專利名稱：一種氧化葡萄糖酸桿菌在制備1,3-二羥基丙酮中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于發(fā)酵工程和酶工程技術領域，涉及一種產(chǎn)甘油脫氫酶的微生物氧化葡 萄糖酸桿菌(Gluconobacter oxydans)，以及將它用于生產(chǎn)二羥基丙酮的方法
背景技術：
1,3-三輕基丙麗，或三輕基丙Sf (1, 3-dihydroxyaeetone 或 dihydroxyacetone, 簡寫為DHA)是最簡單的三碳酮糖，是一種帶有甜味的白色粉末狀結晶，易溶于水、乙醇、丙 酮等溶劑，其分子中含有兩個羥基和一個酮基，化學性質(zhì)活潑，是重要的醫(yī)藥、化學合成中 間體及原料，在精細化工、食品工業(yè)和化妝品工業(yè)等多種行業(yè)發(fā)揮著重要的作用。生產(chǎn)DHA的方法有化學法和生物法兩種，相比化學合成法高耗能，高污染，生物法 則是一種比較低碳，環(huán)保的制備方法，因此研究的比較多的是生物法制備二羥基丙酮。其原 理就是利用微生物代謝產(chǎn)生的甘油脫氫酶或二羥基丙酮合成酶的作用將甘油轉(zhuǎn)化為二羥 基丙酮。其中用于生產(chǎn)二羥基丙酮的微生物有醋酸桿菌屬(Acetobacter) (US4976589)，葡 萄糖酸桿菌屬(Gluconobacter) (US 5770411)，根霉屬(Rhizopus) (US4576913)，單孢絲菌 屬(Micromonospora) (JP 62210994)，芽孢桿菌屬(Bacillus) (JP2286089)等。其中氧化葡 萄糖酸桿菌(Gluconobacter oxydans, G. oxydans)研究的比較多，是工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)DHA的 重要菌種。G. oxydans是專性好氧的微生物，在催化甘油生成DHA的反應時以氧氣為電子受 體，因此氧氣供應成為影響G. oxydans轉(zhuǎn)化甘油生產(chǎn)DHA的關鍵問題，除此之外底物甘油和 產(chǎn)物DHA均會抑制菌體的生長和DHA的生產(chǎn)。為了解決這些問題研究人員通過改變生產(chǎn)DHA 的生產(chǎn)方式，改進發(fā)酵設備等方法，如Hekmat (Bioprocess Biosyt Eng, 2003, 26 109-116) 等通過改進發(fā)酵設備，將傳統(tǒng)的補料分批發(fā)酵發(fā)展為重復補料分批發(fā)酵，最終使得DHA的 產(chǎn)率提高 75%。而 Bauer (Bioprocess Biosyt Eng, 2005, 5 37-43)等通過進一步改良發(fā) 酵設備，采用半連續(xù)雙階重復補料分批發(fā)酵法來解除底物和DHA的抑制作用，從而使得DHA 的濃度最高可達220g/L，兩階段的轉(zhuǎn)化率分分別為85%和83%。通過選擇比較好的生產(chǎn)方 式可以得到比較高產(chǎn)的DHA，這些方法應用到良好的菌種會使得DHA的產(chǎn)量更加高，華東理 工大學(CN 101092604A)利用基因工程技術在G. oxydans中克隆表達了透明顫菌血紅蛋白 基因來提高細胞的攝氧率從而提高DHA的生長效率，但與原始菌相比，基因工程菌的穩(wěn)定 性較差，不適合于工業(yè)化生產(chǎn)。馮屏(食品與發(fā)酵工業(yè)，2005，31 (6) 22-26)等人利用醋酸 桿菌靜止細胞轉(zhuǎn)化甘油生產(chǎn)DHA，甘油起始濃度為60g/L時，轉(zhuǎn)化12批，9批期穩(wěn)定，平均 轉(zhuǎn)化率為91%，當甘油起始濃度增加為100g/L時，菌體穩(wěn)定性下降，只能維持5批次。鄭裕 國(CN 101591681A)等人利用外循環(huán)氣升式反應器轉(zhuǎn)化甘油產(chǎn)DHA，采用流加甘油至總濃 度為300g/L，最終得到200. 4g/L的DHA，平均轉(zhuǎn)化率為67%。以上的方法中生產(chǎn)菌的轉(zhuǎn)化率都較低，且不能耐受高濃度甘油，從而要采用其它 的生產(chǎn)方式來提高產(chǎn)量，增加了工藝的難度和成本，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。申請人:于2009年2月20日申請了專利“一種氧化葡糖桿菌及利用其制備木酮糖的方法”(申請?zhí)?00910024579. 