專利名稱：：含有2-酮戊二酸脫羧酶基因kgd的工程菌及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)及發(fā)酵
技術(shù)領(lǐng)域：
，更具體地涉及一種利用糖類碳源生產(chǎn)3-羥基丁酸和4-羥基丁酸共聚酯(P3HB4HB)的工程菌及其用途，在該工程菌的基因組上重組整合有合成P3HB4HB所需的外源基因。
背景技術(shù)：
：聚羥基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoates，簡稱PHA)是一類廣泛存在于微生物體內(nèi)的高分子生物聚酯，在細(xì)胞內(nèi)主要作為碳源和能量的貯藏物質(zhì)(AndersonAJ,DawesEA.Occurrence,metabolism，metabolicrole，andindustrialuseofbacterialpolyhydroxyalkanoates.MicrobiolRev,1990，54:450-472)。3-羥基丁酸(3-hydroxybutyrate,簡稱3HB)和4_羥基丁酸4_羥基丁酸0-hydroxybutyrate，簡稱4HB)的共聚酯“3-羥基丁酸和4-羥基丁酸共聚酯”[poly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate)，簡稱P3HB4HB]是PHA家族中的一員，其結(jié)構(gòu)如式I所示O式I其中，χ和y表示聚合度。P3HB4H最先由DoiY等于1988年在羅氏真養(yǎng)桿菌Ralstoniaeutropha中發(fā)現(xiàn)(DoiY,KuniokaM,NakamuraY,etal.Nuclearmagnetic-resonancestudiesonunusualbacterialcopolyestersof3-hydroxybutyrateand4-hydroxybutyrate.Macromolecules，1988，21:2722-2727)。當(dāng)向培養(yǎng)基中添加4-羥基丁酸或者4-氯丁酸時，R.eutropha可以合成P3HB4HB，4HB單體的含量可以在O到49mol%之間調(diào)節(jié)。根據(jù)P3HB4HB聚合物中組成單體3HB與4HB比例的不同，P3HB4HB具有從非常堅硬的高度結(jié)晶體到柔軟的彈性體等一系列不同的材料學(xué)性質(zhì)。4HB含量較高時(64100mol%),P3HB4HB的拉伸強(qiáng)度可以由17Mpa提高到104Mpa，表現(xiàn)出熱塑性彈性體的性質(zhì)。當(dāng)4HB比例由Omol%增加到82mol%時，P3HB4HB的斷裂伸長率可以由5%增加到1320%(SaitoY,NakamuraS,HiramitsuM,etal.Microbialsynthesisandpropertiesofpoly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate).PolymInt,1996,39:169—174)。P3HB4HB的熔融溫度隨著4HB單體比例的增加先降低，然后逐漸升高，而玻璃化轉(zhuǎn)變溫度則隨著4HB單體比例的增加呈線性降低趨勢(IshidaK，WangY,InoueY.Comonomerunitcompositionandthermalpropertiesofpoly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate)sbiosynthesizedbyRalstoniaeutropha.Biomacromolecules,2001,21285-1293)。4HB單體被聚合到共聚酯后不含支鏈，使得P3HB4HB既可以被PHA降解酶降解，又可以被脂肪酶水解。4HB單體的摻入加速了酶解和水解的速度，水解速度取決于其單體組成，4HB含量越高時，P3HB4HB被脂肪酶水解的速度越快(SaitoY，NakamuraS,HiramitsuM,etal.Microbialsynthesisandpropertiesofpoly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate).PolymInt,1996,39169-174；DoiY,KanesawaY,KuniokaΜ,etal.Biodegradationofmicrobialcopolyesters:poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate)andpoly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate).Macromolecules,1990,23:26-31)，因此，P3HB4HB有著比其它PHA材料更為優(yōu)異的降解性能，被認(rèn)為是最有應(yīng)用前景的PHA材料之一。迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的可以合成P3HB4HB的野生型細(xì)菌包括羅氏真養(yǎng)桿菌Ralstoniaeutropha,廣泛產(chǎn)堿桿菌Alcaligeneslatus,食酸叢毛單胞菌Comamonasacidovorans,Comamonastestosteroni禾口^ItfellMS1IiiHydrogenophagapseudofIava0一般來說，P3HB4HB共聚酯中的3HB和4HB單體分別由不同類型的碳源來合成，用來產(chǎn)生3HB單體的碳源包括常規(guī)的蔗糖、葡萄糖、果糖和丁酸等，而4HB單體的摻入需要向培養(yǎng)基中加入與4HB結(jié)構(gòu)類似的碳源，例如4-羥基丁酸、Y-丁內(nèi)酯和L4-丁二醇等。碳源的選用與生產(chǎn)菌的種類相關(guān)，不同的微生物喜好利用不同的碳源。4HB結(jié)構(gòu)類似碳源的價格非常昂貴，對細(xì)胞毒性也較大，在發(fā)酵過程中常常需要以分批補(bǔ)料的方式添加，并且混合碳源的發(fā)酵策略也較為繁瑣復(fù)雜。例如，4-羥基丁酸被認(rèn)為是最有效地向共聚酯中摻入4HB單體的碳源，但它在我國是一種管制藥品，很難以化學(xué)品的形式在市場上購買到。4HB結(jié)構(gòu)類似碳源的添加已經(jīng)成為制約P3HB4HB大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用的最大難題。如果能夠利用價格相對便宜的糖類碳源來生產(chǎn)P3HB4HB，將會有效地降低其生產(chǎn)成本，推動其大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)和商業(yè)應(yīng)用開發(fā)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種利用糖類碳源生產(chǎn)3-羥基丁酸和4-羥基丁酸共聚酯(P3HB4HB)的工程菌，在所述工程菌的基因組上，重組整合有合成P3HB4HB所需的外源基因，該外源基因包括來源于羅氏真養(yǎng)桿菌Ralstoniaeutropha的聚_3_羥基丁酸酯合成基因phaCAB(自GENBANK號為AM260479的5‘端第1557353-1561203位核苷酸)，來源于克氏梭菌Clostridiumkluyveri的4-羥基丁酰輔酶A輔酶A轉(zhuǎn)移酶基因orfZ(自GENBANK號為CP000673的5'端第3066385-3067674位核苷酸)，來源于克氏梭菌Clostridiumkluyveri的4-羥基丁酸脫氫酶基因4hbD(自GENBANK號為CP000673的5‘端第3061070-3062185位核苷酸)，以及來源于結(jié)核分枝桿菌Mycobacteriumtuberculosis的2-酮戊二酸脫羧酶基因kgd(自GENBANK號為CP000611的5'端第1390667-1394311位核苷酸)。本發(fā)明所述工程菌的宿主菌可為大腸桿菌野生型，或是大腸桿菌的琥珀酸半縮醛脫氫酶基因突變株，優(yōu)選為大腸桿菌的琥珀酸半縮醛脫氫酶基因突變COliJM109SG。優(yōu)選地，上述合成P3HB4HB所需的外源基因通過重組表達(dá)載體整合到所述工程菌的基因組上,所述重組表達(dá)載體為pUK70CAB、pUK1624hbdorfZ和pUK81kgd，其中pUK70CAB物理圖譜如圖1所示，pUK1624hbdorfZ物理圖譜如圖2所示，pUK81kgd物理圖譜如圖3所7J\ο優(yōu)選地，用于構(gòu)建上述重組表達(dá)載體的出發(fā)載體為pEASY-Blimt(由全式金生物公司購買)和PKD13(NCBIGenBank:HC688602.1)。本發(fā)明所述的糖類碳源為葡萄糖、葡萄糖酸鈉、果糖、甘露醇等可以被工程菌利用的單糖或其組合，或者為經(jīng)過水解后含有上述單糖或其組合的多糖。P3HB4HB的生物合成途徑如圖4所示。另一方面，本發(fā)明的目的是提供一種P3HB4HB的生產(chǎn)方法，所述方法為將上述工程菌，在添加上述糖類碳源的情況下，經(jīng)過發(fā)酵培養(yǎng)得到P3HB4HB。所述發(fā)酵培養(yǎng)的溫度為2838°C，優(yōu)選為37°C。所述發(fā)酵培養(yǎng)過程中所使用的發(fā)酵培養(yǎng)基為以下三種的任意一種，以下培養(yǎng)基均用去離子水配制1)每升培養(yǎng)基含酵母提取物4_6g/L，蛋白胨8_12g/L，NaC18_12g/L，糖類碳源18-22g/L，其余為水。