專利名稱：氨(氨離子)的測定方法與氨(氨離子)診斷/測定試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)/食品檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及氨(氨離子)診斷/測定方法及其試劑盒。
背景技術(shù)：
氨測定的方法有微量擴(kuò)散法、離子交換法、酶法和氨電極法等。目前應(yīng)用最多的方法是酶法和基于離子選擇電極的血氨測定儀分析法。擴(kuò)散法是標(biāo)本堿化后，釋放出NH3,用酸滴定釋放出的氨，或用Nessler反應(yīng)形成棕黃色碘化雙汞胺進(jìn)行比色。這些方法需要堿化，內(nèi)源性的氨形成造成影響，使其準(zhǔn)確性和精密度受到影響，目前已很少應(yīng)用；離子交換法比擴(kuò)散法更準(zhǔn)確，CV為8% 13% ’離子選擇電極法是利用NH3擴(kuò)散到電極表面，引起電極的pH發(fā)生變化進(jìn)行測定，該方法的CV為 3. 5% 4. 8%，回收率高。結(jié)合具體實際，應(yīng)以酶法測定為實用。檢索中國專利，僅查出87105593. 7專利申請公開了一種血氨測定速凍杯，卻未發(fā)現(xiàn)比較理想的血氨測定方法。

發(fā)明內(nèi)容
[要解決的技術(shù)問題]本發(fā)明的目的是提供一種氨(氨離子)的測定方法。本發(fā)明的另一個目的是提供一種氨(氨離子)診斷/測定試劑盒。[技術(shù)方案]本發(fā)明是通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)的。本發(fā)明的方法是一種采用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)與酶 (偶)聯(lián)法(Couple Reaction)的聯(lián)用技術(shù)，利用測定還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在 340nm波長處的吸光度變化測定氨(氨離子)的方法。本發(fā)明氨(氨離子)測定方法的的技術(shù)原理是根據(jù)下述氨激酶、去硫代生物素合成酶、脂酰輔酶A合成酶的系列催化反應(yīng)完成氨+腺苷三磷酸氨激酶腺苷二磷酸+磷酰胺腺苷二磷酸+磷酸根+去硫代牛物素去硫代牛物素合成酶腺苷三磷酸+7，8_ 二氨基壬酸+ 二氧化碳η 二氧化碳+η輔酶A+長鏈-?；?輔酶Α+2η輔酶脂酰輔酶A合成酶乙酰-輔酶Α+η蘋果酰-輔酶Α+2η還原型輔酶本發(fā)明的方法利用氨激酶(ammonia kinase ；EC 2. 7. 3. 8)酶(偶)聯(lián)去硫代生物素合成酶(dethiobiotin synthase ；EC 6. 3. 3. 3)、脂酰輔酶A合成酶 (fatty-acyl-CoAsynthase ；EC 2.3.1.86)酶促反應(yīng)比色終點法。氨激酶酶解氨反應(yīng)產(chǎn)生腺苷二磷酸，再通過(偶)聯(lián)合去硫代生物素合成酶、脂酰輔酶A合成酶的作用，最終將輔CN 102539684 A
酶(在340nm處沒有吸收峰)還原成為還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度上升的程度，這樣可以通過測量340nm處吸光度上升的程度， 可以測算氨(氨離子)的濃度大小。本發(fā)明是通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)的。本發(fā)明涉及一種氨(氨離子)的測定方法。