專利名稱：一種利用紅色熒光蛋白用做水稻轉(zhuǎn)化篩選標(biāo)記的轉(zhuǎn)化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了一種新的應(yīng)用于植物轉(zhuǎn)化的安全的篩選標(biāo)記，并提供了利用熒光顯微鏡進(jìn)行篩選的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)能夠?qū)⒕哂袃?yōu)良性狀的目的基因?qū)胫参锘蚪M中，從而使植物的遺傳性狀得到改良。然而轉(zhuǎn)化過程中只有少數(shù)植物細(xì)胞能夠吸收外源DNA并整合進(jìn)植物基因組中，大多數(shù)細(xì)胞是未轉(zhuǎn)化的。因此，目的基因的引入常常需要借助于篩選標(biāo)記基因， 賦予轉(zhuǎn)化細(xì)胞以特定的選擇性標(biāo)記，以便識別和鑒定轉(zhuǎn)基因植物。傳統(tǒng)的鑒定分離轉(zhuǎn)化細(xì)胞的方法大都是“負(fù)向篩選”，常用的篩選基因如抗生素標(biāo)記Npt II基因(產(chǎn)生新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶，抗卡那霉素、G418、巴龍霉素、新霉素)、HPT基因(產(chǎn)生潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶，抗潮霉素)，抗除草劑基因Bar基因(產(chǎn)生PPT乙酰轉(zhuǎn)移酶，抗 Bialaphos或glufosinate)等，在添加了篩選劑的培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)化細(xì)胞能夠生長，而未轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長則受到抑制甚至被殺死。隨著轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的商業(yè)化，轉(zhuǎn)基因的生物安全尤其是篩選標(biāo)記的生物安全受到廣泛關(guān)注。負(fù)向篩選標(biāo)記基因的潛在危害在于抗除草劑基因可能會導(dǎo)致超級雜草的產(chǎn)生； 抗生素抗性基因可能會逃逸到環(huán)境中進(jìn)行傳播，也有可能通過食物在腸道中水平轉(zhuǎn)移至微生物，從而影響抗生素治療的有效性；另外一方面，非轉(zhuǎn)化細(xì)胞在逐漸凋亡過程中能夠分泌毒素或生長抑制劑，阻礙營養(yǎng)物質(zhì)向轉(zhuǎn)化細(xì)胞的運(yùn)輸，從而影響轉(zhuǎn)化細(xì)胞的增殖及分化。鑒于負(fù)向篩選基因的各種不利因素，正向選擇方法應(yīng)運(yùn)而生。所謂正向篩選是相對于負(fù)向篩選而言的，即在篩選培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞能夠有效利用培養(yǎng)基中的碳源正常生長，而非轉(zhuǎn)化細(xì)胞不能利用培養(yǎng)基中的唯一碳源受到饑餓抑制。常用的正向篩選基因如糖代謝酶基因木糖異構(gòu)酶基因(xylA)，甘露糖磷酸異構(gòu)酶(PMI)和氨基酸代謝酶如谷氨酸-1-半醛轉(zhuǎn)氨酶基因(heml )，這種篩選方法沒有毒素物質(zhì)，不影響轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長和再生，而且很多報道表明正向篩選方法比負(fù)向篩選有著更高的篩選效率。但是，利用這些糖類做唯一碳源可能會對植物細(xì)胞的再生分化產(chǎn)生不同于蔗糖的效應(yīng)，這些都還需要進(jìn)一步的研究。目前還有一些轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，先利用通常的選擇標(biāo)記篩選出初級轉(zhuǎn)基因植株，然后利用轉(zhuǎn)基因植株后代遺傳重組使選擇標(biāo)記與目的基因分離，或利用位點(diǎn)特異酶將標(biāo)記基因切除而培育出無選擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因植株。