專利名稱：一種可改善啤酒起泡性能的啤酒酵母工程菌及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及啤酒釀造技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種可改善啤酒起泡性能的啤酒酵母工 程菌及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
酵母分泌的蛋白酶以及對(duì)泡沫的負(fù)面影響已經(jīng)引起國(guó)內(nèi)外許多研究者的研究興 趣，尤其在國(guó)內(nèi)純生啤酒超高速發(fā)展的情況下，殘留在啤酒中的蛋白酶A(PrA)的活性問(wèn)題 更引起人們重視。純生啤酒由于其口味、營(yíng)養(yǎng)等方面的優(yōu)點(diǎn)已越來(lái)越受到消費(fèi)者的青睞，啤酒泡沫 穩(wěn)定性是衡量啤酒質(zhì)量的重要指標(biāo)，但是目前純生啤酒在貯存過(guò)程中，存在泡沫穩(wěn)定性下 降等問(wèn)題，原因主要是由于純生啤酒中殘留的酵母蛋白酶A對(duì)啤酒泡沫蛋白的降解作用所 致。目前主要通過(guò)調(diào)整發(fā)酵工藝來(lái)改善啤酒泡沫性能，這些手段包括使用糖蛋白含量 高的小麥輔料；調(diào)整制麥、糖化、麥汁過(guò)濾與煮沸工藝；控制發(fā)酵溫度與貯酒條件；適當(dāng)添 加泡沫穩(wěn)定劑或添加酵母PrA抑制劑。采取這些手段所要求的工藝條件較復(fù)雜，而添加劑 又存在安全隱患，不為消費(fèi)者接受，因此都不能從根本上提高啤酒泡沫性能。β-葡聚糖的消極影響也是影響啤酒品質(zhì)的重要因素，雖然制麥過(guò)程中麥芽會(huì)形 成專一性降解β-葡聚糖的內(nèi)β-1，3-1，4-葡聚糖酶，但這種內(nèi)源性β-葡聚糖酶熱穩(wěn)定 性差，其最適溫度為40-45°C，55°C時(shí)即開始失活，在糖化溫度(65°C)下5min酶活性僅存 1%。而且我國(guó)大麥與國(guó)外優(yōu)質(zhì)大麥相比，β-葡聚糖含量高且內(nèi)源性β-葡聚糖酶水平低， β-葡聚糖的消極作用更明顯。目前啤酒生產(chǎn)工業(yè)中主要通過(guò)培育低β-葡聚糖的大麥品種以及添加耐高溫的 外源性葡聚糖酶來(lái)消除或降低葡聚糖的影響。但即使培育出低葡聚糖的大麥 品種作原料，在啤酒釀造時(shí)也仍然要添加外源性β “葡聚糖酶，因此并沒(méi)有從根本上簡(jiǎn)化 啤酒生產(chǎn)的操作工藝。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種啤酒酵母工程菌，利用該菌株進(jìn)行啤酒發(fā)酵解決了傳統(tǒng)酵母發(fā) 酵制得的啤酒殘留蛋白酶A對(duì)啤酒泡沫性能和高含量β _葡聚糖對(duì)啤酒過(guò)濾和穩(wěn)定性帶來(lái) 不利影響的問(wèn)題。一種啤酒酵母工程菌，出發(fā)菌株為釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，該釀酒 酵母染色體上的PEP4基因部分或全部被重組序列替換而破環(huán)，所述的重組序列包括β -葡 聚糖酶基因表達(dá)單元。所述的β -葡聚糖酶基因表達(dá)單元由依次連接的3-磷酸甘油酸激酶基因啟動(dòng)子 序列(PGKlp, Gebank登錄號(hào)CAA42329)、信息素α -因子分泌信號(hào)序列(MFa ls, Gebank登 錄號(hào)ΑΑΑ18405)、β -葡聚糖酶基因序列(bglS，SEQ ID NO. 3)和乙醇脫氫酶基因終止子序列(ADH1T，Gebank 登錄號(hào) CAY86205)組成。所述的重組序列包括來(lái)自質(zhì)粒PUG6的卡拉霉素抗性基因序列(KanMX)。所述的選用來(lái)自釀酒酵母的PGKl強(qiáng)啟動(dòng)子具有增強(qiáng)表達(dá)外源酶基因的特性，所 選用的來(lái)自釀酒酵母的信息素α-因子分泌信號(hào)序列具有較好的引導(dǎo)外源酶基因在酵母 細(xì)胞的分泌和表達(dá)的能力，而所選用的來(lái)自釀酒酵母的乙醇脫氫酶基因終止子序列具有優(yōu) 異的準(zhǔn)確轉(zhuǎn)錄和翻譯功能，上述的表達(dá)單元與酵母基因組的同源性可在一定程度上增加同 源重組整合的機(jī)率，有助于ΡΕΡ4基因的替換和β-葡聚糖酶基因的整合。