專利名稱：雞脂肪候選基因Lpin2基因及其應(yīng)用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā) 明屬于分子生物學(xué)檢測(cè)動(dòng)物脂肪性狀技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種雞脂肪候選 基因lpin2基因及其應(yīng)用方法。
背景技術(shù)：
1、Lpin2基因與脂肪沉積的關(guān)系目前，Lpin2基因的研究主要集中在人和小鼠上，關(guān)于雞Lpin2的研究還未見相 關(guān)報(bào)道。Lpin2是在60%的氨基酸序列與Lpinl相似的基礎(chǔ)上被鑒定出來的，它含有兩個(gè) 高度保守區(qū)域N-LIP (約125個(gè)氨基酸)和C-LIP (約200個(gè)氨基酸)域，這兩個(gè)區(qū)域?qū)λ?的功能來說是很關(guān)鍵的。Jimmy Donkor (2007)的研究確定哺乳動(dòng)物的lipin2是磷脂酸磷 酸酶l(PAPl)，它在甘油三酯、卵磷脂和腦磷脂的從頭合成中起到重要作用，他(2009) 的最新研究又發(fā)現(xiàn)Lpin2與Lpinl—樣，也具有轉(zhuǎn)錄輔激活因子活性，可以調(diào)節(jié)脂肪酸氧 化相關(guān)基因的表達(dá)。在動(dòng)物體內(nèi)中，甘油三酯、卵磷脂和腦磷脂的從頭合成主要是通過甘油磷酸途 徑來催化的。磷脂酸磷酸酶在甘油磷酸途徑中甘油三酯、卵磷脂和腦磷脂的生物合成中 是必需的，甘油磷酸途徑可以催化磷脂酸脫磷酸化產(chǎn)生甘油三酯和Pi。脂肪組織中不足 的和過度的甘油三酯沉積與肝臟和骨骼肌中不恰當(dāng)?shù)闹|(zhì)蓄積相關(guān)，還與受損的脂肪因 子的產(chǎn)生有關(guān)。這些反過來又造成胰島素抗性和血脂異常，即代謝綜合征的主要組分。 從對(duì)疾病如肥胖和脂肪營(yíng)養(yǎng)不良的研究中我們就可以清楚地看到脂肪沉積的調(diào)節(jié)對(duì)于代 謝平衡來說是很關(guān)鍵的。2、Lpin2基因在人上的研究在人類上，Lpin2被定位在ISpll上，一個(gè)與2型糖尿病有關(guān)的區(qū)域。 Lpin23，UTR的一個(gè)SNP rs3745012與脂肪分布和2型糖尿病顯著相關(guān)。Zhou J的研究 指出，人類Lpin2基因包含20個(gè)外顯子并約跨越115kb，推測(cè)Lpin2cDNA包含6245個(gè)核 苷酸。一個(gè)核定位信號(hào)靠近NH2末端，并且在Lpin蛋白質(zhì)間是高度保守的。Lpin2在不 同的組織都有表達(dá)，包括骨骼肌。罕見的Lpin2突變會(huì)引起Majeed綜合癥，一種人類炎 癥性障礙疾病，主要癥狀是易復(fù)發(fā)的骨髓炎、發(fā)燒、紅細(xì)胞生成不良引起的貧血和皮膚 炎癥，這些癥狀揭示了 Lpin2在體內(nèi)非冗余的功能。在無親緣關(guān)系的阿拉伯家族中鑒定 到三個(gè)不同的Lpin2突變，一個(gè)是Lpin2編碼區(qū)兩個(gè)核苷酸的缺失引起未成熟終止密碼子 的出現(xiàn)，可能導(dǎo)致介導(dǎo)的無義mRNA的衰減并出現(xiàn)無功能的蛋白質(zhì)產(chǎn)物；第二個(gè)突變發(fā) 生在Lpin2外顯子17的供體剪接位點(diǎn)處，這可能會(huì)導(dǎo)致內(nèi)含子序列的連讀，在終止密碼 子之前添加65個(gè)無關(guān)的氨基酸殘基；這兩個(gè)突變都阻礙了全長(zhǎng)Lpin2蛋白質(zhì)的生產(chǎn)，而 第三個(gè)突變則是點(diǎn)突變，它引起單個(gè)核苷酸的替換，S734L。3、Lpin2基因在鼠上的研究Matthew C (2009)在fld小鼠上的研究表明，Lpin2是一種在肝臟中富集的磷脂酸
