專利名稱：鴨疫里默氏桿菌病和大腸桿菌病多重pcr檢測用引物和試劑盒及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及家禽細(xì)菌病的診斷技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及用于鴨疫里默氏桿菌、大腸桿 菌多重PCR檢測用引物組試劑盒及其檢測方法。
背景技術(shù)：
鴨疫里默氏桿菌病是由鴨疫里默氏桿菌(Riemerellaanatipestifer，RA)引起的 急性或慢性、接觸性傳染病，主要侵害雛鴨、鵝等多種禽類。該病好發(fā)于2 7周齡鴨，臨床 主要表現(xiàn)為精神不振、食欲下降、咳嗽及歪頸、跛行等神經(jīng)癥狀，耐過鴨成僵鴨，生長遲緩， 其病變特征為纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎等。該病發(fā)病率可達(dá)20%以上，死亡率高達(dá) 25% 57%，該病給養(yǎng)禽業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失，是影響?zhàn)B鴨業(yè)最為嚴(yán)重的細(xì)菌性傳染病之 一。鴨大腸桿菌(Escherichiacoli,E. coli)對(duì)各種日齡鴨都可造成多種危害，以2 6周 齡發(fā)病最嚴(yán)重，發(fā)病率達(dá)17% 56%，有的鴨場死亡率高達(dá)43%。兩種疾病經(jīng)?；旌细腥?，且 二者在臨床癥狀、病理變化及流行病學(xué)等方面都存在諸多相似的地方，另外兩菌血清型眾 多，常規(guī)的診斷方法很難快速、準(zhǔn)確地作出診斷，且容易造成誤診，貽誤疾病的治療。因此建 立一種鑒別診斷鴨疫里默氏桿菌病、大腸桿菌病及兩種疾病混合感染的PCR檢測方法十分 必要。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有技術(shù)很難快速、準(zhǔn)確地作出診斷的不足，本發(fā)明的第一個(gè)目的提供 一種鴨疫里默氏桿菌病和大腸桿菌病多重PCR檢測用引物組，本發(fā)明的第二個(gè)目的提供一 種鴨疫里默氏桿菌病和大腸桿菌病多重PCR檢測試劑盒，本發(fā)明的第三個(gè)目的提供一種鴨 疫里默氏桿菌病和大腸桿菌病多重PCR檢測方法。本發(fā)明的檢測方法具有操作簡單、快速、 特異性好、敏感性高等優(yōu)點(diǎn)。為了實(shí)現(xiàn)上述的第一個(gè)目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案。鴨疫里默氏桿菌病和大腸桿菌病多重PCR檢測用引物組，該引物組由兩對(duì)引物對(duì) 構(gòu)成，兩對(duì)引物對(duì)分別為
鴨疫里默氏菌引物 5' -CCGTAGATTGGCTAACTTTTG-3‘ 5’ -ATTTTAACTGAGATGGGT-3’ ； 大腸桿菌引物
5’ -TTCGTCGTTCTCATCCACAG-3‘ 5’ -ACGCATAATAAACCCCATAG-3，。為了實(shí)現(xiàn)上述的第二個(gè)目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案。鴨疫里默氏桿菌病和大腸桿菌病多重PCR檢測試劑盒，該試劑盒包含如下組分 2XPCR核心試劑預(yù)混物，鴨疫里默氏菌和大腸桿菌陽性對(duì)照DNA，DL2000分子量參照溶液，ddH20和上述的引物組。為了實(shí)現(xiàn)上述的第三個(gè)目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案。鴨疫里默氏桿菌病和大腸桿菌病多重PCR檢測方法，該方法包括以下的步驟
(1)提供待測樣品DNA;
(2)采用如權(quán)利要求2所述的兔巴氏桿菌和波氏桿菌多重PCR檢測用試劑盒，多重PCR 方法擴(kuò)增待測樣品的DNA，采用瓊脂糖凝膠電泳法檢測擴(kuò)增結(jié)果，根據(jù)結(jié)果進(jìn)行判定；所述 根據(jù)結(jié)果進(jìn)行判定具體為，以鴨疫里默氏菌和大腸桿菌陽性DNA作為對(duì)照，若對(duì)照未擴(kuò)增 出以下全部條帶，則重新檢測；若對(duì)照擴(kuò)增出以下全部條帶，則結(jié)果判定如下
若擴(kuò)增片段大小為670bp，為鴨疫里默氏菌陽性；
若擴(kuò)增片段大小為408bp，為大腸桿菌陽性；