這類方法主要有三種系統(tǒng)共轉(zhuǎn)化系統(tǒng)、雙T-DNA邊界序列轉(zhuǎn)化法、特異重組酶轉(zhuǎn)化系統(tǒng)(FLP/ FRTs.Cre/LoxP.R/ RS及GIN系統(tǒng)等)和轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)等，其中應(yīng)用最廣泛的是共轉(zhuǎn)化法和Cre/l0X位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)。然而這些篩選標(biāo)記的剔除技術(shù)尚處于探索階段，所用的載體大多局限于農(nóng)桿菌的T-DNA載體，也主要在模式植物如煙草和擬南芥上研究的較為成熟，要使這些技術(shù)成功應(yīng)用于植物育種，還需要大量的研究工作，并針對不同植物建立相應(yīng)的標(biāo)記基因剔除系統(tǒng)。例如，對于共轉(zhuǎn)化法來說，標(biāo)記基因和目的基因的遺傳分離經(jīng)過有性世代才能實(shí)現(xiàn)，這不僅會增加育種時間，而且無法應(yīng)用于無性繁殖的植物品種。而Cre/lox系統(tǒng)應(yīng)用的難點(diǎn)在于Cre重組酶啟動的時間以及如何啟動Cre重組酶的表達(dá)進(jìn)而消除Iox位點(diǎn)間的序列。其次，篩選標(biāo)記的剔除法需要更高的效率以適應(yīng)大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用。
另外一種安全的篩選標(biāo)記是熒光蛋白。熒光的發(fā)生不需要任何底物和輔助因子，其表達(dá)產(chǎn)物也對細(xì)胞沒有任何毒性，不會影響細(xì)胞的正常生長和功能。而且，利用熒光的強(qiáng)度可以分辨出轉(zhuǎn)基因植物的純合性以及雜合性。第一個廣泛應(yīng)用的熒光蛋白是綠色熒光蛋白 (GFP)，GFP用于植物轉(zhuǎn)化中的篩選標(biāo)記已經(jīng)申請專利(US6486382，EP0904371B1)。但是綠色蛋白本身還是有很多缺點(diǎn)的，它的發(fā)射波普限制在440 529nm,激發(fā)和發(fā)射波譜太短， 能夠激發(fā)細(xì)胞內(nèi)某些物質(zhì)發(fā)生熒光，造成細(xì)胞內(nèi)熒光成像背景較高。1999年報道了第一個紅色熒光蛋白drFP583(DsRed)，其優(yōu)點(diǎn)顯而易見與GFP 系列熒光蛋白共用，且激發(fā)和發(fā)射波長更長，細(xì)胞內(nèi)成像背景低，因此迅速被關(guān)注。短短數(shù)年，對紅色熒光蛋白的一系列研究，不同野生型的紅色熒光蛋白經(jīng)過一些列體外進(jìn)化，得到各種不同發(fā)射波長的突變體，發(fā)射光譜可以覆蓋574nm到655nm，極大地豐富了熒光蛋白的光譜多樣性，為細(xì)胞內(nèi)的多色標(biāo)記提供了更多的熒光標(biāo)簽。然而，紅色熒光蛋白作為轉(zhuǎn)基因植物的篩選標(biāo)記還沒被報道過?；诰G色熒光蛋白基因和紅色熒光蛋白基因，已經(jīng)開發(fā)了大量的熒光蛋白基因突變體，它們的熒光顏色幾乎涵蓋了所有可見光的色譜。對原始Aequorea victoria水母中的綠色熒光蛋白的改造產(chǎn)生的新的蛋白，顏色從藍(lán)到黃，都已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究中。 對紅色熒光蛋白DsRED的突變體研究以及一系列單體進(jìn)行優(yōu)化，得到了發(fā)射光在橙色和紅色光譜區(qū)域內(nèi)各種顏色的長波長的熒光蛋白，性能較好的單體蛋白有mCherry、mOrange 等。另外，在珊瑚蟲及其親緣物種中也發(fā)現(xiàn)了很多天然的各種顏色的熒光蛋白，如亮紅、橘色、灰色、棕色、褐色、黃色等，極大的豐富了熒光蛋白光譜多樣性，為生命科學(xué)研究提供了更多的選擇。

發(fā)明內(nèi)容
