專利名稱：一種快速檢測多種甜瓜病毒的引物組和試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于植物病毒學技術領域，特別是涉及一種快速檢測多種甜瓜病毒的引物 組和試劑盒。
背景技術：
我國是西瓜的主要生產(chǎn)國之一，每年西瓜種植面積平均在1800萬畝以上，種植面 積居世界第一位。其中西北地區(qū)為我國重要的西瓜優(yōu)質產(chǎn)區(qū)。病毒病在西瓜生產(chǎn)上是一種 普遍發(fā)生且危害性很大的病害，一般年份發(fā)病比率為10% 30%，重發(fā)年份可高達50% 80%以上。西瓜病毒病的大面積發(fā)生，造成西瓜大量減產(chǎn)，品質下降，將會嚴重影響了西瓜 的高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)、優(yōu)質、高效益及瓜農的生產(chǎn)積極性。侵染西瓜的病毒主要有以下5種黃瓜花葉病毒(Cucumber mosaicvirus, CMV)、 ItiliE口十__ (Squash mosaic virus, SqMV)(Tobaccomosaic virus, TMV) > 西瓜花葉病毒(Watermelon mosaic virus,WMV)禾口小西萌聲黃花葉病毒(Zucchini yellow mosaic virus, ZYMV)，而且在田間病毒會經(jīng)常發(fā)生復合感染。目前，用于西瓜病毒的檢測方法，有生物學、電鏡觀察、血清學、RT-PCR和核酸雜 交，但由于生物學檢測法周期長，電鏡操作需要一定技能，不易進行大量樣本的集中處理， 同時儀器費用高，所以生物學方法和電鏡檢測在西瓜病毒檢測中存在很大局限性。盡管血 清學方法得到了廣泛應用，但商品化的抗血清價格較高，一種抗血清只能檢測一種病毒，而 且還具有一定的假陽性反應等問題。單重RT-PCR(sRT-PCR)和核酸雜交檢測方法一個反應 只能檢測一種病毒，而田間西瓜病毒多是復合侵染，所以用這兩種方法檢測要耗費較多時 間和試劑。為了保證西瓜生產(chǎn)的產(chǎn)量和質量，準確鑒定西瓜病毒病，西瓜生產(chǎn)上急需一種較 為準確、靈敏和快速的病毒檢測弓I物和試劑盒。

發(fā)明內容
本研究針對陜西省西瓜病害發(fā)生的現(xiàn)狀，運用根據(jù)5種病毒核苷酸保守區(qū)序列設 計的特異性引物對，從影響多重RT-PCR(M-PCR)擴增的引物濃度、Mg2+濃度、Taq DNA聚合 酶濃度、dNTPs濃度、退火溫度等方面進行多重RT-PCR體系的優(yōu)化，建立能從西瓜葉片組織 中同時檢測CMV、SqMV, TMV, WMV和ZYMV 5種病毒復合侵染田間樣品的引物組和試劑盒。為解決上述技術問題，本發(fā)明提供了一種同步檢測2-5種甜瓜病毒的引物組，該 引物組包含如下5對引物中的2-5對引物第1 對引物=CMV-F(SEQ ID NO. 1)/CMV-R(SEQ ID NO. 2)SEQ ID Ν0· 1:5' -ATTGGTCGTCCCACTCTT-3'SEQ ID NO. 2:5' -TCGCCAAACATAGCAGAG-3'第2 對引物SqMV-F (SEQ ID NO. 3)/SqMV-R (SEQ ID NO. 4)SEQ ID NO. 3:5' -AGGCACATTTCGCAGTTC-3'SEQ ID NO. 4:5' -CGATGGTTGCCTTTATGT-3'
第3 對引物TMV-F(SEQ ID NO. 5)/TMV_R(SEQ ID NO. 6)SEQ ID NO. 5:5' -GCCGACCCAATAGAGTTA-3'SEQ ID NO. 6:5' -GAGGTCCAAACTAAACCAGAAG-3'第4 對引物WMV-F (SEQ ID NO. 7)/WMV-R(SEQ ID NO. 8)SEQ ID NO. 7:5' -CCAGTGGCAAAGGTGATA-3'SEQ ID NO. 8:5' -TGCTGCGTCTGAGAAATG-3'第5 對引物ZYMV-F(SEQ ID NO. 9)/ZYMV-R(SEQ ID NO. 10)SEQ ID NO. 9:5' -GGAGCGGAAACAAGTGAA-3'SEQ ID NO. 10 5' -ACCTGCTCATTCCCATCC-3'。