專利名稱：德國鏡鯉抗逆基因標記及其核心選育群體構(gòu)建方法
技術領域：
本發(fā)明涉及魚類抗逆基因標記及其核心選育群體構(gòu)建方法。
背景技術：
德國鏡鯉原種于1984年由原聯(lián)邦德國引進，該魚是歐洲地區(qū)池塘的主要養(yǎng)殖品 種，特點是人工馴養(yǎng)程度高、生長快、飼料轉(zhuǎn)化率高。但它不適應我國的高密度肥水養(yǎng)殖條 件，抗逆能力低。在農(nóng)業(yè)部和國家經(jīng)委的資助下黑龍江水產(chǎn)研究所對其進行了系統(tǒng)選育，到 1995年選育到第4代的選育系通過了鑒定，抗逆能力有了一定的提高，生長速度比原種快 25%。德國鏡鯉選育系由全國水產(chǎn)原良種審定委員會審定為適宜在全國推廣的良種。目前， 德國鏡鯉選育系作為一個重要鯉魚養(yǎng)殖品種，具有體型好、肉味鮮美、含肉率高、食性雜、耐 低溫、易捕撈、生長快(較普通鯉魚快20%-30%)等優(yōu)點，在我國許多養(yǎng)殖池塘，特別是在北方 地區(qū)該魚深受養(yǎng)殖者和消費者喜愛，其養(yǎng)殖產(chǎn)量和經(jīng)濟效益逐年增加。然而，與我國土著 鯉魚相比，其抗逆能力仍然較差，尤其是隨著近幾年養(yǎng)殖環(huán)境的惡化和高密度養(yǎng)殖需求，自 2000年以來德國鏡鯉選育系在高密度網(wǎng)箱養(yǎng)殖的高溫季節(jié)患病，并發(fā)生大規(guī)模的死亡事件 (死亡率高達90%)，而土著鯉魚未受影響，德國鏡鯉養(yǎng)殖業(yè)受到了巨大的經(jīng)濟損失，嚴重影 響了德國鏡鯉產(chǎn)業(yè)的健康、穩(wěn)定和可持續(xù)性發(fā)展。目前，未見有關德國鏡鯉抗逆相關基因標 記的報道，也未見有關魚類抗逆優(yōu)良品種培育的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了德國鏡鯉抗逆基因標記及其核心選育群體構(gòu)建方法。本發(fā)明德國鏡鯉抗逆基因標記序列為MHC class I的HLJI-9擴增序列和MHC class IIB 的 HLJB 擴增序列，其中 MHC class I 的 HLJI-9 擴增序列為 5，-TGATGGCACCAAG GAGGATACTATCAGTTTGGTTACGATGGAGAGGACTTCCTCAGTCTGGATAAGAGCTCCCTCACCTGGACTGCTGCC AATCCTCAAGCTGTCATTACCA-3，，第 28 個堿基 T 為抗逆基因位點；MHC class IIB 的 HLJB 擴 增序列為 5，-TCCTGTATGGTTGAGCATGCCAGCTTCAGTAAACCCATGATTTATGACTGGGGTAAGATGAGACAC GCAACAGATGTCATATTATAACTGTGTTTGTGGTAAGCATAATTTGACATATGACATATGACATACTCCACAGATCC GTCTCTCCCTGAGTCTGAGAGGAATAAAATTGCTATTGGAGCATTTGGTCTGGTGCTGGGAATCATTATTGCAGCTG CTGGACTCATTTACA-3’，第214個堿基G為抗逆基因位點。本發(fā)明德國鏡鯉核心選育群體構(gòu)建方法如將要進行選育的德國鏡鯉親魚群體應 用電子標記進行標記，結(jié)合已篩選兩個抗逆相關基因位點，根據(jù)已經(jīng)選擇具有抗逆位點的 兩對引物進行擴增、測序和抗逆位點堿基分析，將只在抗逆性差群體中出現(xiàn)的堿基做為抗 逆相關基因標記，剔除攜帶這些抗逆基因標記的個體，不攜帶這些基因標記個體形成核心 選育群體。本發(fā)明通過德國鏡鯉抗逆基因標記，建立了德國鏡鯉抗逆核心選育群體，本發(fā)明 針對性強，不受機體生長發(fā)育階段和環(huán)境條件的影響，構(gòu)建核心選育群體選擇準確，能加速 育種進程，提高育種效率，從而有效的解決德國鏡鯉高溫季節(jié)患病導致大規(guī)模死亡的問題。本發(fā)明為魚類抗逆分子育種選育開辟了一條分子育種技術途徑，對魚類抗逆品種培育具有 重要的意義和價值。
