專利名稱：一種小鏈霉菌及其在達托霉素制備中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新型微生物及其用途和應(yīng)用，尤其涉及一種小鏈霉菌及其在制備 達托霉素中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
達托霉素是一類稱為環(huán)酯肽類新抗生素家族的第一個產(chǎn)品。它是從小鏈霉菌 (Streptomyces parvus)發(fā)酵液當中提取得到。它不僅具有新穎的化學結(jié)構(gòu)，且其作用模式 也與任一已獲準抗生素不同。達托霉素能在多個方面破壞細菌細胞膜功能，由此迅速殺死 革蘭陽性菌。達托霉素除能作用于大多數(shù)臨床相關(guān)革蘭陽性菌外，更重要的是在體外對已 呈甲氧西林(methicillin)、萬古霉素和利奈唑胺等耐藥性分離菌株仍具強力活性。達托霉素為發(fā)酵產(chǎn)物，通過發(fā)酵培養(yǎng)得到的發(fā)酵濾液，再通過一系列純化工藝如 色譜層析、脫色、結(jié)晶和重結(jié)晶等可最終獲得達托霉素。一般達托霉素產(chǎn)生菌，生產(chǎn)能力不 穩(wěn)定，產(chǎn)量較低，發(fā)酵副產(chǎn)物較多，雜質(zhì)較多，導致后提取工作較為復(fù)雜，大大地增加了后序 的提純難度，難以獲得高純度的最終產(chǎn)物，從而無法產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對上述問題，提供一種發(fā)酵單位高、能穩(wěn)定生產(chǎn)、產(chǎn)量多且副產(chǎn) 物少的達托霉素產(chǎn)生菌。一種小鏈霉菌SW0702，分類命名為小鏈霉菌(Sti^ptomyces parvus SW0702)，由 中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號為CCTCC NO :M2010136，保藏日期為2010年6月4曰。小鏈霉菌CCTCC NO :M2010136的菌株的菌落特征基內(nèi)菌絲發(fā)育良好，菌絲細長 分枝，直徑為0. 8 0. 9 μ m ；氣生菌絲生長良好，孢子絲著生在氣生菌絲體上，孢子絲直、柔 曲，孢子呈橢圓形或卵圓形，表面光滑，直徑為0. 65 0. 95 X 0. 95 2. 6 μ m,成熟孢子鏈孢 子個數(shù)在20個以上。蔗糖硝酸鹽瓊脂氣絲淺黃色至粉紅色。根據(jù)微生物形態(tài)學及國外相關(guān)資料的描述，結(jié)合小鏈霉菌CCTCC NO :M2010136的 菌株的各種培養(yǎng)特征和形態(tài)特征，該小鏈霉菌CCTCC NO :M2010136的菌株應(yīng)屬于小鏈霉菌 屬，定名為 Streptomyces parvus SW0702。本發(fā)明的另一個目的是提供該菌種在制備達托霉素中的應(yīng)用。小鏈霉菌CCTCC NO :M2010136的菌株可應(yīng)用于發(fā)酵制備達托霉素。該制備方法包 括下列步驟a.發(fā)酵菌株采用小鏈霉菌CCTCC NO :M2010136的菌株；b.菌株培養(yǎng)按常規(guī)方法制備的斜面茄子瓶，挖取斜面菌苔接入搖瓶種子培養(yǎng)得 搖瓶種子液；將搖瓶種子液接種于搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中或種子罐中培養(yǎng)；將種子罐培養(yǎng)液接 種于發(fā)酵罐培養(yǎng)基培養(yǎng)，收集發(fā)酵液；優(yōu)選在發(fā)酵培養(yǎng)過程中進行補料。c.發(fā)酵產(chǎn)物提取色譜層析、脫色、結(jié)晶和重結(jié)晶。
4
