專利名稱：氨(氨離子)的測定方法與氨(氨離子)診斷/測定試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學/食品檢驗測定技術領域，更具體地，本發(fā)明涉及氨(氨離子)診斷/測定方法及其試劑盒。
背景技術：
氨測定的方法有微量擴散法、離子交換法、酶法和氨電極法等。目前應用最多的方法是酶法和基于離子選擇電極的血氨測定儀分析法。
擴散法是標本堿化后，釋放出NH3,用酸滴定釋放出的氨，或用Nessler反應形成棕黃色碘化雙汞胺進行比色。這些方法需要堿化，內(nèi)源性的氨形成造成影響，使其準確性和精密度受到影響，目前已很少應用；離子交換法比擴散法更準確，CV為8% 13% ’離子選擇電極法是利用NH3擴散到電極表面，引起電極的pH發(fā)生變化進行測定，該方法的CV為 3. 5% 4. 8%，回收率高。結(jié)合具體實際，應以酶法測定為實用。
檢索中國專利，僅查出87105593. 7專利申請公開了一種血氨測定速凍杯，卻未發(fā)現(xiàn)比較理想的血氨測定方法。發(fā)明內(nèi)容
[要解決的技術問題]
本發(fā)明的目的是提供一種氨(氨離子)的測定方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種氨(氨離子)診斷/測定試劑盒。
[技術方案]
本發(fā)明是通過下述技術方案實現(xiàn)的。
本發(fā)明的方法是一種采用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)與酶 (偶)聯(lián)法(Couple Reaction)的聯(lián)用技術，利用測定還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在 340nm波長處的吸光度變化測定氨(氨離子)的方法。
本發(fā)明氨(氨離子)測定方法的的技術原理是根據(jù)下述氨激酶、乙酰輔酶A羧化酶、氯苯甲酰-1，2-加雙氧酶的系列催化反應完成
氨+腺苷三磷酸氨激酶腺苷二磷酸+磷酰胺
腺苷二磷酸+磷酸根+蘋果酰-輔酶A乙酰-輔酶A羧化酶
乙酰輔酶A+腺苷三磷酸+ 二氧化碳
二氧化碳+ JL茶酚+輔酶+氯氯苯甲酸-1,2-加雙氧酶
2-氯苯甲酸+還原型輔酶+氧
本發(fā)明的方法利用氨激酶(ammonia kinase ；EC 2. 7. 3. 8)酶(偶)聯(lián)乙酰輔酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase ；EC 6. 4. 1.幻、氯苯甲酰-I，2_加雙氧酶 (Chlorobenzoate 1, 2-dioxygenase ；EC 1. 14. 12. 13)酶促反應比色終點法。氨激酶酶解氨反應產(chǎn)生腺苷二磷酸，再通過(偶)聯(lián)合乙酰輔酶A羧化酶、氯苯甲酰-1，2-加雙氧酶5的作用，最終將輔酶(在340nm處沒有吸收峰)還原成為還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度上升的程度，這樣可以通過測量340nm處吸光度上升的程度，可以測算氨(氨離子)的濃度大小。
本發(fā)明是通過下述技術方案實現(xiàn)的。
本發(fā)明涉及一種氨(氨離子)的測定方法。該氨(氨離子)測定方法的步驟如下
A、樣品準備
A. 1標準樣品的制備
將一定量的氨鹽溶于水或緩沖液中，再將氨濃度調(diào)整到100微摩爾/升，得到的溶液作為標準樣品；
A. 2待測樣品的制備
待測液體樣品直接測試，無須預處理；將一定量的待測固體樣品像制備標準樣品一樣溶于水或緩沖液中；
A. 3空白樣品
所述的水或緩沖液作為空白樣品，其氨(氨離子)濃度為0微摩爾/升；
B、試劑溶液的制備
