專利名稱：微生物菌體的保存方法及微生物菌體的混懸液的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過將具有腈水合酶活性的微生物菌體以規(guī)定濃度在菌體混懸液中 保存來穩(wěn)定地保存該微生物菌體的方法。此外，本發(fā)明還涉及以規(guī)定濃度含有具有腈水 合酶活性的微生物菌體的菌體混懸液。
背景技術(shù)：
微生物產(chǎn)生的酶在很多情況下作為化學(xué)轉(zhuǎn)化反應(yīng)的酶而使用。尤其是通過利用 具有腈基的水合或水解作用的腈水合酶、腈水解酶等，可以廉價(jià)地生產(chǎn)在化學(xué)工業(yè)上重 要的酰胺、羧酸、α-羥基羧酸等。此外，通過利用具有光學(xué)特異性的水合能力或光學(xué) 特異性的水解能力的上述酶，也可以生產(chǎn)作為醫(yī)藥、農(nóng)藥的生產(chǎn)原料的重要的光學(xué)活性 羧酸、氨基酸、α-羥基羧酸等。在將微生物酶作為催化劑的化學(xué)轉(zhuǎn)化反應(yīng)中，有必要將培養(yǎng)及收集的微生物菌 體穩(wěn)定保存至使用之時(shí)。即，在保存時(shí)不能出現(xiàn)由于混入雜菌、腐敗或是溶菌而使微生 物酶的催化能力失去或降低。因此，一般情況下，通過使用穩(wěn)定劑、代謝阻礙劑和高濃 度鹽類來抑制微生物菌體保存時(shí)微生物酶的失活、腐敗和溶菌，從而應(yīng)用于化學(xué)轉(zhuǎn)化反 應(yīng)中。在不添加上述穩(wěn)定劑的情況下，已知可以通過凍結(jié)、冷藏或持續(xù)攪拌來維持酶的 活性，同時(shí)進(jìn)行保存。例如，對(duì)于具有腈水合酶活性的微生物，已知有在含有高濃度的無機(jī)鹽類的水 溶液中保存的方法(專利文獻(xiàn)1)、通過凍結(jié)進(jìn)行保存的方法(專利文獻(xiàn)2)等。參考文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)[專利文獻(xiàn)1]日本專利第3163224號(hào)[專利文獻(xiàn)2]日本特開第2003-219870號(hào)公報(bào)

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明所要解決的課題在這些保存方法中，使用含有高濃度的無機(jī)鹽類的水溶液的方法因?yàn)樵诤罄m(xù)的 工序中需要進(jìn)行洗滌等，故有對(duì)產(chǎn)品的品質(zhì)造成影響之虞，且生產(chǎn)方法也繁雜。此外， 通過凍結(jié)來保存的方法中，存在凍結(jié)、融解操作很繁雜等操作性上的問題，且伴隨著此 操作，有酶活性失去或下降之虞。解決課題的手段本發(fā)明者們對(duì)廉價(jià)且穩(wěn)定地保存培養(yǎng)、收集得到的微生物菌體的混懸液的條件 進(jìn)行了深入的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過將菌體濃縮為4 20質(zhì)量％的范圍的濃度，可在目前 通常情況下還基本未考慮的在室溫下，且無需攪拌也不引起溶菌和酶失活地穩(wěn)定保存， 從而完成本發(fā)明。即，本發(fā)明涉及微生物菌體的保存方法，其特征在于，將具有腈水合酶活性的微生物菌體，以干燥菌體質(zhì)量為4 20質(zhì)量％的濃度在分散介質(zhì)中保存。此外，本發(fā)明 還涉及以干燥菌體質(zhì)量為4 20質(zhì)量％的菌體濃度含有具有腈水合酶活性的微生物菌體 的微生物菌體的混懸液。發(fā)明效果依據(jù)本發(fā)明，通過將菌體混懸液中含有的微生物菌體的濃度控制在一定范圍 內(nèi)，可以在室溫下、即使不攪拌也不出現(xiàn)腐敗或酶的劣化而維持腈水合酶等的酶活性的 情況下，長時(shí)間保存大量菌體。此外，依據(jù)本發(fā)明，能夠提供在使用微生物菌體時(shí)無需 洗滌、可大幅削減現(xiàn)有的保存方法所必需的勞動(dòng)力和成本、在工業(yè)上令人滿意的微生物 菌體的保存方法。發(fā)明的實(shí)施方式以下，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的說明。以下的實(shí)施方式，是用于說明本發(fā)明的示 例，但本發(fā)明并不僅限于此實(shí)施方式。只要不脫離其原理，可以以各式各樣的形態(tài)來實(shí) 施。