若同時(shí)擴(kuò)增670bp、408bp，則為鴨疫里默氏菌和大腸桿菌混合感染。外膜蛋白A(ompA)是鴨疫里默氏桿菌和大腸桿菌各血清型所各自共有的蛋白，并 且已經(jīng)證實(shí)該蛋白在各地各型菌株中保守性相當(dāng)高，本發(fā)明以鴨疫里默氏桿菌和大腸桿菌 的ompA基因序列為目的基因，設(shè)計(jì)了特異性引物，建立了快速鑒別診斷鴨疫里默氏菌、大 腸桿菌及其混合感染的多重PCR檢測方法，該方法可以從病料組織中直接檢測出病原菌， 另外不需要復(fù)雜的DNA提取步驟，具有操作簡單、快速、特異性好、敏感性高等優(yōu)點(diǎn)?？捎糜?鴨疫里默氏桿菌和大腸桿菌感染的快速鑒別診斷和流行病學(xué)調(diào)查，在公共衛(wèi)生、食品安全、 畜牧獸醫(yī)及進(jìn)出口檢驗(yàn)檢疫等等領(lǐng)域應(yīng)用前景廣闊。本發(fā)明建立的多重PCR方法對(duì)檢測樣品不需要進(jìn)行增菌和純培養(yǎng)，可直接用病料 進(jìn)行檢測，節(jié)約了試驗(yàn)成本；覃宗華等(2008)基于16SrRNA建立的鴨疫里默氏菌病和大腸 桿菌病鑒別診斷雙重PCR方法需要增菌和純培養(yǎng)以及復(fù)雜的DNA提取等步驟，鑒別的時(shí)間 較長，而本試驗(yàn)建立的雙重PCR方法直接以菌液為模板，從接收病料到檢出結(jié)果只要3 4h,縮短了檢測時(shí)間，使其在臨床上具有實(shí)用價(jià)值。與現(xiàn)有的技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果如下。1、該多重PCR方法操作簡單，具有良好的特異性，對(duì)同種細(xì)菌的不同菌株具有廣 泛的適用性。2、具有較高的靈敏度，可以檢出痕量級(jí)的模板鴨疫里默氏菌最低模板檢出量為 4X103cfu,大腸桿菌最低模板檢出量為3X 103cfu。3、該多重PCR可以同時(shí)鴨疫里默氏菌和大腸桿菌進(jìn)行鑒別診斷，與單PCR相比更 快速、經(jīng)濟(jì)。


圖1為多重PCR敏感性檢測圖。M:DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1 7(A、B)分別表示不同稀 釋度的RA和E. coli菌液為模板的雙重PCR擴(kuò)增結(jié)果，其中圖A中細(xì)菌數(shù)分別為1、8X106、 8X105、8X104、8X103、8X102、8、0. 8、雙蒸水；圖 B 中細(xì)菌數(shù)分別為1、6X 106、6X 105、、 6X 104、6X 103、6X 102、6、0. 6、雙蒸水。圖2為多重PCR特異性檢測結(jié)果圖。M:DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1、coli078 的混合培養(yǎng)物；2、RA: ；3、RA2 ；4、RA10 ；5、RAn ；6、E. coliC^ ；7、E. coli02 ；8、E. coli078 ；9、 E. coli0133 ；10、鴨源性多殺性巴氏桿菌；11、鴨源性沙門氏菌；12、雙蒸水。
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圖3為多重PCR臨床檢測結(jié)果圖。M :DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1 23 23份不同的臨 床分離樣品；24、陰性對(duì)照雙蒸水。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條 件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1
本實(shí)施例涉及的試劑盒及檢測方法如下 1、試劑盒
本實(shí)施例的多重PCR檢測試劑盒，包括7個(gè)凍存管、50個(gè)PCR反應(yīng)管和說明書。7個(gè) 凍存管分別為代號(hào)凍存管A (2個(gè))裝有2XPCR核心試劑預(yù)混物(Taq酶、dNTPs混合物 和MgCl2溶液，市購)，凍存管B和C分別裝有50ul鴨疫里默氏菌和大腸桿菌DNA溶液， 凍存管D裝有0. 5mlDL2000分子量標(biāo)準(zhǔn)溶液(市購)，凍存管E裝有1. 5mlddH20,凍存管 F裝有PCR體系所用引物混合物，鴨疫里默氏菌引物5 ’ -CCGTAGATTGGCTAACTTTTG-3 ’、 5，-ATTTTAACTGAGATGGGT-3，；大腸桿菌引物5，-TTCGTCGTTCTCATCCACAG-3，、 5’ -ACGCATAATAAACCCCATAG-3，；所有凍存管均保存于 _20°C。2、試劑盒的檢測方法