該氨(氨離子)測定方法的步驟如下A、樣品準(zhǔn)備A. 1標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備將一定量的氨鹽溶于水或緩沖液中，再將氨濃度調(diào)整到100微摩爾/升，得到的溶液作為標(biāo)準(zhǔn)樣品；A. 2待測樣品的制備待測液體樣品直接測試，無須預(yù)處理；將一定量的待測固體樣品像制備標(biāo)準(zhǔn)樣品一樣溶于水或緩沖液中；A. 3空白樣品所述的水或緩沖液作為空白樣品，其氨(氨離子)濃度為0微摩爾/升；B、試劑溶液的制備分別移取或稱取緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、氨激酶、去硫代生物素合成酶、脂酰輔酶A合成酶、腺苷三磷酸、去硫代生物素、長鏈-酰基-輔酶A、單價磷酸鹽與輔酶A，然后將它們混合均勻，用水溶解得到所述的試劑溶液，它們的濃度分別是20-500mmol/L、 0.001-7mol/L、0. l_2mmol/L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、I-IOOmmol/ L、l-100mmol/L、l-100mmol/L、l-100mmol/L 與 l-lOOmmol/L ；C、待測樣品與在步驟B)得到的試劑溶液按照體積比1/10至1/500進(jìn)行混合，在溫度15-45°C下反應(yīng)5-60分鐘，在主波長340nm與副波長405nm(如果受儀器限制可以不設(shè)副波長)下進(jìn)行測定，測定其吸光度隨時間的變化；D、在與步驟C)同樣的條件下測定步驟A)標(biāo)準(zhǔn)樣品的吸光度隨時間的變化；E、在與步驟C)同樣的條件下測定在步驟A)空白樣品的吸光度隨時間的變化；F、數(shù)據(jù)處理由步驟C-E)所述測定的主波長340nm的吸光度隨時間的變化，根據(jù)下式計算得到
氨的含量
ΔΑ (樣品)-ΔΑ(空白)
氨(氨離子)含量=-χ標(biāo)準(zhǔn)濃度(μπιοΙ/L)
ΔΑ (標(biāo)準(zhǔn))-ΔΑ(空白)式中Δ A(樣品)表示步驟C)得到的待測樣品的吸光度變化；Δ A(空白)表示步驟Ε)得到的空白樣品的吸光度變化；Δ A (標(biāo)準(zhǔn))表示步驟D)標(biāo)準(zhǔn)樣品的吸光度變化。根據(jù)本發(fā)明，在所述的氨(氨離子)測定方法中，所述的緩沖液應(yīng)該理解是能夠使其測定介質(zhì)的PH基本保持穩(wěn)定(一般是6. 0-9.0)的溶液。如果該ρΗ高于9.0或ρΗ低于6. 0，則該測定方法使用的酶的活性達(dá)不到預(yù)期的活性效果，因此需要添加更多的介質(zhì)與酶，才有可能達(dá)到預(yù)期的活性效果。在本發(fā)明中，所述的緩沖液是一種或多種選自三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液、磷酸鹽緩沖液、咪唑-鹽酸緩沖液、磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液、硼砂-鹽酸緩沖液、甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液、巴比妥鈉-鹽酸緩沖液、硼酸-硼砂緩沖液、二乙醇胺緩沖液或 “PBS”緩沖液的緩沖液。優(yōu)選地，所述的緩沖液例如選自三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)緩沖液、 磷酸鹽緩沖液或“PBS”緩沖液。更優(yōu)選地，所述的緩沖液例如選自三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)緩沖液或磷酸鹽緩沖液。根據(jù)本發(fā)明，在所述的氨(氨離子)測定方法中，所述的穩(wěn)定劑應(yīng)該理解是一種能保護(hù)試劑中的介質(zhì)(底物)與酶，使其不會隨著時間推移而改變其性質(zhì)，進(jìn)而失去活性的物質(zhì)，它會使得試劑具備很長的活性壽命，通常長達(dá)數(shù)月，甚至一、二年。如果沒有所述的穩(wěn)定劑，則試劑的活性在溶液中只能維持?jǐn)?shù)十小時，頂多數(shù)天，就會逐漸失去活性而不再具備檢測性能。在本發(fā)明中，所述的穩(wěn)定劑使用量是0.01-7mol/L。如果所述的穩(wěn)定劑使用量不夠，則試劑活性的壽命就會縮短；如果所述的穩(wěn)定劑使用量過高，則會增加成本。在本發(fā)明中，所述的穩(wěn)定劑是一種或多種選自氯化鈉、乙二醇、丙二醇、甘油或雙乙酸鈉或疊氮鈉防腐劑的穩(wěn)定劑。