磷酸酶，而且肝臟Lpin2蛋白質(zhì)含量在Lpinl缺失、禁食和肥胖的情況下顯著增加，通常不依賴于穩(wěn)態(tài)mRNA水平的改變。若假設(shè)Lpinl是唯一一個(gè)在甘油三酯合成方面有重要 作用的磷脂酸磷酸酶，fld小鼠的肝臟表型有點(diǎn)奇怪。首先，新生的fld小鼠因甘油三酯的 過度堆積表現(xiàn)出嚴(yán)重的肝臟皮脂腺??；其次，雖然fld小鼠的其它組織嚴(yán)重缺乏PAPl活 性，成年fld小鼠仍保持顯著的依賴Mg2+的PAP活性和甘油三酯合成的正常比率。這些研 究表明肝臟中還有其它活躍的PAPl酶。在標(biāo)記的N端和C端區(qū)域序列同源性的基礎(chǔ)上， Iipin家族的另外一個(gè)成員Lpin2被鑒定出來。重要的是，Lpin2也表現(xiàn)出PAPl活性，雖 然二者的相對(duì)活性和催化最大速率相比較為L(zhǎng)pinl >Lpin2。而這些數(shù)據(jù)又與近來在HeLa 細(xì)胞中使用Kpin2shRNA的研究形成強(qiáng)烈反差[32]，在那個(gè)研究中由于對(duì)IipinlmRNA 和蛋 白質(zhì)的補(bǔ)償性誘導(dǎo)，Kpin2的敲除實(shí)際上使得PAP-I活性增加了。雖然還沒有關(guān)于這些 差異的明確解釋，Kpinl和lipin2作為PAP-I酶的相對(duì)重要性已經(jīng)很清楚的表明具有細(xì)胞 特異性。4、Lpin2基因在豬上的研究X.P.He(2008)對(duì)豬的Lpin2基因進(jìn)行了分子鑒定、染色體定位及與背膘厚度的關(guān) 聯(lián)分析，獲得了豬Lpin2基因的一個(gè)2985bp的cDNA序列，這個(gè)序列包含一個(gè)2676bp， 兩側(cè)分別是Ilbp的5’ UTR和298bp的3’ UTR的開放閱讀框。表達(dá)譜分析顯示豬 Lpin2在肝臟中表達(dá)水平最高，在脾臟、肺、腎和脂肪中的表達(dá)水平也都很高，在心臟和 骨骼肌中的表達(dá)水平低。通過SCHP技術(shù)還將豬Lpin2定位在6q24-(l/2)q31上，依據(jù)豬 QTL數(shù)據(jù)庫(kù)，背膘厚度的幾個(gè)QTL也被定位在這個(gè)小染色體區(qū)域，這表明LPIN2可能與 豬的脂肪沉積有關(guān)，RH作圖揭示了 Lpin2與豬6號(hào)染色體上的SW1059是緊密連鎖的。 另外，在豬Lpin2上還鑒定到一個(gè)同義的SNP T2193C，并且通過Hin6I限制性內(nèi)切酶檢 測(cè)到這個(gè)SNP在編碼序列的2193位置上并且沒有導(dǎo)致氨基酸的改變，關(guān)聯(lián)分析顯示這個(gè) SNP與豬第6和第7肋間的背膘厚度相關(guān)，這是揭示豬脂肪沉積能力的一個(gè)重要性狀，因 此猜測(cè)Lpin2可能是豬脂肪沉積的一個(gè)候選基因。5、Lpin2 與 Lpinl 的關(guān)系Neil Grimsey (2008)的研究揭示Iipinl和2的功能從單細(xì)胞真核生物到哺乳動(dòng)物 在進(jìn)化上都是保守的，兩個(gè)Lipins在HeLa M細(xì)胞內(nèi)的位置不同，成簇的Lpin2與細(xì)胞膜 連接緊密。SiRNA介導(dǎo)的Lpinl的沉默導(dǎo)致HeLa M細(xì)胞中PAPl活性顯著降低，這與表 達(dá)一個(gè)無效的Lpinl突變等位基因的fld小鼠組織中PAPl活性的喪失是一致的。然而， Lpin2的沉默則引起Lpinl水平和PAPl活性的提高。與它們?cè)贖eLa M細(xì)胞內(nèi)不同的功能 一致，Lpinl和Lpin2在3T3-L1脂肪細(xì)胞的分化上表現(xiàn)出不同的蛋白質(zhì)表達(dá)模式。Lpin2 的水平在Lpinl缺失的3T3-L1細(xì)胞中有所增加，并且沒有彌補(bǔ)脂肪生成的缺陷，而Lpin2 的缺失則沒有抑制脂肪生成。兩個(gè)Lpin不同的功能可以解釋它們?cè)谥拘纬善陂g表達(dá)的 時(shí)序性，脂肪生成的細(xì)胞模型顯示前脂肪細(xì)胞首先被定型為進(jìn)行分化，隨后便進(jìn)行有限 的增殖，當(dāng)它們獲得專門的脂肪生成特性，包括脂質(zhì)蓄積時(shí)，最終完成成熟過程。Lpinl 不在前脂肪細(xì)胞中表達(dá)，這表明Lpin2能夠先于細(xì)胞分化提供必需的PAPl活性，Lpin2 的水平會(huì)間接影響脂肪生成。最后還指出兩個(gè)Kpins的PAPl活性都可以被有絲分裂期間 的磷酸化作用所抑制，導(dǎo)致細(xì)胞分裂期間細(xì)胞PAPl活性的降低。因此可以說Lpinl和 Lpinl2不同的和非冗余的功能調(diào)節(jié)了整個(gè)細(xì)胞周期和脂肪細(xì)胞分化期間的脂肪生產(chǎn)。6、雞Lpin2基因的初步分析