分別移取或稱取緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、氨激酶、乙酰輔酶A羧化酶、氯苯甲酰-1， 2-加雙氧酶、腺苷三磷酸、蘋果酰輔酶A、氯、兒茶酚與單價磷酸鹽，然后將它們混合均勻，用水溶解得到所述的試劑溶液，它們的濃度分別是20-500mmol/L、0. 001-7mol/L、 0. l-2mmol/L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、l—lOOmmol/L、I-IOOmmol/ L、l-100mmol/L、l-100mmol/L 與 l-lOOmmol/L ；
C、待測樣品與在步驟B)得到的試劑溶液按照體積比1/10至1/500進行混合，在溫度15-45°C下反應5-60分鐘，在主波長340nm與副波長405nm(如果受儀器限制可以不設副波長)下進行測定，測定其吸光度隨時間的變化；
D、在與步驟C)同樣的條件下測定步驟A)標準樣品的吸光度隨時間的變化；
E、在與步驟C)同樣的條件下測定在步驟A)空白樣品的吸光度隨時間的變化；
F、數(shù)據(jù)處理
由步驟C-E)所述測定的主波長340nm的吸光度隨時間的變化，根據(jù)下式計算得到氨的含量
ΔΑ (樣品)-ΔΑ(空白)氨(氨離子)含量=-χ標準濃度(μπιοΙ/L)ΔΑ (標準)-ΔΑ(空白)
式中
Δ A(樣品)表示步驟C)得到的待測樣品的吸光度變化；
Δ A(空白)表示步驟Ε)得到的空白樣品的吸光度變化；
Δ A (標準)表示步驟D)標準樣品的吸光度變化。
根據(jù)本發(fā)明，在所述的氨(氨離子)測定方法中，所述的緩沖液應該理解是能夠使其測定介質(zhì)的PH基本保持穩(wěn)定(一般是6. 0-9.0)的溶液。如果該ρΗ高于9.0或ρΗ低于6. 0，則該測定方法使用的酶的活性達不到預期的活性效果，因此需要添加更多的介質(zhì)與酶，才有可能達到預期的活性效果。
在本發(fā)明中，所述的緩沖液是一種或多種選自三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液、磷酸鹽緩沖液、咪唑-鹽酸緩沖液、磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液、硼砂-鹽酸緩沖液、 甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液、巴比妥鈉-鹽酸緩沖液、硼酸-硼砂緩沖液、二乙醇胺緩沖液或 “PBS”緩沖液的緩沖液。
優(yōu)選地，所述的緩沖液例如選自三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)緩沖液、 磷酸鹽緩沖液或“PBS”緩沖液。
更優(yōu)選地，所述的緩沖液例如選自三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)緩沖液或磷酸鹽緩沖液。
根據(jù)本發(fā)明，在所述的氨(氨離子)測定方法中，所述的穩(wěn)定劑應該理解是一種能保護試劑中的介質(zhì)(底物)與酶，使其不會隨著時間推移而改變其性質(zhì)，進而失去活性的物質(zhì)，它會使得試劑具備很長的活性壽命，通常長達數(shù)月，甚至一、二年。如果沒有所述的穩(wěn)定劑，則試劑的活性在溶液中只能維持數(shù)十小時，頂多數(shù)天，就會逐漸失去活性而不再具備檢測性能。在本發(fā)明中，所述的穩(wěn)定劑使用量是0.01-7mol/L。如果所述的穩(wěn)定劑使用量不夠，則試劑活性的壽命就會縮短；如果所述的穩(wěn)定劑使用量過高，則會增加成本。
在本發(fā)明中，所述的穩(wěn)定劑是一種或多種選自氯化鈉、乙二醇、丙二醇、甘油或雙乙酸鈉或疊氮鈉防腐劑的穩(wěn)定劑。