優(yōu)選地，所述的穩(wěn)定劑例如是一種或多種選自氯化鈉、丙二醇、甘油或雙乙酸鈉或疊氮鈉的穩(wěn)定劑。更優(yōu)選地，所述的穩(wěn)定劑例如是一種或多種選自甘油或雙乙酸鈉的穩(wěn)定劑。在本發(fā)明中，所述的輔酶是一種或多種選自NADP+、NAD+或thio-NAD+的輔酶。根據(jù)一種本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，本發(fā)明使用全自動生化分析儀測定氨(氨離子)時，待測樣品、所述標(biāo)準(zhǔn)樣品與所述空白樣品由該分析儀在設(shè)定條件下(參數(shù))自動取樣，然后在下述條件下進(jìn)行測定測定方法為二點終點法/終點法，溫度37°C，反應(yīng)時間10 分鐘，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測氨(氨離子)樣品與試劑的體積比例為 1/10-1/500，反應(yīng)方向為正反應(yīng)，延遲時間1/0分鐘，檢測時間4/5分鐘。根據(jù)另一種本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，本發(fā)明使用的試劑溶液配制成如下雙劑試劑由所述的緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、腺苷三磷酸、去硫代生物素、長鏈-?；?輔酶A、 單價磷酸鹽與輔酶A組成的試劑1 ；由所述的緩沖液、穩(wěn)定劑、氨激酶、去硫代生物素合成酶與脂酰輔酶A合成酶組成的試劑2 ；其中輔酶、氨激酶、去硫代生物素合成酶、脂酰輔酶A合成酶、腺苷三磷酸、去硫代生物素、長鏈-酰基-輔酶A、單價磷酸鹽、輔酶A在試劑1或試劑2中的位置是不限定的。根據(jù)另一種本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，本發(fā)明使用的試劑配制成如下三劑試劑由所述的緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、腺苷三磷酸、去硫代生物素、長鏈-酰基-輔酶A、 單價磷酸鹽與輔酶A組成的試劑1 ；由所述的緩沖液、穩(wěn)定劑、去硫代生物素合成酶與脂酰輔酶A合成酶組成的試劑2 ；由所述的緩沖液、穩(wěn)定劑與氨激酶組成的試劑3 ；其中輔酶、氨激酶、去硫代生物素合成酶、脂酰輔酶A合成酶、腺苷三磷酸、去硫代生物素、長鏈-酰基-輔酶A、單價磷酸鹽、輔酶A在試劑1、試劑2或試劑3中的位置是不限定的。在本發(fā)明氨(氨離子)測定方法中使用的測定儀器可以是紫外/可見光分析儀， 例如上海精密儀器儀表有限公司銷售的紫外可見分光光度計、天津喀納斯光學(xué)分析儀器有限公司銷售的723可見分光光度計；半自動生化分析儀，例如上海偉思醫(yī)用設(shè)備有限公司的BTS-330半自動生化分析儀；全自動生化分析儀，例如由邁瑞公司以商品名BS-300、奧林帕斯公司以商品名AU400、東芝公司以商品名120、日立公司以商品名7600、雅培公司以商品名CB8000或貝克曼公司以商品名CX20銷售的全自動生化分析儀。本發(fā)明還涉及氨(氨離子)診斷/測定試劑盒。該氨(氨離子)診斷/測定試劑盒由下述粉狀試劑組成，在使用時用水將它們?nèi)芙獾玫骄哂邢率鰸舛确秶目芍苯邮褂玫?br> 液體試劑
緩沖液20-500mmol/L
穩(wěn)定劑0.001-7mol/L
輔酶0.l-2mmol/L
氨激酶1000-80000U/L
去硫代生物素合成酶1000-80000U/L
脂酰輔酶A合成酶1000-80000U/L
腺苷三磷酸l-100mmol/L
去硫代生物素l-100mmol/L
長鏈-?；?輔酶Al-100mmol/L
單價磷酸鹽l-100mmol/L
輔酶Al-100mmol/Lo
根據(jù)一種本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，本發(fā)明的氨
試劑1
緩沖液1OOmmo1/L
穩(wěn)定劑500mmol/L
輔酶0. 25mmol/L
腺苷三磷酸5mmol/L
去硫代生物素5mmol/L