本項(xiàng)發(fā)明提供了一種紅色熒光蛋白FP在水稻轉(zhuǎn)化中用作篩選標(biāo)記的方法，篩選出的轉(zhuǎn)基因陽性苗經(jīng)分子鑒定，其陽性率高達(dá)80%。因此，本項(xiàng)發(fā)明為植物轉(zhuǎn)化提供了一種安全可靠的篩選標(biāo)記。本項(xiàng)發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于，(1)所使用的篩選標(biāo)記對植物細(xì)胞本身以及對環(huán)境都是安全的；(2)使用該篩選標(biāo)記篩選出的陽性轉(zhuǎn)基因苗經(jīng)過分子鑒定證明其可靠性高；(3)篩選過程在熒光顯微鏡下操作完成，具有直觀、方便的特點(diǎn)。本發(fā)明通過以下方案來實(shí)現(xiàn)首先，人工合成FP基因，并置于愈傷組織/種皮特異啟動子END2下游，并與目的基因緊密串聯(lián)，構(gòu)建于轉(zhuǎn)化載體；利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)入受體材料，并在共培養(yǎng)后30天內(nèi)利用熒光顯微鏡進(jìn)行三次篩選，最后得到的穩(wěn)定熒光團(tuán)進(jìn)入分化階段；最后，得到的轉(zhuǎn)基因幼苗進(jìn)一步在分子水平上進(jìn)行鑒定。具體步驟包括1，構(gòu)建表達(dá)載體；2，植物遺傳轉(zhuǎn)化；3，分子生物學(xué)鑒定。


圖1顯示了實(shí)施例1中植物表達(dá)載體PSPT18結(jié)構(gòu)示意圖。圖2顯示了實(shí)施例2中與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)后10天帶紅色熒光點(diǎn)的愈傷組織。
圖3顯示了實(shí)施例2中與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)后20天帶紅色熒光點(diǎn)的愈傷組織。圖4顯示了實(shí)施例2中與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)后30天的帶紅色熒光團(tuán)的愈傷組織。圖5顯示了實(shí)施例2中分化前的熒光團(tuán)愈傷組織。圖6顯示了實(shí)施例2中農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化后的再生植株(左邊為分化階段的再生植株，右邊為轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基的再生植株)。圖7顯示了實(shí)施例3中部分植株的PCR鑒定(M: DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；負(fù)/陰性對照；+:正/陽性對照)。圖8顯示了實(shí)施例4中部分轉(zhuǎn)基因植株的Southern blot鑒定(C 陰性對照，M: 分子量標(biāo)準(zhǔn)；質(zhì)粒以轉(zhuǎn)化質(zhì)粒作為陽性對照)。
具體實(shí)施例方式
下文結(jié)合實(shí)施例和附圖具體描述本發(fā)明的技術(shù)方案，但不限于此。本發(fā)明實(shí)施例中具體涉及兩個基因，分別是FP和0sCYP704B2。FP用作報告/篩選標(biāo)記基因，來源于礁珊瑚(Discosoma sp.)，它可編碼紅色熒光蛋白，可被激發(fā)出紅色熒光，用于轉(zhuǎn)基因的愈傷組織和種子的篩選，其核苷酸序列及氨基酸序列分別見SEQ ID NO. 1 和SEQ ID N0.2;0sCYP704B2為水稻內(nèi)源基因，催化脂肪酸羥基化，參與花藥角質(zhì)單體生物合成及花粉粒外壁形成，0sCYP704B2基因轉(zhuǎn)入雄性不育突變體可使其育性恢復(fù)。其核苷酸序列及氨基酸序列分別見SEQ ID N0. 3和SEQ ID N0. 4。
實(shí)施例1 構(gòu)建表達(dá)載體
本發(fā)明中轉(zhuǎn)化所使用的表達(dá)載體名稱為PSPT18 (圖1)。該載體是在pPZP基礎(chǔ)上人工構(gòu)建而來。表達(dá)載體上有2個基因表達(dá)盒一是0sCYP704B2基因表達(dá)盒，該表達(dá)盒由 0sCYP704B2基因和自身內(nèi)源啟動子和終止子構(gòu)成。為了區(qū)別水稻本身的內(nèi)源0sCYP704B2 基因及通過表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入水稻的0sCYP704B2基因，在野生型等位基因0sCYP704B2中引入3個單核苷酸突變位點(diǎn)(SNP)突變后轉(zhuǎn)化至水稻中，這3個SNP分別在第1468、1470和 1473位堿基處，均為從G突變?yōu)镃。