現(xiàn)已在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)上搜索到雞Lpin2CDS (ΝΜ_001006386)，經(jīng)分析其位于雞2 號(hào)染色體上，跨越全基因組序列的1938499-1966777bp這個(gè)區(qū)域。經(jīng)分析和重新拼接得 到雞Lpin2基因的完整序列，全長(zhǎng)31516bp，包含19個(gè)外顯子和18個(gè)內(nèi)含子，雞Lpin2 基因全編碼序列長(zhǎng)度為2664bp，預(yù)測(cè)編碼887個(gè)氨基酸蛋白，與人、鼠、豬和爪蟾屬 Lpin2的同源性分別為74.35%、74.67%, 72.94%和69.73%，與雞Lpinl基因的同源性為 47.16%。目前，Lpin2基因的研究主要集中在人和小鼠上，關(guān)于雞Lpin2的研究還未見相 關(guān)報(bào)道。研究Lpin2可以深入了解其與脂肪性狀的關(guān)聯(lián)，為篩選脂肪沉積相關(guān)的分子標(biāo) 記和重要候選基因奠定基礎(chǔ)，在培育低脂肪肉雞新品系，調(diào)控肉雞體內(nèi)脂肪沉積方面有 重要作用。本研究擬通過尋找重要多態(tài)位點(diǎn)進(jìn)行多態(tài)性分析，以了解雞Lpin2基因變異 與性狀的關(guān)聯(lián)，為L(zhǎng)pin2基因在雞上的深入研究奠定基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克隆出雞脂肪性狀的功能候選基因lpin2基因，并提供一種雞脂 肪候選基因的應(yīng)用方法，即單核苷酸多態(tài)性(SNPs)來檢測(cè)雞脂肪性狀的方法。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下本發(fā)明利用電子克隆和RT-PCR，從雞的肝臟組織獲得了雞Lpin2基因(鼠Lpin2 基因的同源基因)的編碼序列，編碼序列(CDS)為2709bp。該基因的核苷酸序列如SEQ ID No.l所示。該基因的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。單核苷酸多態(tài)性(SNPs)來檢測(cè)雞脂肪性狀的方法采用上述雞脂肪候選基因 lpin2基因序列，與雞基因組序列比對(duì)，針對(duì)存在的變異，采用PCR-RFLP法，用下述引 物對(duì)雞的總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后用MspI酶進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)，正向5'CATAGAATCATGTGCTCCAAAG 3‘反向5'TTACCTAAGGGGCTGAACACT 3‘。檢測(cè)出雞候選基因Lpin2的G444A是G還是A，G等位基因可被MSPI酶切產(chǎn) 生一個(gè)268和25堿基的片段；A等位基因不能被MSPI酶切；AA純合子只產(chǎn)生一個(gè)386 的片段；GG純合子將產(chǎn)生227和149堿基的片段；GA雜合子將產(chǎn)生386、227和149堿 基三種片段。分析顯示雞Lpin2基因不同基因型對(duì)一些屠體性狀有顯著效應(yīng)。對(duì)體重和體尺 的效應(yīng)達(dá)到顯著水平中，AA基因型的體重和體尺最大，而GG基因型的體重和體尺均最 小。顯示LPIN2基因?qū)ιL(zhǎng)相關(guān)性狀有重要的效應(yīng)，有望用于雞的標(biāo)記輔助選擇。本發(fā)明巧妙地利用創(chuàng)造酶切位點(diǎn)PCR-RFLP法檢測(cè)SNPs，發(fā)現(xiàn)了影響雞生長(zhǎng)及 屠體性狀的功能基因和特異性突變位點(diǎn)。采用標(biāo)記輔助選擇選擇是一大發(fā)展趨勢(shì)。