而所采用的來(lái)自 質(zhì)粒PUG6的卡拉霉素抗性基因不僅具有作為篩選同源重組子的篩選標(biāo)記，而且在分子重 組酵母?jìng)鞔敝尺^(guò)程中具有自動(dòng)丟失功能，以獲得無(wú)抗性基因的分子重組酵母菌。所述的蛋白酶A被替換序列是從第686個(gè)堿基到第1987個(gè)堿基的序列。本發(fā)明將釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)PRAD保藏在位于北京市朝陽(yáng) 區(qū)大屯路中國(guó)科學(xué)院微生物研究所的中國(guó)微生物菌株保藏管理委員會(huì)普通微生物中心 (CGMCC)，保藏日期為2009年04月14日，保藏號(hào)為CGMCC No. 3010。上述保藏菌株的主要生理生化特征細(xì)胞為橢圓形，短軸5 7微米，長(zhǎng)軸7 9 微米，短長(zhǎng)軸之比為1 1.2 1.3，細(xì)胞呈單個(gè)或成對(duì)排列，單個(gè)出芽為主，極少形成芽 簇；菌落形態(tài)特征是菌落凸起、光滑、乳白色、邊緣整齊。生長(zhǎng)最適PH為5. 5。最適生長(zhǎng)溫 度 25-30 0C ο本發(fā)明提供了一種上述啤酒酵母工程菌的構(gòu)建方法，包括以下步驟在重組序列 兩端連接同源臂序列，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)出發(fā)菌株中進(jìn)行同源重組得到。連接重組序列上游的同源臂序列如SEQ NO. 1所示。連接重組序列下游的同源臂序列如SEQN0. 2所示。本發(fā)明又提供了上述啤酒酵母工程菌在制備純生啤酒中的應(yīng)用。本發(fā)明啤酒酵母工程菌通過(guò)將外源枯草芽孢桿菌β -葡聚糖酶基因表達(dá)單元通 過(guò)同源重組技術(shù)將工業(yè)釀酒酵母染色體上ΡΕΡ4基因的部分序列或全部序列替換，蛋白酶A 活性顯著降低，而能穩(wěn)定表達(dá)葡聚糖酶。由于同源重組效率和親緣性差異較大的外源 基因在釀酒酵母中重組表達(dá)，因此給同源重組替換帶來(lái)的是重組效率問(wèn)題，而本發(fā)明設(shè)計(jì) 的來(lái)自釀酒酵母的信號(hào)肽序列、強(qiáng)啟動(dòng)子序列和終止子序列可以高效實(shí)現(xiàn)外源β-葡聚糖 酶基因序列在釀酒酵母中的重組表達(dá)。通過(guò)遺傳穩(wěn)定性和中試發(fā)酵試驗(yàn)證明，該構(gòu)建的啤 酒酵母工程菌不僅遺傳穩(wěn)定性良好，而且具有優(yōu)于出發(fā)菌株的啤酒釀造品質(zhì)，如啤酒泡沫 穩(wěn)定性提高，β “葡聚糖降解率提高，啤酒過(guò)濾速度改善，而且生理性能和生化特性并無(wú)明 顯差異。


圖1為片斷PGKlP、MFa Is在質(zhì)粒pUC18中的克隆，形成質(zhì)粒pUC18_PM示意圖；圖2為片斷bglS、ADHlT在質(zhì)粒pUC18中的克隆，形成質(zhì)粒pUC18-BT示意圖；圖3為bglS基因表達(dá)單元PGKlp-MF a ls_bglS_ADHlT的形成示意圖；圖4為bglS基因表達(dá)單元與KanMX連接形成質(zhì)粒pUC18_KPMBT示意圖；圖5為重組質(zhì)粒YEPlac 181-KPMBT PCR的擴(kuò)增鑒定凝膠電泳圖譜；圖6為重組質(zhì)粒YEPlac 181-KPMBT的雙酶切鑒定凝膠電泳圖譜，泳道1為SmaI+EcoR I雙酶切結(jié)果，泳道2為BamH I+EcoR I雙酶切結(jié)果；圖7為PCR擴(kuò)增到的用來(lái)轉(zhuǎn)化并替換PEP4的片斷的凝膠電泳圖譜(3732bp，1-8 為平行擴(kuò)增)；圖8為重組釀酒酵母菌PRAD的PCR鑒定凝膠電泳圖譜(1. PEP4-Pl+KanMX-P2產(chǎn) 物；2. bglS-Pl+PEP4-P2 產(chǎn)物；3· PEP4-P1+PEP4-P2 產(chǎn)物)；圖9為重組釀酒酵母菌PRAD的遺傳穩(wěn)定性PCR檢測(cè)凝膠電泳圖譜，泳道1_4模板 分別為重組釀酒酵母RPPD、WZ65以及第十代重組釀酒酵母PRAD。