優(yōu)選地，所述的穩(wěn)定劑例如是一種或多種選自氯化鈉、丙二醇、甘油或雙乙酸鈉或疊氮鈉的穩(wěn)定劑。
更優(yōu)選地，所述的穩(wěn)定劑例如是一種或多種選自甘油或雙乙酸鈉的穩(wěn)定劑。
在本發(fā)明中，所述的輔酶是一種或多種選自NADP+、NAD+或thio-NAD+的輔酶。
根據(jù)一種本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，本發(fā)明使用全自動生化分析儀測定氨(氨離子)時，待測樣品、所述標準樣品與所述空白樣品由該分析儀在設定條件下(參數(shù))自動取樣，然后在下述條件下進行測定測定方法為二點終點法/終點法，溫度37°C，反應時間10 分鐘，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測氨(氨離子)樣品與試劑的體積比例為 1/10-1/500，反應方向為正反應，延遲時間1/0分鐘，檢測時間4/5分鐘。
根據(jù)另一種本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，本發(fā)明使用的試劑溶液配制成如下雙劑試劑
由所述的緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、腺苷三磷酸、蘋果酰輔酶A、氯、兒茶酚與單價磷酸鹽組成的試劑1 ；
由所述的緩沖液、穩(wěn)定劑、氨激酶、乙酰輔酶A羧化酶與氯苯甲酰-1，2-加雙氧酶組成的試劑2 ；
其中輔酶、氨激酶、乙酰輔酶A羧化酶、氯苯甲酰-1，2-加雙氧酶、腺苷三磷酸、蘋果酰輔酶A、氯、兒茶酚、單價磷酸鹽在試劑1或試劑2中的位置是不限定的。
根據(jù)另一種本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，本發(fā)明使用的試劑配制成如下三劑試劑
由所述的緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、腺苷三磷酸、蘋果酰輔酶A、氯、兒茶酚與單價磷酸鹽組成的試劑1 ；
由所述的緩沖液、穩(wěn)定劑、乙酰輔酶A羧化酶與氯苯甲酰-1，2-加雙氧酶組成的試劑2 ；
由所述的緩沖液、穩(wěn)定劑與氨激酶組成的試劑3 ；
其中輔酶、氨激酶、乙酰輔酶A羧化酶、氯苯甲酰-1，2-加雙氧酶、腺苷三磷酸、蘋果酰輔酶A、氯、兒茶酚、單價磷酸鹽在試劑1、試劑2或試劑3中的位置是不限定的。
在本發(fā)明氨(氨離子)測定方法中使用的測定儀器可以是紫外/可見光分析儀， 例如上海精密儀器儀表有限公司銷售的紫外可見分光光度計、天津喀納斯光學分析儀器有限公司銷售的723可見分光光度計；半自動生化分析儀，例如上海偉思醫(yī)用設備有限公司的BTS-330半自動生化分析儀；全自動生化分析儀，例如由邁瑞公司以商品名BS-300、奧林帕斯公司以商品名AU400、東芝公司以商品名120、日立公司以商品名7600、雅培公司以商品名CB8000或貝克曼公司以商品名CX20銷售的全自動生化分析儀。
本發(fā)明還涉及氨(氨離子)診斷/測定試劑盒。該氨(氨離子)診斷/測定試劑盒由下述粉狀試劑組成，在使用時用水將它們?nèi)芙獾玫骄哂邢率鰸舛确秶目芍苯邮褂玫囊后w試劑
緩沖液20-500mmol/L
穩(wěn)定劑0.001-7mol/L
輔酶0.l-2mmol/L
氨激酶1000-80000U/L
乙酰輔酶A羧化酶1000-80000U/
氯苯甲酰-1，2-加雙氧酶1000-80000U/L
腺苷三磷酸l-100mmol/L
蘋果酰輔酶Al-100mmol/L
氯l-100mmol/L
兒茶酚l-100mmol/L
單價磷酸鹽l-100mmol/Lo
根據(jù)一種本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，本發(fā)明的氨(氨
試劑1
