專利名稱：rpsL和rrs基因SNP檢測(cè)特異性引物和液相芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)，具體的是涉及一種rpsL和 rrs基因SNP檢測(cè)特異性引物和液相芯片。
背景技術(shù)：
隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展和結(jié)核分枝桿菌研究的深入，細(xì)菌耐藥的分子機(jī)理 受到廣泛的重視。鏈霉素(SM)是1945年發(fā)明的第一種有效的抗結(jié)核氨基環(huán)醇糖苷類抗 生素，目前仍是結(jié)核病治療的一線藥物。SM主要作用于結(jié)核分枝桿菌的核糖體，誘導(dǎo) 遺傳密碼的錯(cuò)讀，抑制mRNA轉(zhuǎn)譯的開始，干擾轉(zhuǎn)譯過(guò)程中的校對(duì)，從而抑制蛋白質(zhì)合 成。最近研究表明，核糖體蛋白S12編碼基因(rpsL)和16S rRNA編碼基因(rrs)突 變將導(dǎo)致結(jié)核分支桿菌對(duì)鏈毒素耐藥。在結(jié)核菌耐鏈霉素菌株中，70% 85%由rpsL和 rrs基因突變所致。核糖體蛋白S12的作用是維持讀碼過(guò)程中的一些輕微的不準(zhǔn)確性，rpsL基因突 變就會(huì)導(dǎo)致S12蛋白改變，而嚴(yán)格要求核糖體只使用與每一密碼對(duì)應(yīng)的氨酰-tRNA，更 準(zhǔn)確地表達(dá)mRNA上的每一個(gè)密碼，從而抑制了 SM誘導(dǎo)的遺傳密碼錯(cuò)讀而產(chǎn)生耐藥 性。rrs基因是16S rRNA編碼基因，16S rRNA上的530發(fā)夾環(huán)是整個(gè)16S rRNA上最保 守的序列，它參與A位tRNA核糖體的譯碼過(guò)程，在RNA翻譯過(guò)程中起重要作用。它的 這種作用與530發(fā)夾環(huán)上的513 516位堿基和相鄰510區(qū)域凸出環(huán)上的491 497位堿 基對(duì)所產(chǎn)生的假結(jié)構(gòu)有關(guān)。rpsL基因突變主要發(fā)生在兩個(gè)部位43位和88位的賴氨酸(Lys)密碼子(AAG) 突變成精氨酸(Arg)密碼子(AGG)，rrs基因的主要突變位點(diǎn)為G426C、C491T、A513C/ T、C516T。據(jù)統(tǒng)計(jì)，結(jié)核分枝桿菌SM耐藥分離株有rpsL基因點(diǎn)突變的占48.6%，有 rrs基因點(diǎn)突變的占29.0%，這兩個(gè)基因雙重突變的占1 %，未發(fā)現(xiàn)基因突變的占21.5%。 而rpsL基因突變82.7%發(fā)生在第43位氨基酸密碼子，17.3%發(fā)生在第88位氨基酸密碼 子。由此可見(jiàn)，約1/2的結(jié)核分枝桿菌分離株SM耐藥產(chǎn)生是由于rpsL基因突變所致， 而最常見(jiàn)的突變位點(diǎn)是第43位密碼子。目前對(duì)rpsL和rrs基因突變的檢測(cè)產(chǎn)品主要有實(shí)時(shí)熒光定量PCR、直接測(cè)序法、 變性梯度凝膠電泳、DHPLC等，存在靈敏度低、樣品易污染、假陽(yáng)性率高、不能確定突 變位置、價(jià)格昂貴等缺點(diǎn)，同時(shí)由于檢測(cè)通量的局限性，不能滿足實(shí)際應(yīng)用的需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一種rpsL和rrs基因SNP檢測(cè)液相芯片。該液相芯片可 用于檢測(cè)rpsL基因常見(jiàn)突變位點(diǎn)A43G和A88G、rrs基因常見(jiàn)突變位點(diǎn)G426C、C491T、 A513C/T和C516T的野生型和突變型。實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下
4
一種rpsL和rrs基因SNP檢測(cè)液相芯片，主要包括有(A)針對(duì)每種突變位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)的野生型和突變型的ASPE引物，每種ASPE引 物由3’端的針對(duì)突變位點(diǎn)的特異性引物和5’端的tag序列組成，所述tag序列選自SEQ IDN0.1 SEQIDN0.13;所述野生型和突變型的特異性引物選自針對(duì)rpsL基因A43G 位點(diǎn)的 SEQ ID N0.14 及 SEQ ID N0.15、針對(duì) rpsL 基因 A88G 位點(diǎn)的 SEQ ID N0.16 及 SEQ ID NO. 17,針對(duì) rrs 基因 G426C 位點(diǎn)的 SEQ ID N0.18 及 SEQ ID N0.19、針對(duì) rrs 基 因 C491T 的 SEQ ID N0.20 及 SEQ ID N0.21、針對(duì) rrs 基因 A513C/T 的 SEQ IDN0.22 及 SEQ ID N0.23 SEQ ID N0.24、禾口 / 或針對(duì) rrs 基因 C516T 位點(diǎn)的 SEQ IDN0.25 及 SEQ ID N0.26 ；(B)有anti-tag序列包被的、具有不同顏色編碼的微球，所述anti-tag序列選自 SEQ IDN0.27 SEQ ID N0.39，并能相應(yīng)地與(A)中所選的微球上tag序列互補(bǔ)配對(duì)， 且所述anti-tag序列與微球連接中間還設(shè)有間隔臂序列；(C)用于擴(kuò)增出需要檢測(cè)的、具有突變位點(diǎn)的目標(biāo)基因序列的引物。