具體實施例方式本發(fā)明技術方案不局限于以下所列舉具體實施方式
，還包括各具體實施方式
間的 任意組合。
具體實施方式
一本實施方式德國鏡鯉抗逆基因標記序列為MHC class I的 HLJI-9擴增序列和MHC class IIB的HLJB擴增序列，其中MHC class I的HLJI-9擴增序 列為 5，-TGATGGCACCAAGGAGGATACTATCAGTTTGGTTACGATGGAGAGGACTTCCTCAGTCTGGATAAGAGCT CCCTCACCTGGACTGCTGCCAATCCTCAAGCTGTCATTACCA-3，，第 28 個堿基 T 為抗逆基因位點；MHC class IIB 的 HLJB 擴增序列為 5，-TCCTGTATGGTTGAGCATGCCAGCTTCAGTAAACCCATGATTTATGAC TGGGGTAAGATGAGACACGCAACAGATGTCATATTATAACTGTGTTTGTGGTAAGCATAATTTGACATATGACATAT GACATACTCCACAGATCCGTCTCTCCCTGAGTCTGAGAGGAATAAAATTGCTATTGGAGCATTTGGTCTGGTGCTGG GAATCATTATTGCAGCTGCTGGACTCATTTACA-3'，第 214 個堿基 G 為抗逆基因位點。本實施方式中德國鏡鯉抗逆基因標記序列通過如下方法獲得的一、德國鏡鯉抗 逆性強和抗逆性差群體樣品的獲得在高密度網(wǎng)箱養(yǎng)殖的德國鏡鯉，在高溫季節(jié)，開始發(fā)生 大規(guī)模的死亡事件，采集死亡個體鰭條作為抗逆性差的群體樣品，待高溫季節(jié)過后，采集存 活下來個體鰭條作為抗逆性強的群體樣品，分別將抗逆性差的群體樣品和抗逆性強的群體 樣品保存于體積濃度為75%的酒精中；二、德國鏡鯉MHC class I和MHC class IIB基因 遺傳多態(tài)性根據(jù)其它親緣關系相近魚類的已知MHC class I和MHC class IIB基因外顯 子和內(nèi)含子的比對結(jié)果，應用oligo 6. O軟件進行引物設計，其中G+C含量一般為40-60%， 盡量避免引物二級結(jié)構(gòu)或二級結(jié)構(gòu)控制在3個連續(xù)堿基以內(nèi)以免形成引物二聚體，對于保 守性相對較低的序列，設計兼并引物；而后再對設計的引物進行篩選，其中引物篩選方法 為PCR擴增反應體系為 15 μ L :10 χ PCR buffer 1. 5 μ L, IOmM dNTP 0. 3 μ L, TaqDNA 聚 合酶0.6U，基因組DNA模板為50ng，上下游引物濃度各0. 15 μ M，滅菌雙蒸水補足體積，基 因組DNA模板先采用5個個體的混合物，初步篩選的引物再經(jīng)過10個個體進行驗證；初步 篩選出5對擴增效果較好的引物，經(jīng)驗證后，3對引物能擴增出穩(wěn)定、清晰的譜帶；步驟二 中引物HLJI-9針對的是外顯子3序列，引物HLJB針對的是外顯子3至外顯子4位點，引 物HLJB5針對的是外顯子3序列。分別提取德國鏡鯉MHC class I和MHC class IIB的 基因組DNA，而后分別進行PCR擴增，然后用電泳檢測，將目的條帶回收、二次擴增，擴增產(chǎn) 物由上海生物工程有限公司直接進行測序，測得到的序列SNP信息直接由軟件Mutation Surveyor讀取，每個SNP位點等位基因頻率、觀測和期望雜合度、Hardy-Weinberg平衡和 連鎖不平衡由軟件POPGENE version 1. 