緩沖液1OOmmo1/L
穩(wěn)定劑500mmol/L
輔酶0.25mmol/L
腺苷三磷酸5mmol/L
蘋果酰輔酶A5mmol/L
氯5mmol/L
兒茶酚5mmol/L
單價磷酸鹽5mmol/L ；
組成如下的試劑2
緩沖液IOOmmo1/L
穩(wěn)定劑500mmol/L
氨激酶16000U/L
乙酰輔酶A羧化酶18000U/L測定試劑盒有
氯苯甲酰-1，2-加雙氧酶12000U/L。
根據(jù)另一種本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，本發(fā)明的氨(氨離子)診斷/測定試劑盒有
試劑1
緩沖液IOOmmol/L
穩(wěn)定劑500mmol/L
輔酶0. 25mmol/L
腺苷三磷酸5mmol/L
蘋果酰輔酶A5mmol/L
氯5mmol/L
兒茶酚5mmol/L
單價磷酸鹽5mmol/L ；
組成如下的試劑2
緩沖液1OOmmo1/L
穩(wěn)定劑500mmol/L
乙酰輔酶A羧化酶18000U/L
氯苯甲酰-1，2-加雙氧酶12000U/L ；
組成如下的試劑3
緩沖液IOOmmo1/L
穩(wěn)定劑500mmol/L
氨激酶16000U/L。
根據(jù)另一種本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，在本發(fā)明的氨(氨離子)診斷/測定試劑盒中，所述的緩沖液是一種或多種選自:Ξ (羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液、磷酸鹽緩沖液、咪唑-J鹽酸緩沖液、磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液、硼砂-鹽酸緩沖液、甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液、巴比妥鈉-鹽酸緩沖液、硼酸-硼砂緩沖液、二乙醇胺緩沖液或“PBS”緩沖液的緩沖液。
優(yōu)選地，所述的緩沖液例如選自三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)緩沖液、 磷酸鹽緩沖液或“PBS”緩沖液。
更優(yōu)選地，所述的緩沖液例如選自三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)緩沖液或磷酸鹽緩沖液。
在本發(fā)明中，所述的穩(wěn)定劑是一種或多種選自氯化鈉、乙二醇、丙二醇、甘油或雙乙酸鈉或疊氮鈉防腐劑的穩(wěn)定劑。
優(yōu)選地，所述的穩(wěn)定劑例如是一種或多種選自氯化鈉、丙二醇、甘油、雙乙酸鈉或疊氮鈉的穩(wěn)定劑。
更優(yōu)選地，所述的穩(wěn)定劑例如是一種或多種選自甘油或雙乙酸鈉的穩(wěn)定劑。
在本發(fā)明中，無論是單劑試劑、雙劑試劑或三劑試劑，在本發(fā)明測定氨(氨離子) 的方法中，所述的輔酶可以是一種或多種選自NADP+、NAD+或thio-NAD+的輔酶。
使用本發(fā)明的氨(氨離子)診斷/測定試劑盒時，可以使用紫外/可見光分析儀， 例如上海精密儀器儀表有限公司銷售的紫外可見分光光度計、天津喀納斯光學分析儀器有限公司銷售的723可見分光光度計；半自動生化分析儀，例如上海偉思醫(yī)用設備有限公司的BTS-330半自動生化分析儀；全自動生化分析儀，例如由邁瑞公司以商品名BS-300、奧林帕斯公司以商品名AU400、東芝公司以商品名120、日立公司以商品名7600、雅培公司以商品名CB8000或貝克曼公司以商品名CX20銷售的全自動生化分析儀。
在采用本發(fā)明方法測定氨(氨離子)時，根據(jù)實驗要求進行多次試驗，然后將得到的這些試驗結(jié)果按照下式計算出精密度(CV)

可以達到彡5%0
本發(fā)明方法的靈敏度可以達到1 μ mol/L。