所述引物優(yōu)選為針對(duì)rpsL基因的SEQ ID N0.40 SEQ ID N0.41，禾Π /或針 對(duì) rrs 基因的 SEQID N0.42 SEQ ID N0.43。所述ASPE引物為針對(duì)rpsL基因A43G位點(diǎn)的由SEQIDN0.UPSEQIDN0.14 組成的序列及由SEQ ID N0.2和SEQ ID NO. 15組成的序列、針對(duì)rpsL基因A88G位點(diǎn)的 由SEQ ID N0.3和SEQ ID NO.16組成的序列及由SEQ ID N0.4和SEQ ID NO. 17組成的 序列、針對(duì)rrs基因G426C位點(diǎn)的由SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.18組成的序列及由SEQ ID NO.6和SEQ ID N0.19組成的序列、針對(duì)rrs基因C491T的由SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.20組成的序列及由SEQ ID N0.8和SEQ IDN0.21組成的序列、針對(duì)rrs基因A513C/ T 的由 SEQ ID N0.9 和 SEQ ID N0.22 組成的序列及由 SEQID NO. 10 和 SEQ ID N0.23 組 成的序列，由SEQIDN0.11和SEQIDN0.24組成的序列、和/或針對(duì)rrs基因C516T位 點(diǎn)的由 SEQ ID NO.12 和 SEQ ID N0.25 組成的序列及由 SEQ ID N0.13 和 SEQ IDN0.26 組 成的序列。本發(fā)明的另一目的是提供一種用于rpsL和rrs基因SNP檢測(cè)的特異性引物。實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下一種用于rpsL和rrs基因SNP檢測(cè)的特異性引物，包括有針對(duì)rpsL基因A43G 位點(diǎn)的 SEQID NO. 14 及 SEQ ID N0.15、針對(duì) rpsL 基因 A88G 位點(diǎn)的 SEQ ID NO. 16 及 SEQ ID NO.17、針對(duì) rrs 基因 G426C 位點(diǎn)的 SEQ ID NO.18 及 SEQ ID NO.19、針對(duì) rrs 基 因 C491T 的 SEQ ID N0.20 及 SEQ ID N0.21、針對(duì) rrs 基因 A513C/T 的 SEQ ID N0.22 及 SEQ ID N0.23 SEQ ID N0.24、禾口 / 或針對(duì) rrs 基因 C516T 位點(diǎn)的 SEQ ID N0.25 及 SEQ ID N0.26。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于(1)本發(fā)明所提供的rpsL和rrs基因SNP檢測(cè)液相芯片的檢測(cè)結(jié)果與測(cè)序法的吻 合率高達(dá)100%，而所需要的時(shí)間遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于常用的測(cè)序技術(shù)。所制備的rpsL和rrs基因 SNP檢測(cè)液相芯片具有很好的信號(hào)_噪聲比，并且所涉及的探針以及anti-TAG序列之間 基本上不存在交叉反應(yīng)，TAG標(biāo)簽序列、anti-TAG標(biāo)簽序列的選取以及TAG標(biāo)簽序列與 具體ASPE引物的結(jié)合，均能夠避免交叉反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)多個(gè)SNP位點(diǎn)的并行檢測(cè)。
