專利名稱：一種環(huán)氧化物水解酶基因、載體、工程菌及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及環(huán)氧化物水解酶(印oxide hydrolase，EH)基因及其重組表達載體、基 因工程菌，及其在制備重組環(huán)氧化物水解酶中的應用。
背景技術：
EH是一類廣泛存在于植物、昆蟲、哺乳動物以及微生物體內的水解酶，能選擇性水 解外消旋環(huán)氧化物生成具有光活性的環(huán)氧化物和二醇。微生物來源的EH不對稱拆分外消 旋的環(huán)氧化物，具有底物譜和酶的來源廣泛，對映體選擇性高，不需要金屬離子和輔酶，菌 體可以通過發(fā)酵大量得到，在非水介質中也能保持較高催化活性等特點。近年來，人們已在多種微生物中發(fā)現(xiàn)了環(huán)氧化物水解酶，如Rhodococcus equi, Rhodococcus ruber, Nocardia, Mycoplana rubra, Bacillus megaterium, Diplodia gossipina, Streptomyces strains, Rhodotorula glutinis, Bacillus subtilis, Sphingomonas echinoides, Rhodotorula araucariae, Rhodosporidium toruloides, Agrobacterium radiobacter, Mycobacterium tuberculosis, Aspergillus niger 等。其 中，部分環(huán)氧化物水解酶的基因已被克隆并在不同的宿主中表達(大腸桿菌、畢赤酵母、耶 氏酵母等)，獲得產酶活力提高的基因工程菌，隨后用于不對稱拆分外消旋環(huán)氧化物，在手 性環(huán)氧氯丙烷的制備中也有應用。手性環(huán)氧氯丙烷是一種重要的有機合成中間體，在醫(yī)藥、化工、農藥等領域應用廣 泛。化學法拆分外消旋環(huán)氧氯丙烷需要使用重金屬，會造成環(huán)境的污染。生物法拆分具有 反應條件溫和、環(huán)境友好的優(yōu)點，但是具有高效拆分外消旋環(huán)氧氯丙烷活性的微生物報道 較少，因此，通過基因工程技術獲得能選擇性水解外消旋的環(huán)氧氯丙烷的EH基因，構建高 表達的基因工程菌有著重要的意義。

發(fā)明內容
本發(fā)明目的是提供一種環(huán)氧化物水解酶基因及其重組表達載體、基因工程菌，及 其在制備重組環(huán)氧化物水解酶中的應用。本發(fā)明采用的技術方案是
一種環(huán)氧化物水解酶基因，具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列
1GGTCTCCTCG AGAAMGAGCMCCCATACCTTTGCTAGTCCTCCMCMGATTCACAGTA
61GATATCCCTC MTCCGMTTAGATGAGCTGCATTCTCGACTAGATMGACMGATGGCCA
121GCMCCGAGA TAGTTCCAGAGGATGGMCC GATGACCCTACGGCATTCGGCTTGGGGGCT
181GGACCMCCT TGCCACTTATGAMGAGTTA GCTMGGGATGGAGAGMTTCGATTGGMG
241AMGCTCMG ATCACTTGMCACCTTTGMCACTACATGGTCGAMTCGAGGATCTATCT
301ATACACTTTT TGCACCATAGGTCTACCAGA CCTMTGCTGTCCCTCTMTACTATGTCAT
361GGTTGGCCTG GTCACTTTGGAGAGTTCTTG MTGTGATTCCATTGTTGACTGAGCCMGT
421GACCCATCCG CTCMGCTTTTCACGTGGTG GCTCCATCMTGCCTGGATATGCTTGGAGT
3
481TTACCCCCACCATCCTCTMGTGGMCATGCCCGACACCGCCAGAGTGTTCGATMGCTT