具體實(shí)施例方式一 .實(shí)驗(yàn)材料與方法1.實(shí)驗(yàn)材料1.1菌株和克隆載體本發(fā)明所用菌株見表
菌株名稱 表型及基因型 DH5a supE44 ALacl69(Q80 LacZ ΔΜ15) hsdR17 RecA endAl gyrA98 thi-1 recAl JM109 recAl supE44 endAl hsdrl7 gryA96 relAl thiA(lac-proAB)F' (traD36 proAB+ ___IaIq LacZ AMI 5)__本發(fā)明所用的克隆載體為pGEM 3zf (+/_) vectorspGEM 7zf (+/_) vectorsPGEM-T Vectors 均來自 Promega 公司。1.2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物組織樣與血樣 以固始雞、安卡紅肉雞雜交產(chǎn)生的F2代為實(shí)驗(yàn)素材，其中肉雞做父本為正交 系，固始雞做父本為反交系，正反交各4個(gè)家系共860只雞。13周齡宰殺，記錄各項(xiàng)屠 體指標(biāo)。13周齡時(shí)翅靜脈采血，草酸鹽抗凝，酚仿抽提之后，TE溶解_20°C保存。1.3.酶與試劑各種酶、RNA試劑盒、RACE試劑盒等試劑分別購(gòu)自華美生物工程公司、Biolab 公司和Promega公司；PCR引物由上海生物工程公司和西安美聯(lián)公司合成。其它常規(guī)試 劑來自中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)物資供應(yīng)科。1.4.DNA 分析軟件同源性分析軟件DANMANPCR 引物設(shè)計(jì)軟件OLIG04.0，數(shù)據(jù)分析軟件SAS (6.12版本)。2.實(shí)驗(yàn)方法2.1電子克隆方法以鼠LPIN2基因(accession Num. NM_022882)編碼序列為種子序列，搜索 NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得一個(gè)與鼠編碼序列高度同源的基因(NM_001006386)，并以該序列為 模板進(jìn)行基因的PCR驗(yàn)證。2.2設(shè)計(jì)引物DRT-PCR驗(yàn)證雞Lpin2基因編碼序列和檢測(cè)編碼序列多態(tài)的引物表IRT-PCR驗(yàn)證雞Lpin2基因編碼序列和檢測(cè)編碼序列多態(tài)的引物
Primers Primer sequences (5，-3，)Banding Size
number____region__(bp)
896
57CT^ATG^GTAATGGTAGCfQ3i
"F2 5' CTCGAAGGATCATTACCCATTA 3' .2047
^AGTCCA0^CTAGGTGAG"3；3) PCR-RFLP法檢測(cè)變異的引物正向5'CATAGAATCATGTGCTCCAAAG 3‘反向5'TTACCTAAGGGGCTGAACACT 3‘
擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為386bp。2.3緩沖液與常用試劑的配制 TE緩沖液IOmMTris · Cl, ImM EDTA, pH8.0,高壓滅菌。高壓滅菌條件 為 1.034 X IO5Pa, 20min。STE 緩沖液O.lMNaCl，IOmMTris · Cl, lmMEDTApH8.0,高壓滅菌。50XTAE 緩沖液Tris 堿 242g，冰乙酸 57.1ml，0.5MEDTA(pH8.0) 100ml,加水