長鏈-?；?輔酶A5mmol/L
單價磷酸鹽5mmol/L
輔酶A5mmol/L ；
組成如下的試劑2
緩沖液IOOmmo1/L
穩(wěn)定劑500mmol/L
氨激酶16000U/L0085]去硫代生物素合成酶18000U/L0086]脂酰輔酶A合成酶12000U/L。0087]根據(jù)另一種本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，本發(fā)明的氨0088]試劑1 0089]緩沖液IOOmmol/L0090]穩(wěn)定劑500mmol/L0091]輔酶0.25mmol/L0092]腺苷三磷酸5mmol/L0093]去硫代生物素5mmol/L0094]長鏈-?；?輔酶A5mmol/L0095]單價磷酸鹽5mmol/L0096]輔酶A5mmol/L ；0097]組成如下的試劑2 0098]緩沖液1OOmmo1/L0099]穩(wěn)定劑500mmol/L0100]去硫代生物素合成酶18000U/L0101]脂酰輔酶A合成酶12000U/L ；0102]組成如下的試劑3 0103]緩沖液IOOmmo1/L0104]穩(wěn)定劑500mmol/L0105]氨激酶16000U/L。0106]根據(jù)另一種本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，在本發(fā)明的
'測定試劑盒有
(氨離子)診斷/測定試劑盒中，所述的緩沖液是一種或多種選自三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液、磷酸鹽緩沖液、 咪唑-鹽酸緩沖液、磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液、硼砂-鹽酸緩沖液、甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液、巴比妥鈉-鹽酸緩沖液、硼酸-硼砂緩沖液、二乙醇胺緩沖液或“PBS”緩沖液的緩沖液。優(yōu)選地，所述的緩沖液例如選自三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)緩沖液、 磷酸鹽緩沖液或“PBS”緩沖液。更優(yōu)選地，所述的緩沖液例如選自三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)緩沖液或磷酸鹽緩沖液。在本發(fā)明中，所述的穩(wěn)定劑是一種或多種選自氯化鈉、乙 乙酸鈉或疊氮鈉防腐劑的穩(wěn)定劑。優(yōu)選地，所述的穩(wěn)定劑例如是一種或多種選自氯化鈉、丙 疊氮鈉的穩(wěn)定劑。更優(yōu)選地，所述的穩(wěn)定劑例如是一種或多種選自甘油或雙乙酸鈉的穩(wěn)定劑。在本發(fā)明中，無論是單劑試劑、雙劑試劑或三劑試劑，在本發(fā)明測定氨(氨離子) 的方法中，所述的輔酶可以是一種或多種選自NADP+、NAD+或thio-NAD+的輔酶。使用本發(fā)明的氨(氨離子)診斷/測定試劑盒時，可以使用紫外/可見光分析儀， 例如上海精密儀器儀表有限公司銷售的紫外可見分光光度計、天津喀納斯光學(xué)分析儀器有限公司銷售的723可見分光光度計；半自動生化分析儀，例如上海偉思醫(yī)用設(shè)備有限公司的BTS-330半自動生化分析儀；全自動生化分析儀，例如由邁瑞公司以商品名BS-300、奧林帕斯公司以商品名AU400、東芝公司以商品名120、日立公司以商品名7600、雅培公司以商品名CB8000或貝克曼公司以商品名CX20銷售的全自動生化分析儀。在采用本發(fā)明方法測定氨(氨離子)時，根據(jù)實驗要求進(jìn)行多次試驗，然后將得到的這些試驗結(jié)果按照下式計算出精密度(CV)S= V Σ (X-X1) !/n-l^式中又-試驗結(jié)果平均值；Xi-各次試驗結(jié)果；η-試驗次數(shù).N彡10CV=S/ X * 100%將得到的這些試驗結(jié)果按照下式計算出相對極差
Δ - Γ - V