步驟一，取凍存管A溶液12. 5ul分別加入PCR反應(yīng)管中，加入引物溶液2ul，做好標(biāo)記 后，立即加入待測樣品DNA模板，用凍存管E中的ddH20調(diào)終體積至25ul，混合均勻后進(jìn)行 檢測；陽性對(duì)照相同操作，加入凍存管B和C鴨疫里默氏菌和大腸桿菌陽性DNA溶液各2ul ； 陰性對(duì)照不加模板，dH20調(diào)終體積至25ul。步驟二，將PCR反應(yīng)管放置在PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增95°C 5min ；94°C 40s, 52°C 40s， 72V 45s，35 循環(huán)；72°C延伸 lOmin。步驟三，將擴(kuò)增后的產(chǎn)物在110v電壓下進(jìn)行1. 5%瓊脂糖凝膠電泳，PCR產(chǎn)物和凍 存管D中DL2000分子量標(biāo)準(zhǔn)溶液的點(diǎn)樣量為8ul每孔，電泳時(shí)間30min，電泳完畢后用凝膠 成像分析。步驟四，結(jié)果判定
(1)若陽性對(duì)照鴨疫里默氏菌擴(kuò)增片段大小為670bp，大腸桿菌陽性擴(kuò)增片段大小為 408bp,陰性對(duì)照結(jié)果為陰性，則多重PCR體系結(jié)果判定如下
若待測樣品擴(kuò)增出670bp條帶，則為鴨疫里默氏菌； 若待測樣品擴(kuò)增出408bp條帶，則為大腸桿菌； 無對(duì)應(yīng)條帶或條帶大小不吻合，則判斷結(jié)果為陰性；
(2)若陽性對(duì)照未擴(kuò)增出全部條帶或陰性對(duì)照出現(xiàn)陽性目的條帶，需重新檢測并判定。實(shí)施例2
本案例涉及的材料如下鴨疫里默氏桿菌、大腸桿菌、鴨源性多殺性巴氏桿菌、鴨源性 沙門氏菌參考菌株均購自中國獸藥監(jiān)察所。將上述菌種接種于2ml增菌肉湯培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)過夜，然后進(jìn)行以下試驗(yàn)。1、敏感性試驗(yàn)將37°C搖床過夜的鴨疫里默氏桿菌、大腸桿菌菌液進(jìn)行10倍系列稀釋，進(jìn)行平板計(jì)數(shù) 后進(jìn)行多重PCR反應(yīng)以檢測敏感性。多重PCR敏感性檢測結(jié)果如圖1所示，圖1中M:DNA分 子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1 7(A、B)分別表示不同稀釋度的RA和E. coli菌液為模板的雙重PCR擴(kuò)增 結(jié)果，其中圖A中細(xì)菌數(shù)分別為:1、8X106、8X105、8X104、8X103、8X102、8、0. 8、雙蒸水； 圖 B 中細(xì)菌數(shù)分別為:1、6X106、6X105、、6X104、6X103、6X102、6、0. 6、雙蒸水。2、特異性試驗(yàn)
鴨疫里默氏桿菌(血清1、2、10、11型，分別簡稱為以1，以2，以10，以11)、大腸桿菌(血 清 01、02、078、0133 型，分別簡稱為 E. coli01,E. coli02，E. coli078，E. coli0133)、鴨源性 多殺性巴氏桿菌、鴨源性沙門氏菌等復(fù)蘇培養(yǎng)后，提取DNA進(jìn)行特異性試驗(yàn)。多重PCR特異 性檢測結(jié)果如圖2所示，圖2中M :DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1為和E. coli078的混合培養(yǎng)物；2、 RA: ；3、RA2 ；4、RA10 ；5、RAn ；6、E. coliC^ ；7、E. coli02 ；8、E. coli078 ；9、E. coli0133 ；10、鴨源性 多殺性巴氏桿菌；11、鴨源性沙門氏菌；12、雙蒸水。試驗(yàn)例1
