專利名稱：一種膽紅素氧化酶固體發(fā)酵方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及膽紅素氧化酶的發(fā)酵，特別是一種膽紅素氧化酶固體發(fā)酵方法。
背景技術(shù)：
膽紅素氧化酶(Bilirubin oxidase, EC 1. 3. 3. 5)是一種含銅的多酚氧化酶， 能催化膽紅素氧化，氧氣是其電子受體。反應(yīng)過程為膽紅素氧化酶催化膽紅素生成膽綠素， 后者可進(jìn)一步氧化最終生成性質(zhì)還不清楚的無色化合物。利用此反應(yīng)，測定波長在440nm 或450nm處吸光值的下降，可以用于血清膽紅素的測定。自從1981年日本學(xué)者發(fā)現(xiàn)漆斑菌 屬能高產(chǎn)膽紅素氧化酶后，臨床醫(yī)學(xué)中開始使用該酶來測定膽紅素，該方法具有特異性、靈 敏高和操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，適用于臨床手工或自動(dòng)化檢測。膽紅素氧化酶在臨床中可用于診 斷黃疸水平，并有望用于新生兒黃疸及高膽紅素血癥的治療。近年來，膽紅素氧化酶的應(yīng)用 逐漸拓寬，被用于生物電池的制造、污水處理等方面的研究和應(yīng)用。由于膽紅素氧化酶具有 廣泛的用途，對于該酶的需求量也越來越大。但因?yàn)槟懠t素氧化酶生產(chǎn)發(fā)酵工藝復(fù)雜，成本 高，造成市場上銷售的膽紅素氧化酶價(jià)格昂貴，嚴(yán)重阻礙了膽紅素氧化酶的應(yīng)用，所以對膽 紅素氧化酶發(fā)酵方法的研究以及如何提高產(chǎn)量成為酶生成產(chǎn)中迫切需要解決的問題。但現(xiàn)行的膽紅素氧化酶生產(chǎn)多是采用液體深層發(fā)酵通氣攪拌的方式獲得，所用培 養(yǎng)基以PDB為主，其主要生產(chǎn)菌株是漆斑菌屬。液體深層通氣發(fā)酵需要對培養(yǎng)基進(jìn)行高溫 高壓蒸汽消毒，之后對培養(yǎng)基進(jìn)行降溫后接入菌種，然后進(jìn)行通氣攪拌發(fā)酵。該方法蒸汽消 耗量大，攪拌和通氣培養(yǎng)時(shí)間長，能耗高，并且發(fā)酵后污水排放量大。到目前為止，還未見到 關(guān)于膽紅素氧化酶的固體發(fā)酵方法的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種成本低，生產(chǎn)過程簡單，酶提取方便的膽紅素氧化酶固體發(fā) 酵方法。本發(fā)明的技術(shù)方案是，一種膽紅素氧化酶固體發(fā)酵方法，其特征在于(1)從土壤 中分離篩選出露濕漆斑菌，并制出露濕漆斑菌孢子懸浮液；(2)稱取3-7重量份的麩皮置于 三角瓶中，然后加入13-17重量份的蒸餾水，用玻棒將麩皮和蒸餾水?dāng)嚢杈鶆颍?2廣130°C 高壓滅菌2(Γ30分鐘，冷卻后，接入用步驟(1)培養(yǎng)出的廣5重量份的孢子懸浮液，在培養(yǎng) 溫度為22°C 31°C，培養(yǎng)時(shí)間為疒11天后，取出培養(yǎng)后的三角瓶，在三角瓶中加入50-70重 量份的蒸餾水，用搖床振蕩浸提2-4小時(shí)，用定性濾紙過濾即得膽紅素氧化酶粗酶液。所述 步驟(1)中的露濕漆斑菌孢子懸浮液為將其接種在PDA斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)10天左右，加 上一定量的無菌水，制成孢子量為IX 10^10 X IO8個(gè)/ml的露濕漆斑菌孢子懸浮液。所述 步驟(2)當(dāng)中的13-17重量份的蒸餾水可以被12 18份濃度為0. Γ5毫摩爾/升銅離子。 溶液取代。固體培養(yǎng)基的麩皮，為經(jīng)過40目篩所得。本發(fā)明所用原料來源豐富、易取，生產(chǎn)成本低，酶提取的工藝簡便易行，生產(chǎn)過程 節(jié)能環(huán)保。