2)每升培養(yǎng)基含酵母提取物4_6g/L，蛋白胨8_12g/L，糖類碳源20_60g/L，(NH4)2SO41.8-2.2g/L,MgSO40.38-0.45g/L,Na2HPO4·12H209.6-9.7g/L,KH2PO4L2-1.8g/L，微量元素溶液I8-12mL/L，微量元素溶液II0.8_1.2mL/L，其余為水；其中每升微量元素溶液I含:Fe(III)-NH4-Citrate4_6g/L，CaCl2·2H201.8-2.2g/L,其余為0.4-0.6MHCl；每升微量元素溶液II含ZnS04·7H2080_120mg/L，MnCl2·4H2025_35mg/L，H3B03280-320mg/L,CoCl2·6Η20180_220mg/L，CuSO4·5H208_12mg/L，NiCl2·6H2018_22mg/L,NaMoO4·2H2(^8-32mg/L，其余為0.4-0.6MHCl。3)每升培養(yǎng)基含糖類碳源20-60g/L,(NH4)2SO4L8-2.2g/L，MgSO4O.38-0.45g/L，Na2HPO4·Iffl2O9.6-9.7g/L，KH2PO4L2-1.8g/L，微量元素溶液I8_12mL/L，微量元素溶液II0.8-1.2mL/L，其余為水；每升微量元素溶液I含F(xiàn)e(III)-NH4-Citrate4_6g/L，CaCl2·2H201.8-2.2g/L，其余為0.4-0.6MHCl；每升微量元素溶液II含=ZnSO4·7H2080-120mg/L,MnCl2·4H2025_35mg/L，H3B03280-320mg/L,CoCl2·6H20180_220mg/L,CuSO4·5H208-12mg/L,NiCl2·6H2018_22mg/L，NaMoO4·2H2028_32mg/L，其余為0.4-0.6MHC1。本發(fā)明通過分子生物學(xué)和代謝工程的手段，構(gòu)建能夠利用糖類碳源發(fā)酵生產(chǎn)P3HB4HB的工程菌，使用該工程菌生產(chǎn)P3HB4HB無需添加4HB結(jié)構(gòu)類似的碳源，例如4-羥基丁酸、Y-丁內(nèi)酯和1，4_丁二醇等。因此，使用該工程菌可利用相對廉價的碳源進(jìn)行發(fā)酵，降低了P3HB4HB的生產(chǎn)成本。圖1:pUK70CAB的物理圖譜(Km卡那霉素抗性基因；phaC:PHA聚合酶基因；PhaA3-酮硫解酶基因；phaB=NADPH-依賴的乙酰乙酰輔酶A還原酶基因；attP大腸桿菌attBHK022相應(yīng)的attP位點；R6kgamma:R6kgamma復(fù)制子)。圖2:PUK1624hbdorfZ的物理圖譜(Km卡那霉素抗性基因；orfZ:4_羥基丁酰輔酶A輔酶A轉(zhuǎn)移酶基因；4tibD:4-羥基丁酸脫氫酶基因；attP大腸桿菌attBphi80相應(yīng)的5attP位點；R6kgamma:R6kgamma復(fù)制子)。圖3:pUK81kgd的物理圖譜(Km卡那霉素抗性基因；kgd:2_酮戊二酸脫羧酶基因；attP大腸桿菌attBP21相應(yīng)的attP位點；R6kgamma:R6kgamma復(fù)制子)。圖4:P3HB4HB的生物合成途徑。圖5構(gòu)建工程菌E.coliJM109SG3hb4hb基因組的流程圖。具體實施例方式下述實施例中的方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中涉及分子生物學(xué)操作所用的酶，均購自MBIFermentas公司，相應(yīng)的操作步驟完全按照相關(guān)的產(chǎn)品說明書進(jìn)行；質(zhì)粒提取、DNA片段回收所用的試劑盒購自美國OMEGABio-Tek公司，相應(yīng)的操作完全按照其產(chǎn)品說明書進(jìn)行；實驗中涉及的引物合成和DNA測序工作由北京奧科生物技術(shù)公司完成。下述實施例中涉及的細(xì)菌培養(yǎng)基如下，如無特殊指明，培養(yǎng)基均用去離子水配制；如無特殊指明，培養(yǎng)基的滅菌條件均為115°C，20分鐘LB液體培養(yǎng)基每升培養(yǎng)基含有5g/L酵母提取物、10g/L蛋白胨、10g/LNaCl,pH7.0，其余為水。LB-Amp液體培養(yǎng)基每升培養(yǎng)基含有5g/L酵母提取物、10g/L蛋白胨、10g/LNaCl和100yg/mL氨芐青霉素，其余為水。LB-Amp固體培養(yǎng)基每升培養(yǎng)基含有15g/L瓊脂、5g/L酵母提取物、10g/L蛋白胨、10g/LNaCl和100μg/mL氨芐青霉素，其余為水。LB-Km液體培養(yǎng)基每升培養(yǎng)基含5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，10g/LNaCl和50μg/mL硫酸卡那霉素，其余為水。LB-Km固體培養(yǎng)基每升培養(yǎng)基含15g/L瓊脂，5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，10g/LNaCl和50μg/mL硫酸卡那霉素，其余為水。