通過大量試驗確定，本發(fā)明方法測定氨(氨離子)含量范圍是Ο-ΙΟΟΟμπιοΙ/L，本發(fā)明方法適合于醫(yī)學臨床/食品診斷/檢測。
具體實施方式
下述實施例說明本發(fā)明而不限制本發(fā)明的保護范圍。
實施例1 血漿中氨(氨離子)含量的測定
1)標準樣品的制備
將一定量的氨鹽溶于水或緩沖液中，再將氨濃度調(diào)整到100微摩爾/升；
2)待測樣品預處理
血漿樣品作為待測樣品，無須預處理；
3)空白樣品
所述的水或緩沖液作為空白樣品，其氨濃度為0微摩爾/升；
B、試劑溶液的制備
本實施例的氨診斷/測定試劑為單劑試劑，它含有S= V Σ (X-X1) 2Zn-I 式中又-試驗結(jié)果平均值； Xi-各次試驗結(jié)果； η-試驗次數(shù).N彡10CV = S/ X * 100%將得到的這些試驗結(jié)果按照下式計算出相對極差Δ - Γ - V~~ (3Γ + ^ + 1Z ) ^ 3χ_第一批各次試驗結(jié)果平均值 Y_第二批各次試驗結(jié)果平均值 Z~第三批各次試驗結(jié)果平均值 _為X，γ，Z中的最大值V_為X，Y，ζ中的最小值每批試樣數(shù)取η ^3經(jīng)過大量試驗確定，對于氨(氨離子)含量為O-lOOOymol/L的樣品，其分析誤差
三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 lOOmmol/L
甘油lmol/L
NADP+0. 25mmol/L
氨激酶16000U/L
乙酰輔酶A羧化酶18000U/L
氯苯甲酰-1，2-加雙氧酶12000U/L
腺苷三磷酸5mmol/L
蘋果酰輔酶A5mmol/L
氯5mmol/L
兒茶酚5mmol/L
單價磷酸鹽5mmol/L。
按照上述濃度將這些試劑加入去離子水全部溶解配制好待用。
C、待測血漿樣品，與在步驟B)得到的試劑溶液按照體積比1/20進行混合，在溫度 37°C下反應5分鐘，在主波長340nm與副波長405nm下進行測定，測定其吸光度隨時間的變化ΔΑ(樣品)為0.0277 ；
D、在與步驟C)同樣的條件下測定步驟Α)標準樣品的吸光度隨時間的變化 △ Α (標準)為 0.0523 ；
Ε、在與步驟C)同樣的條件下測定在步驟Α)使用的水作為空白溶液的吸光度隨時間的變化ΔΑ(空白)為0.0106 ；
F、數(shù)據(jù)處理
由步驟C-E)所述測定的主波長340nm的吸光度隨時間的變化，根據(jù)下式計算得到氨(氨離子)的含量
ΔΑ (樣品)-ΔΑ(空白)氨(氨離子)含量=-χ標準濃度(μπιοΙ/L)ΔΑ (標準)-ΔΑ(空白)
式中
Δ A(樣品)表示步驟C)得到的待測樣品的吸光度變化；
Δ A(空白)表示步驟Ε)得到的空白樣品的吸光度變化；
Δ A (標準)表示步驟D)標準樣品的吸光度變化。
通過上式計算得到該血漿樣品的氨(氨離子)含量為82 ymol/L，其誤差是士2 μ mol/L0
實施例2 血漿中氨(氨離子)含量的測定
1)標準樣品的制備
將一定量的氨鹽溶于水中，再將氨(氨離子)濃度調(diào)整到100微摩爾/升，作為標準樣品；
2)待測樣品的制備
血漿樣品作為待測樣品，無須預處理；
3)空白樣品0171]0172]0173]0174]0175]0176]0177]0178]0179]0180] 0181] 0182]0183]0184]0185]0186]0187]0188]0189]0190]0191]0192]0193]0194]0195]0196]0197]0198]0199]0200] 0201] 0202]0203]0204]0205]0206]0207]0208] 0209]所述的水作為空白樣品，其氨(氨離子)濃度為0微摩爾/升B、試劑溶液的制備氨(氨離子)診斷/測定試劑為雙劑試劑，它含有 組成如下的試劑1 磷酸鹽緩沖液lOOmmol/LNAD+0. 