具體實(shí)施例方式
具體描述實(shí)施例
實(shí)施例1 麩皮從市場購買后過40目篩。稱取3g麩皮置于250ml三角瓶中，然后加入
3蒸餾水13ml，用玻棒將麩皮和蒸餾水?dāng)嚢杈鶆颍?21°C高壓滅菌20分鐘，冷卻后，接入Iml濃 度為IX 10^10X IO8個(gè)/ml的孢子懸浮液，22°C靜置培養(yǎng)11天。取出培養(yǎng)11天后的三角 瓶，在三角瓶中加入50ml的蒸餾水，180r/min振蕩浸提2. 5小時(shí)，用定性濾紙過濾即得膽紅 素氧化酶粗酶液，其酶活力可達(dá)25. 4U/克。實(shí)施例2:麩皮從市場購買后過40目篩。稱取7g麩皮置于250ml三角瓶中，然后 加入蒸餾水17ml，用玻棒將麩皮和蒸餾水?dāng)嚢杈鶆颍?25°C高壓滅菌25分鐘，冷卻后，接入 5ml濃度為IX 10^10X IO8個(gè)/ml的孢子懸浮液，31°C靜置培養(yǎng)7天。取出培養(yǎng)7天后的 三角瓶，在三角瓶中加入65ml的蒸餾水，180r/min振蕩浸提3. 5小時(shí)，用定性濾紙過濾即得 膽紅素氧化酶粗酶液，其酶活力可達(dá)26. 2U/克。實(shí)施例3:麩皮從市場購買后過40目篩。稱取5g麩皮置于250ml三角瓶中，然后 加入蒸餾水15ml，用玻棒將麩皮和蒸餾水?dāng)嚢杈鶆颍?30°C高壓滅菌30分鐘，冷卻后，接入 1.5ml濃度為IX IO8 10X IO8個(gè)/ml的孢子懸浮液，26°C靜置培養(yǎng)9天。取出培養(yǎng)9天后 的三角瓶，在三角瓶中加入60ml的蒸餾水，180r/min振蕩浸提3. 5小時(shí)，用定性濾紙過濾即 得膽紅素氧化酶粗酶液，其酶活力可達(dá)27. 6U/克。實(shí)施例4:麩皮從市場購買后過40目篩。稱取5g麩皮置于250ml三角瓶中，然后 加入12ml濃度為0. 1毫摩爾/升銅離子溶液(銅離子溶液為用分析純的硫酸銅固體配制而 成)，用玻棒將麩皮和蒸餾水?dāng)嚢杈鶆颍?21°C高壓滅菌20分鐘，冷卻后，接入1. 5ml濃度為 1 X IO8^lO X IO8個(gè)/ml的孢子懸浮液，22°C靜置培養(yǎng)7天。取出培養(yǎng)7天后的三角瓶，在三 角瓶中加入50ml的蒸餾水，180r/min振蕩浸提2. 5小時(shí)，用定性濾紙過濾即得膽紅素氧化 酶粗酶液，其酶活力可達(dá)59. 7U/克。實(shí)施例5:麩皮從市場購買后過40目篩。稱取5g麩皮置于250ml三角瓶中，然后 加入18ml濃度為4. 5毫摩爾/升銅離子溶液(銅離子溶液為用分析純的硫酸銅固體配制 而成)，用玻棒將麩皮和蒸餾水?dāng)嚢杈鶆颍?30°C高壓滅菌25分鐘，冷卻后，接入5ml濃度為 1 X IO8^lO X IO8個(gè)/ml的孢子懸浮液，26°C靜置培養(yǎng)9天。取出培養(yǎng)9天后的三角瓶，在三 角瓶中加入60ml的蒸餾水，180r/min振蕩浸提3. 5小時(shí)，用定性濾紙過濾即得膽紅素氧化 酶粗酶液，其酶活力可達(dá)56. 7U/克。實(shí)施例6:麩皮從市場購買后過40目篩。