LB-Km-Amp液體培養(yǎng)基每升培養(yǎng)基含有5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，10g/LNaCl，50μg/mL硫酸卡那霉素和100μg/mL氨芐青霉素，其余為水。LB-Km-Amp固體培養(yǎng)基每升培養(yǎng)基含15g/L瓊脂，5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，10g/LNaCl，50μg/mL硫酸卡那霉素和100μg/mL氨芐青霉素，其余為水。LBG液體培養(yǎng)基每升培養(yǎng)基含有5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，10g/LNaCl,20g/L葡萄糖，其余為水。實施例1、構(gòu)建大腸桿菌基因組整合質(zhì)粒pKD13km1.用AceIII單酶切質(zhì)粒pKD13，膠回收2.51Λ的片段，得到含有Km抗性基因和R6kgamma復(fù)制子的片段。2.使用Takara的solution〗連接試劑盒(solution〗試劑盒為T4DNA連接酶，在Takara公司的貨號為D6022)對步驟1中回收到的片段進(jìn)行自連接反應(yīng)(酶切后的片段與solution〗比例為11)，將連接產(chǎn)物通過電轉(zhuǎn)化的方法導(dǎo)入到E.coliS17-1(Apir)(Herrero,Μ,V.deLorenzo,andK.N.Timmis.1990.Transposonvectorscontainingnon-antibioticresistanceselectionmarkersforcloningandstablechromosomalinsertionofforeigngenesingram-negativebacteria.J.Bacteriol.1726557-6567)中，并涂布于LB-Km固體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)16h。3.質(zhì)粒驗證從LB-Km固體培養(yǎng)基上挑取單克隆到LB-Km液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)16h(37°C搖床，200rpm)，提取質(zhì)粒，通過AceIII單酶切，得到一條大小為2.5kb的DNA片段，確認(rèn)質(zhì)粒構(gòu)建成功。實施例2、構(gòu)建基因組整合表達(dá)載體pUK系列pUK162、pUK70、pUK63、pUK81和pUK15401.在標(biāo)準(zhǔn)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)條件下，以pEASY-Blunt為模板，以引物PlCCATCGCCCTGATAGACGGT(SalI)和引物P2:ACTCTTCCTTTTTCAATTCAGAAG(EcoRI)為上下游引物擴(kuò)增得到1365bp的DNA片段。經(jīng)測序表明，該片段含有Km抗性基因。經(jīng)過內(nèi)切酶EcoRI和MlI處理后回收Km抗性基因片段。2.在標(biāo)準(zhǔn)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)條件下，以pEASY-Blunt為模板，以引物P3:ATAAGAATTCGGCAACTATGGATGAACGAA(EcoR)和引物P4:ATATGTCGACTAATACGACTCACTATAGGGCGA(Sail)為上下游引物擴(kuò)增得到1409bp的DNA片段。經(jīng)測序表明，該片段含有pEASY-Blunt的復(fù)制子序列，經(jīng)過內(nèi)切酶EcoRI和MlI處理后回收復(fù)制子基因片段。3.使用Takara的solution〗連接試劑盒(solution〗試劑盒為T4DNA連接酶，在Takara公司的貨號為D6022)對步驟1和2中回收后的片段進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物通過電轉(zhuǎn)化的方法導(dǎo)入到E.coliJM109(從中國普通微生物菌種保藏管理中心購得)中，并涂布于LB-Km固體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)16h。4.質(zhì)粒驗證從LB-Km固體培養(yǎng)基上挑取單克隆到LB-Km液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)16h(37°C搖床，200rpm)，提取質(zhì)粒，通過BamHI單酶切，得到一條大小為2.7kb的DNA片段，確認(rèn)質(zhì)粒構(gòu)建成功。5.