專利名稱：一種檢測(cè)原料乳中蠟樣芽孢桿菌的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)原料乳中細(xì)菌的方法。
背景技術(shù)：
蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)是一種革蘭式陽(yáng)性菌，能形成芽孢，因此廣泛存在于自然界中，其中一些菌株極易污染食物從而引起食物中毒，特別是在蛋白質(zhì)和碳水化合物含量豐富的食品中，如肉類、米飯中，尤其是原料乳和乳制品中。原料乳作為一種廣泛食用并且很多乳制品加工的原輔料，是人類非常理性的營(yíng)養(yǎng)食品之一，隨著人們生活水平的逐步提高，人們對(duì)乳及乳制品的需求也在以較高的速度增長(zhǎng)，然而由于蠟樣芽孢桿菌對(duì)原料乳的污染造成人群食物中毒的事件卻頻頻發(fā)生。因此，為提高食品的安全性，對(duì)原料乳及乳制品中致病性蠟樣芽孢桿菌的檢測(cè)勢(shì)在必行。傳統(tǒng)的檢測(cè)蠟樣芽孢桿菌的方法主要采用生化方法，這種方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且靈敏度不高；隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)在已經(jīng)建立了分子生物學(xué)檢測(cè)水平的基因檢測(cè)技術(shù)，如 PCR和LAMP技術(shù)，但這些技術(shù)大都采用預(yù)增菌來獲得足夠的菌體，在預(yù)增菌步驟后再進(jìn)行 PCR檢測(cè)，能夠達(dá)到很低的檢出限，然而預(yù)增菌步驟一般需要10-14h，耗時(shí)長(zhǎng)，增加了檢測(cè)時(shí)間及檢測(cè)成本，并且LAMP技術(shù)極易污染，不能保證結(jié)果的準(zhǔn)確度。隨著我國(guó)乳制品行業(yè)的快速發(fā)展，原料乳及乳制品的安全性也受到越來越多的重視。因此，現(xiàn)在急需一種能夠快速檢測(cè)原料乳中蠟樣芽孢桿菌的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了解決傳統(tǒng)的蠟樣芽孢桿菌檢測(cè)方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力、靈敏度低以及現(xiàn)有的基因檢測(cè)技術(shù)必須進(jìn)行預(yù)增菌，無法快速檢測(cè)原料乳中蠟樣芽孢桿菌并且易污染的問題，而提供的一種快速檢測(cè)原料乳中蠟樣芽孢桿菌的方法。本發(fā)明一種檢測(cè)原料乳中蠟樣芽孢桿菌的方法按以下步驟實(shí)現(xiàn)一、將待檢測(cè)的原料乳離心進(jìn)行脫脂；二、將脫脂乳與EDTA-Na溶液以5-7 1的比例向脫脂乳中加入體積濃度為60%的EDTA-Na溶液，在37°C的溫度下水浴20-30min ；三、將水浴后的樣品進(jìn)行無菌過濾；四、用生理鹽水洗脫濾膜上的菌體，離心2次后棄掉上清，收集菌體；五、利用細(xì)菌DNA提取試劑盒提取菌體基因組DNA作為模板，進(jìn)行Real Time RT-PCR檢測(cè)，根據(jù)擴(kuò)增曲線和融解曲線進(jìn)行分析；即得到檢測(cè)結(jié)果；其中步驟五中20ul反應(yīng)體系由IOul的 2 X SYBR buffer,2. Oul的DNA模板、1. Oul的引物和7. Oul的滅菌雙蒸水組成；擴(kuò)增反應(yīng)條件為預(yù)變性95°C 30s，變性95°C 5s，退火60°C 35s，共40個(gè)循環(huán)；蠟樣芽孢桿菌上游引物為 5，-AGTTCGTAGCCTATGCCGT-3，，下游引物為 5，-GGCTTATTCGCTATGCG-3，。本發(fā)明采用的蠟樣芽孢桿菌引物為根據(jù)蠟樣芽孢桿菌腸毒素基因(entFM)設(shè)計(jì)的特異性引物。本發(fā)明操作簡(jiǎn)單、省時(shí)，檢測(cè)的全部操作時(shí)間在證以內(nèi)；本發(fā)明不需要預(yù)增菌，具有快速的優(yōu)點(diǎn)；本發(fā)明采用離心脫脂后用EDTA鹽溶液處理原料乳中的蛋白質(zhì)，鼠酪蛋白膠束解離成小分子單體，能夠快速過濾原料乳中的菌體；本發(fā)明對(duì)蠟樣芽孢桿菌的致病基因進(jìn)行了引物設(shè)計(jì)，針對(duì)性強(qiáng)、特異性好。
