專利名稱：一種微生物發(fā)酵生產(chǎn)恩拉霉素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微生物發(fā)酵生產(chǎn)恩拉霉素的方法，屬于生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
恩拉霉素(Enramycin)，又名安來霉素，是由土壤中分離出來的放線菌 Streptomyces fungicidious NO. B5477發(fā)酵產(chǎn)生的一種多肽類抗生素。恩拉霉素因其強(qiáng) 大的殺菌作用而被命名為Enduracidin，之后世界衛(wèi)生組織(WHO)確定其通用名為恩拉霉 素。恩拉霉素是一種有機(jī)堿，其鹽酸鹽為白色結(jié)晶性粉末，分子量約為2500，融點(diǎn)為238 245°C。本品易溶于稀鹽酸和二甲亞砜，可溶于甲醇、含水乙醇，難溶于乙醇和丙酮，不溶于 苯、氯仿等。恩拉霉素的化學(xué)結(jié)構(gòu)可通過部分水解肽鍵的方法測定。現(xiàn)已證實，恩拉霉素 是由包括13個不同種類的17個氨基酸分子和脂肪酸分子所組成，其中氨基酸分子構(gòu)成環(huán) 狀多肽結(jié)構(gòu)，脂肪酸位于多肽結(jié)構(gòu)末端。據(jù)其末端脂肪酸種類不同，得到A、B兩種組分，即 A(C107H138C12N26O31)和B(Cltl8H14ciC12N26O31)15恩拉霉素則是由這兩種組分組成的混合物。作為 一種全新的多肽類抗生素飼料添加劑，恩拉霉素被世界上許多國家推薦使用。目前，恩拉霉素生產(chǎn)通常采用傳統(tǒng)的斜面培養(yǎng)，接種環(huán)挖塊接種搖瓶，搖瓶再接種 子罐的工藝，制種工藝繁瑣，染菌幾率高，發(fā)酵結(jié)果不穩(wěn)定，重復(fù)性差。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對上述生產(chǎn)恩拉霉素工藝的不足，提供了一種工藝簡單、發(fā)酵產(chǎn)量高的 微生物發(fā)酵生產(chǎn)恩拉霉素的方法。本發(fā)明是通過以下措施來實現(xiàn)的以往生產(chǎn)恩拉霉素的方法是通過斜面培養(yǎng)和搖瓶培養(yǎng)制備菌種的，但是斜面培養(yǎng) 保藏時間短、不穩(wěn)定，需要循環(huán)不斷的制作篩選高產(chǎn)斜面。本發(fā)明對傳統(tǒng)的工藝進(jìn)行了改 進(jìn)，優(yōu)化了制種過程，通過液氮環(huán)境凍存的方法使制得的菌種可以長期保存，這樣可以一次 性制備大量的菌種，省去了繁瑣的重復(fù)制種步驟，縮短了生產(chǎn)時間；且本工藝發(fā)酵結(jié)果穩(wěn) 定，重復(fù)性好，恩拉霉素產(chǎn)量大，可達(dá)8500 μ g/ml以上(HPLC)。本發(fā)明所用的菌株為殺真菌素鏈霉菌(Sti^ptomyces fungicidicus) SDSL1205, 已于2010年6月21日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保 藏號為 CGMCCNo. 3933。該SDSL1205菌株是通過以下幾個階段選育出來的一、從野生菌Str印tomyces fungicidicus SDSLl號菌出發(fā)，經(jīng)連續(xù)紫外誘變得到 比出發(fā)菌株產(chǎn)量提高203%的236號高產(chǎn)菌株。二、將236號高產(chǎn)菌株經(jīng)連續(xù)的鏈霉素抗性篩選，得到較236菌株產(chǎn)量提高191% 的417菌株。鏈霉素抗性篩選過程為將鏈霉素按照30 200ug/ml的濃度添加至平板培養(yǎng)基 中，制作成平板，121°C滅菌30分鐘。利用該鏈霉素抗性篩選平板篩選抗鏈霉素的菌株，培