32進行統(tǒng)計，序列之間的比對應用軟件Clustal W，其中，在HLJI-9位點，共鑒定出基因頻率為1. 89%-41. 51%的10個不同基因型，其中在 外顯子3序列上第66(A/C)、67 (T/G)、72 (Α/Τ)和102 (T/C)堿基位點上存在多態(tài)性并 均能改變所編碼的氨基酸，觀測雜合度為0. 0377-0. 3774，平均為0. 1745，所有位點均處于 Hardy-Weinberg平衡下，在第66和72堿基之間存在連鎖不平衡情況(P<0. 05)；在HLJB 位點，經(jīng)比對，與cyca-DAB3*01/ cyca_DAB4*01基因相似度為87. 33%_91· 33%，共鑒定出 基因頻率為2. 94%-11. 76%的28個不同基因型，內(nèi)含子序列長度為85_87bp，外顯子3序列中第 350 (T/C)、374 (T/C)和外顯子 4 第 36 (G/T)、71 (C/T)、74 (C/T)、75 (T/ G)堿基位點上存在多態(tài)性，兩個位點能改變所編碼的氨基酸，外顯子序列觀測雜合度為 0. 1176-0. 4706，平均為0. 3480，所有位點均處于Hardy-Weinberg平衡下；在外顯子4第 71和74堿基之間存在連鎖不平衡情況(P<0. 05)；在HLJB5位點，擴增序列可分為兩個基 因座，第一個共鑒定出基因頻率為3. 85%-26. 92%的9個不同基因型，其中在外顯子序列上 第93 (T/G)、104 (G/A)、170 (G/A)、195 (G/C)、197 (G/C)堿基位點上存在多態(tài)性，其中 3個位點并均能改變所編碼的氨基酸，觀測雜合度為0. 0000-0. 6154，平均為0. 2308，在位 點97和197存在Hardy-Weinberg不平衡(P<0. 001)；在第195和197堿基之間存在連鎖 不平衡情況(P<0. 05)；在HLJB5位點，第二個基因座共鑒定出基因頻率為3. 85%_23. 08%的 11個不同基因型，其中在外顯子序列上第125 (A/T)、127 (A/G)、139 (G/C)、176 (A/ T)、180 (C/T)、198 (A/G)堿基位點上存在多態(tài)性，其中6個位點能改變所編碼的氨基 酸，觀測雜合度為0. 0769-0. 8462，平均為0. 3333 ；位點180處于Hardy-Weinberg不平衡； 在第125和176堿基之間存在連鎖不平衡情況(P<0. 05)；三、德國鏡鯉抗逆相關基因標記 的篩選根據(jù)各多態(tài)堿基在抗逆性差和抗逆性強的個體中的分布，應用SPSS 13. 0軟件進 行各多態(tài)位點抗逆關聯(lián)性分析，經(jīng)分析，在MHC class I序列外顯子3第72堿基，經(jīng)卡方 檢驗，A/T堿基在抗逆性強和抗逆性差個體中分布差異顯著(Pearson c2=4. 046, df =1， P=O. 044)，T堿基在抗逆性強個體中出現(xiàn)頻率為28%，在抗逆性差個體中出現(xiàn)頻率為64. 3%， 在MHC class IIB序列外顯子4第75堿基位點，經(jīng)卡方檢驗，T/G堿基在抗逆性強和抗逆 性差個體中分布差異顯著(Pearson c2=20. 526, df =1，P=O. 000)，G堿基在抗逆性強個體 中出現(xiàn)頻率為0. 0%，在死亡個體中出現(xiàn)頻率為71. 