~ (^T + ^ + 1Z ) ^ 3χ——第一批各次試驗結(jié)果平均值γ——第二批各次試驗結(jié)果平均值Z_第三批各次試驗結(jié)果平均值 ——為X，Y，Z中的最大值γ——為X，Y，Z中的最小值每批試樣數(shù)取η彡3經(jīng)過大量試驗確定，對于氨(氨離子)含量為Ο-ΙΟΟΟμπιοΙ/L的樣品，其分析誤差可以達(dá)到彡5%0本發(fā)明方法的靈敏度可以達(dá)到1 μ mol/L。通過大量試驗確定，本發(fā)明方法測定氨(氨離子)含量范圍是Ο-ΙΟΟΟμπιοΙ/L，本發(fā)明方法適合于醫(yī)學(xué)臨床/食品診斷/檢測。
具體實施例方式下述實施例說明本發(fā)明而不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。實施例1 血漿中氨(氨離子)含量的測定1)標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備將一定量的氨鹽溶于水或緩沖液中，再將氨濃度調(diào)整到100微摩爾/升；2)待測樣品預(yù)處理血漿樣品作為待測樣品，無須預(yù)處理；3)空白樣品所述的水或緩沖液作為空白樣品，其氨濃度為0微摩爾/升；
B、試劑溶液的制備本實施例的氨診斷/測定試劑為單劑試劑，它含有三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 lOOmmol/L甘油lmol/LNADP+0. 25mmol/L氨激酶16000U/L去硫代生物素合成酶18000U/L脂酰輔酶A合成酶12000U/L腺苷三磷酸5mmol/L去硫代生物素5mmol/L長鏈-酰基-輔酶A5mmol/L單價磷酸鹽5mmol/L輔酶A5mmol/L0按照上述濃度將這些試劑加入去離子水全部溶解配制好待用。C、待測血漿樣品，與在步驟B)得到的試劑溶液按照體積比1/20進(jìn)行混合，在溫度37°C下反應(yīng)5分鐘，在主波長340nm與副波長405nm下進(jìn)行測定，測定其吸光度隨時間的變化八々(樣品)為0.0277;D、在與步驟C)同樣的條件下測定步驟A)標(biāo)準(zhǔn)樣品的吸光度隨時間的變化 △ A (標(biāo)準(zhǔn))為 0.0523 ；E、在與步驟C)同樣的條件下測定在步驟A)使用的水作為空白溶液的吸光度隨時間的變化ΔΑ(空白)為0.0106 ；F、數(shù)據(jù)處理由步驟C-E)所述測定的主波長340nm的吸光度隨時間的變化，根據(jù)下式計算得到
氨(氨離子)的含量
ΔΑ (樣品)-ΔΑ(空白)
氨(氨離子)含量=-χ標(biāo)準(zhǔn)濃度(μπιοΙ/L)
ΔΑ (標(biāo)準(zhǔn))-ΔΑ(空白)式中Δ A(樣品)表示步驟C)得到的待測樣品的吸光度變化；Δ A(空白)表示步驟Ε)得到的空白樣品的吸光度變化；Δ A (標(biāo)準(zhǔn))表示步驟D)標(biāo)準(zhǔn)樣品的吸光度變化。通過上式計算得到該血漿樣品的氨(氨離子)含量為82 ymol/L，其誤差是士2 μ mol/L0實施例2 血漿中氨(氨離子)含量的測定1)標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備將一定量的氨鹽溶于水中，再將氨(氨離子)濃度調(diào)整到100微摩爾/升，作為標(biāo)準(zhǔn)樣品；2)待測樣品的制備0169]
0170]
0171]
0172]
0173]
0174]
0175]
0176]
0177]
0178]
0179]
0180] 0181] 0182]
0183]
0184]
0185]
0186]
0187]
0188]
0189]
0190]
0191]
0192]
0193]
0194]
0195]
0196]
0197]
0198]
0199]
0200] 0201] 0202]
0203]
0204]
0205]
0206] 0207]
血漿樣品作為待測樣品，無須預(yù)處理； 3)空白樣品
所述的水作為空白樣品，其氨(氨離子)濃度為0微摩爾/升； B、試劑溶液的制備
氨(氨離子)診斷/測定試劑為雙劑試劑，它含有 組成如下的試劑1 磷酸鹽緩沖液 NAD+
腺苷三磷酸去硫代生物素
長鏈-酰基-輔酶A 單價磷酸鹽輔酶A
組成如下的試劑2 磷酸鹽緩沖液
乙二醇氨激酶