具體實(shí)施例方式1、出發(fā)菌株選用工業(yè)釀酒酵母WZ65(溫州英博雙鹿啤酒有限公司)作為出發(fā)菌株，經(jīng)過(guò)剛果 紅-β -葡聚糖選擇性平板檢驗(yàn)和液體發(fā)酵監(jiān)測(cè)，證明該釀酒酵母不表達(dá)β “葡聚糖酶活， 同時(shí)該工業(yè)酵母經(jīng)過(guò)染色體分離和孢子分離試驗(yàn)，證明其為二倍體。2、bglS同源重組表達(dá)質(zhì)粒載體Y印Iac 181-KPMBT的構(gòu)建及其酶切驗(yàn)證2. 1、同源重組各表達(dá)單元的克隆獲得(l)bglS基因的獲得及其驗(yàn)證 ! . 古胃 $ 包 ff 胃(B. Subtilis) ZJF-1A5 (Construction ofrecombinantindustrial Saccharomyces cerevisiae strain with bglS gene insertion into PEP41ocus by homologous recombination. Journal of Zhejiang University Science B，2008，9 (7) 527-535)的基因組為模板，設(shè)計(jì)下列引物 Agls-P1 =GG AAGCTTCGGCTCAAACAGGTGGATCGTTTTTTG,引入 HindIII 位；bgls_P2 GGGGTACCGCATTATTTTTT TGTATAGCGCACCCJIA KpnI位點(diǎn)；PCR擴(kuò)增該枯草芽孢桿菌中bglS基因，該菌株中的bglS 基因總長(zhǎng)度為729bp，如SEQ ID N0. 3所示，其中前84bp為其信號(hào)肽編碼序列，信號(hào)肽斷裂 位點(diǎn)發(fā)生在丙氨酸(28)處，本實(shí)施例刪掉編碼β _葡聚糖酶信號(hào)肽前26個(gè)氨基酸的78bp 堿基，最終序列如SEQ ID N0. 4所示，該序列也可人工合成。PCR擴(kuò)增β-葡聚糖酶基因序列，PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5min，然后 940C 45s, 500C 45s，72°C lmin,30循環(huán)；最后72°C延伸lOmin。的瓊脂糖電泳顯示擴(kuò)增 得到了 650bp左右基因片斷，與設(shè)計(jì)結(jié)果相符。(2) PGKlp的擴(kuò)增及其獲得提取工業(yè)釀酒酵母WZ65基因組為模板，設(shè)計(jì)以下引物對(duì)PGK Ip-P 1 :CC/GGATCC/CATATG/CTTCAACTCAAGACGCACAG 上游加 BamH I 和 NdeI ；PGK 1P-P2 :GG/TCTAGA/TGTTTTATATTTGTTGTAAAAAGTAG 下游加 Xba I。擴(kuò)增PGKlp, PCR 條件為94°C變性 5min ；94°C 45s, 50°C 45s, 72°C lmin, 30 循環(huán)； 最后72°C延伸lOmin。大小與預(yù)期結(jié)果相符(778bp)。 (3) MF α Is的擴(kuò)增及其獲得提取釀酒酵母WZ65基因組為模板，設(shè)計(jì)下列引物MF α Is-Pl :G/TCTAGA/AGAATGAGATTTCCTTC，引入 XbaI 位點(diǎn)；MF α 1 S_P2 GGCC/AAGCTT/CAGCCTCTCTTTTATC 引入 HindIII 位點(diǎn)；擴(kuò)增MF α Is 片斷，擴(kuò)增條件為 94°C變性 5min ；94°C 45s，50°C 45s，72°C 30s，30 循環(huán)；最后72°C延伸lOmin。大小為273bp，電泳結(jié)果顯示跟設(shè)計(jì)相符。(4) ADHItW擴(kuò)增及其獲得以工業(yè)釀酒酵母WZ65的基因組為模板，設(shè)計(jì)引物對(duì)ADHIt-PI :GG/GGTACC/GCGAATTTCTTATG，引入 Kpn I 位點(diǎn)；ADH 1T-P2 :GG/GAATTC/GCATATCTACAATTGGG，引入 EcoR I 位點(diǎn)；擴(kuò)增ADHIt 終止子片斷，條件為94°C變性 5min ；94°C 45s, 50°C 45s, 72°C 30sec, 30循環(huán)；最后72°C延伸lOmin。電泳顯示擴(kuò)增得到250bp左右的基因片斷，與理論值相符。