優(yōu)選地，引物組中包含5對引物SEQ ID NO. I-IO0其中甜瓜病毒為黃瓜花葉病毒(CMV)、南瓜花葉病毒(SqMV)、煙草花葉病毒 (TMV)、西瓜花葉病毒(WMV)和小西葫蘆黃花葉病毒(ZYMV)。本發(fā)明還提供了一種同步檢測2-5種甜瓜病毒的試劑盒，該試劑盒包含5對引物 SEQ ID N0. 1-10。上述試劑盒中的5對引物濃度比例為第1對引物第2對引物第3對引物第 4 對引物第 5 對引物=1. 2-1. 6 0.8-1.2 0.8-1.2 0.8-1.2 1.3-1. 7，優(yōu)選地， 五對引物濃度比例為第1對引物第2對引物第3對引物第4對引物第5對引物= 1:1:1:1:1。上述試劑盒中，還包dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR緩沖液。其中dNTPs濃度為 0. 10-0. 6mmol/L ；Taq DNA 聚合酶濃度為 0. 05-0. 5U/ μ L ；Mg2+ 濃度為 1. 0-3. 5mmol/L,優(yōu)選 地 dNTPs 濃度為 0. 4mmol/L,Taq DNA 聚合酶濃度為 0. 20U/μ L，Mg2+濃度為 3. Ommo 1/L, PCR 緩沖液濃度為0.8X至IX。上述同步檢測2-5種甜瓜病毒的引物組和試劑盒的使用是按照包含如下步驟的 方法使用1)病毒總RNA的提取提取感染1-5種病毒的甜瓜葉中的病毒總RNA ；2)多重 RT-PCR 應用SEQ ID N0. 2、4、6、8、10(第1-5對引物中反向引物序列)對病毒總RNA進行 逆轉錄制備cDNA模板，然后應用SEQ ID NO. 1_10 (第1_5對引物中的正向和反向序列)對 cDNA模板進行多重PCR反應，得擴增產(chǎn)物；3)電泳檢測對擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，獲得病毒基因擴增產(chǎn)物條帶，判定煙草病毒種 類。上述方法還可以包含如下步驟4)結果分析將條帶中的基因與質粒進行體外連接，挑取陽性克隆，提取質粒測序，與設計的 PCR產(chǎn)物大小比較，分析所得序列與參考序列的同源率，判定多重RT-PCR檢測結果的可靠 性。該方法中所述的物質應用上述引物組和試劑盒。
上述方法中，多重PCR反應中，退火溫度為46-51 °C，延伸時間為20s-90s，循環(huán)次 數(shù)為25-45次，優(yōu)選地，擴增條件為退火溫度51°C，延伸時間60s，循環(huán)次數(shù)35次。甜瓜病毒病常為復合侵染，本研究經(jīng)過多次優(yōu)化和摸索條件建立了同時檢測五種 甜瓜病毒的多重PCR的引物組和試劑盒。應用這些引物組和試劑盒的技術在甜瓜復合感染 病毒的檢測中，具有節(jié)省時間、降低成本、提高效率優(yōu)點。在甜瓜栽培生產(chǎn)中，能夠即快速、 準確又簡便和經(jīng)濟的檢測出幼苗帶毒情況，以便盡早采取有效防治措施，對控制病害在田 間的發(fā)生、減少經(jīng)濟損失、抗病篩選和病害流行預測具有十分重要的意義。在國內同時檢測 多種甜瓜病毒病害幾乎沒有報道。這項技術已成功的應用于田間甜瓜病害復合侵染的同步 檢測。


圖1實驗室條件下用所建立的多重RT-PCR體系檢測五種單一(樣品1、樣品2、樣 品3、樣品4、樣品5)及混合的甜瓜病毒(樣品6)；圖2是檢測陜西省楊凌、韓城、禮泉、扶風、周至、武功6個地區(qū)甜瓜樣品上的甜瓜 病毒(樣品1、樣品2、樣品3、樣品4、樣品5、樣品6)的電泳檢測結果
