專利名稱：酶解蛋白過程中抗氧化肽活性保護及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及動植物蛋白的開發(fā)利用領(lǐng)域，特指在蛋白酶解制備抗氧化肽過程中通 過使用充入保護氣體隔絕氧氣，以保護產(chǎn)品抗氧化活性和蛋白酶催化活性的制備方法。
背景技術(shù)：
許多研究證實，氧化與人類及其他動物的許多疾病諸如癌癥、老化、動脈硬化等的 發(fā)病機理有關(guān)?？寡趸钚噪氖且活惥哂幸种粕锎蠓肿舆^氧化或清除體內(nèi)自由基功效的 生物活性肽。近些年國內(nèi)外很多學(xué)者以植物蛋白或動物蛋白為原料，進行抗氧化肽的制備研 究。許多食物源蛋白水解后可產(chǎn)生有較強抗氧化活性的肽，蛋白的氨基酸殘基側(cè)鏈通常包 含疏水性、抗氧化性基團如羥基、酚羥基、巰基同時這些基團提供較強的供氫能力。蛋白質(zhì) 的疏水基團導(dǎo)致分散性減弱，不易水解，以往研究已經(jīng)證實，采用酶控制水解技術(shù)是制備大 量天然抗氧化肽最安全有效的方法。但在迄今所有的研究中，蛋白酶解過程均是在開放體 系下完成的，由于蛋白所含的羥基、酚羥基、巰基等活性基團易受氧化等因素影響而降低活 性，并且會造成蛋白在酶解過程中分散性降低，從而影響水解效率和效果；同時蛋白酶本身 所含巰基、疏水基等活性基團，這些往往是酶的活性部位，與催化活性有密切關(guān)系，在開放 體系酶解中同樣面臨被氧化導(dǎo)致酶活降低的問題。因此，肽的抗氧化活性保護和酶活性保 護成為抗氧化肽制備過程中需要高度重視和亟待解決的難題。本發(fā)明針對上述問題對酶解 體系中蛋白酶及產(chǎn)物的抗氧化活性進行保護，減少這些基團氧化失活的機會，使產(chǎn)物肽抗 氧化活性比傳統(tǒng)酶解方法得到提高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服蛋白質(zhì)酶解過程中使用的蛋白酶和制得的抗氧化肽被氧 化導(dǎo)致的產(chǎn)物抗氧化活性降低以及部分蛋白質(zhì)分散性差等技術(shù)難題，從而提供一種酶解過 程中抗氧化肽和蛋白酶活性保護及其制備方法。本發(fā)明的技術(shù)方案一種酶解蛋白過程中抗氧化肽活性保護及其制備方法，以動 植物蛋白或動物血液為原料，通過加蛋白酶進行酶法水解，同時添加微量的巰基乙醇、亞硫 酸鈉或巰基乙胺等巰基保護劑改善蛋白分散性，在水解過程中充入N2、CO2或其他惰性氣體 等為保護氣體隔絕水解液與氧氣的接觸，對酶解過程中肽的抗氧化活性和蛋白酶分子的活 性進行保護，制備高活性的抗氧化肽。酶解過程中抗氧化肽活性保護及其制備方法，該方法的具體步驟為1.樣品液制備取一定量的上述蛋白樣品加入終濃度為0. 005 0. 06% (W V) 的巰基保護劑配制成2% 10%濃度(W V)的蛋白液，并加HCL或者NaOH溶液調(diào)整并維 持PH為3 10，以保護酶與蛋白的巰基，同時改善易結(jié)塊蛋白的分散性。2.保護酶解將制備好樣品液放入可以密閉的反應(yīng)釜中，然后以[E]/[S]= 0. 5 10%迅速加入蛋白酶，立刻密封反應(yīng)釜；并抽去反應(yīng)釜內(nèi)的空氣，直至反應(yīng)釜內(nèi)壓力降為10mm/Hg時，通入N2、C02或惰性氣體等保護氣體至常壓；開動攪拌器攪拌，在反應(yīng)釜溫 度30 65°C，pH3 10，反應(yīng)釜密閉條件下，酶解2 12h。水解結(jié)束后，沸水浴滅酶IOmin。3.抗氧化肽制備將水解液過濾、濃縮，然后經(jīng)過冷凍干燥、真空干燥或噴霧干 燥，即為抗氧化活性肽產(chǎn)品。