去硫代生物素合成酶脂酰輔酶A合成酶
IOOmmol/L 0. 25mmol/L 5mmol/L 5mmol/L
5mmol/L 5mmol/L 5mmol/L ；
1OOmmo1/L 5mol/L 16000U/L 32000U/L 40000U/L。
按照上述濃度將這些試劑加入去離子水全部溶解配制好待用, C、樣品使用日立7080全自動生化分析儀測定該全自動生化分析儀主要操作參數(shù)如下
計量方法測試計量時間點主波長副波長反應(yīng)溫度樣品體積試劑1 (Rl)體積試劑2(R3)體積反應(yīng)方向標(biāo)準(zhǔn)樣品1 標(biāo)準(zhǔn)樣品2
兩點終點法 21,31 340 405 37 20 200 50 正 0100
定標(biāo)結(jié)果顯示K值為5011，換算成靈敏度為0. 00020 Δ A/ μ mol/L。 測試結(jié)果顯示該血漿中含有氨(氨離子)為21 μ mol/L。其誤差是士 1 μ mol/Lc 實施例3 血漿樣品中氨(氨離子)含量的測定該實施例的操作方式與實施例2相同，只是本實施例 B、試劑溶液的制備
氨(氨離子)診斷/測定試劑為三劑試劑，它含有
組成如下的試劑1 三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 lOOmmol/LNAD+0. 25mmol/L腺苷三磷酸5mmol/L去硫代生物素5mmol/L長鏈-酰基-輔酶A5mmol/L單價磷酸鹽5mmol/L輔酶A5mmol/L ；組成如下的試劑2:三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 lOOmmol/L氯化鈉2mol/L去硫代生物素合成酶28000U/L脂酰輔酶A合成酶50000U/L ；組成如下的試劑3:三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 lOOmmol/L氯化鈉2mol/L氨激酶26000U/L。按照上述濃度將這些試劑加入去離子水全部溶解配制好待用。C、樣品使用日立7080全自動生化分析儀測定該全自動生化分析儀主要操作參數(shù)如下計量方法兩點終點法測試計量時間點21，31主波長340副波長405反應(yīng)溫度37樣品體積20試劑I(Rl)體積20試劑2 (ぬ)體積180試劑3(R3)體積50反應(yīng)方向正標(biāo)準(zhǔn)樣品1:0標(biāo)準(zhǔn)樣品2100定標(biāo)結(jié)果顯示K值為4705，換算成靈敏度為0. 00021 A A/U mol/L。測試結(jié)果顯示該血漿中含有氨(氨離子)為78 ii mol/L。其誤差是士 2 y mol/L。實施例4 穩(wěn)定性試驗該實施例的操作方式與實施例1相同，只是在實施例1實施后，實施例1使用的試 劑在密閉試劑瓶中在2-8°C下存放了半年與一年。使用同樣的標(biāo)準(zhǔn)樣品，使用與實施例2同樣的新試劑與上述存放半年與一年的試 劑分別進(jìn)行了測定，其它條件都與實施例2相同，其測定結(jié)果如下
表權(quán)利要求
1.一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的氨(氨離子)濃度測定方法，其測定的技術(shù)原理是根據(jù)下述氨激酶、去硫代生物素合成酶、脂酰輔酶A合成酶的系列催化反應(yīng)完成氨+腺苷三磷酸氨激酶腺苷二磷酸+磷酰胺腺苷二磷酸+磷酸根+去硫代牛物素去硫代牛物素合成酶腺苷三磷酸+7，8_ 二氨基壬酸+ 二氧化碳 η 二氧化碳+η輔酶A+長鏈-?；?輔酶Α+2η輔酶脂酰輔酶A合成酶乙酰-輔酶Α+η蘋果酰-輔酶Α+2η還原型輔酶