具體實施例方式為了理解本發(fā)明，下面以實施例進一步說明本發(fā)明，但不限制本發(fā)明。引物的設計和制備根據(jù)GenBank上登錄的CMV、SqMV、TMV、WMV和ZYMV病毒外殼蛋白基因序列 (EF202597. UDQ868881. UDQ352454. UDQ399708. UAY611022. 1)，應用 Primier 5. 0 引物 設計軟件分別設計這5種病毒的特異引物。由于多重PCR要求在同一個退火溫度下同時擴 增多個目的片段，因此利用軟件DNAMAN計算引物Tm值，對設計的大量引物進行篩選，選擇 Tm值較一致的各條引物，保證在同一個退火溫度下同時檢測到WMV、CMV、SqMV, TMV和ZYMV 5 種病原 CMV-F (SEQ ID NO. 1)/CMV-R (SEQ ID NO. 2)、SqMV-F (SEQ ID NO. 3)/SqMV-R (SEQ ID NO. 4)、TMV-F (SEQ ID NO. 5)/TMV-R(SEQ ID NO. 6),WMV-F(SEQ ID NO. 7)WMV-R(SEQ ID NO. 8)和 ZYMV-F (SEQ ID NO. 9)/ZYMV-R (SEQ ID NO. 10)。每個引物的信息如下表 1 所示表1引物序列SEQ ID N0. 1-10的信息 上述引物由北京賽百盛公司合成。本發(fā)明的實施例中所用到的實驗材料如下ZYMV, WMV, TMV、SqMV和CMV 5種毒原分別在甜瓜上接種繁殖，保存于_80°C冰箱 中。Taq盒為優(yōu)晶生物工程有限公司產(chǎn)品，克隆載體pMDIS-T simple vector、分子生物學 菌株材料購自TaKaRa (大連)生物有限公司。實施例1單重RT-PCR檢測陜西楊凌5種單一甜瓜病毒樣品 分別采取6個樣品ZYMV、WMV, TMV、SqMV, CMV及5種病毒混合感染的甜瓜葉，樣 品標號為樣品1、樣品2、樣品3、樣品4、樣品5、樣品6。病毒總RNA的提取分別稱取ZYMV、WMV, TMV、SqMV, CMV及5種病毒混合感染的甜瓜葉(分別標記為 樣品2、樣品3、樣品4、樣品5、樣品6)各0. 5g放入-80°C深凍研缽中加液氮充分研磨，迅速 轉入到無RNase的無菌1. 5mL印pendorf管中，加入500 μ L苯酚/氯仿(1 1)和500 μ L RNA 抽提緩沖液(Tris-HC120mmol/L，SDSl %, NaCl 200mmol/L, EDTA50mmol/L)，充分振蕩 2min，4°C，12，OOOg離心5min。上清用等體積苯酚/氯仿再抽提一次，4°C，12，OOOg離心 5min。上清加入等體積4M LiCl，4°C沉淀4h以上，于4°C，12，OOOg離心15min。棄上清液， 沉淀用70%預冷的乙醇洗滌兩次，充分干燥后溶于30 μ L DEPC處理的ddH20中_20°C保存 備用。同時以健康煙草(標記為樣品1)總RNA為陰性對照，提取方法同上。逆轉錄(RT)反應分別對每種病毒的總RNA進行逆轉錄反應。用M-MLV反轉錄酶反轉錄合成各病 毒cDNA第一鏈。25yLRT反應體系如下2yL總RNA，lyL病毒特異反向引物(IOymol/ L)，7 μ LDEPC-H2O, 70 "C 變性 5min，迅速置冰上 5min ；再加入 5yL 5 X RT buffer, 5 μ LdNTP (2. 5mmol/L each)，0. 5 μ LRNase 抑制劑(40U/ μ L)禾口 1 μ L M-MLV 反轉錄酶 (200U/ μ L)，離心后，42°C水浴lh, 95°C滅活5min,置冰上待用。PCR 反應25 μ L PCR 標準反應體系12· 3μ L ddH20, 2. 5 μ L 10XPCR buffer [750mmol/ LTris-HCl (pH 8. 8) , 200mmol/L (NH4) 2S04, 0. 1 % Tween 20]，2 μ L25mmol/LMgCl2， 2 μ LdNTP(2. 5m mol/L each)，2 μ L正向和反向引物混合物(各 10 μ mol/L)，0. 2 μ LTaq DNA 聚合酶(5U/y L)和2μ L RT產(chǎn)物。PCR反應循環(huán)參數(shù)94°C預變性3min ；94°C變性45s， 46°C退火45s，72°C延伸lmin，循環(huán)30次；最后72°C終止補償延伸lOmin。取5μ LPCR產(chǎn)物 經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分析比較。