本發(fā)明的有益效果采用本發(fā)明方法制備得到的肽產(chǎn)品為白色或淡黃色粉末、無 異味，抗氧化活性強。經(jīng)實驗驗證，以玉米醇溶蛋白為原料制備得到的抗氧化肽產(chǎn)品中總氮 收率93%以上，相比同條件下的開放體系酶解，其DPPH自由基清除活性和ABTS自由基清除 活性分別提高了 35 50%以上和10 15%以上；以膠原蛋白為原料時，保護酶解與開放 體系酶解的產(chǎn)物相比，總抗氧化活性提高了 15 45%以上，酶解速度加快15 35%;以鹿 茸血為原料時，保護酶解與開放體系酶解的產(chǎn)物相比，總抗氧化活性提高了 25%以上。說明 采取適當(dāng)?shù)谋Ｗo方法可以有效防止酶解過程抗氧化肽的活性損失和蛋白酶分子的活性損 失，能夠制得具有較高活性的產(chǎn)品。
具體實施例方式實施例1:1.玉米醇溶蛋白懸濁液制備稱取80g玉米醇溶蛋白粉于3L燒杯中，加入2L經(jīng) 過超聲脫氣的0. 03%亞硫酸鈉溶液，在室溫下攪拌加堿(1N的NaOH)，調(diào)整并維持pH在9. O
左右穩(wěn)定。2.保護酶解將制備好的玉米醇溶蛋白懸濁液放入帶有攪拌器、PH計、溫度計和 溶解氧電極的5L的反應(yīng)釜內(nèi)，迅速加入1. 6mL堿性蛋白酶(酶活1. 6*105U/mL)立刻密封反 應(yīng)釜；開動真空泵抽去反應(yīng)釜內(nèi)的空氣(至反應(yīng)釜內(nèi)壓力降為10mm/Hg)，再通入氮氣，至常 壓，開動攪拌器攪拌，并開始升溫至55 °C，保持4h。酶解期間自動進樣口自動加堿，保持pH 穩(wěn)定9. O。水解結(jié)束后，沸水浴滅酶lOmin。取出水解液放在冰浴里迅速冷卻后，以12000r/ min 4°C離心15min，取上清液。3.抗氧化肽產(chǎn)品制備將上步制得的上清液超濾、蒸發(fā)濃縮后冷凍干燥，即為抗 氧化活性肽產(chǎn)品。該成品的總氮收率在93%以上；相比同條件下的開放體系酶解，其DPPH自由基清 除活性和ABTS自由基清除活性分別提高50%以上和14%以上。實施例2:1.膠原蛋白懸濁液制備稱取50g膠原蛋白溶解于IL經(jīng)過超聲脫氣的0.005%巰 基乙醇溶液中，用HCL調(diào)整并維持pH3.0至穩(wěn)定，配制成5% (W V)的蛋白懸濁液。2.保護酶解將底物懸濁液移至反應(yīng)釜中，以[E]/[S] = 5% (酶活8. 0*104U/g) 加入酶后密閉反應(yīng)釜，抽真空后通入二氧化碳至常壓；開動攪拌器攪拌，并開始升溫并維持 在55°C，pH3. O。保持4h。水解結(jié)束后沸水浴滅酶IOmin結(jié)束反應(yīng)，取出水解液放在冰浴里 迅速冷卻后，以12000r/min在4°C離心15min，取上清液。3.抗氧化肽產(chǎn)品制備將上步制得的上清液超濾、蒸發(fā)濃縮后冷凍干燥，即為抗 氧化活性肽產(chǎn)品。該成品的總氮收率在95%以上；相比同條件下的開放體系酶解，水解速度加快 10%，而水解液總抗氧化活性提高15%以上。
實施例3:1.馬鹿茸血樣品液制備稱取50g馬鹿茸血，加入0. 005%二硫蘇糖醇500mL，配 成濃度為10% (W V)的馬鹿茸血樣品液。2.保護酶解將樣品液在100°C水浴IOmin后移入反應(yīng)釜內(nèi)，以氫氧化鈉溶液調(diào)至 PH 7，以[E]/[S] =6. 5%加入中性蛋白酶(酶活10. 82X 104U/g)，加入酶后密閉反應(yīng)釜，抽 真空后通入氦氣至常壓；開動攪拌器攪拌，在50°C反應(yīng)2h，煮沸IOmin滅活酶，迅速冷卻至 45°C以下，以[E]/[S] =9%加入木瓜蛋白酶(酶活14. 