(5) KanMX的擴(kuò)增及其獲得以質(zhì)粒pUG6為模板，設(shè)計(jì)引物對(duì)KanMX-Pl GGGGATCCCAGCTGAAGCTTCGTACGC,弓 I 入酶切位點(diǎn) BamHI ；KanMX~P2 :CCCCCGGGGCATAGGCCACTAGTGGATCTG,引入酶切位點(diǎn) Sma I。擴(kuò)增KanMX 片斷，條件為94°C變性 5min ；94°C 45s, 58°C 45s, 72°C 90s, 30 循環(huán)； 最后72°C延伸IOmin02. 2、同源重組表達(dá)單元的構(gòu)建及其驗(yàn)證以質(zhì)粒pUC18為克隆載體，按照pUC18以及設(shè)計(jì)的引物上的酶切位點(diǎn)，將各片斷 分步雙酶切后連接進(jìn)行克隆，最終在PUC18上連接成bgls基因在釀酒酵母中的表達(dá)單元 PGKlp-MF α ls_bglS_ADHlT。每一次連接的程序?yàn)槊盖蠭Oh后凝膠電泳回收；另一酶酶切IOh后凝膠電泳回收；按載體片斷= 1 5連接過(guò)夜后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)；涂加氨芐的LB平板后37°C培養(yǎng)16h;挑取平板上 生長(zhǎng)出的菌落到5mL加氨芐的LB液體培養(yǎng)基，200rpm 37°C水浴振蕩培養(yǎng)12h后提質(zhì)粒；對(duì) 提取的質(zhì)粒進(jìn)行瓊脂糖電泳比對(duì)大小，然后進(jìn)行PCR及雙酶切鑒定。(1)片斷PGKlP、MFa Is在質(zhì)粒pUC18中的克隆如圖1所示，用BamH I和Xba I分步酶切質(zhì)粒pUC18和片斷PGKlp,連接形成質(zhì)粒 pUC 18-P;對(duì)質(zhì)粒pUC 18-P以及MF a Is進(jìn)行Xba I和HindIII分步雙酶切后連接形成質(zhì) 粒 pUC18-PM。(2)片斷bglS、ADHlT在質(zhì)粒pUC18中的克隆如圖2所示，HindIILKpn I分步雙酶切質(zhì)粒pUC18和片斷bglS，連接形成質(zhì) 粒pUC18-B ；Kpn I、EcoR I分步雙酶切質(zhì)粒pUC18_B和終止子片斷ADH1T，連接形成質(zhì)粒 PUC18-BT。(3) bglS 基因表達(dá)單元 PGKlp-MF α ls-bglS_ADHlT 的形成如圖3所示，Nde I、HindIII雙切質(zhì)粒pUC18_PM后回收小片斷，跟Nde I,HindIII 雙切PUC18-BT后的大片斷相連，形成質(zhì)粒pUC18-PMBTl，質(zhì)粒含方向一致的表達(dá)單元片斷 PGKlp-MF α ls_bglS_ADHlT。(4) bglS基因表達(dá)單元與KanMX的連接以構(gòu)建的重組質(zhì)粒pUC18-PMBTl為模板，設(shè)計(jì)引物(EX-PI、EX-P2，分別位于重組 質(zhì)粒PUC18-PMBT1中的bglS基因表達(dá)單元的PGKl啟動(dòng)子上游和ADHl終止子下游)EX-Pl :CCCCCGGGCTTCAACTCAAGACGCACAG，引入酶切位點(diǎn) Sma I ；EX-P2 :GG/GAATTC/GCATATCTACAATTGGG，引入酶切位點(diǎn) EcoR I ；