25mmol/L腺苷三磷酸5mmol/L蘋果酰輔酶A5mmol/L氯5mmol/L兒茶酚5mmol/L單價磷酸鹽5mmol/L ；組成如下的試劑2 磷酸鹽緩沖液lOOmmol/L乙二醇5mol/L氨激酶16000U/L乙酰輔酶A羧化酶32000U/L氯苯甲酰-1，2-加雙氧酶40000U/L。按照上述濃度將這些試劑加入去離子水全部溶解配制好待用。C、樣品使用日立7080全自動生化分析儀測定該全自動生化分析儀主要操作參數(shù)如下計量方法測試計量時間點主波長副波長反應溫度樣品體積試劑1 (Rl)體積試劑2(R3)體積反應方向標準樣品1 標準樣品2兩點終點法 21,31 340 405 37 20 200 50 正 0100定標結(jié)果顯示K值為5011，換算成靈敏度為0. 00020 Δ A/ μ mol/L。 測試結(jié)果顯示該血漿中含有氨(氨離子)為21 μ mol/L。其誤差是士 1 μ mol/Lc 實施例3 血漿樣品中氨(氨離子)含量的測定該實施例的操作方式與實施例2相同，只是本實施例 B、試劑溶液的制備氨(氨離子)診斷/測定試劑為三劑試劑，它含有 組成如下的試劑1 (羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液IOOmmol/LCN 102539674 A




NAD+0. 25mmol/L腺苷三磷酸5mmol/L蘋果酰輔酶A5mmol/L氯5mmol/L兒茶酚5mmol/L單價磷酸鹽5mmol/L ；組成如下的試劑2 三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液氯化鈉乙酰輔酶A羧化酶氯苯甲酰-1，2-加雙氧酶組成如下的試劑3 三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液氯化鈉氨激酶按照上述濃度將這些試劑加入去離子水全部溶解配制好待用, C、樣品使用日立7080全自動生化分析儀測定該全自動生化分析儀主要操作參數(shù)如下IOOmmol/L 2mol/L 28000U/L 50000U/L ；IOOmmol/L 2mol/L 26000U/L。計量方法測試計量時間點主波長副波長反應溫度樣品體積兩點終點法 :21,31反應方向標準樣品1 標準樣品23404053720體積20體積180體積50正0100定標結(jié)果顯示K值為4705，換算成靈敏度為0. 00021 Δ A/μ mol/L。 測試結(jié)果顯示該血漿中含有氨(氨離子)為78 μ mol/L。其誤差是士 2 μ mol/L。 實施例4 穩(wěn)定性試驗該實施例的操作方式與實施例1相同，只是在實施例1實施后，實施例1使用的試劑在密閉試劑瓶中在2-8°C下存放了半年與一年。
使用同樣的標準樣品，使用與實施例2同樣的新試劑與上述存放半年與一年的試劑分別進行了測定，其它條件都與實施例2相同，其測定結(jié)果如下
表權利要求
1.一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術的氨(氨離子)濃度測定方法，其測定的技術原理是根據(jù)下述氨激酶、乙酰輔酶A羧化酶、氯苯甲酰-1，2-加雙氧酶的系列催化反應完成氨+腺苷三磷酸氨激酶腺苷二磷酸+磷酰胺腺苷二磷酸+磷酸根+蘋果酰-輔酶A乙酰-輔酶A羧化酶乙酰輔酶A+腺苷三磷酸+ 二氧化碳二氧化碳+兒茶酚+輔酶+氯氯苯甲酸-1,2-加雙氧酶2-氯苯甲酸+還原型輔酶+氧