3養(yǎng)溫度27 30°C，培養(yǎng)時間6 7天。平板培養(yǎng)基組分為可溶性淀粉9-13g/L、酵母浸膏 1. 5-2. 2g/L、瓊脂 18-20g/L，培養(yǎng)基 pH6. 8-7. 0。三、將417菌株經(jīng)多輪亞硝基胍誘變，結(jié)合鏈霉素抗性篩選得到SDSL959菌株，較 417菌株產(chǎn)量提高96%。四、SDSL959菌株經(jīng)多輪自然分純，鏈霉素抗性篩選得到SDSL1205菌株，產(chǎn)量達(dá)到 8500U/ml 以上。本發(fā)明的技術(shù)方案如下一種微生物發(fā)酵生產(chǎn)恩拉霉素的方法，包括以下步驟(1)制備凍存孢子液a.將殺真菌素鏈霉菌CGMCCNo. 3933接種到多個平板培養(yǎng)基上進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，得 到大量殺真菌素鏈霉菌孢子；所得孢子具有灰色、圓形、中間有小突起特征；b.將上述得到的孢子刮到甘油水溶液中，打散混勻制成孢子液，將孢子液分裝在 凍存管中在液氮環(huán)境中冷凍保存，待用；每毫升孢子液中含LOXlO8-L OX IO9個殺真菌素 鏈霉菌孢子；(2)種子培養(yǎng)將凍存孢子液接種到種子培養(yǎng)基中，每30L培養(yǎng)基接種l_2ml凍存 孢子液，培養(yǎng)得種子液，種子液中的固形物占種子液總量的20-30體積％ ；(3)發(fā)酵培養(yǎng)按4_6wt%的接種量將種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；發(fā)酵完畢，發(fā)酵液經(jīng)過濾得菌絲體，菌絲體用甲醇浸提，再經(jīng)離心分離得浸提液， 浸提液經(jīng)濃縮、結(jié)晶得到恩拉霉素結(jié)晶。本發(fā)明第一步中制得的凍存孢子液可長期保存，可以一次性制備大量的孢子液供 后期使用，省去了繁瑣的重復(fù)制種步驟，縮短了生產(chǎn)時間。上述的生產(chǎn)恩拉霉素的方法中，步驟(1)中凍存孢子液還可以用來制備新的凍存 孢子液，其步驟為①用生理鹽水梯度稀釋凍存孢子液，將稀釋的凍存孢子液接種到多個平板培養(yǎng)基 上進(jìn)行培養(yǎng)，得到大量孢子；②將得到的孢子刮到甘油水溶液中，打散混勻制成孢子液，孢子液分裝在凍存管 中在液氮環(huán)境中進(jìn)行冷凍保存，待用，每毫升孢子液中含LOXlO8-L OX IO9個殺真菌素鏈 霉菌孢子。上述步驟①的具體步驟為將凍存孢子液梯度稀釋至原先濃度的10_8_10_12倍，在 此濃度范圍內(nèi)取5個梯度的稀釋孢子液分別接種到5個平板培養(yǎng)基上進(jìn)行平板培養(yǎng)，接種 量均為0. Imlo上述制備凍存孢子液的過程中，每個平板制得的孢子液裝20-30支凍存管，每支 凍存管裝Iml孢子液。上述生產(chǎn)恩拉霉素的方法中，平板培養(yǎng)的條件為平板培養(yǎng)基成分可溶性淀粉 9-13g/L、酵母浸膏 1. 5-2. 2g/L、瓊脂 18_20g/L，培養(yǎng)基 ρΗ6· 8-7. 0，27_28°C下培養(yǎng) 6-7 天。上述生產(chǎn)恩拉霉素的方法中，種子培養(yǎng)基組分及各組分的濃度為玉米粉 3. 0-3. 5wt %、玉米漿 2. 8-3. Owt %、棉籽餅粉 0. 3-0. 5wt %、玉米蛋白粉 0. 5-lwt %、硫 酸銨 0. 25-0. 75wt %、硫酸亞鐵 0. 036-0. 043wt %、磷酸二氫鉀 0. 1-0. 125wt %、碳酸鈣 1. 5-2. 0wt%、泡敵 0. 025-0. 05wt%，水余量，培養(yǎng)基 pH7. 0-7. 5。