對(duì)來自浙江省杭州、湖州、嘉興、紹興、金華等地區(qū)不同鴨場送檢的出現(xiàn)疑似病例(剖 檢具有心包炎、肝周炎和氣囊炎等病變)的病死鴨共計(jì)23份。無菌剪取部分肝臟組織，稱 重，按10倍量(lg肝臟組織加lOmLPBS)加PBS研磨后用濾紙過濾，取2uL慮液作模板按照 實(shí)施例2的方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增。對(duì)23份剖檢變化具有明顯肝周炎、心包炎和氣囊炎的病死鴨的肝臟進(jìn)行細(xì)菌分 離和PCR鑒定，結(jié)果23份樣品細(xì)菌分離鑒定結(jié)果和PCR的鑒定結(jié)果一致，進(jìn)一步證明了該 雙重PCR檢測方法的可靠性。23份樣品的檢測結(jié)果顯示，有6份樣品檢測出鴨疫里默氏桿 菌和大腸桿菌混合感染，占所檢樣品的26. 09%； 12份樣品和5份樣品分別為鴨疫里默氏桿 菌和大腸桿菌單獨(dú)感染，分別占所檢樣品的52. 17%和21. 74% ；鴨疫里默氏桿菌和大腸桿菌 感染的檢測結(jié)果陽性率分別為78. 26%和47. 83%。多重PCR臨床檢測結(jié)果如圖3所示，圖3中M :DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1 23 23份不 同的臨床分離樣品；24、陰性對(duì)照雙蒸水。
權(quán)利要求
鴨疫里默氏桿菌病和大腸桿菌病多重PCR檢測用引物組，其特征在于該引物組由兩對(duì)引物對(duì)構(gòu)成，兩對(duì)引物對(duì)分別為鴨疫里默氏菌引物5’ CCGTAGATTGGCTAACTTTTG 3’5’ ATTTTAACTGAGATGGGT 3’；大腸桿菌引物5’ TTCGTCGTTCTCATCCACAG 3’5’ ACGCATAATAAACCCCATAG 3’。
2.鴨疫里默氏桿菌病和大腸桿菌病多重PCR檢測試劑盒，其特征在于該試劑盒包含如 下組分2XPCR核心試劑預(yù)混物，鴨疫里默氏菌和大腸桿菌陽性對(duì)照DNA，DL2000分子量參 照溶液，ddH20和如權(quán)利要求1所述的引物組。
3.鴨疫里默氏桿菌病和大腸桿菌病多重PCR檢測方法，其特征在于該方法包括以下的 步驟(1)提供待測樣品DNA;(2 )采用如權(quán)利要求2所述的兔巴氏桿菌和波氏桿菌多重PCR檢測用試劑盒，多重PCR 方法擴(kuò)增待測樣品的DNA，采用瓊脂糖凝膠電泳法檢測擴(kuò)增結(jié)果，根據(jù)結(jié)果進(jìn)行判定；所述 根據(jù)結(jié)果進(jìn)行判定具體為，以鴨疫里默氏菌和大腸桿菌陽性DNA作為對(duì)照，若對(duì)照未擴(kuò)增 出以下全部條帶，則重新檢測；若對(duì)照擴(kuò)增出以下全部條帶，則結(jié)果判定如下 若擴(kuò)增片段大小為670bp，為鴨疫里默氏菌陽性； 若擴(kuò)增片段大小為408bp，為大腸桿菌陽性； 若同時(shí)擴(kuò)增670bp、408bp，則為鴨疫里默氏菌和大腸桿菌混合感染。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的鴨疫里默氏桿菌病和大腸桿菌病多重PCR檢測方法，其特征 在于 PCR 擴(kuò)增參數(shù)具體為95 "C 5 min ；94 "C 40 s，52 "C 40 s，72 "C 45 s，35 循環(huán)； 72 V 10 min。
全文摘要
本發(fā)明涉及家禽細(xì)菌病的診斷技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及用于鴨疫里默氏桿菌、大腸桿菌多重PCR檢測用引物組試劑盒及其檢測方法。該試劑盒包含7個(gè)凍存管，其中2個(gè)凍存管分別裝有2×PCR核心試劑預(yù)混物，其它5個(gè)凍存管分別裝有鴨疫里默氏桿菌DNA溶液，鴨疫里默氏桿菌陽性DNA溶液，DL2000分子量標(biāo)準(zhǔn)溶液，ddH2O及PCR體系所用引物混合物。該試劑盒的檢測方法包括如下步驟步驟一，提供待測樣品DNA；步驟二，取試劑盒，采用常規(guī)PCR方法擴(kuò)增待測樣品的DNA，采用瓊脂糖凝膠電泳方法檢測擴(kuò)增結(jié)果，根據(jù)結(jié)果進(jìn)行判定。本發(fā)明所建立的多重PCR檢測方法特異、靈敏、簡便快捷，能用于臨床樣品的快速檢測及鴨疫里默氏桿菌和大腸桿菌的分子流行病學(xué)調(diào)查研究。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101984075SQ20101054697
公開日2011年3月9日 申請日期2010年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月17日
發(fā)明者劉燕, 季權(quán)安, 王春平, 肖琛聞, 邵澤香, 韋強(qiáng), 鮑國連 申請人:浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院