2.一種氨(氨離子)的測定方法，其特征在于該方法的步驟如下 2. 1樣品準備2. 1. 1標準樣品的制備將一定量的氨鹽溶于水或緩沖液中，再將其濃度調(diào)整到100微摩爾/升； 2. 1.2待測樣品的制備待測液體樣品直接測試，無須預處理；將一定量的待測固體樣品像制備標準樣品一樣溶于水或緩沖液中； 2. 1.3空白樣品所述的水或緩沖液作為空白樣品，其氨(氨離子)濃度為0微摩爾/升； 2. 2試劑溶液的制備分別移取或稱取緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、氨激酶、乙酰輔酶A羧化酶、氯苯甲酰-1，2-加雙氧酶、腺苷三磷酸、蘋果酰輔酶A、氯、兒茶酚與單價磷酸鹽，然后將它們混合均勻，用水溶解得到所述的試劑溶液，它們的濃度分別是20-500mmol/L、0. 001-7mol/L、0. l-2mmol/L、 1000-80000U/L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、l-lOOmmol/L、l-lOOmmol/L、I-IOOmmol/ LU-lOOmmol/L 與 l-100mmol/L ；2. 3待測樣品與在步驟2. 2)得到的試劑溶液按照體積比1/10至1/500進行混合，在溫度15-45°C下反應5-60分鐘，在主波長340nm與副波長405nm(如果受儀器限制，可以不設副波長)下進行測定，測定其吸光度隨時間的變化；2. 4在與步驟2. 3)同樣的條件下測定步驟2. 1. 1)標準樣品的吸光度隨時間的變化； 2. 5在與步驟2. 3)同樣的條件下測定在步驟2. 1. 3)使用的水或緩沖液作為空白溶液的吸光度隨時間的變化；2.6數(shù)據(jù)處理由步驟2. 3-2. 5)所述測定的主波長340nm的吸光度隨時間的變化，根據(jù)下式計算得到氨的含量氨含量=式中ΔΑ(樣品)表示步驟2. 3)得到的待測樣品的吸光度變化； ΔΑ(空白)表示步驟2. 5)得到的空白溶液的吸光度變化； 八八(標準)表示步驟2. 4)標準樣品的吸光度變化。
3.根據(jù)權利要求1、2所述的測定方法，其特征在于使用全自動生化分析儀測定時，待2ΔΑ (樣品)-ΔΑ (空白)-χ標準濃度(μπιοΙ/L )ΔΑ(標準)-ΔΑ(空白)測樣品、所述標準樣品與所述空白樣品由該分析儀在設定條件下自動取樣，然后在下述條件下進行測定測定方法為終點法，溫度37°C，反應時間10分鐘，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測氨樣品與試劑的體積比例為1/10-1/500，反應方向為正反應，延遲時間 1/0分鐘，檢測時間4/5分鐘。
4.根據(jù)權利要求1、2或3所述的測定方法，其特征在于，所述的穩(wěn)定劑是一種或多種選自氯化鈉、乙二醇、丙二醇、甘油或雙乙酸鈉、疊氮鈉等防腐劑的穩(wěn)定劑；所述的緩沖液是一種或多種選自三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液、磷酸鹽緩沖液、咪唑-鹽酸緩沖液、磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液、硼砂-鹽酸緩沖液、甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液、巴比妥鈉-鹽酸緩沖液、硼酸-硼砂緩沖液、二乙醇胺緩沖液或“PBS”緩沖液的緩沖液；所述的輔酶是一種或多種選自NADP+、NAD+或thio-NAD+的輔酶。
5.根據(jù)權利要求1、2或3所述的測定方法，其特征在于5. 1所述的試劑溶液配制成如下單劑試劑它是由所述的緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、腺苷三磷酸、蘋果酰輔酶A、氯、兒茶酚、單價磷酸鹽、氨激酶、乙酰輔酶A羧化酶與氯苯甲酰-1，2-加雙氧酶組成的；5. 