擴(kuò)增上下游分別帶有Sma I和EcoR I位點(diǎn)的bglS表達(dá)單元片斷，經(jīng)Sma I和EcoR I雙酶切后與經(jīng)同樣雙酶切的質(zhì)粒PUC18連接，形成質(zhì)粒pUC 18-PMBT.以質(zhì)粒pUG6為模板，設(shè)計(jì)引物KanMX-Pl GGGGATCCCAGCTGAAGCTTCGTACGC,弓 I 入酶切位點(diǎn) BamHI ；KanMX~P2 :CCCCCGGGGCATAGGCCACTAGTGGATCTG,引入酶切位點(diǎn) Sma I，擴(kuò)增兩端帶有IoxP位點(diǎn)的KanMX片斷。經(jīng)BamHI和Sma I雙酶切后與同樣雙酶 切(BamHI 和 SmaI)的質(zhì)粒 PUC18-PMBT 相連，形成質(zhì)粒 pUC 18-KPMBT。(5)bglS基因釀酒酵母表達(dá)載體的形成將重組質(zhì)粒pUC 18-KPMBT 中的 KanMX-PGKlp-MF α ls_bglS_ADHlT 片段用內(nèi)切酶 BamHI和EcoR I切下回收，然后與經(jīng)同樣雙酶切的穿梭載體YEPlacl81相連，形成bglS基 因在釀酒酵母中的表達(dá)載體YEPlacl81-KPMBT。2. 3重組表達(dá)質(zhì)粒載體YEPlac 181-KPMBT的PCR、酶切和酶表達(dá)驗(yàn)證(I)PCR 驗(yàn)證以質(zhì)粒 YEPIac 181-KPMBT 為模板，分別用 KanMX-Pl+KanMX-P2、 PGK1p-P1+ADH1t-P2、KanMX-Pl+ADHlT_P2 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增 KanMX、bglS 表達(dá)單元、KanMX+bglS 表達(dá)單元，結(jié)果如圖5所示(理論值分別為1613、1976、3589bp)。(2)雙酶切驗(yàn)證分別以Sma I+EcoR I、BamH I+EcoR I 對(duì)重組質(zhì)粒 YEPlacl81_KPMBT 進(jìn)行雙酶切 鑒定。酶切鑒定結(jié)果如圖6所示，理論值分別為1976+7355bp，3589+5726bp，酶切鑒定結(jié)果 與理論值相符。將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒YEPlac 181-KPMBT送上海生物工程技術(shù)有限公司測(cè) 序，測(cè)序結(jié)果與設(shè)計(jì)一致。(3)表達(dá)單元的轉(zhuǎn)化及其酶活驗(yàn)證提取重組質(zhì)粒YEPlacl81_KPMBT，轉(zhuǎn)化釀酒酵母，然后涂布含200 μ g/mL的YEPD平 板。60h后隨機(jī)挑取生長(zhǎng)出的酵母菌落進(jìn)行保存，在原生長(zhǎng)平板上緩慢倒入5mL瓊脂-地衣 多糖，30°C放置3h后染色，在酵母菌落的周圍觀察到明顯的透明圈，隨即挑取重組酵母菌 在IOmL YEPD培養(yǎng)基中200r/min、30°C培養(yǎng)24h，然后按1/100的接種量轉(zhuǎn)接于IOOmL新的 YEPD培養(yǎng)基中，相同條件培養(yǎng)，每隔8h取樣測(cè)定酶活，培養(yǎng)的上清液為粗酶。結(jié)果顯示，在 轉(zhuǎn)接后很長(zhǎng)的一段時(shí)間內(nèi)測(cè)不到酶活，測(cè)得的較明顯的酶活是在轉(zhuǎn)接后的36h開始，然后 酶活迅速上升，60h時(shí)達(dá)到最高值最高，然后下降，72h后基本穩(wěn)定。該步轉(zhuǎn)化試驗(yàn)證明所構(gòu) 建的表達(dá)單元正確的表達(dá)了枯草芽孢桿菌β -葡聚糖酶基因，并實(shí)現(xiàn)了正確的分泌表達(dá)， 為下一步同源重組替換蛋白酶A基因提供了準(zhǔn)確的表達(dá)單元。3、同源重組表達(dá)單元替換釀酒酵母WZ65中ΡΕΡ4基因構(gòu)建獲得釀酒酵母工程菌株 PRAD及驗(yàn)證3. 1釀酒酵母PRAD的轉(zhuǎn)化構(gòu)建以構(gòu)建獲得的同源重組質(zhì)粒pUC18-KPMBT為模板，用a、b引物(見表1)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，得到轉(zhuǎn)化DNA片段。50 μ 1反應(yīng)體系中，加1 μ lpUC18_KPMBT，四種dNTP各200 μ Μ, 引物各為0. 2μΜ，1. 2mM MgCl2,10XPCR緩沖液5 μ 1及2. 5U的Taq DNA聚合酶。反應(yīng)條 件94°C始變性5min ；循環(huán)30個(gè)周期，每個(gè)周期為94°C變性40s，58°C退火lmin，72°C延伸 3min ；最后72°C終延伸IOmin0