上述生產(chǎn)恩拉霉素的方法中，種子培養(yǎng)條件為在27. 5-28. 5 °C，通氣量 1. 0-1. Ivvm,轉(zhuǎn)速 200-250rpm 下培養(yǎng) 46_50h。上述生產(chǎn)恩拉霉素的方法中，發(fā)酵培養(yǎng)基的組分及各組分濃度為葡萄糖 3. 6-4. Owt %、玉米淀粉 1. 8-2. Owt %、玉米漿 2. 0-2. 2wt%、玉米蛋白粉 2. 8-3. 0wt%、棉籽 餅粉 1. 0-1. 2wt%、氯化銨 0. 35-0. 5wt%、氯化鈉 1. 5-1. 75wt%、碳酸鈣 1. 2-1. 5wt%、泡敵 0. 025-0. 05wt%，水余量，培養(yǎng)基 pH7. 0-7. 2。上述的生產(chǎn)恩拉霉素的方法中，發(fā)酵培養(yǎng)條件為在27. 5-28. 5 °C，通氣量 0. 6-1. 3vvm，轉(zhuǎn)速 50-115rpm 下發(fā)酵培養(yǎng) 270_300h。上述的生產(chǎn)恩拉霉素的方法中，所用甘油水溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%。將按本發(fā)明方法制得的發(fā)酵液通過HPLC方法進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果顯示發(fā)酵液中 恩拉霉素的生物效價在8500U/ml以上，檢測條件如下柱子RPC18(4. 6x250mm)流動相乙腈-35mmol/L磷酸二氫鉀溶液，乙腈與磷酸二氫鉀溶液的體積比為 30 70。磷酸二氫鉀(35mmol/L)配制方法稱取磷酸二氫鉀4. 76g溶于700ml純水中，用 磷酸調(diào)PH至4. 5。流速L0ml/min波長267nm柱溫35°C樣品處理方法稱取2g發(fā)酵液加入到18ml丙酮浸提液中，室溫下超聲處理40min 后過濾進(jìn)樣，超聲頻率100W。丙酮浸提液是丙酮、2mol/L鹽酸溶液和水的混合液，其中，丙 酮、2mol/L的鹽酸溶液、水的體積比為20 1 21。標(biāo)準(zhǔn)溶液配制將恩拉霉素標(biāo)準(zhǔn)品配制成濃度為200 μ g/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液。本發(fā)明與傳統(tǒng)斜面培養(yǎng)，接種環(huán)挖塊接種搖瓶，搖瓶再接種子罐的傳統(tǒng)工藝相比， 具有以下積極效果1、本方法簡單易行，省去了繁瑣的制種工藝，降低了染菌幾率。2、本方法大幅降低了工作量，一次制備菌種，可長期供應(yīng)發(fā)酵。3、本方法接種量易控制，發(fā)酵結(jié)果穩(wěn)定，重復(fù)性好。4、本方法將孢子液在液氮環(huán)境中冷凍保存，減少了菌種分純復(fù)壯頻率，降低菌種 變異幾率。5、本方法發(fā)酵結(jié)果比傳統(tǒng)工藝有所提高，恩拉霉素最大產(chǎn)量達(dá)到8500 μ g/ml以 上(HPLC)。微生物保藏信息殺真菌素鏈霉菌(Sti^ptomycesfungicidicus) SDSL1205,已于 2010 年 6 月21日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號為 CGMCCNo. 3933。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作具體的說明，應(yīng)該明白的是，下述說明僅是示例
5性的，并不對本發(fā)明進(jìn)行限制。以下百分?jǐn)?shù)如無特別說明，均為重量百分?jǐn)?shù)。菌株選育過程如下一、從野生菌Str印tomyces fungicidicus SDSLl號菌出發(fā)，經(jīng)連續(xù)紫外誘變得到 比出發(fā)菌株產(chǎn)量提高203%的236號高產(chǎn)菌株，操作步驟如下將SDSLl號菌株接入平板培養(yǎng)基，培養(yǎng)6天后，選取一塊生長良好的平板，將孢子 刮到121°C，消毒30min的20wt%的甘油水溶液中，用玻璃珠打散混勻，得菌懸液，孢子在 IO8-IO9個/ml左右。將菌懸液裝在平皿中，暴露于30W紫外燈源下15厘米處，照射60秒。 照射后將菌懸液梯度稀釋10_8-10_12倍，涂平板。培養(yǎng)溫度28°C，培養(yǎng)時間7天。選取長勢 良好的菌落，進(jìn)行發(fā)酵驗證。經(jīng)HPLC檢測發(fā)酵液中恩拉霉素含量，誘變菌株SDSL236號產(chǎn) 量為1491U/ml，而野生菌SDSLl號產(chǎn)量為491U/ml。