4%，從而獲得了抗逆相關基因標記序列， 并確定了抗逆基因位點，其中步驟二中德國鏡鯉MHC class I基因的PCR引物HLJI-9 上游 引物 5，-TGTTCACTCAGTCCAGCAGA-3，，下游引物 5，-TTGGTAATGACAGCTTGAGG-3，，PCR 反應條 件95°C變性5min，95°C變性30 s、58. 2°C退火30s、72°C延伸30s、共25個循環(huán)，再72°C延 伸5min，4°C保溫；德國鏡鯉MHC class IIB基因的PCR引物為HLJB與HLJB5，HLJB上游引 物 5，-CACTCT/AGAGCTGGAGTACAC-3，，下游引物為 5，-GTAAATGAGTCCAGCAGCTG-3，，PCR 反應 條件95°C變性5min，95°C變性30 s、56. 0°C退火30s、72°C延伸30s、共25個循環(huán)，再72°C 延伸 5min，4°C 保溫，HLJB5 上游引物 5，- A/GTTAC/AA/GCTCAGG/TTC/TAGC/TGAG/AG-3，， HLJB5 下游引物 5，- TCTTCTCTCCAGATTTGGGGG-3，，PCR 反應條件95°C變性 5min，95°C變性 30 S、59. 5°C退火30s、72°C延伸30s、共25個循環(huán)，再72°C延伸5min，4°C保溫；步驟二中 提取DNA的方法為分別將德國鏡鯉采集鰭條從酒精中取出，用蒸餾水洗凈、剪碎，在消化 液(10mmol/L Tris-HCl ρΗ 8. 0，100mmol/L EDTA (ρΗ8· 0)，0. 5% SDS , 100yg/mL 蛋白 酶K)中55 °C徹底消化，再分別用飽和酚、酚/氯仿、氯仿/異戊醇抽提除蛋白、透析、乙醇 沉淀，然后溶解于1/10TE中，并將其濃度調(diào)至50 ng/yL，-20°C保存?zhèn)溆?；步驟二中的鯉魚 MHC class I和MHC class IIB基因已經(jīng)得到克隆。 對步驟三進行驗證對經(jīng)過抗逆性死亡而存活下來個體進行了特定堿基檢測分 析，在MHC class I基因中，在30個個體群體中，T堿基出現(xiàn)頻率為0% ；在500個個體群體 中，T堿基出現(xiàn)頻率39. 6%。在MHC class II基因中，在30個個體群體中，G堿基出現(xiàn)頻率 為2. 8% ；在500個個體群體中，G堿基出現(xiàn)頻率2. 9%。這兩種堿基在存活個體中出現(xiàn)幾率 均較低，與篩選結(jié)果一致，驗證了與抗逆的相關性。
具體實施方式
二 本實施方式德國鏡鯉核心選育群體構(gòu)建方法如將要進行選育 的德國鏡鯉親魚群體應用電子標記進行標記，結(jié)合已篩選兩個抗逆相關基因位點，根據(jù)已 經(jīng)選擇具有抗逆位點的兩對引物進行擴增、測序和抗逆位點堿基分析，將只在抗逆性差群 體中出現(xiàn)的堿基做為抗逆相關基因標記，剔除攜帶這些抗逆基因標記的個體，不攜帶這些 基因標記個體形成核心選育群體。本實施方式所述的德國鏡鯉抗逆基因標記序列為MHC class I的HLJI-9擴增序 列和MHC class IIB的HLJB擴增序列，其中MHC class I的HLJI-9擴增序列為5’ -TGATG GCACCAAGGAGGATACTATCAGTTTGGTTACGATGGAGAGGACTTCCTCAGTCTGGATAAGAGCTCCCTCACCTGGA CTGCTGCCAATCCTCAAGCTGTCATTACCA-3，，第 28 個堿基 T 為抗逆基因位點；MHC class IIB 的 HLJB 擴增序列為 5，-TCCTGTATGGTTGAGCATGCCAGCTTCAGTAAACCCATGATTTATGACTGGGGTAAGAT GAGACACGCAACAGATGTCATATTATAACTGTGTTTGTGGTAAGCATAATTTGACATATGACATATGACATACTCCA CAGATCCGTCTCTCCCTGAGTCTGAGAGGAATAAAATTGCTATTGGAGCATTTGGTCTGGTGCTGGGAATCATTATT GCAGCTGCTGGACTCATTTACA-3'，第214個堿基G為抗逆基因位點。