這些改變均不影響所編碼的氨基酸序列。修飾后的 0sCYP704B2基因核苷酸序列見SEQ ID N0. 3所示，其中SNP由方框標(biāo)出；二是報告/篩選標(biāo)記基因FP基因(見SEQ ID NO. 1)表達(dá)盒，該表達(dá)盒由來自玉米的愈傷組織/種子特異性啟動子END2驅(qū)動(其核苷酸序列見SEQ ID N0. 5)，并由來自馬鈴薯的終止子PIN II終止轉(zhuǎn)錄，PIN II的核苷酸序列見SEQ ID N0. 6。載體中T-DNA區(qū)段內(nèi)不含抗生素抗性標(biāo)記基因和除草劑篩選標(biāo)記基因。 實(shí)施例2 水稻轉(zhuǎn)化
經(jīng)過了以下步驟 一、種子消毒
1，去掉外皮的水稻種子在95%的乙醇里浸泡2-3分鐘；
2，在含有吐溫(40ul，20%Tween/100ml)的40%次氯酸鈉溶液中漂洗15分鐘，更換一次漂洗液，繼續(xù)漂洗15分鐘；
3，在不含吐溫的40%次氯酸鈉溶液中漂洗15分鐘，更換漂洗液，繼續(xù)漂洗15分鐘； 4，用無菌水將種子漂洗4遍。二、愈傷誘導(dǎo)
在32°C光照培養(yǎng)箱誘導(dǎo)愈傷組織11天。
三、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化
1，挑取單菌落，接至25ml新鮮制備的農(nóng)桿菌培養(yǎng)基(添加抗生素)，280C 250-300 RPM 搖培過夜，擴(kuò)培農(nóng)桿菌至0. 3<0D550 <1.0 ；
2，將菌液以6000Xg離心5分鐘(4°C)，輕柔重懸農(nóng)桿菌至0D550= 0.1 (添力卩100 μ M AS, AS溶于DMSO的母液濃度為100mmol/L)；
3，侵染預(yù)培養(yǎng)的愈傷5-10分鐘，每隔一定時間輕柔地翻轉(zhuǎn)或搖動培養(yǎng)瓶； 4，取出農(nóng)桿菌液，在濾紙上陰干愈傷組織。，將愈傷組織放置在鋪有濾紙的共培養(yǎng)基平板上，每皿放置量以愈傷之間有縫隙為準(zhǔn)；
6，于21-25 ！培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)72小時。，常規(guī)方法漂洗愈傷組織后，陰干并轉(zhuǎn)移至篩選培養(yǎng)基，于黑暗培養(yǎng)。四、熒光篩選
1，共培養(yǎng)結(jié)束后4天，可以觀察轉(zhuǎn)化效率。共培養(yǎng)結(jié)束后第10天，丟棄無熒光的愈傷組織，對發(fā)熒光的愈傷組織進(jìn)行第一次分切，將發(fā)熒光的細(xì)胞團(tuán)切成0. 1-0. 2mm大小，轉(zhuǎn)移至新的篩選培養(yǎng)基。，共培養(yǎng)結(jié)束后第20天，第二次分切，盡量分成獨(dú)立轉(zhuǎn)化的細(xì)胞團(tuán)，大小為 0. 1-0. 2mm，轉(zhuǎn)移至新的篩選培養(yǎng)基。，共培養(yǎng)結(jié)束后第30天，第三次分切，切割標(biāo)準(zhǔn)為每個細(xì)胞團(tuán)大小為0.1-0. 2mm, 轉(zhuǎn)至新的篩選培養(yǎng)基。五、分化
1，分切三次后的愈傷在篩選培養(yǎng)基上長至>0. 2mm時，轉(zhuǎn)移到預(yù)分化培養(yǎng)基，黑暗條件下培養(yǎng)7-10天。
2，將愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基，2-3周后可見幼芽。，待小苗長至7_8cm時，轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基，7天后煉苗、移栽。實(shí)施例3 轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測