電泳檢測取5 μ L PCR反應產(chǎn)物進行2%瓊脂糖凝膠電泳，在0. 5 X TAE緩沖液環(huán)境中，110V 穩(wěn)壓電泳40min，然后用凝膠成像系統(tǒng)觀察并記錄結果，分別得到5條特異性條帶，得到每 種病毒的擴增引物條帶位置，參見說明書附圖中的圖1。實施例2多重RT-PCR檢測陜西楊凌多種病毒感染的甜瓜病毒樣品病毒總RNA的提取分別對來自陜西楊凌、韓城、禮泉、扶風、周至和武功六個地方的甜瓜花葉病樣品 (分別標記為樣品1、樣品2、樣品3、樣品4、樣品5、樣品6)各0. 5g放入-80°C深凍研缽中 加液氮充分研磨，迅速轉入到無RNase的無菌1. 5mL印pendorf管中，加入500 μ L苯酚/氯仿(1 1)和 500 μ LRNA 抽提緩沖液(Tris-HCl 20mmol/L, SDSl %, NaCl 200mmol/L, EDTA50mmol/L)，充分振蕩2min，4°C，12，OOOg離心5min。上清用等體積苯酚/氯仿再抽提 一次，4°C，12，OOOg離心5min。上清加入等體積4M LiCl，4°C沉淀4h以上，于4°C，12，OOOg 離心15min。棄上清液，沉淀用70%預冷的乙醇洗滌兩次，充分干燥后溶于30 μ L DEPC處 理的ddH20中_20°C保存?zhèn)溆?。多重逆轉錄(RT)反應分別對每個病毒樣品的總RNA進行逆轉錄反應。用M-MLV反轉錄酶反轉錄合成各 病毒cDNA第一鏈。25 μ L RT反應體系如下15yL總RNA，2yL 5種病毒特異反向引物混 合物(各1(^11101/1)，7口1^ DEPC-H2O, 70°C 變性 5min，迅速置冰上 5min ；再加入5 μ L 5 X RT buffer, 5 μ LdNTP (2. 5mmol/L each)，0. 5 μ LRNase 抑制劑(40U/ μ L)禾口 1 μ L M-MLV 反轉錄 酶(20(^/1^)，離心后，421水浴lh，95°C滅活5min，置冰上待用。多重PCR反應25 μ L PCR 標準反應體系12· 3μ L ddH20, 2. 5 μ L 10XPCR buffer [750mmol/ LTris-HCl (pH 8. 8), 200mmol/L (NH4) 2S O4,0. 1 % Tween 20]，3 μ LMgCl2 (25mmol/L)， 4 μ LdNTP (各 2. 5m mol/L)，5 對特異性引物各 0· 4 μ L (各 10 μ mol/L)，0. 2 μ L Taq DNA 聚 合酶(5U/y L)和2μ L RT產(chǎn)物。PCR反應循環(huán)參數(shù)94°C預變性3min ；94°C變性45s，46°C 退火45s，72°C延伸lmin，循環(huán)30次；最后72°C終止補償延伸lOmin。取5μ LPCR產(chǎn)物經(jīng) 2%瓊脂糖凝膠電泳分析比較。電泳檢測取5 μ L PCR反應產(chǎn)物進行2%瓊脂糖凝膠電泳，在0. 5 X TAE緩沖液環(huán)境中，IlOV 穩(wěn)壓電泳40min，然后用凝膠成像系統(tǒng)觀察并記錄結果，分別得到5條特異性條帶，得到每 種病毒的擴增引物條帶位置，參見說明書附圖中的圖2。PCR產(chǎn)物序列分析割膠回收經(jīng)多重PCR 擴增的 ZYMV、WMV、TMV、SqMV 和 CMV 條帶，與 pMD18_T simple vector進行體外連接，挑取陽性克隆，提取質粒測序。測序結果表明，ZYMV、WMV, TMV、SqMV 和CMV的擴增產(chǎn)物分別由542、485、410、354、293個核苷酸組成，與設計的PCR產(chǎn)物大小相 同，分別為ZYMV、WMV, TMV、SqMV和CMVCP基因的部分序列。序列同源性分析結果表明，所 得序列與參考序列的同源率分別達到98. 63%,99. 24%,99. 91%,98. 32和99. 02%.證明 了多重PCR檢測結果的可靠性。本發(fā)明的方法已經(jīng)通過具體的實施例進行了描述。本領域技術人員可以借鑒本發(fā) 明的內容適當改變原料、工藝條件等環(huán)節(jié)來實現(xiàn)相應的其它目的，其相關改變都沒有脫離 本發(fā)明的內容，所有類似的替換和改動對于本領域技術人員來說是顯而易見的，都被視為 包括在本發(fā)明的范圍之內。