其中所述的步驟b為按常規(guī)方法制備的斜面，挖取0. 5 X 1. Ocm2的斜面菌苔接入 搖瓶種子培養(yǎng)基，150 250rpm，培養(yǎng)16 32小時，得搖瓶種子液；將搖瓶種子液按種子罐 培養(yǎng)基體積0. 1 5%的接種量接種于種子罐，80 120rpm，培養(yǎng)16 32h ；將種子罐培養(yǎng) 液按發(fā)酵培養(yǎng)基體積5 15%的量接種于發(fā)酵罐培養(yǎng)基，120 200rpm，發(fā)酵培養(yǎng)130 240小時，收集發(fā)酵液；其中培養(yǎng)溫度均為28 32°C。其中步驟b中的補料在發(fā)酵的整個過程中是很重要。具體補料工藝根據(jù)發(fā)酵液實 際情況從PH、菌濃、碳氮源消耗、溶氧及菌絲鏡檢情況等幾方面來考慮，補料可采用連續(xù)流 加或間歇補料的方式。其中發(fā)酵培養(yǎng)過程中的補料，也即發(fā)酵罐補料視不同的具體發(fā)酵情況有多種，主 要有以下幾種不同的方法，1、待菌絲生長良好后，開始補癸酸與油酸甲酯以體積比1 1的混合物料，根據(jù)菌 絲鏡檢情況和發(fā)酵單位情況調(diào)整補料量，所補的量為0. lml/L 0. 6ml/L發(fā)酵液.h ；或者2、待菌絲生長良好后，開始流加補8%癸酸氨，流速1. 0 3. 0ml/L/h，控制發(fā)酵時 溶氧不低于10%。具體地說就是在培養(yǎng)一定時間(此時發(fā)酵液較粘稠，菌絲生長旺盛，菌濃 20%以上)開始補料流加癸酸氨，當癸酸氨加入一定量后菌絲開始自溶，菌濃下降，培養(yǎng)液 變稀，溶氧上升，這時可以適當降低轉(zhuǎn)速、通氣量。或者3、在發(fā)酵過程中pH第一次升到7. 0 8. 5時開始補，所補的為癸酸與油酸甲酯以 體積比1 1的混合物料(為了簡便后序的描述，將癸酸與油酸甲酯以體積比1 1的混 合物料簡稱為前體)，所補的量為0. 03 0. 2ml/L發(fā)酵液.h ；在發(fā)酵進行到35 45小時 左右一直到結(jié)束，所補的量為0. 10 0. 55ml/L發(fā)酵液· h ；為了進一步地提高發(fā)酵單位，還可以在補料操作中增加菜油的補料，具體為當發(fā) 酵至70 78小時，暫時停止前體的補入，一次性補入第一次菜油，補量以體積計為發(fā)酵罐 體積的0. 5 1. 7%，空氣流量適當減少，約減少10 20%，在第一次菜油補料結(jié)束后4 8小時再重新開始補前體，補料量為0. 10 0. 55ml/L發(fā)酵液.h ；在第一次補菜油后24 40小時，暫停補前體，改補菜油(第二次)，一次性補入，補料量以體積計為發(fā)酵罐體積的 0. 5 1. 5%左右，空氣流量繼續(xù)適當減少，約減少10 20%。第二次菜油補料結(jié)束后4 8小時，恢復(fù)前體的補入。在發(fā)酵罐第二次補菜油后24小時，還可以再次暫停前體的補入，而再補一次菜油 (第三次)，補量以體積計為發(fā)酵罐體積的0. 5 1. 2%，之后再恢復(fù)前體的補入。在整個發(fā) 酵罐補料過程中，菜油的總補量以體積計為發(fā)酵罐體積的1. 5 4. 4%?；蛘?、待菌絲生長良好后開始補前體，根據(jù)菌絲鏡檢情況和發(fā)酵單位情況調(diào)整補料 量，菌絲生長粗壯，量多，發(fā)酵單位逐步產(chǎn)生并開始上升，所補的量為0. lml/L 0. 4ml/L發(fā) 酵液.h，當培養(yǎng)基中的還原糖降低至以下，開始補葡萄糖，以保持還原糖的濃度，濃度 維持在左右。在補料過程中，油酸甲脂和癸酸兩者按1 1體積混合，通過膜過濾除菌后用于補 料。由于癸酸有很強的腐蝕性，補料用的管道質(zhì)量一定要好。防止癸酸補料不正常，導致發(fā)酵異常。另外，氣溫低于20°C以下，癸酸很容易凝固，造成補料管道堵塞，因此對管道要進行 保溫，保持管道通暢。本發(fā)明還公開了培養(yǎng)基按重量體積比計，搖瓶培養(yǎng)過程中的碳源為1.0 9. 5%，優(yōu)選1. 5 9. 2%，最優(yōu)選為8. 0 9. 0%;氮源為0. 4 3. 8%，優(yōu)選1. 0 3. 5%， 最優(yōu)選為2. 0 2. 8%;無機鹽為0. 2 2. 5%，優(yōu)選0. 4 2. 