稱取7g麩皮置于250ml三角瓶中，然 后加入15ml濃度為5毫摩爾/升銅離子溶液(銅離子溶液為用分析純的硫酸銅固體配制 而成)，用玻棒將麩皮和蒸餾水?dāng)嚢杈鶆颍?25°C高壓滅菌25分鐘，冷卻后，接入4ml濃度為 1 X IO8^IOXIO8個(gè)/ml的孢子懸浮液，31°C靜置培養(yǎng)11天。取出培養(yǎng)11天后的三角瓶，在 三角瓶中加入70ml的蒸餾水，180r/min振蕩浸提4小時(shí)，用定性濾紙過濾即得膽紅素氧化 酶粗酶液，其酶活力可達(dá)55. 4U/克。
權(quán)利要求
一種膽紅素氧化酶固體發(fā)酵方法，其特征在于(1)從土壤中分離篩選出露濕漆斑菌，并制出露濕漆斑菌孢子懸浮液；(2)稱取3 7重量份的麩皮置于三角瓶中，然后加入13 17重量份的蒸餾水，用玻棒將麩皮和蒸餾水?dāng)嚢杈鶆颍?21~130℃高壓滅菌20~30分鐘，冷卻后，接入用步驟(1)培養(yǎng)出的1~5重量份的孢子懸浮液，在培養(yǎng)溫度為22℃~31℃，培養(yǎng)時(shí)間為7~11天后，取出培養(yǎng)后的三角瓶，在三角瓶中加入50 70重量份的蒸餾水，用搖床振蕩浸提2 4小時(shí)，用定性濾紙過濾即得膽紅素氧化酶粗酶液。
2.如權(quán)利要求1所述的一種膽紅素氧化酶固體發(fā)酵方法，其特征在于所述步驟(1)中 的露濕漆斑菌孢子懸浮液為將其接種在PDA斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)10天左右，加上一定量的 無菌水，制成孢子量為IX 10^10 X IO8個(gè)/ml的露濕漆斑菌孢子懸浮液。
3.如權(quán)利要求1所述的一種膽紅素氧化酶固體發(fā)酵方法，其特征在于所述步驟(2)當(dāng) 中的13-17重量份的蒸餾水可以被12 18份濃度為0. Γ5毫摩爾/升銅離子溶液取代。
4.如權(quán)利要求1所述的一種膽紅素氧化酶固體發(fā)酵方法，其特征在于固體培養(yǎng)基的 麩皮，為經(jīng)過40目篩所得。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種膽紅素氧化酶固體發(fā)酵方法，本發(fā)明的目的是提供一種成本低，生產(chǎn)過程簡單，酶提取方便的膽紅素氧化酶固體發(fā)酵方法。(1)從土壤中分離篩選出露濕漆斑菌，并制出露濕漆斑菌孢子懸浮液；(2)稱取3-7重量份的麩皮置于三角瓶中，然后加入13-17重量份的蒸餾水，用玻棒將麩皮和蒸餾水?dāng)嚢杈鶆颍?21~130℃高壓滅菌20~30分鐘，冷卻后，接入用步驟(1)培養(yǎng)出的1~5重量份的孢子懸浮液，在培養(yǎng)溫度為22℃~31℃，培養(yǎng)時(shí)間為7~11天后，取出培養(yǎng)后的三角瓶，在三角瓶中加入50-70重量份的蒸餾水，用搖床振蕩浸提2-4小時(shí)，用定性濾紙過濾即得膽紅素氧化酶粗酶液。本發(fā)明所用原料來源豐富、易取，生產(chǎn)成本低，酶提取的工藝簡便易行，生產(chǎn)過程節(jié)能環(huán)保。
文檔編號C12N9/02GK101974496SQ20101052989
公開日2011年2月16日 申請日期2010年11月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月3日
發(fā)明者劉友勛, 張煜, 石如玲, 趙春澎, 黃娟 申請人:新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院