劑為糊精，其使用濃度為0.5-4%；b.采用室溫交聯(lián)，溫度不超過30°C；室溫交聯(lián)的時(shí)間為1.5-2. 5小時(shí)；交聯(lián)劑為戊二醛，使用濃度為0. 5-1.5% ；c.最后加入IOOmM最終濃度為3-6%的硼氫化鈉，再經(jīng)過低溫靜止交聯(lián)過程，其溫度為-2V至8°C，靜止時(shí)間為3-M小時(shí)，得到游離酶活性在60%以上的糖化酶。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種糖化酶固定化的方法，屬生物工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的方法是在交聯(lián)酶聚集體固定化方法基礎(chǔ)上的改進(jìn)，其改進(jìn)為a.采用酶底物保護(hù)劑進(jìn)行保護(hù)；b.采用室溫交聯(lián)，交聯(lián)劑為戊二醛；c.經(jīng)過低溫靜置交聯(lián)過程。本發(fā)明的糖化酶固定化的方法，較其他固定化方法操作簡單，交聯(lián)糖化酶聚集體水解糊精的能力和原酶液能力相當(dāng)，在對(duì)抗外界環(huán)境的穩(wěn)定性方面都遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于游離酶液，并且能反復(fù)使用，使用時(shí)間超過兩個(gè)月。通過改良及優(yōu)化使得交聯(lián)酶的顆粒硬度活性都得到很好的提高，而且有利于回收再利用。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于操作簡單，成本低廉，固定的糖化酶熱穩(wěn)定性好，儲(chǔ)存穩(wěn)定性高，有廣譜的pH適應(yīng)性，其活性達(dá)到游離酶活性的60％以上。
文檔編號(hào)C12N11/00GK102154255SQ20101059318
公開日2011年8月17日 申請(qǐng)日期2010年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月17日
發(fā)明者喬敏, 余澤芬, 周薇, 張克勤, 李小冬, 賈東晨 申請(qǐng)人:云南大學(xué)