表1基因替換以及重組菌株檢測(cè)中所采用的引物
權(quán)利要求
一種啤酒酵母工程菌，出發(fā)菌株為釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，該釀酒酵母染色體上的PEP4基因部分或全部被重組序列替換而破環(huán)，其特征在于所述的重組序列包括β 葡聚糖酶基因表達(dá)單元。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的啤酒酵母工程菌，其特征在于所述的葡聚糖酶基因表 達(dá)單元由依次連接的3-磷酸甘油酸激酶基因啟動(dòng)子序列、信息素α-因子分泌信號(hào)序列、 β-葡聚糖酶基因序列和乙醇脫氫酶基因終止子序列組成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的啤酒酵母工程菌，其特征在于所述的重組序列包括卡拉霉 素抗性基因序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的啤酒酵母工程菌，其特征在于所述的ΡΕΡ4基因被替換的部 分為第686個(gè)堿基到第1987個(gè)堿基的序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的啤酒酵母工程菌，其特征在于命名為釀酒酵母PRAD，保藏號(hào) 為 CGMCC No. 3010。
6.權(quán)利要求1 5任一所述的啤酒酵母工程菌的構(gòu)建方法，包括以下步驟在重組序 列兩端連接同源臂序列，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)出發(fā)菌株中進(jìn)行同源重組得到。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的構(gòu)建方法，其特征在于連接重組序列上游的同源臂序列如 SEQ ID NO. 1 所示。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的構(gòu)建方法，其特征在于連接重組序列下游的同源臂序列如 SEQ ID NO. 2 所示。
9.權(quán)利要求1 5任一所述的啤酒酵母工程菌在制備純生啤酒中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種啤酒酵母工程菌，出發(fā)菌株為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，該釀酒酵母染色體上的PEP4基因部分或全部被重組序列替換而破環(huán)，所述的重組序列包括β-葡聚糖酶基因表達(dá)單元。本發(fā)明啤酒酵母工程菌通過(guò)將外源β-葡聚糖酶基因表達(dá)單元通過(guò)同源重組技術(shù)將工業(yè)釀酒酵母染色體上PEP4基因的部分序列或全部序列替換，蛋白酶A活性顯著降低，而能穩(wěn)定表達(dá)β-葡聚糖酶。該構(gòu)建的啤酒酵母工程菌不僅遺傳穩(wěn)定性良好，而且具有優(yōu)于出發(fā)菌株的啤酒釀造品質(zhì)，啤酒泡沫穩(wěn)定性和β-葡聚糖降解率提高，啤酒過(guò)濾速度改善，而且生理性能和生化特性并無(wú)明顯差異。
文檔編號(hào)C12N1/19GK101955891SQ20101025793
公開日2011年1月26日 申請(qǐng)日期2010年8月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月20日
發(fā)明者何國(guó)慶, 張強(qiáng), 阮暉, 陳啟和 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)