誘變菌株比野生菌株產(chǎn)量提高203%。二、將SDSL236號高產(chǎn)菌株經(jīng)連續(xù)的鏈霉素抗性篩選，得到SDSL417號菌株。操作 步驟如下將鏈霉素按照30 200ug/ml的濃度添加至平板培養(yǎng)基中，制作成平板，121°C滅 菌30分鐘。將SDSL236號菌株接種到平板培養(yǎng)基中，利用該鏈霉素抗性篩選平板篩選抗 鏈霉素的菌株，培養(yǎng)溫度28°C，培養(yǎng)時間6-7天。選取長勢良好的菌落，進(jìn)行發(fā)酵驗證。經(jīng) HPLC檢測發(fā)酵液中恩拉霉素含量，SDSL417號菌株產(chǎn)量為4339U/ml，比誘變菌株SDSL236號 產(chǎn)量提高191%。三、再利用亞硝基胍誘變SDSL417號菌株，結(jié)合鏈霉素抗性篩選得到SDSL959菌 株，操作步驟如下將SDSL417號菌株接入平板培養(yǎng)基，培養(yǎng)7天后，選取一塊生長良好的平板，將孢 子刮到121°C，消毒30min的20wt %的甘油水溶液中，用玻璃珠打散混勻，得菌懸液，孢子控 制在IO8-IO9個/ml左右。在通風(fēng)櫥內(nèi)，稱取20mg亞硝基胍，按0. lml/mg的比例先加丙酮使之溶解，再加4 倍檸檬酸鹽緩沖液稀釋，這樣制成的溶液濃度為2mg/ml。將孢子菌懸液與亞硝基胍溶液按 1 2混合，在26 28°C下作用30分鐘。處理后，離心分離，并反復(fù)用生理鹽水洗滌離心 10次以上，最后用生理鹽水恢復(fù)到原有體積。然后按照與上面相同的方法進(jìn)行梯度稀釋，稀 釋孢子液涂布到鏈霉素抗性篩選平板中，培養(yǎng)溫度28°c，培養(yǎng)時間7天。選取長勢良好的菌 落，進(jìn)行發(fā)酵驗證。經(jīng)HPLC檢測發(fā)酵液中恩拉霉素含量，突變株SDSL959號產(chǎn)量超過亞硝 基胍誘變前的SDSL417號96%，達(dá)到8505U/ml。四、將已經(jīng)得到的SDSL959號菌株，再經(jīng)多輪自然分純得SDSL1205號菌株。操作 如下按照前述方法制備孢子菌懸液，孢子濃度大約IO8-IO9個/ml。選取8支粗試管，在1-8號中加入9毫升無菌水，吸取Iml孢子懸液入1號管，充 分震動混勻，從1號管吸Iml到2號管，依次類推，制成梯度濃度。從6號管中吸取0. 05ml 于平板培養(yǎng)基內(nèi)涂抹均勻。同理，從7、8號管分別吸取0. 1和0. 2ml稀釋液于平板培養(yǎng)基 中。培養(yǎng)溫度28°C，培養(yǎng)時間8天。挑選具有灰色、圓形、中間有小突起特征的單菌落接入 平板培養(yǎng)，通過種子培養(yǎng)，然后進(jìn)行發(fā)酵驗證。HPLC檢測恩拉霉素含量達(dá)到了 8515U/ml。發(fā)酵過程如下(1)制備凍存孢子液a.將SDSL1205號菌株接種到多個平板培養(yǎng)基上，在28°C培養(yǎng)6天，得孢子，孢子具有灰色、圓形、中間有小突起特征；b.將每個平板上培養(yǎng)的孢子分別刮到20wt%甘油水溶液中，用玻璃珠打散混勻 制成孢子液，孢子液分裝在30支凍存管中，每管裝Iml孢子液，孢子濃度約為IO8-IO9個/ ml，凍存管在液氮環(huán)境中進(jìn)行冷凍保存；(2)種子培養(yǎng)將凍存孢子液接種到種子培養(yǎng)基中，每30升培養(yǎng)基接種2毫升凍 存孢子液，在28°C，通氣量1. Ivvm,轉(zhuǎn)速250rpm下無菌培養(yǎng)50h，得種子液；種子液中的固 形物占種子液總量的20-30體積％ ；(3)發(fā)酵培養(yǎng)按5%的接種量將種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在28°C，通氣量 1. 3vvm，轉(zhuǎn)速IOOrpm下發(fā)酵培養(yǎng)280h ；發(fā)酵完畢，發(fā)酵液經(jīng)過濾后，菌絲體用甲醇浸提，離心分離，浸提液經(jīng)濃縮后，結(jié)晶 得到恩拉霉素結(jié)晶。