0%，最優(yōu)選0. 5 1. 3%;其 余為水；種子罐培養(yǎng)過程中的碳源為1. 0 9. 5 %，優(yōu)選1. 3 9. 2 %，最優(yōu)選為7. 0 9.0% ；氮源為0. 8 3. 8 %，優(yōu)選1. 5 3. 3 %，最優(yōu)選為2. 0 3. 0 % ；無機鹽為0. 2 2.5%，優(yōu)選0.4 2.0%，最優(yōu)選0.5 1.3% ；其余為水；其中碳源選自麥芽糊精、淀粉、淀粉水解糖、糖蜜、糊精、甘油、葡萄糖、麥芽糖、麥 芽汁、土豆浸出粉、土豆糊精、燕麥片中的一種或幾種；優(yōu)選麥芽糊精、淀粉水解糖、糖蜜、甘 油、葡萄糖、麥芽汁、土豆糊精、燕麥片中的一種或幾種；最優(yōu)選麥芽糊精、淀粉水解糖、糖 蜜、甘油、葡萄糖、土豆糊精中的一種或幾種。其中氮源選自黃豆餅粉、玉米漿、玉米蛋白、蛋白胨、植物性蛋白胨、胰酶大豆蛋 白、肉胨、尿素、硫酸銨鐵、酵母粉、酵母浸出物、生豆粉、硝酸鹽、味精中一種或幾種；優(yōu)選黃 豆餅粉、玉米蛋白、蛋白胨、植物性蛋白胨、胰酶大豆蛋白、尿素、硫酸銨鐵、酵母粉、生豆粉、 硝酸鹽、味精中一種或幾種；最優(yōu)選生豆粉、胰酶大豆蛋白、酵母粉三者的混合，或者植物性 蛋白胨、胰酶大豆蛋白兩者的混合。其中無機鹽選自K2HP04、NaCl、Fe (NH4) 2 (SO4) 2. 6H20、NaNO3> KNO3> MgSO4. 7H20、 FeSO4. 7H20、KH2PO4 中的一種或幾種；優(yōu)選 K2HP04、NaCl、Fe (NH4) 2 (SO4) 2. 6H20、NaNO3> KNO3 中 的一種或幾種；最優(yōu)選Fe (NH4) 2 (SO4) 2. 6H20、KNO3中的一種或兩種。其中，發(fā)酵培養(yǎng)過程中，按重量體積比計，碳源為1. 5 15%，優(yōu)選2. 5 13%，最 優(yōu)選5 11% ；氮源為0. 5 7.0%，優(yōu)選0.7 5%，最優(yōu)選0.7 3% ；無機鹽為0. 1 2. 0%，優(yōu)選0.3 1.6%，最優(yōu)選0.5 1.3%;氨基酸0 1.5%，優(yōu)選0.2 1.2%，最優(yōu) 選0.3 0.9% ；其余為水；發(fā)酵培養(yǎng)過程中的培養(yǎng)基物料選擇如下碳源選自麥芽糊精、淀粉、可溶性淀粉、淀粉水解糖、甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜、糊精、甘 油、菜油、葡萄糖、麥芽糖、麥芽汁、土豆浸出粉、土豆糊精、燕麥片中的一種或幾種；優(yōu)選麥 芽糊精、可溶性淀粉、淀粉水解糖、甘蔗糖蜜、甘油、菜油、葡萄糖、麥芽汁、土豆糊精、燕麥片 中的一種或幾種，最優(yōu)選麥芽糊精、可溶性淀粉、甘蔗糖蜜、葡萄糖、菜油、土豆糊精中的一 種或幾種。氮源選自黃豆餅粉、黃豆粉、玉米漿、玉米蛋白、蛋白胨、植物性蛋白胨、胰酶大豆 蛋白、肉胨、尿素、硫酸亞鐵銨、酵母粉、酵母浸出物、生豆粉、硝酸鹽、味精中的一種或幾種； 優(yōu)選黃豆餅粉、黃豆粉、玉米蛋白、蛋白胨、植物性蛋白胨、胰酶大豆蛋白、尿素、硫酸亞鐵 銨、酵母粉、生豆粉、硝酸鹽、味精中一種或幾種；最優(yōu)選為同時選擇黃豆粉、KNO3、谷氨酸鈉 三種物料同時選用蛋白胨、尿素、硫酸亞鐵銨、酵母粉四種物料。無機鹽選自K2HP04、NaCl、Fe(NH4)2(SO4)2. 6H20、NaN03、KN03、MgSO4. 7H20、 FeSO4. 7H20、CH3COONa, CaCO3 中的一種或幾種；優(yōu)選 Fe (NH4) 2 (SO4) 2· 6H20、NaNO3> KNO3> MgSO4. 7H20、FeSO4. 7Η20、CH3COONa, CaCO3 中的一種或幾種；最優(yōu)選 Fe(NH4)2(SO4)2. 6Η20、NaNO3> KNO3> CH3COONa, CaCO3 中的一種或多種。經(jīng)發(fā)酵完成放罐后，對發(fā)酵產(chǎn)物進行提取，通過樹脂吸附并解吸，再進行色譜層析 和純化后可以獲得純度達98%以上的達托霉素。