具體實(shí)施例方式具體實(shí)施方式
一本實(shí)施方式檢測(cè)原料乳中蠟樣芽孢桿菌的方法按以下步驟實(shí)現(xiàn)一、將待檢測(cè)的原料乳離心進(jìn)行脫脂；二、將脫脂乳與EDTA-Na溶液以5-7 1的比例向脫脂乳中加入體積濃度為60%的EDTA-Na溶液，在37 °C的溫度下水浴20-30min ；三、將水浴后的樣品進(jìn)行無菌過濾；四、用生理鹽水洗脫濾膜上的菌體，離心2次后棄掉上清，收集菌體；五、利用細(xì)菌DNA提取試劑盒提取菌體基因組DNA作為模板，進(jìn)行Real Time RT-PCR 檢測(cè)，根據(jù)擴(kuò)增曲線和融解曲線進(jìn)行分析；即得到檢測(cè)結(jié)果；其中步驟五中20ul反應(yīng)體系由IOul的2 X SYBR buffer,2. Oul的DNA模板、1. Oul的引物和7. Oul的滅菌雙蒸水組成； 擴(kuò)增反應(yīng)條件為預(yù)變性95°C 30s，變性95°C 5s，退火60°C 35s，共40個(gè)循環(huán)；蠟樣芽孢桿菌上游引物為 5’ -AGTTCGTAGCCTATGCCGT-3，，下游引物為 5’ -GGCTTATTCGCTATGCG-3，。本實(shí)施方式中EDTA-Na溶液為市售的常規(guī)試劑。本實(shí)施方式無擴(kuò)增曲線說明檢測(cè)的原料乳中不含蠟樣芽孢桿菌；有擴(kuò)增曲線說明被檢測(cè)的原料乳中含有蠟樣芽孢桿菌。
具體實(shí)施方式
二 本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是步驟一中離心是在 3000g的條件下離心20min。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
三本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是步驟二中將脫脂乳與 EDTA-Na溶液以6 1的比例向脫脂乳中加入體積濃度為60%的EDTA-Na溶液。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
四本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是步驟二中脫脂乳在 37°C的溫度下水浴25min。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
五本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是步驟三中水浴后的脫脂乳利用0. 22um孔徑的蔡氏濾器進(jìn)行無菌過濾。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
六本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是步驟四中洗脫液是在 9000g的條件下離心15min。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
七本實(shí)施方式檢測(cè)原料乳中蠟樣芽孢桿菌的方法按以下步驟實(shí)現(xiàn)一、將待檢測(cè)的原料乳進(jìn)行脫脂將待測(cè)原料乳在3000g的條件下離心20min進(jìn)行脫脂；二、將脫脂乳與EDTA-Na溶液以6 1的比例向脫脂乳中加入體積濃度為60%的 EDTA-Na溶液，在37 °C的溫度下水浴25min ；三、采用0. 22um孔徑的蔡氏濾器在無菌條件下對(duì)水浴后的脫脂乳進(jìn)行過濾將水浴后的樣品進(jìn)行無菌過濾；四、將濾膜四成碎塊，用生理鹽水在渦旋振蕩器上進(jìn)行震蕩，洗脫濾膜上的菌體，然后在9000g的條件下離心洗脫液 15min，棄去上清，用磷酸鹽緩沖液重懸沉淀，9000g的條件下離心洗脫液15min，棄掉上清后收集菌體；五、利用細(xì)菌DNA提取試劑盒提取菌體基因組DNA作為模板，進(jìn)行Real Time RT-PCR 檢測(cè)，20ulReal Time RT-PCR 反應(yīng)體系由 IOul 的 2 X STOR buffer、2. Oul 的 DNA 模板、l.Oul的引物和7. Oul的滅菌雙蒸水組成；擴(kuò)增反應(yīng)條件為預(yù)變性95°C 30s，變性 95°C 5s，退火 60°C :35s，共 40 個(gè)循環(huán)。