將步驟4中驗證構(gòu)建成功的質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶KpnI和MlI進(jìn)行酶切處理，回收大小為2.61Λ的片段。6.在標(biāo)準(zhǔn)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)條件下，以pKD13km為模板，以引物P5GAGCGCTTTTGAAGCTCACGC(KpnI)和引物P6:GCGAGGCTTTGCCATGG(Sail)為上下游引物擴(kuò)增得到1409bp的DNA片段，經(jīng)測序表明該序列含有Km抗性基因和R6kgamma復(fù)制子序列。經(jīng)內(nèi)切酶KpnI和MlI處理后回收抗性基因和復(fù)制子片段。7.使用Takara的solution〗連接試劑盒(solution〗試劑盒為T4DNA連接酶，在Takara公司的貨號為D6022)對步驟5和6中回收后的片段進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物通過電轉(zhuǎn)化的方法導(dǎo)入到E.coliS17-lUpir)中，并涂布于LB-Km固體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)16h。8.質(zhì)粒驗證從LB-Km固體培養(yǎng)基上挑取單克隆到LB-Km液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)16h(37°C搖床，200rpm)，提取質(zhì)粒，通過EcoRI單酶切，得到一條大小為4.2kb的DNA片段，確認(rèn)質(zhì)粒構(gòu)建成功。9.人工合成一段序列，其序列為tagggcgaattgggccctctagatgcatgctcgagcggccgccagtgtgatggatatctgcagaattgcccttacaagtttgtacaaaaaagctgaacgagaaacgtaaaatgatataaatatcaatatattaaattagattttgcataaaaaacagactacataatactgtaaaacacaacatatccagtcactatgaagggcaattccagcacactggcggccgttactagtggatccgagctcggtaccaagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatcc，在標(biāo)準(zhǔn)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)條件下，以其為模板，以引物P7TAAGGTACCATAAATAGCCTGAAAGGCCAAATAATGATTTTATTTTGACTGATAGTGACC(KpnI)和引物P8:ATATGTCGACATAATTACACTTCGTGAGCCTGCTTTTTTGTACAAAGTTGGC(Sail)為上下游引物擴(kuò)增得到179bp的DNA片段。經(jīng)測序表明該序列含有Lamda的attR序列，經(jīng)內(nèi)切酶處理后回收此片段。10.使用Takara的solution〗連接試劑盒(solution〗試劑盒為T4DNA連接酶，在Takara公司的貨號為D6022)對步驟5和9中回收得到的片段進(jìn)行連接反應(yīng)，將連接產(chǎn)物通過電轉(zhuǎn)化的方法導(dǎo)入到E.coliJM109中，并涂布于LB-Km固體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)16h。11.質(zhì)粒驗證從LB-Km固體培養(yǎng)基上挑取單克隆到LB-Km液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)16h(37°C搖床，200rpm)，提取質(zhì)粒，通過EcoRI單酶切，得到一條大小為2.7kb的DNA片段，確認(rèn)質(zhì)粒構(gòu)建成功。12.在標(biāo)準(zhǔn)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)條件下，以pETj8a(NCBIGeneBank:AX767071.1)為模板，以引物P9:ATAAGGTACCATAAATAGCCTGAAAGGCACAAGTTTGTACAAAAAAGCTGAACGAG(KpnI)和引物PlO:ATAAGTCGACATAATTACACTTCGTGCATAGTGACTGGATATGTTGTGTTTTACAG(AlwNI)為上下游引物擴(kuò)增得到347bp的片段，經(jīng)測序表明該片段含有T7啟動子序列。經(jīng)內(nèi)切酶處理后回收此片段。13.