本發(fā)明所公開的小鏈霉菌CCTCC N0.M2010136是目前用于生產(chǎn)的一種高單位的達 托霉素產(chǎn)生菌，發(fā)酵性能優(yōu)良，可用于大規(guī)模生產(chǎn)。發(fā)酵過程是達托霉素生產(chǎn)的重要環(huán)節(jié)， 其發(fā)酵水平與工藝優(yōu)劣直接相關(guān)，本發(fā)明提供的發(fā)酵工藝經(jīng)過搖瓶和10噸發(fā)酵罐中進行 試驗，其生產(chǎn)能力穩(wěn)定。經(jīng)檢測，用本發(fā)明提供的菌種及發(fā)酵培養(yǎng)方法制備的達托霉素單位 可高達3100 μ g/ml或以上，從而為后續(xù)的工業(yè)化生產(chǎn)提供了良好的基礎(chǔ)。同時本發(fā)明的發(fā) 酵副產(chǎn)物相對較少，并降低了后提取的難度，提取和純化的工藝相對簡單，大大提高了收率 和純度，在工業(yè)化生產(chǎn)上更具優(yōu)勢。菌株保藏情況保藏于武漢中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC)，保藏編號為 CCTCCNO :M2010136，分類命名為小鏈霉菌SW0702 (Sti^ptomyces parvusSW0702)，保藏日期 為2010年6月4日。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但不能將方案中所涉及的方法及 技術(shù)參數(shù)理解為對本發(fā)明的限制。實施例1 小鏈霉菌CCTCC NO :M2010136的培養(yǎng)特征將小鏈霉菌CCTCC NO :M2010136的菌株接種于高氏一號、葡萄糖天門冬素等用于 觀察形態(tài)特征的培養(yǎng)基。28°C培養(yǎng)一定的時間5、8、10天，觀察并進行描述。表1、小鏈霉菌CCTCC NO :M2010136的菌株在各種培養(yǎng)基上的菌落特征(見表1) 實施例2 生理生化特征及碳源利用生理生化性質(zhì)采用小鏈霉菌分類中的標準方法。小鏈霉菌CCTCC NO :M2010136的生理生化反應(yīng)為該菌明膠液化緩慢，鮮黃色素。 牛奶不凝固，迅速胨化。淀粉水解。纖維素不生長。硝酸鹽還原弱，不產(chǎn)生類黑色素。利 用Biolog自動微生物鑒定系統(tǒng)考察小鏈霉菌對95種不同碳源的代謝情況將菌株接種 于BUG+B平板培養(yǎng)基，37°C恒溫培養(yǎng)16h，用無菌棉簽將平板上的菌體洗下，與接種液(GN/ GP-IF+T)混合，制成菌懸液，用濁度計調(diào)整至20%T。用8孔電動加液器將菌懸液分別加在 Biolog GP2微孔的各孔中，每孔150uL。將微孔鑒定板放在37°C培養(yǎng)箱中，分別在培養(yǎng)6h、 24h和48h后將其置于Biolog讀數(shù)儀上讀取結(jié)果。經(jīng)Biolog讀數(shù)儀分析代謝指紋，小鏈霉菌CCTCC NO :M2010136可較強利用其中22 種碳源，對其它73種碳源利用能力較弱或不能利用。系統(tǒng)給出48h鑒定結(jié)果見表2。表2小鏈霉菌CCTCC NO :M2010136對Biolog GP2板上95種碳源的利用能力 說明+，能利用碳源；-，不能利用碳源；B 利用碳源能力較弱實施例3 達托霉素的生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)1.種子菌種培養(yǎng)及保存固體培養(yǎng)基葡萄糖0. 5g，酵母膏0. 3g，麥芽汁0. 3g，CaC030. 3g，瓊脂1. 8g，加水100ml,pH7.0培養(yǎng)菌株接種于固體培養(yǎng)基斜面上，30°C培養(yǎng)7 10天。固體培養(yǎng)結(jié)束后，斜面放置4 10°C冷藏備用。2.