至1L。5 X TBE 緩沖液Tris 堿 54g，硼酸 27.5g，0.5M EDTA (pH8.0) 20ml,力卩水至1L。質(zhì)粒DNA 提取溶液 I 50mM 葡萄糖，2.5mM Tris · Cl (pH8.0)，IOmM EDTA(pH8.0)，高壓滅菌10磅15min，貯存于4°C。質(zhì)粒DNA提取溶液II 0.2M NaOH, 1% SDS,現(xiàn)配現(xiàn)用。質(zhì)粒DNA提取溶液III: 5M乙酸鉀溶液60ml，冰乙酸11.5ml，滅菌水28.5ml。IPTG溶液IPTG Ig溶解于50ml雙蒸水中，過濾除菌，分裝貯存于_20°C。IM Tris · Cl: 121.14g Tris堿溶于800ml雙蒸水中，用鹽酸調(diào)pH值至8.0，定 容至1000ml，高壓滅菌。0.5M EDTA EDTA 186.Ig 溶于 800ml 雙蒸水中，用 NaOH 調(diào) pH 值至 8.0，定 容至1000ml，高壓滅菌。3M NaAc(pH7.0) NaAc · 3H20 408.Ig 溶于 800ml 雙蒸水中，用冰乙酸調(diào) pH 至7.0，定容至1000ml，高壓滅菌。3M NaAc(pH5.2) NaAc · 3H20 408.Ig 溶于 800ml 雙蒸水中，用冰乙酸調(diào) pH 至5.2，定容至1000ml，高壓滅菌。IM CaCl2 CaCl2 · 6H20 27g 加水至 100ml，過濾滅菌，貯存于 _20°C。10% SDS SDS IOOg溶于900ml雙蒸水中，加熱至68°C助溶，用HCl調(diào)pH值 至7.2，定容至IOOOmLRNaseA 溶液100mg/ml 溶于 IOmM Tris · Cl (pH7.5)，15mM NaCl 中 100°C煮 沸IOmin，室溫冷卻后，貯存于_20°C。血液DNA 提取液IOmM Tris · Cl (pH8.0)，0.1M EDTA(pH8.0)，20 μ g/ml 胰 RNA 酶，0.5% SDS。組織DNA提取液
Stock concentrationWorking concentration
RnaselOmg/ml_20ug/ml_
"Proteinase KlOms/ml100~200ug/ml
Tissue DNAIM Tris-Cl(pH8.0)50mM
extraction0.5M EDTA(pH8.0) Μ^
solution'
2M NaClIOOmM
10% SDS1%2.4膠回收方法
1)將單一的DNA條帶從瓊脂糖凝膠中切下(盡量切除多余部分)放入滅菌的小
離心管中，稱取重量。2)向膠塊中加入3倍體積溶膠液PN(如果凝膠重為O.lg，其體積可視為 IOOuL,則加入300 μ L溶膠液)，55°C水浴放置10分鐘，每?jī)煞昼姄u動(dòng)一下離心管，以 確保膠塊充分溶解。4)膠塊完全熔解后，將降至室溫的膠溶液(吸附柱在較高溫度時(shí)結(jié) 合DNA的能力較弱)移入一個(gè)吸附柱CA2 (吸附柱放入收集管中)，3000rpm離心30sec， 倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放入收集管中。如果是少而貴重的物品，可將收集 管中的液體重新吸到吸附柱中離心，以提高回收效率。3)向吸附柱中加入500 μ L漂洗液PW(按要求使用前加入無水乙醇)，8000rpm
離心30sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放入收集管中。重復(fù)步驟此步驟一次以 提高回收效率。4)將收集管中的廢液倒掉，IOOOOrpm離心Imin盡量除去漂洗液。將吸附柱置 于室溫徹 底晾干，以防止殘留的漂洗液影響回收率和DNA的質(zhì)量。5)將吸附柱放到一滅菌的離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加適量65 70°C 水浴預(yù)熱的30 μ L洗脫緩沖液EB，室溫放置2分鐘。IOOOOrpm離心Imin收集DNA溶液。2.5克隆測(cè)序流程Α、連接反應(yīng)1)將純化回收產(chǎn)物用pGEM-T Easy(promega)載體4°C連接24h，連接體系如 下2 X快速連接反應(yīng)緩沖液 5ul;pGEM-T Easy 載體(50ng/ul) 0.5ul ；回收產(chǎn)物3ul ；T4 連接酶0.5ul ；去離子水Iul_總體積IOulB、轉(zhuǎn)化過程取5ul連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5 α感受態(tài)細(xì)胞(天根公司)，具體操作如下(冰上操 作)①取一管(IOOul) DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，冰水浴溶解后取50ul，加入1.5ml離心管 