需要說明的是，本說明書中引用的全部文獻(xiàn)和公開公報(bào)、專利公報(bào)以及其它的 專利文獻(xiàn)，均作為參考包含于本說明書中。此外，本說明書包含2009年7月24日提交 的作為本申請(qǐng)優(yōu)先權(quán)主張的基礎(chǔ)的日本國專利申請(qǐng)(日本特愿2009-173162號(hào))的說明書 中記載的內(nèi)容。本發(fā)明中的具有腈水合酶活性的微生物菌體，具有生產(chǎn)作為目的的酶催化物并 在菌體內(nèi)積蓄或分泌至菌體外的性質(zhì)。此微生物中含有從自然界中分離出的微生物以及 基因重組微生物。作為這樣的微生物的代表例，可舉例例如具有腈水合酶活性的屬于紅 球菌屬(Rhodococcus) >戈登菌屬(Gordona)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、假諾卡氏菌 屬(Pseudonocardia)、地芽孢桿菌屬(Geobacillus)的微生物菌體。此外，還可舉例引入了 這些微生物的腈水合酶基因的重組微生物菌體。其中，在工業(yè)上優(yōu)選紅球菌屬、戈登菌 屬及引入了這些微生物的腈水合酶基因的重組大腸桿菌及重組紅球菌屬細(xì)菌。例如，作 為紅球菌屬微生物的具體實(shí)例，可舉例日本特公平6-55148號(hào)公報(bào)記載的紫紅紅球菌J-I 株(Rhodococcus rhodochrous J-1)。該株以委托編號(hào) “FERM BP-1478” 于 1987 年 9 月 18日保藏于國家高級(jí)工業(yè)科學(xué)技術(shù)學(xué)院國際專利生物保藏中心(茨城縣筑波市東1-1-1中 央第6(本說明書中下同))中。所謂腈水合酶是指具有水解腈化合物、生成對(duì)應(yīng)的酰胺化合物的能力的酶。 作為編碼腈水合酶的核酸及其序列的實(shí)例，可舉例前述專利文獻(xiàn)2記載的例子。這 類核酸通過通常的分子生物學(xué)方法即可導(dǎo)入微生物細(xì)胞內(nèi)(有關(guān)這些分子學(xué)的方 法，參考如下Sambrook, Fritsch and Maniatis, "Molecular Cloning A Laboratory Manual” 2ndEdition (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press)。以干燥菌體計(jì)，保存時(shí)的菌體混懸液的濃度為4質(zhì)量％以上，優(yōu)選5質(zhì)量％以 上?，F(xiàn)已知在不足4質(zhì)量％的低濃度的情況時(shí)，在室溫下的活性降低?？紤]其原因，認(rèn) 為若在菌濃度高達(dá)一定程度的液體中的密集狀態(tài)下，在菌體表面具有抑制其它菌的生長 發(fā)育的機(jī)能，或是具有某種抑制其它菌體生長發(fā)育的物質(zhì)。在不足4質(zhì)量％的低濃度的 情況下，不能出現(xiàn)這種效果，混懸液中雜菌易發(fā)生增殖，認(rèn)為由于雜菌生成的氮氧化物 等而使菌體遭受損傷。且在不足4質(zhì)量％的低濃度的情況下，認(rèn)為由于粘度較低，因此菌體可以自由地做布朗運(yùn)動(dòng)，菌體之間的沖突頻發(fā)，菌體自身損傷，酶活力下降。因此，通過使菌濃度在4質(zhì)量％以上，室溫下的保存穩(wěn)定性變得良好，但若超 過20質(zhì)量％，菌體混懸液的流動(dòng)性降低，因此作為液體的處理變困難，不適于保存 搬 運(yùn)。故，以干燥菌體計(jì)，保存時(shí)的菌體混懸液的濃度為4 20質(zhì)量％、優(yōu)選5 15質(zhì) 量％、更優(yōu)選5 10質(zhì)量％。所謂“干燥菌體”是指在實(shí)質(zhì)上不含有水的微生物菌體的干燥物，但某些場(chǎng)合 下含有菌體以外的殘存混懸液成分。干燥菌體例如通過使菌體混懸液在120°C的干燥器中 干燥3小時(shí)而獲得。所謂“干燥菌體濃度(干燥菌體質(zhì)量(％))”是用菌體混懸液中含有的菌體干 燥質(zhì)量的比率來表示的，具體而言，從菌體混懸液在120°C的干燥機(jī)中干燥3小時(shí)的干燥 前后的質(zhì)量比(百分率(菌體干燥殘?jiān)壤埃ァ?)中減去將菌體混懸液分離為微生 物菌體層和實(shí)質(zhì)上不含有菌體的液層時(shí)的該液層同樣地干燥時(shí)的干燥前后的質(zhì)量比(百 分率上清鹽濃度“％” )而求得的。