搖瓶種子培養(yǎng)培養(yǎng)基甘油20g，可溶性淀粉80g，酵母粉6g，生豆粉20g，胰酶大豆蛋白20g， Fe (NH4) 2 (SO4) 2· 6H20 IOg,加水 2000ml，pH 7· 0接種量挖取斜面菌苔塊接入2L搖瓶種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)30°C，24h搖床轉(zhuǎn)速250rpm在菌絲長起，有明顯掛壁現(xiàn)象且菌濃為11%左右，將2L搖瓶種子培養(yǎng)液，接入以 下種子罐中。3.種子罐種子培養(yǎng)培養(yǎng)基甘油4kg，酵母粉1. 2kg，黃豆餅粉1. 6kg，NaNO3 0. 4kg，消泡劑0. 2kg， pH7. 0裝量1000L種子罐內(nèi)裝培養(yǎng)基400L, 121°C滅菌30min。接種量2L搖瓶種子液培養(yǎng)30°C，28h4.發(fā)酵培養(yǎng)培養(yǎng)基可溶性淀粉100kg，葡萄糖50kg，硝酸鉀30kg，黃豆粉100kg，谷氨酸鈉 20kg，五水硫酸亞鐵 0. 25kg，菜油 100kg, CaCO3 10kg, pH 7. 0裝量10噸發(fā)酵罐內(nèi)裝培養(yǎng)基5噸接種量400L的種子液培養(yǎng)UOrpm，30°C，140h5.發(fā)酵補料在發(fā)酵培養(yǎng)過程中pH第一次升到7. 0左右時開始補前體，補料量為0. 03ml/L發(fā)酵液.h，即每小時補150ml前體；在發(fā)酵進行到35小時左右一直到結(jié)束，補料 的量為0. 55ml/L發(fā)酵液.h，即每小時補2750ml前體。按照上述發(fā)酵條件和工藝，在10噸發(fā)酵罐進行3批發(fā)酵試驗，發(fā)酵單位分別為 3780 μ g/ml、3250 μ g/ml 禾口 3420 μ g/ml。實施例4 達托霉素的生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)1.搖瓶種子培養(yǎng)培養(yǎng)基葡萄糖100g，糖蜜40g，甘油20g，植物性蛋白胨14g，玉米漿36g，KNO3 26g，加水 2000ml, ρΗ7· 0培養(yǎng):30°C,24h, 250rpm在菌絲長起，有明顯掛壁現(xiàn)象且菌濃約13%左右，將2L搖瓶種子培養(yǎng)液，接入以 下種子罐中。2.種子罐種子培養(yǎng)種子罐培養(yǎng)甘油26kg，葡萄糖50kg酵母粉14. 2kg，生豆粉5. 2kg、胰酶大豆蛋白 4kg, Fe (NH4) 2 (SO4) 2· 6H20 0. 6kg，消泡劑 0. 16kg，ρΗ7· 0裝量2000L種子罐內(nèi)裝培養(yǎng)基800L, 121°C滅菌30min。
10
接種量2L搖瓶種子液培養(yǎng)30°C，32h3.發(fā)酵罐培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖44kg，甘蔗糖蜜31kg，黃豆粉182kg，蛋白胨165kg，乙酸鈉 48kg，硫酸亞鐵銨3kg，加水5噸，ρΗ7· 2裝量10噸發(fā)酵罐內(nèi)裝培養(yǎng)基6噸接種量800L的種子液培養(yǎng)120rpm，30°C，190h4.發(fā)酵補料在發(fā)酵培養(yǎng)過程中pH第一次升到7. 5左右時開始補前體；前體的量為0. 08ml/L 發(fā)酵液.h ；在發(fā)酵進行到38小時左右一直到結(jié)束，前體的量為0. 45ml/L發(fā)酵液.h。但在 發(fā)酵至70小時左右，暫停前體的補入而一次性補入菜油，菜油的補量以體積計為發(fā)酵罐體 積的0. 5%左右即30kg，空氣流量適當減少10 20%;菜油補料結(jié)束后4小時繼續(xù)補前體， 補料量為0. 10ml/L發(fā)酵液.h ；在補菜油后24小時，再次暫停補前體而改補菜油，一次性補 入，補料量以體積計為發(fā)酵罐體積的1. 5%左右即90kg，空氣流量繼續(xù)適當減少10 15%; 然后接著按前面所述的補前體，0. 45ml/L發(fā)酵液.h 一直到發(fā)酵結(jié)束。