4)，并公開了一株氧化葡糖桿菌(Gluconobacter oxydans) NH-10，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，保藏單位 地址中國.北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學院微生物研究所。登記入冊的編號是CGMCC No. 2709，保藏日期是2008年10月14日。申請人發(fā)現(xiàn)上述菌株能夠高效轉(zhuǎn)化D-阿拉伯糖 醇生成D-木酮糖。通過一個偶然的實驗，申請人發(fā)現(xiàn)上述菌株能高產(chǎn)甘油脫氫酶，其可耐 高濃度甘油并可高效率轉(zhuǎn)化甘油制備1，3_ 二羥基丙酮，并完成了本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種氧化葡萄糖酸桿菌在制備1，3-二羥基丙 酮中的新應用，該菌株為CGMCC No. 2709。為解決上述技術問題，本發(fā)明采用的技術方案如下一種氧化葡萄糖酸桿菌在制備1，3_ 二羥基丙酮中的應用，所述的氧化葡萄糖酸 桿菌其分類命名為氧化葡糖桿菌(Gluconobacter oxydans)NH-10，保藏于中國微生物菌種 保藏管理委員會普通微生物中心，登記入冊的編號是CGMCC No. 2709，保藏日期是2008年 10月14日。上述應用是將菌株CGMCC No. 2709接種于含碳源、氮源、甘油、無機鹽和水的無菌 培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)產(chǎn)酶，離心或超濾獲得含甘油脫氫酶的CGMCC No. 2709細胞，進而利用游 離的或經(jīng)固定化的含甘油脫氫酶的CGMCC No. 2709細胞轉(zhuǎn)化甘油生成1，3-二羥基丙酮。具體來說上述方法包括產(chǎn)酶和轉(zhuǎn)化兩個階段。產(chǎn)酶階段將氧化葡萄糖酸桿菌CGMCC No. 2709斜面活化一天后(斜面培養(yǎng)基成分除含有碳 源、氮源等之外，還含有20g/L的瓊脂)，接種于含碳源、氮源、甘油、無機鹽和水的無菌培養(yǎng) 基中。碳源用量為10 100g/L，氮源用量為1 10g/L，甘油用量為40 200g/L，無機鹽用 量為0. 1 10g/L，其余為水。培養(yǎng)基中的碳源為葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、山梨糖醇和 淀粉水解液中的一種或多種；氮源為牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、玉米漿、豆餅粉、棉籽餅粉、尿 素、(NH4)#04和NH4Cl中的一種或多種；無機鹽為鈉鹽、鎂鹽、鈣鹽、磷酸鹽和磷酸二氫鹽中 的一種或多種。培養(yǎng)基的初始PH范圍為4. 0 8. 0，發(fā)酵溫度25 35°C，搖床轉(zhuǎn)速100 250r/min,培養(yǎng)24 60h，細胞濕重達20g/L，發(fā)酵液酶活達5. 2 10. 3U/mL,然后離心或超 濾獲得含甘油脫氫酶的細胞，離心條件室溫條件下，7000 12000r/min，10 30min。采 用超濾法時，所用超濾膜孔徑0. 01 0. 1 μ m，操作壓力0. 1 0. 6MPa，超濾膜截流分子量 為IO5 IO6道爾頓。甘油脫氫酶酶活測定方法發(fā)酵液在8000r/min下離心IOmin收集細胞，用pH 7. 0的IOOmM的磷酸鉀緩沖液 洗滌3次每次洗滌之后在8000r/min，4°C離心lOmin。超聲破碎將洗滌后的菌體懸浮在緩沖液中，超聲破碎lOmin，工作強度為40%， 工作4min冰浴6min，隨后在4°C下lOOOOr/min離心15min，除去細胞碎片，所得上清液即為 粗酶液。反應體系50mM磷酸鈉緩沖液(pH 6. 0) ,0. 25mM DCIP (2,6-dichlorophenol indophenol, 二氯酚靛酚)，0· 2M 甘油，0. 325mM PMS(phenazine methosulphate,硫酸甲酯吩嗪)。30°C在600nm處測定吸光度的改變。在pH6. 0的溶液中，DCIP的消光系數(shù)為 10. 8mM_10酶活定義一個酶活單位定義為在30°C、pH6.0條件下，一分鐘內(nèi)還原ΙμΜ DICP所用的酶量。