培養(yǎng)基組成平板培養(yǎng)可溶性淀粉10g，酵母浸提物2g，瓊脂20g，1000ml蒸餾水溶解，調(diào)PH至 7. 0，121°C滅菌。 種子培養(yǎng)玉米粉3.5%，玉米漿2.8%，棉籽餅粉0.5%，玉米蛋白粉0.5%，硫酸 銨0.25%，硫酸亞鐵0. 036 %，磷酸二氫鉀0.125%，輕質(zhì)碳酸鈣2.0%，泡敵0.05%，30L蒸 餾水，pH 7. 5，121°C滅菌發(fā)酵培養(yǎng)葡萄糖4. 0 %，玉米淀粉2.0%，玉米漿2.0%，玉米蛋白粉3. 0 %，棉籽 餅粉1.0%，氯化銨0.5%，氯化鈉1.5%，碳酸鈣1.5%，泡敵0. 05%,800L蒸餾水，ρΗ7· 2， 121°C滅菌。發(fā)酵液通過HPLC方法進(jìn)行檢測，樣品處理方法稱取2g發(fā)酵液加入18ml丙酮浸 提液中(Vrafi: V2mol/LHC1 V7k= 20 1 21)，超聲(100W)40min后過濾進(jìn)樣。將恩拉霉 素標(biāo)準(zhǔn)品配制成200μ g/ml進(jìn)行檢測，檢測條件如下柱子RPC18(4. 6x250mm)流動相Viw V 磷酸二a鐘=30 70磷酸二氫鉀(35mmol/L)配制方法稱取磷酸二氫鉀4. 76g溶于700ml純水中，用 磷酸調(diào)PH至4. 5。流速L0ml/min波長267nm柱溫35°C實施例1利用選育的SDSL1205號菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。(1)制備凍存孢子液a.將菌株接種到多個平板培養(yǎng)基上，在27°C培養(yǎng)7天，所得孢子具有灰色、圓形、 中間有小突起特征；b.將每個平板上培養(yǎng)的孢子分別刮到20wt%甘油水溶液中，用玻璃珠打散混勻 制成孢子液，孢子液分裝在25支凍存管中，每管裝Iml孢子液，凍存管在液氮環(huán)境中進(jìn)行冷 凍保存；孢子濃度在IO8-IO9個/ml左右；(2)種子培養(yǎng)將凍存孢子液接種到種子培養(yǎng)基中，每30升培養(yǎng)基接種1. 5毫升
7凍存孢子液，在28. 50C，通氣量1. Ovvm,轉(zhuǎn)速200rpm下無菌培養(yǎng)50h，得種子液；種子液中 的固形物占種子液總量的20-30體積％ ；(3)發(fā)酵培養(yǎng)按4%的接種量將種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在27. 5°C，通氣量 1. Ovvm,轉(zhuǎn)速70rpm下發(fā)酵培養(yǎng)270h ；發(fā)酵完畢，發(fā)酵液經(jīng)過濾后，菌絲體用甲醇浸提，離心分離，浸提液經(jīng)濃縮后，結(jié)晶 得到恩拉霉素結(jié)晶。培養(yǎng)基組成平板培養(yǎng)可溶性淀粉9g，酵母浸提物2. 2g，瓊脂18g，1000ml蒸餾水溶解，調(diào)PH 至 6. 8，121°C滅菌。種子培養(yǎng)玉米粉3.0%，玉米漿3.0%，棉籽餅粉0.3%，玉米蛋白粉1.0%，硫酸 銨0.75%，硫酸亞鐵0. 043 %，磷酸二氫鉀0.1%，輕質(zhì)碳酸鈣1.5%，泡敵0. 025 %，30L蒸 餾水，pH 7. 2，121°C滅菌。 發(fā)酵培養(yǎng)葡萄糖3.6%，玉米淀粉1.8%，玉米漿2.2%，玉米蛋白粉2. 8 %，棉籽 餅粉1.2%，氯化銨0. 35%，氯化鈉1.75%，碳酸鈣1.2%，泡敵0. 025%，800L蒸餾水，pH 7. 0，121°C滅菌。發(fā)酵液通過HPLC方法進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果顯示發(fā)酵液中恩拉霉素的生物效價為 8512U/ml。