放罐所得發(fā)酵液效價為3100 μ g/ml。按照上述發(fā)酵條件和工藝，若在第二次補菜油后24小時，第三次補菜油，補量以 體積計為發(fā)酵罐體積的1. 0%左右即60kg，然后接著按前面所述的補前體，即以0. 25ml/L 發(fā)酵液.h—直到發(fā)酵結(jié)束。放罐時，發(fā)酵單位為3200 μ g/ml。實施例5 達托霉素的中試發(fā)酵培養(yǎng)1.搖瓶種子培養(yǎng)培養(yǎng)基麥芽糊精20g，植物性蛋白胨40g，K2HPO4IOg, pH自然，加水2000ml培養(yǎng) 300C，培養(yǎng):30°C, 25h, 250rpm在菌絲長起，有明顯掛壁現(xiàn)象且菌濃約為9%左右，將2L搖瓶種子培養(yǎng)液，接入以 下種子罐中。2.種子罐種子培養(yǎng)培養(yǎng)基葡萄糖1.7kg，土豆糊精4. 5kg，甘蔗糖蜜730g，黃豆餅粉2. 6kg， Fe (NH4) 2 (SO4) 2· 6H20 1. 2kg，消泡劑 100g，ρΗ7· 0裝量300L種子罐內(nèi)裝培養(yǎng)基100L，121°C滅菌30min。接種量2L搖瓶種子液培養(yǎng)30°C，27h3.發(fā)酵罐培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖45kg，麥芽糊精65kg，酵母粉3. 5kg，F(xiàn)e (NH4) 2 (SO4) 2x6H20 1.5kg，消泡劑 2kg，pH 7.0裝量2噸發(fā)酵罐內(nèi)裝培養(yǎng)基1噸接種量100L的種子液培養(yǎng)120rpm，30°C，160h
4、發(fā)酵補料在發(fā)酵過程中pH第一次升到8. 5左右時開始補前體，補料的量為0. 2ml/L發(fā)酵 液.h ；在發(fā)酵進行到45小時左右一直到結(jié)束，補料的量為0. 10ml/L發(fā)酵液.h。同時監(jiān)測還原糖的濃度，小于0. 9%時開始補入50%的葡萄糖2L，繼續(xù)監(jiān)測還原 糖的濃度，使之維持在左右。放罐所得發(fā)酵液效價為3200μ g/ml。實施例6 達托霉素的生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)1、搖瓶種子培養(yǎng)搖瓶種子培養(yǎng)基糊精180g，胰酶大豆蛋白8g，NaNO3 1. 0g，加2000ml水，240rpm， 30°C, 24 28h。2、種子罐培養(yǎng)種子罐培養(yǎng)基葡萄糖9kg，土豆糊精36kg，甘蔗糖蜜9kg/L，黃豆餅粉9kg， Fe (NH4) (SO) 2. 6H203kg,消泡劑 300g，pH 值 7. 2培養(yǎng)過程pH值流加氨水來控制，pH值控制在6. 5 7. 0之間。裝量1000L種子罐內(nèi)裝培養(yǎng)基600L，121°C滅菌30min。接種量2L搖瓶種子液培養(yǎng)30°C，30h3、發(fā)酵罐培養(yǎng)發(fā)酵罐培養(yǎng)基葡萄糖20kg，土豆糊精42kg，糖蜜28kg/L，酵母粉38kg， Fe (NH4)2SO4. 6H20 4kg，，消毒前加入少量高溫淀粉酶，一般3u/g，可以液化即可。裝量10噸發(fā)酵罐內(nèi)裝培養(yǎng)基6噸接種量600L的種子液培養(yǎng)120rpm，156 164h培養(yǎng)溫度30士 1°C，罐壓0. 03 0. 05MPa，空氣流量1 lvvm，攪拌轉(zhuǎn)速80 140rpm,發(fā)酵過程用濃氨水調(diào)節(jié)pH不低于6. 5，發(fā)酵過程中溶氧不低于20 %，4、發(fā)酵補料在培養(yǎng)28hr左右(此時發(fā)酵液較粘稠，菌絲生長旺盛，菌容20%以上)開始補料 流加癸酸氨(8%以癸酸重量計算)流速1.5 2.0ml/L/h至發(fā)酵結(jié)束。當癸酸加入一定量 后菌絲開始自溶，溶氧上升，可以適當降低轉(zhuǎn)速、通氣。放罐時，發(fā)酵單位為3100 μ g/ml。以上所述的實施中所獲得的發(fā)酵液單位高，雜質(zhì)少，發(fā)酵液經(jīng)過濾取濾液，通過樹 脂吸附并解吸，再進行色譜層析和純化，即可獲得純度在98%以上的達托霉素。