本發(fā)明中的“保存”是指在儲(chǔ)罐和容器中保管菌體混懸液。此時(shí)，為了不使儲(chǔ) 罐和容器內(nèi)的濃度不均勻，可進(jìn)行攪拌和通氣。在不易形成濃度分布的菌體混懸液的情 況下，不進(jìn)行攪拌和通氣，靜置即可。在本發(fā)明中，因?yàn)椴恍枰獢嚢韬屯猓蕛?yōu)選靜置。本發(fā)明中的“靜置”是指不進(jìn)行攪拌和通氣，將菌體混懸液保存在儲(chǔ)罐和容器 中。保存可在室溫下進(jìn)行。但為了抑制菌體及酶的腐敗 分解，優(yōu)選在分解介質(zhì)不凍結(jié) 的范圍內(nèi)的較低溫。具體而言，指冰點(diǎn) 35°C，優(yōu)選冰點(diǎn) 30°C，更優(yōu)選冰點(diǎn) 20°C， 進(jìn)一步優(yōu)選冰點(diǎn) 10°C。此處，所謂“冰點(diǎn)”是指菌體混懸液的固體狀態(tài)和液體狀態(tài)的 平衡溫度，是依照混懸液的組成(分散介質(zhì)的種類、濃度、菌體的濃度等)和保存容器內(nèi) 的壓力不同而變化的溫度。因此，菌體混懸液在冰點(diǎn)以上的溫度下保存時(shí)，維持不凍結(jié) 的狀態(tài)。保存時(shí)間可以為1日以上，但本發(fā)明的效果在保存3日以上的情況下比較顯著， 故可優(yōu)選3日以上、更優(yōu)選5日以上的長期保存。依照本發(fā)明的方法保存微生物菌體時(shí)，前述微生物菌體的腈水合酶的活性在保 存前后并無實(shí)質(zhì)上的變化。所謂微生物菌體的腈水合酶的活性“在保存前后并無實(shí)質(zhì) 性的變化”是指相對(duì)于保存前的腈水合酶的活性，保存后的腈水合酶的活性維持在70% 以上，優(yōu)選維持在75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、91%以上、92%以上、 93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、100%以 上。腈水合酶的活性可以使用本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)公知的任一方法進(jìn)行測(cè)定，例如，可以 通過比較保存開始前和保存后對(duì)基質(zhì)(例如，丙烯腈)的丙烯酰胺生成反應(yīng)速度等來測(cè)定。在本發(fā)明中，所謂混懸液的分散介質(zhì)是指在作為保存對(duì)象的微生物菌體的混懸 中所使用的溶液。該分散介質(zhì)優(yōu)選有機(jī)酸的水溶液。該有機(jī)酸水溶液的有機(jī)酸濃度是任 意的，但過低時(shí)會(huì)導(dǎo)致酶活性的降低，另一方面，過高時(shí)會(huì)導(dǎo)致后續(xù)過程中將其除去時(shí) 的工序繁雜，故優(yōu)選10 100mM。
在本發(fā)明中的分散介質(zhì)的組成，只要是不阻礙酶活性的有機(jī)酸水溶液即可，并 無特別的規(guī)定。作為有機(jī)酸，可列舉例如，丙烯酸、甲酸、醋酸、丙酸、丁酸、草酸等 羧酸類，其中，從維持丙烯酰胺的品質(zhì)這一點(diǎn)考慮，優(yōu)選丙烯酸。在本發(fā)明的混懸液的配制中，具有腈水合酶活性的微生物菌體可以使用該技術(shù) 領(lǐng)域內(nèi)公知的任一濃縮方法進(jìn)行濃縮，但優(yōu)選膜分離或離心分離來進(jìn)行濃縮。使用膜分 離進(jìn)行濃縮的情況下，優(yōu)選使用具有0.02 0.45 μ m孔徑的膜。此類膜可以為市售的， 可列舉例如中空纖維膜組件(Kuraray會(huì)社，細(xì)孔徑0.05 μ m，表面積39000m2)等。此 外，使用離心分離進(jìn)行濃縮的情況下，優(yōu)選使用分離板型連續(xù)離心分離機(jī)。以下，使用實(shí)例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方法進(jìn)行更加詳細(xì)的說明，但這些實(shí)施例的目 的是本發(fā)明的示例，而本發(fā)明并不僅限于此。在以下的實(shí)施例及比較例中的％表示的是 質(zhì)量％。