將步驟11中驗證構(gòu)建成功的質(zhì)粒利用內(nèi)切酶BglI和KpnI進(jìn)行酶切處理，然后回收2.7kb的片段，使用Takara的solution〗連接試劑盒(solution〗試劑盒為T4DNA連接酶，在Takara公司的貨號為D6022)將回收的片段與步驟12得到的片段進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物通過電轉(zhuǎn)化的方法導(dǎo)入到E.coliJM109中，并涂布于LB-Km固體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)16h。14.質(zhì)粒驗證從LB-Km固體培養(yǎng)基上挑取單克隆到LB-Km液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)16h(37°C搖床，200rpm)，提取質(zhì)粒，通過BamHI單酶切，得到一條大小為31Λ的DNA片段，確認(rèn)質(zhì)粒構(gòu)建成功。15.人工合成一段序列，其序列為tatagggcgaattgaagctgcccttcaaataatgattttattttgactgatagtgacctgttcgttgcaacaaattgataagcaatgcttttttataatgccaactttgtacaaaaaagcaggctaagggcagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttcc,在標(biāo)準(zhǔn)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)條件下，以其為模板，以引物Pll:ATAAGGTACCATAAATAGCCTGAAAGGCCAAATAATGATTTTATTTTGACTGATAGTGACC(KpnI)和引物P12:AGCCTGCTTTTTTGTACAAAGTTGGC(BglI)為上下游引物擴(kuò)增得到IMbp的片段。經(jīng)測序表明該片段含有LamdaattL啟動子序列。經(jīng)內(nèi)切酶處理后回收此片段。16.將步驟8中驗證構(gòu)建成功的質(zhì)粒用內(nèi)切酶DraIII和Mil進(jìn)行酶切處理，回收4.2kb的片段，與步驟15得到的回收片段進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物通過通過電轉(zhuǎn)化的方法導(dǎo)入到E.coliS17-1(Apir)中，并涂布于LB-Km固體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)16h。17.質(zhì)粒驗證從LB-Km固體培養(yǎng)基上挑取單克隆到LB-Km液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)16h(37°C搖床，200rpm)，提取質(zhì)粒，通過EcoRI單酶切，得到一條大小為4.3kb的DNA片段，確認(rèn)質(zhì)粒構(gòu)建成功。18.將步驟14中驗證構(gòu)建成功的質(zhì)粒用DraIII和KpnI進(jìn)行酶切處理，回收464bp的片段；將步驟17中驗證構(gòu)建成功的質(zhì)粒用BglI和KpnI進(jìn)行酶切處理，回收4.3kb的片段。使用iTakara的solution〗連接試劑盒(solution〗試劑盒為T4DNA連接酶，在Takara公司的貨號為D6022)將上述兩個回收的片段與步驟12得到的片段進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物通過電轉(zhuǎn)化的方法導(dǎo)入到E.coliS17-l(Apir)中，并涂布于LB-Km固體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)16h。19.質(zhì)粒驗證從LB-Km固體培養(yǎng)基上挑取單克隆到LB-Km液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)16h(37°C搖床，200rpm)，提取質(zhì)粒，通過BamHI單酶切，得到一條大小為4.8kb的DNA片段，確認(rèn)質(zhì)粒構(gòu)建成功。20.在標(biāo)準(zhǔn)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)條件下，以質(zhì)粒pAH162，pAH70,pAH63，pAH81和ρAHl54為模板(AndreasHaldimann,BarryyL.Wanner.ConditionalReplication,Integration,Excision,andRetrievalPlasmid-HostSystemsforGeneStructure-FuctionStudiesofBacterica.JOURNALOFBACTERIOLOGY.2001,183(12)6384-6393)，分別以表1中的引物為上下游引物進(jìn)行擴(kuò)增，得到5個DNA片段，經(jīng)測序驗證分別為大腸桿菌中的5個attP位點的核心序列，經(jīng)相應(yīng)的內(nèi)切酶處理后回收這些片段。