此外，凍存孢子液快用完時可以用現(xiàn)有的凍存孢子液再制備新的凍存孢子液，其 過程如下取現(xiàn)有的凍存孢子液，用生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋，取濃度為原先10_8、10_9、10_1Q、 IO-11UO-12倍的稀釋孢子液涂在平皿上，每個濃度涂5個平皿，每個平皿接種0. Iml菌懸液， 接種后的平皿在28°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6-7天。平皿在28°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6-7天后，將單菌落劃線擴(kuò)種到另外的平板上，平板在 28°C下培養(yǎng)6-7天。用蒸餾水稀釋20g甘油，定溶到100ml，攪拌均勻，121°C，消毒30min。將平板上的 孢子刮到甘油水溶液中，用玻璃珠打散搖勻，將孢子液分裝到凍存管(容積5ml)中，每個平 板裝20-30支凍存管，每管裝Iml孢子液，孢子液中孢子濃度約為IO8-IO9個/ml。凍存管 至于液氮中保存。實施例2(1)制備凍存孢子液a.將SDSL1205號菌株接種到多個平板培養(yǎng)基上，在28°C培養(yǎng)7天；b.將每個平板上培養(yǎng)的孢子分別刮到20wt%甘油水溶液中，用玻璃珠打散混勻 制成孢子液，孢子液分裝在20支凍存管中，每管裝Iml孢子液，凍存管在液氮環(huán)境中進(jìn)行冷 凍保存；孢子濃度在IO8-IO9個/ml左右；(2)種子培養(yǎng)將凍存孢子液接種到種子培養(yǎng)基中，每30升培養(yǎng)基接種1毫升凍 存孢子液，在28°C，通氣量1. Ivvm,轉(zhuǎn)速250rpm下無菌培養(yǎng)50h，得種子液；種子液中的固 形物占種子液總量的20-30體積％ ；(3)發(fā)酵培養(yǎng)按5%的接種量將種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在28°C，通氣量 0. 6vvm,轉(zhuǎn)速50rpm下發(fā)酵培養(yǎng)300h ；
發(fā)酵完畢，發(fā)酵液經(jīng)過濾后，菌絲體用甲醇浸提，離心分離，浸提液經(jīng)濃縮后，結(jié)晶 得到恩拉霉素結(jié)晶。培養(yǎng)基組成平板培養(yǎng)可溶性淀粉13g，酵母浸提物1. 5g，瓊脂19g，1000ml蒸餾水溶解，調(diào)PH 至 7. 0，121°C滅菌。種子培養(yǎng)玉米粉3.2%，玉米漿2.9%，棉籽餅粉0.4%，玉米蛋白粉0. 75 %，硫酸 銨0. 5 %，硫酸亞鐵0. 040 %，磷酸二氫鉀0.110%，輕質(zhì)碳酸鈣1.8%，泡敵0. 030 %，30L蒸 餾水，pH 7. 0，121°C滅菌。發(fā)酵培養(yǎng)葡萄糖3.8%，玉米淀粉1.9%，玉米漿2.1%，玉米蛋白粉2. 9 %，棉籽 餅粉1.1%，氯化銨0.4%,氯化鈉1.6%,碳酸鈣1.4%,泡敵0. 04%, 800L蒸餾水，pH 7. 2， 121°C滅菌。發(fā)酵液通過HPLC方法進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果顯示發(fā)酵液中恩拉霉素的生物效價為 8512U/ml。凍存孢子液可以一次性制備很多待用，避免了每次都要配制孢子液的麻煩。在凍 存液快用完時再用剩余的孢子液進(jìn)行擴(kuò)種培養(yǎng)再制備出一批凍存孢子液待用。制備方法如 實施例1。實施例3(1)制備凍存孢子液a.將SDSL1205號菌株接種到多個平板培養(yǎng)基上，在28°C培養(yǎng)6天；b.將每個平板上培養(yǎng)的孢子分別刮到20wt%甘油水溶液中，用玻璃珠打散混勻 制成孢子液，孢子液分裝在20支凍存管中，每管裝Iml孢子液，凍存管在液氮環(huán)境中進(jìn)行冷 凍保存；孢子濃度在IO8-IO9個/ml左右；(2)種子培養(yǎng)將凍存孢子液接種到種子培養(yǎng)基中，每30升培養(yǎng)基接種1毫升凍 存孢子液，在28°C，通氣量1. Ivvm,轉(zhuǎn)速250rpm下無菌培養(yǎng)50h，得種子液；種子液中的固 形物占種子液總量的20-30體積％ ；(3)發(fā)酵培養(yǎng)按5%的接種量將種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在28°C，通氣量 1. 