(2)本發(fā)明所提供的ASPE引物特異性引物，能夠靈敏特異地識(shí)別目標(biāo)檢測(cè)的 突變位點(diǎn)。在同一個(gè)反應(yīng)體系中，不同的特異性引物之間、特異性引物與非目標(biāo)檢測(cè)的 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物之間基本上不存在交叉反應(yīng)，除了能夠單獨(dú)檢測(cè)rpsL基因或rrs基因突變情 況，也能夠同時(shí)并行檢測(cè)rpsL基因和rrs基因多個(gè)突變位點(diǎn)的SNP情況，檢測(cè)效果一致。(3)本發(fā)明設(shè)計(jì)的ASPE特異引物具有非常好的特異性，能準(zhǔn)確區(qū)分各種型號(hào)的 基因型。(4)本發(fā)明的檢測(cè)方法步驟簡(jiǎn)單，6種SNPs檢測(cè)可通過(guò)一步PCR即可完成含有 6個(gè)SNP位點(diǎn)的目標(biāo)序列的擴(kuò)增，避免了反復(fù)多次PCR等復(fù)雜操作過(guò)程中存在的諸多不 確定因素，因而可大大提高檢測(cè)的準(zhǔn)確率，同時(shí)能夠定性、定量分析的特征。(5)本發(fā)明不僅克服了傳統(tǒng)固相芯片敏感性不高、檢測(cè)結(jié)果可重復(fù)性差的缺陷， 同時(shí)對(duì)現(xiàn)有的液相芯片技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)，使得所制備的微球能適用于不同的檢測(cè)項(xiàng)目，具 有很強(qiáng)的拓展性。檢測(cè)的熒光信號(hào)值大大提高，從而使得檢測(cè)的靈敏度進(jìn)一步得到提 高，信噪比增強(qiáng)，檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例IrpsL和rrs基因SNP檢測(cè)液相芯片，主要包括有一、ASPE 引物針對(duì)rpsL基因的 SNP 位點(diǎn) A43G 和 A88G、rrs 基因的 SNP 位點(diǎn) G426C、C491T、 A513C/T、C516T，分別設(shè)計(jì)特異性引物序列。ASPE引物由“Tag序列+特異性引物序 列”組成。ASPE引物序列如下表所示表IASPE引物序列(Tag序列+特異性引物序列)
權(quán)利要求
1.一種rpsL和rrs基因SNP檢測(cè)液相芯片，其特征是，主要包括有(A)針對(duì)每種突變位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)的野生型和突變型的ASPE引物，每種ASPE引物 由5’端的tag序列和3’端的針對(duì)突變位點(diǎn)的特異性引物組成，所述tag序列選自SEQ IDN0.1 SEQIDN0.13;所述野生型和突變型的特異性引物選自針對(duì)rpsL基因A43G 位點(diǎn)的 SEQ ID NO. 14 及 SEQ ID N0.15、針對(duì) rpsL 基因 A88G 位點(diǎn)的 SEQ ID NO. 16 及 SEQ ID NO. 17,針對(duì) rrs 基因 G426C 位點(diǎn)的 SEQ ID N0.18 及 SEQ ID N0.19、針對(duì) rrs 基 因 C491T 的 SEQ ID N0.20 及 SEQ ID N0.21、針對(duì) rrs 基因 A513C/T 的 SEQ IDN0.22 及 SEQ ID N0.23 SEQ ID N0.24、禾口 / 或針對(duì) rrs 基因 C516T 位點(diǎn)的 SEQ IDN0.25 及 SEQ ID N0.26 ；(B)有anti-tag序列包被的、具有不同顏色編碼的微球，所述anti-tag序列選自SEQ IDN0.27 SEQ ID N0.39，并能相應(yīng)地與(A)中所選的微球上tag序列互補(bǔ)配對(duì)，且所 述anti-tag序列與微球連接中間還設(shè)有間隔臂序列；(C)用于擴(kuò)增出需要檢測(cè)的、具有突變位點(diǎn)的目標(biāo)基因序列的引物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的rpsL和rrs基因SNP檢測(cè)液相芯片，其特征是，所述引物為 針對(duì)rpsL基因的SEQ ID N0.40 SEQ ID N0.41，和/或針對(duì)rrs基因的SEQ ID N0.42 SEQ ID N0.43。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的rpsL和rrs基因SNP檢測(cè)液相芯片，其特征是，所述ASPE 引物為針對(duì)rpsL基因A43G位點(diǎn)的由SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.14組成的序列及由 SEQ ID N0.2和SEQ IDN0.15組成的序列、針對(duì)rpsL基因A88G位點(diǎn)的由SEQ ID N0.3 禾口 SEQ ID NO. 16組成的序列及由SEQ ID N0.4和SEQ ID NO.17組成的序列、針對(duì)rrs基 因G426C位點(diǎn)的由SEQ ID N0.5和SEQ IDN0.18組成的序列及由SEQ ID N0.6和SEQ ID N0.19組成的序列、針對(duì)rrs基因C491T的由SEQID N0.7和SEQ ID N0.20組成的序列及 由SEQ ID N0.8和SEQ ID N0.21組成的序列、針對(duì)rrs基因A513C/T的由SEQ ID N0.9 和SEQ ID N0.22組成的序列及由SEQ ID NO. 10和SEQ ID N0.23組成的序列，由SEQ ID NO. 11和SEQ ID N0.24組成的序列、禾Π /或針對(duì)rrs基因C516T位點(diǎn)的由SEQ IDN0.12 禾口 SEQ ID N0.25組成的序列及由SEQ ID NO. 13和SEQ ID N0.26組成的序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的rpsL和rrs基因SNP檢測(cè)液相芯片，其特征是，主 要包括(A)ASPE引物由 SEQ ID N0.1 和 SEQ ID NO. 14 組成的序列及由 SEQ ID N0.2 禾口 SEQ IDN0.15組成的序列、由SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.16組成的序列及由SEQ ID N0.4 禾口 SEQ ID N0.17組成的序列、由SEQ ID N0.5和SEQ ID NO. 18組成的序列及由SEQ IDN0.6和SEQ ID NO. 19組成的序列、由SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.20組成的序列及由 SEQ ID N0.8 和 SEQ ID N0.21 組成的序列、由 SEQ ID NO.9 和 SEQ ID N0.22 組成的序 列及由 SEQ ID NO. 10 和 SEQ ID N0.23 組成的序列，由 SEQ ID NO. 11 和 SEQ ID N0.24 組成的序列、和由SEQ ID N0.12和SEQ ID N0.25組成的序列及由SEQ ID N0.13和SEQ ID N0.26組成的序列；(B)有anti-tag序列包被的、具有不同顏色編碼的微球，所述anti-tag序列選自SEQ IDN0.27 SEQ ID N0.39，并能相應(yīng)地與(A)中所選的微球上tag序列互補(bǔ)配對(duì)，且所 述anti-tag序列與微球連接中間還設(shè)有間隔臂序列；(C)擴(kuò)增引物針對(duì)rpsL基因A43G、A88G突變位點(diǎn)的SEQ ID N0.40及SEQ ID N0.41,和針對(duì) rrs 基因 G426C、C491T、A513C/T 和 C516T 的 SEQ ID N0.42 及 SEQID N0.43。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的rpsL和rrs基因SNP檢測(cè)液相芯片，其特征是，所述間隔臂 序列為5-10個(gè)T。
6.一種用于rpsL和rrs基因SNP檢測(cè)的特異性引物，其特征是，包括有針對(duì)rpsL 基因A43G位點(diǎn)的SEQ ID N0.14及SEQ ID N0.15、針對(duì)rpsL基因A88G位點(diǎn)的SEQ ID N0.16 及 SEQIDN0.17、針對(duì) rrs 基因 G426C 位點(diǎn)的 SEQ ID N0.18 及 SEQ ID N0.19、針 對(duì) rrs 基因 C491T 的 SEQID N0.20 及 SEQ ID N0.21、針對(duì) rrs 基因 A513C/T 的 SEQ ID N0.22 及 SEQ ID NO.23 SEQ IDN0.24、和 / 或針對(duì) rrs 基因 C516T 位點(diǎn)的 SEQ ID N0.25 及 SEQ ID N0.26。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種rpsL和rrs基因SNP檢測(cè)液相芯片，主要包括有ASPE引物，所述ASPE引物特異性引物選自針對(duì)rpsL基因A43G位點(diǎn)的SEQ ID NO.14及SEQ ID NO.15、針對(duì)rpsL基因A88G位點(diǎn)的SEQ ID NO.16及SEQ ID NO.17、針對(duì)rrs基因G426C位點(diǎn)的SEQ ID NO.18及SEQ ID NO.19、針對(duì)rrs基因C491T的SEQ ID NO.20及SEQ ID NO.21、針對(duì)rrs基因A513C/T的SEQ ID NO.22及SEQID NO.23～SEQ ID NO.24、和/或針對(duì)rrs基因C516T位點(diǎn)的SEQ ID NO.25及SEQ ID NO.26；微球；擴(kuò)增引物。本發(fā)明所提供的rpsL和rrs基因SNP檢測(cè)液相芯片的檢測(cè)結(jié)果與測(cè)序法的吻合率高達(dá)100％，而所需要的時(shí)間遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于常用的測(cè)序技術(shù)。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102010908SQ201010539269
公開日2011年4月13日 申請(qǐng)日期2010年11月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月9日
發(fā)明者石文香, 羅彩英, 許嘉森, 陳家欣 申請(qǐng)人:廣州益善生物技術(shù)有限公司