利用DraIII和KpnI酶切處理步驟19中驗證構(gòu)建成功的質(zhì)粒，回收大小為2.Ikb的片段，分別與上述5個片段進(jìn)行連接，連接反應(yīng)完成后，分別獲得質(zhì)粒pM162、pUK70,pUK63,pUK81和pUK154，然后通過電轉(zhuǎn)化的方法分別將獲得的重組質(zhì)粒pUK162、pUK70、pUK63、pUK81和PUK154導(dǎo)入到Ε.coliS17-1(Apir)中，并涂布于LB-Km固體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)16h。21.質(zhì)粒驗證從LB-Km固體培養(yǎng)基上挑取單克隆到LB-Km液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)16h(37°C搖床，200rpm)，分別提取質(zhì)粒，通過BamHI單酶切，所得DNA片段大小如表1所示，確認(rèn)質(zhì)粒構(gòu)建成功。分別得到大腸桿菌基因組整合表達(dá)載體PUK162，pUK70,pUK63，pUK81和pUKIM。表1構(gòu)建基因組整合表達(dá)載體pUK162、pUK70、pUK63、pUK81和pUKIM所用模板、引物以及所得DNA片段大小權(quán)利要求1.一種利用糖類碳源生產(chǎn)3-羥基丁酸和4-羥基丁酸共聚酯(P3HB4HB)的工程菌，其特征在于，在所述工程菌的基因組上重組整合有合成P3HB4HB所需的外源基因，該外源基因包括聚-3-羥基丁酸酯合成基因phaCAB、4-羥基丁酰輔酶A輔酶A轉(zhuǎn)移酶基因orfZ、4-羥基丁酸脫氫酶基因4hbD和2-酮戊二酸脫羧酶基因kgd。2.權(quán)利要求1所述的工程菌，其中所述工程菌的宿主菌可為大腸桿菌野生型，或是大腸桿菌的琥珀酸半縮醛脫氫酶基因突變株。3.權(quán)利要求2所述的工程菌，其中所述工程菌的宿主菌為大腸桿菌的琥珀酸半縮醛脫氫酶基因突變株EscherichiacoliJM109SG。4.權(quán)利要求1-3中任一項所述的工程菌，其中所述外源基因通過重組表達(dá)載體整合到所述工程菌的基因組上，所述重組表達(dá)載體為PUK70CAB、pUK1624hbdorfZ和pUK81kgd，其中pUK70CAB物理圖譜如圖1所示，pUK16MtibdorfZ物理圖譜如圖2所示，pUK8Ikgd物理圖譜如圖3所示。5.權(quán)利要求4所述的工程菌，其中用于構(gòu)建所述重組表達(dá)載體的出發(fā)載體為pEASY-Blunt禾口pKD13。6.權(quán)利要求1所述的工程菌，其中糖類碳源為葡萄糖、葡萄糖酸鈉、果糖、甘露醇或其組合，或者為經(jīng)過水解后含有葡萄糖、葡萄糖酸鈉、果糖、甘露醇之一或其組合的多糖。7.—種3-羥基丁酸和4-羥基丁酸共聚酯的生產(chǎn)方法將權(quán)利要求1-5任一項所述的工程菌，在添加糖類碳源的情況下，經(jīng)過發(fā)酵培養(yǎng)得到3-羥基丁酸和4-羥基丁酸共聚酯。8.權(quán)利要求7所述的生產(chǎn)方法，其中所述發(fā)酵培養(yǎng)溫度為觀38°C。9.權(quán)利要求7-8中任一項所述的生產(chǎn)方法，其中糖類碳源為葡萄糖、葡萄糖酸鈉、果糖、甘露醇或其組合，或者為經(jīng)過水解后含有葡萄糖、葡萄糖酸鈉、果糖、甘露醇之一或其組合的多糖。全文摘要本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)及發(fā)酵
技術(shù)領(lǐng)域：
，更具體地，本發(fā)明公開了一種利用糖類碳源生產(chǎn)3-羥基丁酸和4-羥基丁酸共聚酯(P3HB4HB)的工程菌，在該工程菌的基因組上重組整合有合成P3HB4HB所需的外源基因，該外源基因包括聚-3-羥基丁酸酯合成基因phaCAB、4-羥基丁酰輔酶A輔酶A轉(zhuǎn)移酶基因orfZ、4-羥基丁酸脫氫酶基因4hbD和2-酮戊二酸脫羧酶基因kgd。利用此工程菌可以使用價格相對便宜的糖類碳源來生產(chǎn)P3HB4HB，有效地降低其生產(chǎn)成本，推動其大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)和商業(yè)應(yīng)用開發(fā)。文檔編號C12R1/19GK102382789SQ201010273490公開日2012年3月21日申請日期2010年9月2日優(yōu)先權(quán)日2010年9月2日發(fā)明者呂渭川,周子振,陳國強(qiáng)申請人:天津國韻生物材料有限公司