2所述的試劑溶液配制成如下雙劑試劑試劑1，它是由所述的緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、腺苷三磷酸、蘋果酰輔酶A、氯、兒茶酚與單價磷酸鹽組成的；試劑2，它是由所述的緩沖液、穩(wěn)定劑、氨激酶、乙酰輔酶A羧化酶與氯苯甲酰-1，2-加雙氧酶組成的；其中輔酶、氨激酶、乙酰輔酶A羧化酶、氯苯甲酰-1，2-加雙氧酶、腺苷三磷酸、蘋果酰輔酶A、氯、兒茶酚、單價磷酸鹽在試劑1或試劑2中的位置是不限定的；5.3所述的試劑配制成如下三劑試劑試劑1，它是由所述的緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、腺苷三磷酸、蘋果酰輔酶A、氯、兒茶酚與單價磷酸鹽組成的；試劑2，它是由所述的緩沖液、穩(wěn)定劑、乙酰輔酶A羧化酶與氯苯甲酰-1，2-加雙氧酶組成的；試劑3，它是由所述的緩沖液、穩(wěn)定劑與氨激酶組成的；其中輔酶、氨激酶、乙酰輔酶A羧化酶、氯苯甲酰-1，2-加雙氧酶、腺苷三磷酸、蘋果酰輔酶A、氯、兒茶酚、單價磷酸鹽在試劑1、試劑2或試劑3中的位置是不限定的。
6.一種氨(氨離子)診斷/測定試劑盒，其特征在于6. 1它由下述粉狀試劑組成，在使用時用水將它們?nèi)芙獾玫骄哂邢率鰸舛确秶目芍苯邮褂玫囊后w試劑20-500mmol/L 0.001-7mol/L 0.l-2mmol/L 1000-80000U/L 1000-80000U/L 1000-80000U/L l-100mmol/L緩沖液穩(wěn)定劑輔酶氨激酶乙酰輔酶A羧化酶氯苯甲酰-1，2-加雙氧酶腺苷三磷酸CN 102539674 A蘋果酰輔酶A 氯兒茶酚單價磷酸鹽l-100mmol/L l-100mmol/L l-100mmol/L l-100mmol/L ；6. 2根據(jù)權利要求6. 1所述的氨(氨離子)診斷/測定試劑盒，其特征在于它有組成如下的試劑1 緩沖液20-500mmol/L穩(wěn)定劑0.001-7mol/L輔酶0.l-2mmol/'L腺苷三磷酸1--IOOmmol/xL蘋果酰輔酶A1.-IOOmmol/L氯1--IOOmmol/xL兒茶酚1--IOOmmol/xL單價磷酸鹽1--IOOmmol/7L組成如下的試劑2 緩沖液穩(wěn)定劑氨激酶乙酰輔酶A羧化酶氯苯甲酰-1，2-加雙氧酶6. 3根據(jù)權利要求6. 1所述的氨組成如下的試劑1 緩沖液穩(wěn)定劑輔酶腺苷三磷酸蘋果酰輔酶A 氯兒茶酚單價磷酸鹽組成如下的試劑2 緩沖液穩(wěn)定劑乙酰輔酶A羧化酶氯苯甲酰-1，2-加雙氧酶組成如下的試劑3 緩沖液穩(wěn)定劑氨激酶20-500mmol/L 0.001-7mol/L 1000-80000U/L 1000-80000U/L 1000-80000U/L ； (氨離子)診斷/測定試劑盒，其特征在于它有20-500mmol/L 0.001-7mol/L 0.l-2mmol/L l-100mmol/L l-100mmol/L l-100mmol/L l-100mmol/Ll-100mmol/L ；20-500mmol/L 0.001-7mol/L 1000-80000U/L 1000-80000U/L ；20-500mmol/L 0.001-7mol/L 1000-80000U/L。
全文摘要
本發(fā)明涉及利用酶比色法及酶聯(lián)法技術的氨(氨離子)含量的測定方法、試劑的組成及成分，其測定的技術原理是依據(jù)氨激酶、乙酰輔酶A羧化酶、氯苯甲酰-1,2-加雙氧酶的系列催化反應完成，本發(fā)明還涉及一種氨(氨離子)診斷/測定試劑盒。本發(fā)明的測定方法靈敏度高、誤差小，因此本發(fā)明的測定方法與試劑盒可以廣泛地應用于臨床醫(yī)學/食品檢驗。
文檔編號C12Q1/527GK102539674SQ201010583828
公開日2012年7月4日 申請日期2010年12月13日 優(yōu)先權日2010年12月13日 公開號201010583828.發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司