2.一種氨(氨離子)的測定方法，其特征在于該方法的步驟如下 2. 1樣品準(zhǔn)備.2. 1. 1標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備將一定量的氨鹽溶于水或緩沖液中，再將其濃度調(diào)整到100微摩爾/升； 2. 1.2待測樣品的制備待測液體樣品直接測試，無須預(yù)處理；將一定量的待測固體樣品像制備標(biāo)準(zhǔn)樣品一樣溶于水或緩沖液中； 2. 1.3空白樣品所述的水或緩沖液作為空白樣品，其氨(氨離子)濃度為0微摩爾/升； 2. 2試劑溶液的制備分別移取或稱取緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、氨激酶、去硫代生物素合成酶、脂酰輔酶A合成酶、腺苷三磷酸、去硫代生物素、長鏈-?；?輔酶Α、單價磷酸鹽與輔酶Α，然后將它們混合均勻，用水溶解得到所述的試劑溶液，它們的濃度分別是20-500mmol/L、0. 001-7mol/L、 0. l-2mmol/L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、l—lOOmmol/L、I-IOOmmol/ L、l-100mmol/L、l-100mmol/L 與 l-lOOmmol/L ；.2. 3待測樣品與在步驟2. 2)得到的試劑溶液按照體積比1/10至1/500進(jìn)行混合，在溫度15-45°C下反應(yīng)5-60分鐘，在主波長340nm與副波長405nm(如果受儀器限制，可以不設(shè)副波長)下進(jìn)行測定，測定其吸光度隨時間的變化；.2. 4在與步驟2. 3)同樣的條件下測定步驟2. 1. 1)標(biāo)準(zhǔn)樣品的吸光度隨時間的變化； 2. 5在與步驟2. 3)同樣的條件下測定在步驟2. 1. 3)使用的水或緩沖液作為空白.溶液的吸光度隨時間的變化；.2.6數(shù)據(jù)處理由步驟2. 3-2. 5)所述測定的主波長340nm的吸光度隨時間的變化，根據(jù)下式計算得到氨的含量氨含量=式中ΔΑ(樣品)表示步驟2. 3)得到的待測樣品的吸光度變化； ΔΑ(空白)表示步驟2. 5)得到的空白溶液的吸光度變化； 八八(標(biāo)準(zhǔn))表示步驟2. 4)標(biāo)準(zhǔn)樣品的吸光度變化。
3.根據(jù)權(quán)利要求1、2所述的測定方法，其特征在于使用全自動生化分析儀測定時，待2ΔΑ (樣品)-ΔΑ (空白)-χ標(biāo)準(zhǔn)濃度(μπιοΙ/L )ΔΑ(標(biāo)準(zhǔn))-ΔΑ(空白)測樣品、所述標(biāo)準(zhǔn)樣品與所述空白樣品由該分析儀在設(shè)定條件下自動取樣，然后在下述條件下進(jìn)行測定測定方法為終點法，溫度37°C，反應(yīng)時間10分鐘，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測氨樣品與試劑的體積比例為1/10-1/500，反應(yīng)方向為正反應(yīng)，延遲時間 1/0分鐘，檢測時間4/5分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的測定方法，其特征在于，所述的穩(wěn)定劑是一種或多種選自氯化鈉、乙二醇、丙二醇、甘油或雙乙酸鈉、疊氮鈉等防腐劑的穩(wěn)定劑；所述的緩沖液是一種或多種選自三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液、磷酸鹽緩沖液、咪唑-鹽酸緩沖液、磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液、硼砂-鹽酸緩沖液、甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液、巴比妥鈉-鹽酸緩沖液、硼酸-硼砂緩沖液、二乙醇胺緩沖液或“PBS”緩沖液的緩沖液；所述的輔酶是一種或多種選自NADP+、NAD+或thio-NAD+的輔酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的測定方法，其特征在于.5. 1所述的試劑溶液配制成如下單劑試劑它是由所述的緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、腺苷三磷酸、去硫代生物素、長鏈-?；?輔酶A、 單價磷酸鹽、輔酶A、氨激酶、去硫代生物素合成酶與脂酰輔酶A合成酶組成的；.5. 