權利要求
一種同步檢測2 5種甜瓜病毒的引物組，該引物組包含如下5對引物中的2 5對引物第1對引物CMV F(SEQ ID NO.1)/CMV R(SEQ ID NO.2)SEQ ID NO.15′ ATTGGTCGTCCCACTCTT 3′SEQ ID NO.25′ TCGCCAAACATAGCAGAG 3′第2對引物SqMV F(SEQ ID NO.3)/SqMV R(SEQ ID NO.4)SEQ ID NO.35′ AGGCACATTTCGCAGTTC 3′SEQ ID NO.45′ CGATGGTTGCCTTTATGT 3′第3對引物TMV F(SEQ ID NO.5)/TMV R(SEQ ID NO.6)SEQ ID NO.55′ GCCGACCCAATAGAGTTA 3′SEQ ID NO.65′ GAGGTCCAAACTAAACCAGAAG 3′第4對引物WMV F(SEQ ID NO.7)/WMV R(SEQ ID NO.8)SEQ ID NO.75′ CCAGTGGCAAAGGTGATA 3′SEQ ID NO.85′ TGCTGCGTCTGAGAAATG 3′第5對引物ZYMV F(SEQ ID NO.9)/ZYMV R(SEQ ID NO.10)SEQ ID NO.95′ GGAGCGGAAACAAGTGAA 3′SEQ ID NO.105′ ACCTGCTCATTCCCATCC 3′。
2.根據(jù)權利要求1所述的引物組，該引物組中包含5對引物SEQIDNO. I-IO0
3.根據(jù)權利要求1或2所述的引物組，其中甜瓜病毒為黃瓜花葉病毒(CMV)、南瓜花葉 病毒(SqMV)、煙草花葉病毒(TMV)、西瓜花葉病毒(WMV)和小西葫蘆黃花葉病毒(ZYMV)。
4.一種同步檢測2-5種甜瓜病毒的試劑盒，該試劑盒包含5對引物SEQ IDN0. 1_10。
5.根據(jù)權利要求4所述的試劑盒，其中5對引物濃度比例為第1對引物第2對引物 第 3對引物第4對引物第 5對引物=1. 2-1. 6 0. 8-1. 2 0. 8-1. 2 0. 8-1. 2 1. 3-1 .7。
6.根據(jù)權利要求5所述的試劑盒，其中5對引物濃度比例為第1對引物第2對引物 第3對引物第4對引物第5對引物=1 1 1 1 1。
7.根據(jù)權利要求4所述的試劑盒，其中還包dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg2+、PCR緩沖液。
8.根據(jù)權利要求7所述的試劑盒，其中dNTPs濃度為0.10-0. 6mmol/L TaqDNA聚合酶 濃度為 0. 05-0. 5U/ μ L ；Mg2+ 濃度為 1. 0-3. 5mmol/L。
9.根據(jù)權利要求7或8所述的試劑盒，其中dNTPs濃度為0.4mmol/L, Taq DNA聚合酶 濃度為0. 20U/ μ L，Mg2+濃度為3. Ommol/L, PCR緩沖液濃度為0. 8Χ至1 X。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種快速檢測多種甜瓜病毒的引物組和試劑盒，運用根據(jù)5種病毒核苷酸保守區(qū)序列設計的特異性引物對SEQ ID NO.1-10，從影響多重RT-PCR(M-PCR)擴增的引物濃度、Mg2+濃度、Taq DNA聚合酶濃度、dNTPs濃度、退火溫度等方面進行多重RT-PCR體系的優(yōu)化，建立能從西瓜葉片組織中同時檢測CMV、SqMV、TMV、WMV和ZYMV 5種病毒復合侵染田間樣品的引物組和試劑盒。應用這些引物組和試劑盒的技術在甜瓜復合感染病毒的檢測中，具有節(jié)省時間、降低成本、提高效率優(yōu)點。
文檔編號C12Q1/70GK101906485SQ20101023275
公開日2010年12月8日 申請日期2010年7月21日 優(yōu)先權日2010年7月21日
發(fā)明者吳云鋒 申請人:西北農林科技大學