權(quán)利要求
一種菌株，分類命名為小鏈霉菌SW0702(Streptomyces parvus SW0702)，由武漢中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCC NOM2010136，保藏日期為2010年6月4日。
2.如權(quán)利要求1所述小鏈霉菌的CCTCCNO :M2010136的菌株在發(fā)酵制備達托霉素中的應(yīng)用。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于該制備方法包括下列步驟a.發(fā)酵菌株采用小鏈霉菌CCTCCNO :M2010136的菌株；b.菌株培養(yǎng)按常規(guī)方法制備的斜面，挖取斜面菌苔接入搖瓶種子罐培養(yǎng)得搖瓶種子 液；將搖瓶種子液接種于種子罐中培養(yǎng)；將種子罐培養(yǎng)液接種于發(fā)酵罐培養(yǎng)基培養(yǎng)，收集 發(fā)酵液；其特征在于在發(fā)酵培養(yǎng)過程中進行補料，c.發(fā)酵產(chǎn)物提取樹脂吸附并解吸，色譜層析和純化，結(jié)晶； 優(yōu)選在所述的步驟b發(fā)酵培養(yǎng)過程中進行補料。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于其所述的步驟b為按常規(guī)方法制備的斜面， 挖取0. 5 X 1. Ocm2的斜面菌苔接入搖瓶種子培養(yǎng)基，150 250rpm，培養(yǎng)16 32小時，得 搖瓶種子液；將搖瓶種子液按種子罐培養(yǎng)基體積0. 1 5%的接種量接種于種子罐，80 120rpm，培養(yǎng)16 32h ；將種子罐培養(yǎng)液按發(fā)酵培養(yǎng)基體積5 15%的量接種于發(fā)酵罐培 養(yǎng)基，120 200rpm，發(fā)酵培養(yǎng)130 240小時，收集發(fā)酵液；其中培養(yǎng)溫度均為28 32°C。
5.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征是所述的步驟b中的發(fā)酵培養(yǎng)過程中的補料為1)、待菌絲生長良好后開始補癸酸與油酸甲酯以體積比1 1的混合物料，所補的量為 0. lml/L 0. 6ml/L 發(fā)酵液.h ；或2)、待菌絲生長良好后開始流加補8%癸酸氨，流速1.0 3. 0ml/L/h ； 或3)、在發(fā)酵過程中pH第一次升到7.0 8.5時開始補癸酸與油酸甲酯以體積比1 1 的混合物料，所補的量為0. 03 0. 2ml/L發(fā)酵液.h ；在發(fā)酵進行到35 45小時左右一直 到結(jié)束，所補的量為0. 10 0. 55ml/L發(fā)酵液.h ；其中在發(fā)酵至70 78小時，暫停癸酸與油酸甲酯以體積比1 1的混合物料補料，一 次性補入菜油，所補菜油以體積計為發(fā)酵罐體積的0. 5 1. 7%，空氣流量減少10 20%; 菜油補料結(jié)束后4 8小時繼續(xù)依前方法補癸酸與油酸甲酯以體積比11的混合物料; 在補菜油后24 40小時，暫停補癸酸與油酸甲酯以體積比1 1的混合物料，再次一次性 補入菜油，所補菜油量以體積計為發(fā)酵罐體積的0. 5 1. 5%左右，空氣流量繼續(xù)減少10 20%，菜油補料結(jié)束后4 8小時繼續(xù)依前方法補癸酸與油酸甲酯以體積比1 1的混合 物料； 或4)、待菌絲生長良好后開始補癸酸與油酸甲酯以體積比1 1的混合物料，所補的量為 0. lml/L 0. 4ml/L發(fā)酵液.h，當培養(yǎng)基中的還原糖降低至以下，開始補葡萄糖，以保持 還原糖的濃度在1%。
6.