2所述的試劑溶液配制成如下雙劑試劑試劑1，它是由所述的緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、腺苷三磷酸、去硫代生物素、長鏈-酰基-輔酶A、單價磷酸鹽與輔酶A組成的；試劑2，它是由所述的緩沖液、穩(wěn)定劑、氨激酶、去硫代生物素合成酶與脂酰輔酶A合成酶組成的；其中輔酶、氨激酶、去硫代生物素合成酶、脂酰輔酶A合成酶、腺苷三磷酸、去硫代生物素、長鏈-酰基-輔酶A、單價磷酸鹽、輔酶A在試劑1或試劑2中的位置是不限定的；.5.3所述的試劑配制成如下三劑試劑試劑1，它是由所述的緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、腺苷三磷酸、去硫代生物素、長鏈-?；?輔酶A、單價磷酸鹽與輔酶A組成的；試劑2，它是由所述的緩沖液、穩(wěn)定劑、去硫代生物素合成酶與脂酰輔酶A合成酶組成的；試劑3，它是由所述的緩沖液、穩(wěn)定劑與氨激酶組成的；其中輔酶、氨激酶、去硫代生物素合成酶、脂酰輔酶A合成酶、腺苷三磷酸、去硫代生物素、長鏈-?；?輔酶A、單價磷酸鹽、輔酶A在試劑1、試劑2或試劑3中的位置是不限定的。
6、一種氨(氨離子)診斷/測定試劑盒，其特征在于.6. 1它由下述粉狀試劑組成，在使用時用水將它們?nèi)芙獾玫骄哂邢率鰸舛确秶目芍苯邮褂玫囊后w試劑緩沖液20-500mmol/L穩(wěn)定劑0.001-7mol/L輔酶0.l-2mmol/L氨激酶1000-80000U/L去硫代生物素合成酶1000-80000U/L脂酰輔酶A合成酶1000-80000U/L腺苷三磷酸去硫代生物素l-100mmol/L l-100mmol/L長鏈-酰基-輔酶A l-100mmol/L單價磷酸鹽輔酶Al-100mmol/L l-100mmol/L ；、6. 2根據(jù)權(quán)利要求6. 1所述的氨(氨離子)診斷/測定試劑盒，其特征在于它有組成如下的試劑1 緩沖液穩(wěn)定劑輔酶腺苷三磷酸去硫代生物素20-500mmol/L 0.001-7mol/L 0.l-2mmol/L l-100mmol/L l-100mmol/L長鏈-?；?輔酶A l-100mmol/Ll-100mmol/L l-100mmol/L20-500mmol/L 0.001-7mol/L 1000-80000U/L單價磷酸鹽輔酶A組成如下的試劑2 緩沖液穩(wěn)定劑氨激酶去硫代生物素合成酶1000-80000U/L 脂酰輔酶A合成酶 1000-80000U/L ；、6. 3根據(jù)權(quán)利要求6. 1所述的氨(氨離子)診斷/測定試劑盒，其特征在于它有組成如下的試劑1 緩沖液穩(wěn)定劑輔酶腺苷三磷酸去硫代生物素長鏈-?；?輔酶A 單價磷酸鹽輔酶A組成如下的試劑2 緩沖液穩(wěn)定劑去硫代生物素合成酶脂酰輔酶A合成酶組成如下的試劑3 緩沖液穩(wěn)定劑20-500mmol/L 0.001-7mol/L 0.l-2mmol/L l-100mmol/L l-100mmol/Ll-100mmol/L l-100mmol/L l-100mmol/L ；20-500mmol/L 0.001-7mol/L 1000-80000U/L 1000-80000U/L20-500mmol/L 0.001-7mol/L氨激酶1000-80000U/L。
全文摘要
本發(fā)明涉及利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的氨(氨離子)含量的測定方法、試劑的組成及成分，其測定的技術(shù)原理是依據(jù)氨激酶、去硫代生物素合成酶、脂酰輔酶A合成酶的系列催化反應(yīng)完成，本發(fā)明還涉及一種氨(氨離子)診斷/測定試劑盒。本發(fā)明的測定方法靈敏度高、誤差小，因此本發(fā)明的測定方法與試劑盒可以廣泛地應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)/食品檢驗。
文檔編號C12Q1/48GK102539684SQ20101058389
公開日2012年7月4日 申請日期2010年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月13日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司