中，在加入5ul連接產(chǎn)物，用移液槍頭輕輕吹打幾下混勻，冰水浴30分鐘；②將混合液42°C熱激90秒(此過程需要嚴(yán)格操作，不要搖動(dòng)離心管)，迅速冰 水浴15分鐘；③再向離心管中加950ulLB液體基(不含氨芐青霉素)，混勻后轉(zhuǎn)入IOml的滅 菌玻璃小試管中，于37°C搖床上培養(yǎng)45分鐘(150轉(zhuǎn)/分鐘)，復(fù)蘇菌液；④將培養(yǎng)液再轉(zhuǎn)入1.5ml離心管中，8000轉(zhuǎn)/分鐘離心30秒；⑤棄上清，余留200ul，并用移液槍頭吹打混勻菌液；⑥取IOOul菌液，用三角玻璃棒涂布于已經(jīng)制好的固體培養(yǎng)基上(含有IOOmg/ml的氨芐青霉素鈉、20mg/ml X-GAL和24mg/ml I100mg/ml PTG)，37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 12到 16小時(shí)。⑦通過藍(lán)白斑篩選，滅菌牙簽挑選白色的陽(yáng)性克隆，在新的固體培養(yǎng)基上劃 線，進(jìn)行二次擴(kuò)大培養(yǎng)，于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8小時(shí)即可。同時(shí)挑選一個(gè)藍(lán)斑進(jìn)行培養(yǎng) 作對(duì)照。用滅菌牙簽挑取二次培養(yǎng)過的白色單菌落，分別接種于裝有5mlLB液體培養(yǎng) 基的滅菌玻璃試管中，含有60ug/ml的氨芐青霉素，37°C劇烈振蕩培養(yǎng)過夜(12 16小 時(shí))。C、質(zhì)粒DNA的提取使用質(zhì)粒小提試劑盒(天根)提取菌液的質(zhì)粒DNA，具體步驟如下①將菌液離心，聚集沉淀，13000轉(zhuǎn)/分鐘離心30秒，②向沉淀中加入250ulPl溶液，用移液槍頭輕輕吹打，使沉淀重懸于液體之 中；③再液體中加入250U1P2溶液，上下溫和旋轉(zhuǎn)離心管6到10次，裂解菌液；④再液體中加入350ulP3溶液，立即混勻，上下翻轉(zhuǎn)離心管6到10次；⑤12000轉(zhuǎn)/分鐘離心1分鐘，為了沉淀完全，可以進(jìn)行二次離心。⑥向CB3柱子中加入500ul的平衡液BL，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心1分鐘，待用。⑦將(5)中上層清液轉(zhuǎn)入處理好的CB3柱子中，靜置2分鐘，12000轉(zhuǎn)/分鐘離 心50秒；⑧向CB3柱子中加入700ul的PW，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心50秒；⑨向CB3柱子中加入500ul的PW，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心50秒；⑩向CB3柱子的底膜中央加60ulEB洗脫液，靜置2分鐘，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心 2分鐘，-20°C保存。D、質(zhì)粒DNA的酶切鑒定取IOul質(zhì)粒DNA進(jìn)行雙酶切鑒定，方法如下①酶切體系如下質(zhì)粒DNA IOulIOXBuffer 2ulEcoRI IulDEPC 水 7ul_共計(jì)20ul②混合均勻，旋混幾秒鐘；③37°C水浴2個(gè)小時(shí)。④取5ul產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)。
2.6用TRIZOL試劑盒提取總RNA1)勻漿在Iml的TRIZOL試劑中加50-1 OOmg組織，樣本體積不應(yīng)超過TRIZOL的 10%。用勻漿機(jī)高速勻漿2分鐘。2)(可選)