本實施方式通過德國鏡鯉抗逆基因標記，建立了德國鏡鯉抗逆核心選育群體，本 發(fā)明針對性強，不受機體生長發(fā)育階段和環(huán)境條件的影響，構(gòu)建核心選育群體選擇準確，能 加速育種進程，提高育種效率，從而有效的解決德國鏡鯉高溫季節(jié)患病導致大規(guī)模死亡的 問題。本實施方式為魚類抗逆分子育種選育開辟了一條分子育種技術途徑，對魚類抗逆品 種培育具有重要的意義和價值。
權(quán)利要求
德國鏡鯉抗逆基因標記，其特征在于德國鏡鯉抗逆基因標記序列為MHC class I 的HLJI 9擴增序列和MHC class IIB的HLJB擴增序列，其中MHC class I 的HLJI 9擴增序列為5' TGATGGCACCAAGGAGGATACTATCAGTTTGGTTACGATGGAGAGGACTTCCTCAGTCTGGATAAGAGCTCCCTCACCTGGACTGCTGCCAATCCTCAAGCTGTCATTACCA 3'，第28個堿基T為抗逆基因位點；MHC class IIB的HLJB擴增序列為5' TCCTGTATGGTTGAGCATGCCAGCTTCAGTAAACCCATGATTTATGACTGGGGTAAGATGAGACACGCAACAGATGTCATATTATAACTGTGTTTGTGGTAAGCATAATTTGACATATGACATATGACATACTCCACAGATCCGTCTCTCCCTGAGTCTGAGAGGAATAAAATTGCTATTGGAGCATTTGGTCTGGTGCTGGGAATCATTATTGCAGCTGCTGGACTCATTTACA 3'，第214個堿基G為抗逆基因位點。
2.德國鏡鯉核心選育群體構(gòu)建方法，其特征在于德國鏡鯉核心選育群體構(gòu)建方法如 下將要進行選育的德國鏡鯉親魚群體應用電子標記進行標記，結(jié)合已篩選兩個抗逆相關 基因位點，根據(jù)已經(jīng)選擇具有抗逆位點的兩對引物進行擴增、測序和抗逆位點堿基分析，將 只在抗逆性差群體中出現(xiàn)的堿基做為抗逆相關基因標記，剔除攜帶這些抗逆基因標記的個 體，不攜帶這些基因標記個體形成核心選育群體。
全文摘要
德國鏡鯉抗逆基因標記及其核心選育群體構(gòu)建方法。本發(fā)明提供了德國鏡鯉抗逆基因標記及其核心選育群體構(gòu)建方法。德國鏡鯉抗逆基因標記序列為MHCclassI的HLJI-9擴增序列和MHCclassIIB的HLJB擴增序列；方法如下采用基因標記和電子標記相結(jié)合的方法，將選育群體進行電子標記，根據(jù)基因標記檢測結(jié)果，將只在抗逆性差群體中出現(xiàn)的堿基做為抗逆相關基因標記，篩選不攜帶這些抗逆基因標記的個體，構(gòu)建核心選育群體。本發(fā)明構(gòu)建的核心選育群體能夠解決德國鏡鯉高密度網(wǎng)箱養(yǎng)殖高溫季節(jié)患病導致大規(guī)模死亡的問題，本發(fā)明對魚類抗逆品種培育具有重要的意義和價值。
文檔編號C12N15/11GK101892319SQ201010248328
公開日2010年11月24日 申請日期2010年8月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月9日
發(fā)明者李池陶, 石連玉, 賈智英 申請人:中國水產(chǎn)科學研究院黑龍江水產(chǎn)研究所