7.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征是所述的3)中的發(fā)酵培養(yǎng)過程補料在第二次補菜 油后24小時，暫停癸酸與油酸甲酯以體積比1 1的混合物料的補入，再補一次菜油，一次性補入，補量以體積計為發(fā)酵罐體積的0. 5 1. 2%，菜油補料結(jié)束后4 8小時繼續(xù)依前 方法補癸酸與油酸甲酯以體積比11的混合物料。
8.如權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征是所述的菜油的總補量以體積計為發(fā)酵罐體 積的1. 5 4. 4%。
9.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征是所述的步驟b中的培養(yǎng)基為按重量體積比計， 搖瓶罐培養(yǎng)過程中的碳源為1. 0 9. 5 %，氮源為0. 4 3. 8 %，無機鹽為0. 2 2. 5 %，種子 罐培養(yǎng)過程中的碳源為1. 0 9. 5%，氮源為0. 8 3. 8%，無機鹽為0. 2 2. 5%，其余為 水；其中碳源選自麥芽糊精、淀粉、淀粉水解糖、糖蜜、糊精、甘油、葡萄糖、麥芽糖、麥芽汁、 土豆浸出粉、土豆糊精、燕麥片中的一種或幾種；所述的氮源選自黃豆餅粉、玉米漿、玉米蛋 白、蛋白胨、植物性蛋白胨、胰酶大豆蛋白、肉胨、尿素、硫酸亞鐵銨、酵母粉、酵母浸出物、生 豆粉、硝酸鹽、味精中的幾種；無機鹽選自K2HP04、NaCl, Fe (NH4)2(SO4)2. 6H20、NaNO3 > KNO3 > MgSO4. 7H20、FeSO4. 7H20、KH2PO4 中的一種或幾種；發(fā)酵培養(yǎng)過程中，碳源為1.5 15%，氮源為0.5 7.0%，無機鹽為0. 1 2.0%氨 基酸0 1. 5%，其余為水；其中碳源選自麥芽糊精、淀粉、可溶性淀粉、淀粉水解糖、甘蔗糖 蜜、甜菜糖蜜、糊精、甘油、菜油、葡萄糖、麥芽糖、麥芽汁、土豆浸出粉、土豆糊精、燕麥片中 的一種或幾種；所述的氮源選自黃豆餅粉、玉米漿、玉米蛋白、蛋白胨、植物性蛋白胨、胰酶 大豆蛋白、肉胨、尿素、硫酸亞鐵銨、酵母粉、酵母浸出物、生豆粉、硝酸鹽、味精中的幾種；無 機鹽選自 K2HP04、NaCl、Fe(NH4)2(S04)2· 6H20、NaN03、KNO3、MgSO4. 7H20、FeS04. 7H20、CH3COONa、 CaCO3中的一種或幾種。
10.如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征是所述的其特征是所述的步驟b中的培養(yǎng)基為 按重量體積比計，搖瓶培養(yǎng)過程中的碳源為8. 0 9. 0%，氮源為2. 0 2. 8%，無機鹽為0. 5 1. 3%， 種子罐培養(yǎng)過程中的碳源為7. 0 9. 0%，氮源為2. 0 3. 0%，無機鹽為0. 5 1. 3%，其 余為水；其中碳源選自淀粉水解糖、糖蜜、麥芽糊精、甘油、葡萄糖、土豆糊精中的一種或幾 種；所述的氮源為生豆粉、胰酶大豆蛋白、酵母粉三種或植物性蛋白胨、胰酶大豆蛋白二種； 無機鹽選自Fe (NH4) 2 (SO4) 2. 6H20、KNO3中的一種或幾種；發(fā)酵培養(yǎng)過程中，碳源為5 11%，氮源為0. 7 3%，無機鹽為0. 5 1. 3%，氨基酸 0.3 0.9%，其余為水；其中碳源選自甘蔗糖蜜、可溶性淀粉、麥芽糊精、葡萄糖、菜油、土 豆糊精中的一種或幾種；所述的氮源為黃豆粉、KN03、谷氨酸鈉三種或蛋白胨、尿素、硫酸亞 鐵銨、酵母粉四種；無機鹽選自 Fe (NH4) 2 (SO4) 2. 6H20、NaNO3> KNO3> CH3COONa, CaCO3 中的一種 或幾種。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種小鏈霉菌及其在達托霉素制備中的應(yīng)用，該菌株由中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號為CCTCC NOM2010136，保藏日期為2010年6月4日。本發(fā)明制備達托霉素的方法為a.采用小鏈霉菌CCTCC NOM2010136為發(fā)酵菌株；b.菌株培養(yǎng)斜面菌苔接入搖瓶種子罐培養(yǎng)得搖瓶種子液；將搖瓶種子液接種于種子罐中培養(yǎng)；將種子罐培養(yǎng)液接種于發(fā)酵罐培養(yǎng)基培養(yǎng)，收集發(fā)酵液；發(fā)酵培養(yǎng)過程中進行補料，c.發(fā)酵產(chǎn)物提取。本發(fā)明提供的發(fā)酵工藝經(jīng)過中試和10噸發(fā)酵罐中進行試驗，其生產(chǎn)能力穩(wěn)，發(fā)酵單位高且發(fā)酵副產(chǎn)物相對較少，大大地降低了后提取的難度，適宜于工業(yè)化大生產(chǎn)。
文檔編號C12R1/465GK101899410SQ201010225330
公開日2010年12月1日 申請日期2010年7月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月13日
發(fā)明者朱健, 李艷, 王蓓, 許永鋒, 陳曉霞, 高興蓉 申請人:杭州華東醫(yī)藥集團生物工程研究所有限公司