酶法轉(zhuǎn)化階段將游離的含甘油脫氫酶的CGMCC No. 2709細胞用40 200g/L的甘油溶液懸浮， 于試管或三角瓶中轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化時溫度為25 35°C，轉(zhuǎn)化時間16 60h，轉(zhuǎn)速為150 250r/ min?；蛘邔GMCC No. 2709細胞裝入到含有1. 5 2. 5L的40 200g/L的甘油溶液的發(fā) 酵罐中進行轉(zhuǎn)化，發(fā)酵罐的通風量為0. 4 1. Ovvm，攪拌轉(zhuǎn)速為200 800r/min，溫度為 25 35°C，流加甘油維持發(fā)酵罐內(nèi)甘油濃度為10 15g/L，甘油總流加量至200 300g/ L(以流加結束時發(fā)酵液體積計)時結束流加，總轉(zhuǎn)化時間為16 60h?；蛘邔⒐潭ɑ暮视兔摎涿傅腃GMCC No. 2709細胞裝入鼓泡填充床式柱反應器 中，該反應器以0. 5 5mL/min的流速單向流加或循環(huán)連續(xù)流加30 100g/L的甘油溶液， 進行酶轉(zhuǎn)化反應，反應溫度25 35°C，每批轉(zhuǎn)化時間12 24h。通過調(diào)整流速，控制甘油 的轉(zhuǎn)化率在90 100%之間，收集流出液，濃縮結晶得到DHA。含甘油脫氫酶的細胞進行固定化的方法為配制1 3% (即10 30g/L)濃度的 海藻酸鈉，加入10 25%的細胞(即每IOOmL海藻酸鈉溶液中加入10 25克的細胞)， 并添加5 10%硅藻土(即每升海藻酸鈉溶液中加入50 100克的硅藻土)，再用濃度為 1 4%的CaCl2溶液(10 40g/L)將包埋材料海藻酸鈉固定成型，以此作為酶源進行反 應。除了海藻酸鈉作為固定化載體包埋外，還可以用卡拉膠、甲殼素等載體包埋細胞。DHA的分析方法采用二苯胺顯色法和高效液相色譜法進行。二苯胺顯色法試劑包括二苯胺0. 6g，冰醋酸54ml，98%的濃硫酸6ml，將樣品用 去離子水稀釋到適當?shù)臐舛?，?. 5ml的稀釋液置于20ml具塞試管內(nèi)，加入4. 5ml的二苯 胺試劑，加塞密封后于沸水浴煮15 30min，迅速用冷水冷卻，以同樣處理的去離子水對 照，分光光度計中于615nm波長下比色，通過DHA與A615的標準曲線計算DHA的含量。高效液相色譜法將發(fā)酵液離心(8000rpm，IOmin)，上清液經(jīng)0. 22 μ m針式濾膜過 濾后進樣。色譜柱Aminex HPX-87H，流動相0. 04mol/L H2SO4溶液，流速0· 6mL/min，柱 溫60°C。檢測器為紫外，波長215nm，利用DHA與峰面積的標準曲線計算DHA的含量。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明中的微生物菌株氧化葡萄糖酸桿菌NH-10 (CGMCC No. 2709)能在比較高濃 度的甘油條件下將甘油轉(zhuǎn)化為DHA，而且對甘油進行脫氫反應能力較強；利用氧化葡萄糖 酸桿菌NH-10生產(chǎn)DHA，在起始甘油濃度為120 200g/L的條件下，甘油轉(zhuǎn)化率最高可達 99.7%,DHA得率可達95%，轉(zhuǎn)化液中DHA濃度可達166. 2g/L，轉(zhuǎn)化液中幾乎不含其它成分， 利于DHA的分離純化，因此，氧化葡萄糖酸桿菌NH-10 (CGMCCNo. 2709)適用于DHA的工業(yè)化 生產(chǎn)。
具體實施例方式根據(jù)下述實施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結果僅用于說明本發(fā)明，而不應當也不會限 制權利要求書中所詳細描述的本發(fā)明。實施例1 斜面培養(yǎng)基葡萄糖30g/L，酵母膏5g/L，牛肉膏3g/L，瓊脂20g/L。發(fā)酵培養(yǎng)基(同搖瓶培養(yǎng)基)山梨糖醇10g/L，甘油40g/L，酵母膏5g/L，牛肉膏 3g/L, MgSO4 · 7H20 0. 5g/L, CaCO3O. 5g/L，起始 pH 為 5. 0，121°C滅菌 15min。將氧化葡萄糖酸桿菌CGMCC No. 2709在斜面培養(yǎng)基30°C培養(yǎng)24h，后用接種環(huán)從 斜面上接一環(huán)菌與搖瓶培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)24h，搖瓶轉(zhuǎn)速為200r/min，離心收集發(fā)酵液中 的菌體，以游離細胞轉(zhuǎn)化，稱取1. 