541ATGACGGGACTTGGTTATGAGAMTATATGGCTCMGGTGGTGATTGGGGATCTATTGCA
601GCTCGTTGCCTTGGTTCATTGCATMGGACCACTGTMGGCTGTGCACCTAMCTTTCTG
661CCAGTGTTCCCACCAGTCCCCATGTGGCTAATAMTCCACATACTCTACTGGCATGGGCT
721CCMGATTTCTTGTTCCCGAAAMCAGGCTGCTCGTATGAAGAGAGGACTTGCCTACTTG
781GAGAMGGATCTGCATACTACGTCATGCAGCMTTGACTCCACGTACCCCTGCCTATGGA
841CTTACAGATTCTCCAGTTGGACTACTAGCATGGATTGGTGAAAMTTCGAGCCCACCATC
901CAGGAGGCTTCTAMCAGGCCCMCCMCGTTGACGCGTGATGMTTGTACTTTACTTGT
961TCCTTATACTGGTTCACACGTTCTATTGGTACTTCTTTTCTGCCCTACAGTTTGMCCCA
1021CATTTTACTACATTCCTGACCGATTCCAMTACCATTTACCAMCTTTGCCCTMGTCTT
1081TATCCCGGAGAGATTTATTGCCCAGCCGMAGGGACGCTAAGAGGACAGGCMTTTGMG
1141TGGATCMGGACGCTCCAGAAGGAGGACACTTCGCTGCCCTTGAAMGCCAGACGTCTTT
1201GTTGAGCATCTTAGAGMGCCTTCGGTGTTATGTGGGAMMCATCATCATCATCACCAT
1261TGA 該環(huán)氧化物水解酶基因來源于微生物Rhodosporidium toruloides (中國普通微 生物菌種保藏管理中心(北京)，編號為AS. 2. 1389)該序列全長為1263bp，其堿基組成 為
權利要求
一種環(huán)氧化物水解酶基因，具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
2.如權利要求1所述的環(huán)氧化物水解酶基因，其特征在于所述環(huán)氧化物水解酶基因編 碼SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列。
3.一種含有權利要求1所述環(huán)氧化物水解酶基因的重組載體。
4.一種用權利要求4所述重組載體轉化得到的重組基因工程菌。
5.如權利要求1所述的環(huán)氧化物水解酶基因在制備重組環(huán)氧化物水解酶中的應用。
6.如權利要求5所述的應用，其特征在于所述的應用為構建含有所述環(huán)氧化物水解 酶基因的重組載體，將所述重組載體轉化至大腸桿菌中，獲得的重組基因工程菌進行誘導 培養(yǎng)，培養(yǎng)液分離得到含有重組環(huán)氧化物水解酶的菌體細胞。
7.如權利要求5所述的應用，其特征在于所述重組環(huán)氧化物水解酶作為轉化用酶，以 外消旋環(huán)氧氯丙烷為底物，進行轉化反應制備R-環(huán)氧氯丙烷。
全文摘要
本發(fā)明提供了環(huán)氧化物水解酶(EH)基因及其重組表達載體、基因工程菌，及其在制備重組環(huán)氧化物水解酶中的應用。本發(fā)明提供了一種環(huán)氧化物水解酶核苷酸序列；構建了一種含有該基因的表達重組質粒pET-28b-EH，將其轉化至大腸桿菌BL21中，獲得了含有表達質粒pET-28b-EH的重組大腸桿菌BL21/pET-28b-EH，并利用該菌株表達生產重組環(huán)氧化物水解酶；提供了一種以本發(fā)明構建的重組大腸桿菌為酶源進行生物催化與轉化的方法，生產R-環(huán)氧氯丙烷，為手性環(huán)氧氯丙烷的工業(yè)化生產提供可能。
文檔編號C12N15/55GK101967489SQ20101022621
公開日2011年2月9日 申請日期2010年7月14日 優(yōu)先權日2010年7月14日
發(fā)明者壯曉健, 張莉萍, 柳志強, 沈寅初, 胡忠策, 鄭裕國 申請人:浙江工業(yè)大學