3vvm,轉(zhuǎn)速115rpm下發(fā)酵培養(yǎng)280h ；發(fā)酵完畢，發(fā)酵液經(jīng)過濾后，菌絲體用甲醇浸提，離心分離，浸提液經(jīng)濃縮后，結(jié)晶 得到恩拉霉素結(jié)晶。培養(yǎng)基組成平板培養(yǎng)可溶性淀粉10g，酵母浸提物2. Og,瓊脂20g，1000ml蒸餾水溶解，調(diào)PH 至 7. 0，121°C滅菌。種子培養(yǎng)玉米粉3.5%，玉米漿2.8%，棉籽餅粉0.5%，玉米蛋白粉0.5%，硫酸 銨0.25%，硫酸亞鐵0. 036 %，磷酸二氫鉀0.125%，輕質(zhì)碳酸鈣2.0%，泡敵0.05%，30L蒸 餾水，pH 7. 5，121°C滅菌。發(fā)酵培養(yǎng)葡萄糖4. 0 %，玉米淀粉2.0%，玉米漿2.0%，玉米蛋白粉3. 0 %，棉籽 餅粉1.0%,氯化銨0.5%,氯化鈉1.5%,碳酸鈣1.5%,泡敵0. 05%, 800L蒸餾水，pH 7. 2， 121°C滅菌。發(fā)酵液通過HPLC方法進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果顯示發(fā)酵液中恩拉霉素的生物效價為
98515U/mL· 由上述說明可以看出，本方法簡單易行，省去了繁瑣的制種工藝，因此降低了染菌 幾率；一次制備菌種，可長期供應(yīng)發(fā)酵，減少了工作時間，此外，本方法還減少了菌種分純復(fù) 壯頻率，降低菌種變異幾率。
權(quán)利要求
一種微生物發(fā)酵生產(chǎn)恩拉霉素的方法，其特征是包括以下步驟(1)制備凍存孢子液a.將殺真菌素鏈霉菌(Streptomyces fungicidicus)SDSL1205CGMCCNo.3933接種到多個平板培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，得殺真菌素鏈霉菌孢子；b.將上述得到的孢子刮到甘油水溶液中，打散混勻制成孢子液，將孢子液分裝在凍存管中在液氮環(huán)境中冷凍保存，待用；(2)種子培養(yǎng)將凍存孢子液接種到種子培養(yǎng)基中，每30L培養(yǎng)基接種1 2ml凍存孢子液，培養(yǎng)得種子液，種子液中的固形物占種子液總量的20 30體積％；(3)發(fā)酵培養(yǎng)按4 6wt％的接種量將種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；發(fā)酵完畢，將發(fā)酵液過濾得菌絲體，菌絲體用甲醇浸提、離心分離得浸提液，浸提液經(jīng)濃縮、結(jié)晶得到恩拉霉素結(jié)晶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)恩拉霉素的方法，其特征是采用步驟(1)中制得的凍存 孢子液制備新的凍存孢子液，其步驟為①用生理鹽水梯度稀釋凍存孢子液，將稀釋的凍存孢子液接種到多個平板培養(yǎng)基上進(jìn) 行培養(yǎng)，得殺真菌素鏈霉菌孢子；②將得到的孢子刮到甘油水溶液中，打散混勻制成孢子液，孢子液分裝在凍存管中在 液氮環(huán)境中進(jìn)行冷凍保存，待用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的生產(chǎn)恩拉霉素的方法，其特征是步驟①中，將凍存孢子液梯 度稀釋至原先濃度的ICT8-IO-12倍，在此濃度范圍內(nèi)取5個梯度的稀釋孢子液分別接種到5 個平板培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，接種量均為0. Iml0