5g離心后的濕細胞加入IOmL 100g/L的甘油溶液中(細 胞的添加量按每150g細胞轉(zhuǎn)化IL 100g/L的甘油溶液計)，在30°C條件下，于200r/min的 搖床上轉(zhuǎn)化24h，反應結束后測定底物轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物的濃度。甘油的轉(zhuǎn)化率為99. 5%, DHA 的產(chǎn)率為96. 9g/L。實施例2 培養(yǎng)基成分同實施例1。將氧化葡萄糖酸桿菌CGMCC No. 2709在斜面培養(yǎng)基30°C 培養(yǎng)24h，后用接種環(huán)從斜面上接一環(huán)菌與搖瓶培養(yǎng)基中，28°C培養(yǎng)30h，搖瓶轉(zhuǎn)速為120r/ min，離心收集發(fā)酵液中的菌體，pH7.0磷酸鉀緩沖液洗滌兩遍，稱取1.5g離心后的濕細胞 加入IOmL 160g/L的甘油溶液中(細胞的添加量按每150g細胞轉(zhuǎn)化IL 160g/L的甘油溶 液計)，在28°C條件下，于120r/min中搖床中轉(zhuǎn)化生產(chǎn)DHA，轉(zhuǎn)化48h，反應結束后測定底物 的轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物的濃度。甘油的轉(zhuǎn)化率為97%，DHA濃度為154g/L。實施例3 培養(yǎng)基成分同實施例1。將氧化葡萄糖酸桿菌CGMCC No. 2709在斜面培養(yǎng)基30°C 培養(yǎng)24h，后用接種環(huán)從斜面上接一環(huán)菌與搖瓶培養(yǎng)基中，32°C培養(yǎng)40h，搖瓶轉(zhuǎn)速為220r/ min，離心收集發(fā)酵液中的菌體，pH7.0磷酸鉀緩沖液洗滌兩遍，稱取1.5g離心后的濕細胞 加入IOmL 200g/L的甘油溶液中(細胞的添加量按每150g細胞轉(zhuǎn)化IL 200g/L的甘油溶 液計)，在30°C條件下，于200r/min中搖床中轉(zhuǎn)化生產(chǎn)DHA，轉(zhuǎn)化60h，反應結束后測定底物 的轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物的濃度。甘油的轉(zhuǎn)化率為90%，DHA產(chǎn)率為166. 2g/L。實施例4 斜面培養(yǎng)基同實施例1。發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖10g/L,甘油 40g/L,酵母膏 2. 5g/L，(NH4) 2S042. 0g/L, K2HPO4O. lg/L, KH2PO4O. 9g/L, MgSO4 · 7H20 1. Og/L, CaCl2L 5g/L, pH8. 0。將氧化葡萄糖酸桿菌CGMCC No. 2709在斜面培養(yǎng)基30°C培養(yǎng)24h，后用接種環(huán)從 斜面上接一環(huán)菌與搖瓶培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)24h，搖瓶轉(zhuǎn)速為200r/min，離心收集發(fā)酵液中 的菌體，PH7. 0磷酸鉀緩沖液洗滌兩遍，稱取7. 5g離心后的濕細胞加入50mL100g/L的甘油 溶液中，30°C條件下，200r/min中搖床進行重復批次轉(zhuǎn)化生產(chǎn)DHA，即每轉(zhuǎn)化24h后，離心收 集菌體和發(fā)酵液，再次用50mL 100g/L的甘油溶液懸浮，如此重復10批次，收集10次發(fā)酵 液混合，測定底物的轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物的濃度。甘油的平均轉(zhuǎn)化率96%，DHA平均得率為92%， DHA總產(chǎn)量為46g，具體數(shù)據(jù)見表1。表1利用氧化葡萄糖酸桿菌CGMCC No. 2709重復批次轉(zhuǎn)化甘油產(chǎn)DHA
權利要求
一種氧化葡萄糖酸桿菌在制備1，3 二羥基丙酮中的應用，所述的氧化葡萄糖酸桿菌其分類命名為氧化葡糖桿菌(Gluconobacter oxydans)NH 10，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，登記入冊的編號是CGMCC No.2709，保藏日期是2008年10月14日。