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)原料乳中蠟樣芽孢桿菌的方法，其特征在于檢測(cè)原料乳中蠟樣芽孢桿菌的方法按以下步驟實(shí)現(xiàn)一、將待檢測(cè)的原料乳離心進(jìn)行脫脂；二、將脫脂乳與EDTA-Na 溶液以5-7 1的比例向脫脂乳中加入體積濃度為60 %的EDTA-Na溶液，在37°C的溫度下水浴20-30min;三、將水浴后的樣品進(jìn)行無菌過濾；四、用生理鹽水洗脫濾膜上的菌體，離心2次后棄掉上清，收集菌體；五、利用細(xì)菌DNA提取試劑盒提取菌體基因組DNA作為模板，進(jìn)行Real TimeRT-PCR檢測(cè)，根據(jù)擴(kuò)增曲線和融解曲線進(jìn)行分析；即得到檢測(cè)結(jié)果；其中步驟五中20ul反應(yīng)體系由IOul的2 X STOR buffer、2. Oul的DNA模板、l.Oul的引物和7. Oul的滅菌雙蒸水組成；擴(kuò)增反應(yīng)條件為預(yù)變性95°C 30s，變性95°C 5s，退火 60°C 35s，共40個(gè)循環(huán)；蠟樣芽孢桿菌上游引物為5，-AGTTCGTAGCCTATGCCGT-3，，下游引物為 5’ -GGCTTATTCGCTATGCG-3，。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)原料乳中蠟樣芽孢桿菌的方法，其特征在于步驟一中待測(cè)樣品是在3000g的條件下離心20min。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)原料乳中蠟樣芽孢桿菌的方法，其特征在于步驟二中將脫脂乳與EDTA-Na溶液以6 1的比例向脫脂乳中加入體積濃度為60%的EDTA-Na 溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)原料乳中蠟樣芽孢桿菌的方法，其特征在于步驟二中水浴條件為37°C，25min。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)原料乳中蠟樣芽孢桿菌的方法，其特征在于步驟三中采用0. 22um孔徑的蔡氏過濾器進(jìn)行無菌過濾。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)原料乳中蠟樣芽孢桿菌的方法，其特征在于步驟四中菌體洗脫液在9000g，15min的條件下離心2次。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)原料乳中蠟樣芽孢桿菌的方法，其特征在于；步驟五中利用細(xì)菌DNA提取試劑盒提取菌體基因組DNA。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)原料乳中蠟樣芽孢桿菌的方法，其特征在于步驟五中提取的菌體DNA直接作為Real Time RT-PCR反應(yīng)的模板。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)原料乳中蠟樣芽孢桿菌的方法。本發(fā)明解決傳統(tǒng)的蠟樣芽孢桿菌檢測(cè)方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力、靈敏度低以及現(xiàn)有的基因檢測(cè)技術(shù)必須進(jìn)行預(yù)增菌，無法快速檢測(cè)原料乳中蠟樣芽孢桿菌并且易污染的問題。檢測(cè)方法一、對(duì)待檢測(cè)的原料乳進(jìn)行脫脂處理；二、加入EDTA-Na溶液進(jìn)行水浴；三、過濾水浴后的脫脂乳；四、收集洗脫液；五、提取菌體DNA，并進(jìn)行Real Time RT-PCR檢測(cè)。本發(fā)明操作簡(jiǎn)單；不需要預(yù)增菌，具有快速的優(yōu)點(diǎn)；本發(fā)明能夠快速過濾原料乳中的菌體；本發(fā)明對(duì)蠟樣芽孢桿菌的致病基因進(jìn)行了引物設(shè)計(jì)，針對(duì)性強(qiáng)、特異性好。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102453753SQ20101052088
公開日2012年5月16日 申請(qǐng)日期2010年10月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月27日
發(fā)明者張文龍 申請(qǐng)人:張文龍