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的生產(chǎn)恩拉霉素的方法，其特征是每毫升凍存孢子液 中含1. OX IO8-L OX IO9個殺真菌素鏈霉菌孢子。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的生產(chǎn)恩拉霉素的方法，其特征是平板培養(yǎng)的條件為平板培 養(yǎng)基成分可溶性淀粉9-13g/L、酵母浸膏1. 5-2. 2g/L、瓊脂18_20g/L，培養(yǎng)基pH6. 8-7. 0， 27-28 °C下培養(yǎng)6-7天。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的生產(chǎn)恩拉霉素的方法，其特征是種子培養(yǎng)基組分及各 組分的濃度為玉米粉3. 0-3. 5wt %、玉米漿2. 8-3. Owt %、棉籽餅粉0. 3-0. 5wt %、玉 米蛋白粉0. 5-lwt %、硫酸銨0. 25-0. 75wt %、硫酸亞鐵0. 036-0. 043wt %、磷酸二氫鉀0.1-0. 125wt%、碳酸鈣 1. 5-2. Owt %、泡敵 0. 025-0. 05wt%，水余量，培養(yǎng)基 pH7. 0-7. 5。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的生產(chǎn)恩拉霉素的方法，其特征是種子培養(yǎng)條件為在 27. 5-28. 50C，通氣量 1. 0-1. Ivvm,轉(zhuǎn)速 200-250rpm 下培養(yǎng) 46_50h。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的生產(chǎn)恩拉霉素的方法，其特征是發(fā)酵培養(yǎng)基的組分及各組 分濃度為葡萄糖3. 6-4. Owt %、玉米淀粉1. 8-2. Owt %、玉米漿2. 0-2. 2wt%、玉米蛋白粉 2. 8-3.籽餅粉 1. 0-1. 2wt%、氯化銨 0. 35-0. 5wt%、氯化鈉 1. 5-1. 75wt%、碳酸鈣1.2-1. 5wt%、泡敵 0. 025-0. 05wt%，水余量，培養(yǎng)基 pH7. 0-7. 2。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的生產(chǎn)恩拉霉素的方法，其特征是發(fā)酵培養(yǎng)條件為在 27. 5-28. 5°C，通氣量 0. 6-1. 3vvm，轉(zhuǎn)速 50_115rpm 下發(fā)酵培養(yǎng) 270_300h。
10.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的生產(chǎn)恩拉霉素的方法，其特征是所述甘油水溶液質(zhì) 量分?jǐn)?shù)為20%。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種微生物發(fā)酵生產(chǎn)恩拉霉素的方法，包括以下步驟制備殺真菌素鏈霉菌(Streptomyces fungicidicus)SDSL1205 CGMCC No.3933的孢子液，將孢子液在液氮環(huán)境下保存；將凍存孢子液接種到種子培養(yǎng)基中進(jìn)行種子培養(yǎng)得種子液；按4-6wt％的接種量將種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；發(fā)酵后的發(fā)酵液經(jīng)進(jìn)一步處理得恩拉霉素結(jié)晶。本方法簡單易行，省去了繁瑣的制種工藝，降低了染菌幾率；接種量易控制，發(fā)酵結(jié)果穩(wěn)定，重復(fù)性好；發(fā)酵結(jié)果比傳統(tǒng)工藝有所提高，恩拉霉素最大產(chǎn)量達(dá)到8500μg/ml以上(HPLC)。
文檔編號C12R1/465GK101899490SQ20101022650
公開日2010年12月1日 申請日期2010年7月14日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月14日
發(fā)明者景巍, 王永星, 胡江林, 葛慶燕 申請人:山東勝利股份有限公司