10X104u/g)，再次抽真空后通入氦 氣至常壓；反應(yīng)4h(pH 6. 8)，煮沸IOmin后冷卻，將水解液以12000rpm/min離心lOmin，收 集上清液。3.抗氧化肽產(chǎn)品制備將上步制得的上清液超濾、蒸發(fā)濃縮后冷凍干燥，即為抗 氧化活性肽產(chǎn)品。該成品的總氮收率在95%以上；相比同條件下的開放體系酶解，水解液總抗氧化 活性提高25%以上。應(yīng)用例1 以紫外線照射建立UVB小鼠皮膚損傷模型，日糧中添加10 25g/kg體重保護酶 解的骨膠原水解產(chǎn)物肽，可顯著提高免疫器官指數(shù)、皮膚水分及羥脯氨酸含量，降低耳指數(shù) 及皮膚厚度；有效降低血液及皮膚的自由基水平，并對氧化應(yīng)激造成的GSH-Px、SOD,CAT活 力的下降、總抗氧化能力的降低、MDA含量的升高具有顯著的改善作用，從而減輕UVB照射 造成的皮膚老化損傷以及機體的免疫、抗氧化系統(tǒng)損傷。
權(quán)利要求
一種酶解過程中抗氧化肽活性保護及其制備方法，其特征在于分別以N2、CO2或惰性氣體為酶解過程中的保護氣體以及亞硫酸鈉、巰基乙醇、巰基乙胺或二巰基化合物等巰基保護劑，改善蛋白分散性，保護蛋白酶及其水解過程中產(chǎn)生的抗氧化肽活性基團，提高酶解效率。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于使用的蛋白原料中植物蛋白為玉米 蛋白、玉米醇溶蛋白、大豆蛋白、大豆醇溶蛋白、小麥蛋白、小麥醇溶蛋白，大米蛋白、米糠蛋 白等，動物蛋白為膠原蛋白、乳清蛋白等，動物血液豬血、牛血、馬鹿茸血等。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述使用的蛋白酶包括來源于動物、 植物、微生物的內(nèi)切蛋白酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的內(nèi)切蛋白酶為堿性蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜 蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶等。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述酶解過程中充入的保護氣體為氮 氣、二氧化碳?xì)怏w和氦氣等惰性氣體。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法其特征在于所述使用的巰基保護劑為亞硫酸鈉、 巰基乙醇、巰基乙胺、二硫蘇糖醇或二巰基化合物等。
全文摘要
酶解過程中抗氧化肽活性保護及其制備方法，屬于動植物蛋白的開發(fā)利用領(lǐng)域。本發(fā)明以動物、植物蛋白和動物血液為原料，通過在酶解過程中采取充入保護氣體和添加巰基保護劑的處理方法，以提高蛋白溶解性和酶解效率，保護蛋白酶活性和抗氧化肽活性，制成高活性的抗氧化肽產(chǎn)品。本方法制得的抗氧化肽產(chǎn)品在制備時間、抗氧化活性等方面均比使用傳統(tǒng)方法制得的產(chǎn)品有明顯的提高。該產(chǎn)品具有極佳的抗氧化活性，適宜在保健品、高級營養(yǎng)食品、化妝品、動物飼料和動物食品等領(lǐng)域的應(yīng)用。
文檔編號C12P21/06GK101914604SQ20101024227
公開日2010年12月15日 申請日期2010年8月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月2日
發(fā)明者樂國偉, 施用暉, 田許, 馬淑鳳 申請人:江南大學(xué)