2.根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于將菌株CGMCCNo. 2709接種于含碳源、 氮源、甘油、無機鹽和水的無菌培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，離心或超濾獲得含甘油脫氫酶的CGMCC No. 2709細胞，進而利用游離的或經(jīng)固定化的含甘油脫氫酶的CGMCCNo. 2709細胞轉(zhuǎn)化甘油 生成1，3-二羥基丙酮。
3.根據(jù)權利要求2所述的應用，其特征在于所述培養(yǎng)基中，各組分用量為碳源用量為 10 100g/L，氮源用量1 10g/L，甘油用量40 200g/L，無機鹽用量為0. 1 10g/L，其 余為水。
4.根據(jù)權利要求2或3所述的應用，其特征在于所述培養(yǎng)基中，所述碳源為葡萄糖、蔗 糖、果糖、麥芽糖、山梨糖醇和淀粉水解液中的一種或多種，所述氮源為牛肉膏、蛋白胨、酵 母膏、玉米漿、豆餅粉、棉籽餅粉、尿素、(NH4)2SO4^P NH4Cl中的一種或多種，所述無機鹽為鈉 鹽、鎂鹽、鈣鹽、磷酸鹽和磷酸二氫鹽中的一種或多種。
5.根據(jù)權利要求2所述的應用，其特征在于將菌株CGMCCNo. 2709進行培養(yǎng)的條件是 培養(yǎng)基的初始pH范圍為4. 0 8. 0，發(fā)酵溫度25 35°C，搖床轉(zhuǎn)速100 250r/min，培養(yǎng) 24 60h。
6.根據(jù)權利要求2所述的應用，其特征在于利用游離的含甘油脫氫酶的CGMCCNo.2709 細胞轉(zhuǎn)化甘油生成1，3- 二羥基丙酮是將CGMCC No. 2709細胞用40 200g/L的甘油溶液 懸浮，于試管或三角瓶中轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化時溫度為25 35°C，轉(zhuǎn)化時間16 60h，轉(zhuǎn)速為150 250r/min ；或者將CGMCC No. 2709細胞裝入到含有1. 5 2. 5L的40 200g/L的甘油溶液 的發(fā)酵罐中進行轉(zhuǎn)化，發(fā)酵罐的通風量為0. 4 1. Ovvm,攪拌轉(zhuǎn)速為200 800r/min，溫度 為25 35°C，流加甘油維持發(fā)酵罐內(nèi)甘油濃度為10 15g/L，甘油總流加量至200 300g/ L時結束流加，總轉(zhuǎn)化時間為16 60h。
7.根據(jù)權利要求2所述的應用，其特征在于利用經(jīng)固定化的含甘油脫氫酶的CGMCC No. 2709細胞轉(zhuǎn)化甘油生成1，3-二羥基丙酮是將固定化的含甘油脫氫酶的CGMCC No. 2709 細胞裝入鼓泡填充床式柱反應器中，該反應器以0. 5 5mL/min的流速單向流加或循環(huán)連 續(xù)流加30 100g/L的甘油溶液，進行酶轉(zhuǎn)化反應，反應溫度25 35°C，每批轉(zhuǎn)化時間12 24h。
8.根據(jù)權利要求1或7所述的應用，其特征在于固定化的細胞是采用海藻酸鈣或卡拉 膠作為固定化載體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種氧化葡萄糖酸桿菌在制備1，3-二羥基丙酮中的應用，所述的氧化葡萄糖酸桿菌其分類命名為氧化葡糖桿菌NH-10，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，登記入冊的編號是CGMCC No.2709，保藏日期是2008年10月14日。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)氧化葡糖桿菌NH-10能夠在高濃度的甘油濃度條件下高效的轉(zhuǎn)化甘油產(chǎn)1，3-二羥基丙酮，在本發(fā)明工藝條件下，甘油的轉(zhuǎn)化率最高可達到99.7％(w/w)，1，3-二羥基丙酮的得率最高可達97％，轉(zhuǎn)化液中1，3-二羥基丙酮濃度可達166.2g/L，轉(zhuǎn)化液中幾乎不含其它的成分。本發(fā)明中的微生物菌株適用于二羥基丙酮的工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號C12N1/20GK101948878SQ20101027167
公開日2011年1月19日 申請日期2010年9月2日 優(yōu)先權日2010年9月2日
發(fā)明者馮小海, 徐虹, 戴小燕, 朱宏陽, 李莎 申請人:南京工業(yè)大學