取實(shí)施例4中的轉(zhuǎn)基因水稻植株葉片，抽取總DNA。以FP基因序列為模板設(shè)計(jì)引物，對TO代轉(zhuǎn)基因水稻基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物片段為789bp。擴(kuò)增程序?yàn)?940C IOmin ；94°C lmin，60°C lmin, 72°C Imin ；37 循環(huán)；72°C IOmin0 正向引物序列為 5，-GGACTTGAACTCCACCAGG-3，；反向引物序列為5，-ATAATGCCAATACGACACC-3，。附圖 7 為部分轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR擴(kuò)增結(jié)果，說明外源基因已整合至水稻受體基因組中。實(shí)施例4 轉(zhuǎn)基因植株的Southern Blot檢測
對TO代轉(zhuǎn)基因水稻基因組DNA進(jìn)行Southern Blot檢測，以鑒定外源基因在水稻轉(zhuǎn)化受體中的整合情況。取實(shí)施例4中TO代轉(zhuǎn)基因水稻植株葉片，抽取總DNA。以FP基因序列中的M6bp核苷酸片段為探針，選用NEB公司的)(ba I限制性內(nèi)切酶進(jìn)行消化反應(yīng)。酶切反應(yīng)體系為 200ul 基因組 DNA15ug、NE Buffer 20ul、BSA 2ul、Xba I 4ul (20 U/ul)并用無離子水將體系補(bǔ)足至200 uL· 37°C溫育6小時。Southern Blot檢測結(jié)果表明，外源基因已整合至受體水稻基因組中。
權(quán)利要求
1.一種無抗生素和除草劑標(biāo)記基因的植物遺傳轉(zhuǎn)化方法，該方法包括a)一段核苷酸片段，包含熒光蛋白篩選標(biāo)記基因序列，所述序列緊密連接于愈傷組織和種皮特異性啟動子，b)將權(quán)力要求1. a)所述篩選標(biāo)記基因轉(zhuǎn)入水稻雄性不育突變體的愈傷組織中，轉(zhuǎn)化載體的T-DNA區(qū)域不含抗生素和除草劑篩選基因，c)篩選表達(dá)熒光的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，d)將篩選出的愈傷組織分化成轉(zhuǎn)基因苗。
2.權(quán)利要求書1中所述之轉(zhuǎn)基因苗所結(jié)的熒光種子。
3.權(quán)利要求書1中所述之篩選標(biāo)記基因選自FP基因，綠色熒光蛋白基因和黃色熒光蛋白基因。
4.權(quán)利要求書1中所述之熒光篩選標(biāo)記基因與內(nèi)含3個SNP的MS^序列緊密連接。
5.權(quán)利要求書3中所述之篩選標(biāo)記FP其核苷酸序列是SEQID N0:1。
6.權(quán)利要求書lb)中所述之轉(zhuǎn)化載體的T-DNA區(qū)域也不含有除草劑抗性基因。
7.權(quán)利要求書1中的轉(zhuǎn)基因植株包含修飾的MS^序列以及與之緊密相連的FP基因以及END2啟動子。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種利用紅色熒光蛋白做篩選標(biāo)記的轉(zhuǎn)化方法。我們合成了FP基因并根據(jù)水稻密碼子偏好性進(jìn)行了修改，用它作為水稻轉(zhuǎn)化和植株再生的篩選標(biāo)記基因。FP基因由愈傷組織/種皮特異啟動子驅(qū)動，并與目的基因緊密連接，由農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)入水稻胚性愈傷。在共培養(yǎng)后的30天內(nèi)利用熒光顯微鏡進(jìn)行三次篩選。獲得的轉(zhuǎn)基因苗利用PCR以及Southern雜交進(jìn)一步驗(yàn)證，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因苗陽性率高達(dá)80%，證明了FP作為植物轉(zhuǎn)化的篩選標(biāo)記是完全可行的。本發(fā)明有效降低了傳統(tǒng)篩選標(biāo)記如抗生素和除草劑抗性基因?qū)Νh(huán)境和食品安全的潛在危害，是一種新型的安全的植物遺傳轉(zhuǎn)化篩選系統(tǒng)。
文檔編號C12N15/82GK102199619SQ20101056355
公開日2011年9月28日 申請日期2010年11月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月29日
發(fā)明者萬向元, 周君莉, 王海洋, 鄧興旺 申請人:北京凱拓迪恩生物技術(shù)研發(fā)中心有限責(zé)任公司, 北京未名凱拓作物設(shè)計(jì)中心有限公司