要分離蛋白、脂肪、多糖或細(xì)胞外物質(zhì)如肌肉、脂肪組織，在勻漿后 2-80C 12000g離心10分鐘。將上清勻轉(zhuǎn)移至一新的Eppendof管。3)分相15-30°C溫育5分鐘，完全解離核蛋白復(fù)合體。力口 0.2ml氯仿，用力搖動(dòng)15秒， 15-30°C放置2-3分鐘。小于12000g 2_8°C離心15分鐘。4) RNA 的沉淀轉(zhuǎn)移水相于一新管。加0.5ml異丙醇，混勻，室溫放置10分鐘。4_8°C 12000g 離心10分鐘(離心前RNA通常不可見，在管壁或管底形成膠樣沉淀)。5) RNA沉淀的洗滌棄上清，每Iml TRIZOL至少加Iml 75%的乙醇洗滌RNA—次。 2_8°C小于 7500g離心5分鐘。6) RNA 的重溶倒掉乙醇，空氣中干燥或真空干燥5-10分鐘。加適當(dāng)?shù)腄EPC處理水，吸打幾 次，放于55-60°C溶解10分鐘。-70°C保存。7) RNA變性電泳在一滅菌微量離心管中混合下列液體，以制備RNA樣品。
權(quán)利要求
1.一種雞脂肪候選基因Lpin2基因，其特征在于該基因的核苷酸序列如SEQ ID No.l所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雞脂肪候選基因Lpin2基因，其特征在于該基因的氨基酸 序列如SEQ ID No.2所示。
3.權(quán)利要求1所述的雞脂肪候選基因Lpin2基因的應(yīng)用方法，其特征在于采用 上述雞脂肪候選基因Lpin2基因序列，與雞基因組序列比對(duì)，針對(duì)存在的變異，采用 PCR-RFLP法，對(duì)雞的總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后用MspI酶進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性檢 測(cè)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述雞脂肪候選基因Lpin2基因的應(yīng)用方法，其特征在于采 用上述雞脂肪候選基因Lpin2基因序列，與雞基因組序列比對(duì)，針對(duì)存在的變異，采用 PCR-RFLP法，用下述引物對(duì)雞的總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后用MspI酶進(jìn)行單核苷酸 多態(tài)性檢測(cè)，正向5' CATAGAATCATGTGCTCCAAAG 3‘反向5' TTACCTAAGGGGCTGAACACT 3‘。檢測(cè)出雞候選基因Lpin2的G444A是G還是A，G等位基因可被MSPI酶切產(chǎn)生一 個(gè)268和25堿基的片段；A等位基因不能被MSPI酶切；AA純合子只產(chǎn)生一個(gè)386的片 段；GG純合子將產(chǎn)生227和149堿基的片段；GA雜合子將產(chǎn)生386、227和149堿基三 種片段。
全文摘要
雞脂肪候選基因Lpin2基因及功能突變檢測(cè)方法，屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明提供的雞脂肪候選基因lpin2基因，的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。雞脂肪候選基因功能突變檢測(cè)方法采用上述雞脂肪候選基因lpin2基因序列，與雞基因組序列比對(duì)，針對(duì)存在的變異，采用PCR-RFLP法，用下述引物對(duì)雞的總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后用MspI酶進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)，正向5′CATAGAATCATGTGCTCCAAAG 3′，反向5′TTACCTAAGGGGCTGAACACT 3′。本發(fā)明巧妙地利用創(chuàng)造酶切位點(diǎn)PCR-RFLP法檢測(cè)SNPs，發(fā)現(xiàn)了影響雞生長(zhǎng)及屠體性狀的功能基因和特異性突變位點(diǎn)。采用標(biāo)記輔助選擇選擇是一大發(fā)展趨勢(shì)。
文檔編號(hào)C12N15/12GK102021174SQ20101026482
公開日2011年4月20日 申請(qǐng)日期2010年8月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月27日
發(fā)明者孫桂榮, 康相濤, 王彥彬, 田亞東, 陳文 , 韓瑞麗, 黃艷群 申請(qǐng)人:黃艷群