實(shí)施例實(shí)施例1 (室溫保存)培養(yǎng)在500ml的三角燒瓶中配制含有葡萄糖2%、尿素1%、蛋白胨0.5%、酵母提取 物0.3%、氯化鈷0.05%的培養(yǎng)基(PH7.0) 100ml，通過高壓釜于121°C下滅菌20分鐘。 在此培養(yǎng)基中接種具有腈水合酶活性的紫紅紅球菌J-I株(Rhodococcus rhodochrous J-I FERM BP-1478)，在 30°C、230rpm 下培養(yǎng) 66 小時(shí)。菌體混懸液的干燥菌體質(zhì)量測(cè)定將培養(yǎng)后的菌體混懸液約Ig采集至鋁盤中并稱量。并在12000rpm下將菌體緩 沖液離心分離20分鐘，用濾膜(Advantec社，細(xì)孔徑0.45 μ m)過濾上清10g，置于鋁盤 中并稱量。分別通過干燥器(Yamato科學(xué)會(huì)社生產(chǎn)，DN63)于120°C下干燥3小時(shí)后， 對(duì)它們進(jìn)行稱量。對(duì)于菌體混懸液和上清，將干燥后的質(zhì)量用相對(duì)于干燥前的質(zhì)量的百 分率表示，求出干燥菌體質(zhì)量。保存用菌體混懸液的配制通過離心分離(1200rmp，20分鐘)將培養(yǎng)后的微生物菌體沉淀后，使用0.1%的 丙烯酸鈉水溶液(PH7.0)再混懸 再離心分離，反復(fù)操作3次后，再次使用0.1%的丙烯 酸鈉水溶液(pH7.0)將沉淀菌體混懸，得到以干燥菌體質(zhì)量為8.0%的菌體混懸液(實(shí)施 例1)。將此菌體混懸液的一部分用0.1%的丙烯酸鈉水溶液稀釋，得到干燥菌體質(zhì)量為 3.4%的菌體混懸液(比較例1)。腈水合酶活性的測(cè)定、腈水合酶的活性如下得到使用通過上述方法剛剛配制的菌體混懸液(第0日) 和同樣地配制的菌體混懸液在室溫(15 20°C )下靜置、保存5日而得到的混懸液(5日 后)，通過這些混懸液內(nèi)含有的菌體引起的丙烯酰胺生成反應(yīng)速度來計(jì)算。將作為基質(zhì)的 丙烯腈的水溶液添加至菌體混懸液中即可啟動(dòng)反應(yīng)，10°C下震蕩10分鐘后，通過菌體的 過濾分離和磷酸的添加而終止反應(yīng)，用氣相色譜儀(GC-14B，島津制作所)進(jìn)行分析。 分析條件為使用填充了 Porapack PS (Waters會(huì)社)的Im玻璃柱，柱溫為210°C，檢測(cè)器 用 230 °C 的 FID0
本發(fā)明中的腈水合酶的酶活性用1分鐘內(nèi)Img菌體產(chǎn)生的丙烯酰胺的量(ymol)來測(cè)定，以下以O(shè)日的反應(yīng)速度為100%的相對(duì)反應(yīng)速度比在表1中顯示。[表1]
權(quán)利要求
1.微生物菌體的保存方法，其特征在于，將具有腈水合酶活性的微生物菌體以干燥 菌體質(zhì)量為4 20質(zhì)量％的濃度保存在分散介質(zhì)中。
2.權(quán)利要求1的方法，其中，前述保存方式是在35°C以下且不凍結(jié)的狀態(tài)下靜置保存。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中，前述分散介質(zhì)為有機(jī)酸水溶液。
4.權(quán)利要求3的方法，其中，前述有機(jī)酸為丙烯酸。
5.權(quán)利要求1 4中任一項(xiàng)的方法，其特征在于，前述微生物菌體的腈水合酶活性在 保存前后并無實(shí)質(zhì)性變化。
6.權(quán)利要求1 5中任一項(xiàng)的方法，其中，具有腈水合酶活性的微生物為屬于紅球菌 屬(Rhodococcus)的微生物。
7.權(quán)利要求6的方法，其中，具有腈水合酶活性的微生物為紫紅紅球菌J-I株 (Rhodococcus rhodochrous J-1)(委托編號(hào)FERM BP-1478)或紫紅紅球菌 M8 株(委托 編號(hào)VKPM S-926)。
8.微生物菌體的混懸液，其以干燥菌體質(zhì)量為4 20質(zhì)量％的菌體濃度含有具有腈 水合酶活性的微生物菌體。
全文摘要
本發(fā)明提供提供代替現(xiàn)有技術(shù)的廉價(jià)且簡(jiǎn)便的微生物菌體保存用混懸液及保存方法。本發(fā)明涉及微生物菌體的保存方法，其特征在于，將具有腈水合酶活性的微生物菌體以干燥菌體質(zhì)量為4～20質(zhì)量％的濃度保存在分散介質(zhì)中。
文檔編號(hào)C12N1/00GK102010826SQ20101024730
公開日2011年4月13日 申請(qǐng)日期2010年7月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月24日
發(fā)明者竹內(nèi)雅人 申請(qǐng)人:大野綠水株式會(huì)社