專利名稱：黑色素前體的制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種通過酶反應(yīng)有效地從酪氨酸或其衍生物制造黑色素前體的制造 方法。
背景技術(shù)：
已知5，6_ 二羥基吲哚滿等黑色素前體通過空氣中的氧而轉(zhuǎn)變?yōu)楹谏?，利用這 一點(diǎn)而將其用于空氣氧化型染發(fā)劑中。作為在染發(fā)劑中使用的黑色素前體的獲得方法，是通過化學(xué)合成反應(yīng)進(jìn)行制造 的，但是，存在有副反應(yīng)引起的收率下降、單離目的反應(yīng)產(chǎn)物等引起的時間消耗、成本高、擔(dān) 心因溶劑殘留產(chǎn)生的影響等問題。此外，作為通過酶反應(yīng)制造黑色素前體的技術(shù)，已知有使 用漆酶制造吲哚類或吲哚滿類的方法(專利文獻(xiàn)1)。但是，使用的漆酶需要從漆樹等植物 中精制等。此外，在制造效率性、以及得到的黑色素前體不兼?zhèn)淙旧院头€(wěn)定性方面，也是 不充分的。另一方面，在專利文獻(xiàn)2中，公開了來自新型曲霉菌的酪氨酸酶基因MelB。專利文獻(xiàn)1 日本專利特開2002-291496號公報專利文獻(xiàn)2 日本專利特開2002-191366號公報

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種黑色素前體的制造方法，包括工序(a)，在反應(yīng)液中，使用 選自曲霉(Aspergillus)屬、脈胞菌(Neurospora)屬、根毛霉(Rhizomucor)屬、木霉 (Trichoderma)屬和青霉(Penicillium)屬的絲狀菌的兒茶酚氧化酶或表達(dá)所述酶的細(xì) 胞，對酪氨酸或其衍生物進(jìn)行氧化，將其轉(zhuǎn)變?yōu)楹谏厍绑w的工序；工序(b)，從所述反應(yīng) 液中除去所述酶或所述細(xì)胞的工序；工序(c)，在所述工序(a)或(b)后，對所述反應(yīng)液進(jìn) 行處理，提高5，6- 二羥基吲哚和/或5，6- 二羥基吲哚-2-羧酸的濃度的工序；所述黑色素 前體包含多巴色素(D0pachr0me)、5，6-二羥基吲哚和5，6-二羥基吲哚-2-羧酸。


圖1是表示在制造例1中，酪氨酸酶產(chǎn)生細(xì)胞引起的L-DOPA氧化反應(yīng)的反應(yīng)液中 的L-DOPA濃度和黑色素前體濃度推移的圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明涉及一種通過酶反應(yīng)有效地從酪氨酸或其衍生物制造黑色素前體，并將其 作為染料使用，而使染色性和制造簡便性提高的空氣氧化型染發(fā)劑。
本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，含有使用特定的方法通過酶或含有酶的菌體制造的黑色素 前體的空氣氧化型染發(fā)劑，顯示了優(yōu)異的性能。所謂在本發(fā)明中使用的黑色素前體，是從酪氨酸或其衍生物制造的，并且能夠用 于空氣氧化型染發(fā)劑的染料，即通過空氣中的氧迅速氧化聚合而形成黑色素的物質(zhì)，作為 具體例子，可以列示5，6- 二羥基吲哚滿、5，6- 二羥基吲哚滿-2-羧酸等吲哚滿衍生物，5， 6- 二羥基吲哚、5，6- 二羥基吲哚-2-羧酸等吲哚衍生物等。由于DOPA的氧化聚合速度慢， 缺乏作為染發(fā)劑用染料的實(shí)用性，所以，不包含在本發(fā)明所說的黑色素前體中。此外，作為 來自酪氨酸的氧化反應(yīng)中間體，存在有多巴色素、吲哚醌等，但由于它們只在短時間穩(wěn)定， 不具有長時間(例如1個月)的穩(wěn)定性，所以不能用作染發(fā)劑用染料。因此，它們也不包含 在本發(fā)明所說的黑色素前體中。但是，當(dāng)能夠通過一般的化學(xué)處理等從這些中間體制造具 有作為上述空氣氧化型染發(fā)劑的要素的穩(wěn)定化合物時，這樣的穩(wěn)定化合物就包含在本發(fā)明 所說的黑色素前體中。此外，在本發(fā)明中的黑色素前體不一定限于單體，也可以包含滿足上 述空氣氧化型染料的要素的二倍體以上的低聚物。在本發(fā)明中使用的黑色素前體由以下方 法制造。-氧化工序(A)-〈原料〉作為原料(底物化合物)，使用酪氨酸或其衍生物。作為具體例子，可以列舉(1) D型或L型酪氨酸、(2)D型或L型多巴(D0PA;3-(3，4-二羥基苯基)丙氨酸)、(3)多巴 胺(Dopamine ；3，4-二羥基苯基乙胺)、(4)酪氨酸的低級(C1-4)烷基酯、(5) DOPA的低級 (C1-4)烷基酯、(6)N-烷氧基(例如乙酰氧基)化或N-烷基(例如乙基)化的DOPA或酪 氨酸等，也可以是其異構(gòu)體。其中，從可以得到天然型黑色素前體出發(fā)，優(yōu)選L-酪氨酸和 L-D0PA,從對酶的親和性出發(fā)，更優(yōu)選L-D0PA。這些酪氨酸或其衍生物，都可以單獨(dú)或組合 2種以上使用?！达@示兒茶酚氧化酶活性的酶〉所謂兒茶酚氧化酶活性，指的是催化由兒茶酚的氧化引起鄰醌生成的活性。在具 有兒茶酚氧化酶活性的酶(以下簡稱為“兒茶酚氧化酶”)中，包含稱為兒茶酚氧化酶、單 酚氧化酶、二酚氧化酶、鄰二酚酶、酪氨酸酶等酶。這些酶通常具有單酚氧化酶的活性。此 外，不具有單酚氧化酶的活性，但具有多酚氧化酶活性的漆酶、過氧物酶也被包含在具有兒 茶酚氧化酶活性的酶中。其中，從因?qū)-DOPA的親和性高而能夠有效制造天然型黑色素前 體的方面出發(fā)，優(yōu)選使用酪氨酸酶。此外，當(dāng)使用酪氨酸作為底物化合物時，優(yōu)選使用酪氨 酸酶。兒茶酚氧化酶可以是來自任何生物的酶，但從表達(dá)效率高，并且在宿主細(xì)胞內(nèi)穩(wěn) 定的方面出發(fā)，優(yōu)選來自絲狀菌的酪氨酸酶。此外，在進(jìn)行從酪氨酸衍生物到黑色素前體 的氧化反應(yīng)的工序中，為了不使原料殘留，優(yōu)選反應(yīng)收率(相對底物的氧化生成物的比例) 高的酶。作為這樣的絲狀菌，可以列舉曲霉(Aspergillus)屬、脈胞菌(Neurospora)屬、根 毛霉(Rhizomucor)屬、木霉(Trichoderma)屬和青霉(Penicillium)屬等。其中，從對熱 比較穩(wěn)定，并且安全性確切的方面出發(fā)，優(yōu)選曲霉屬絲狀菌的酪氨酸酶，具體來說，可以列 舉與米曲霉(Aspergillus oryzae)的melB基因(日本專利特開2002-191366號公報)、 melD基因(日本專利特開2004-201545號公報)或melO基因(Molecular cloning andnucleotide sequence of the protyrosinase gene，melO，from Aspergillus oryzae and expression of the gene in yeast cells. Biochim Biophys Acta. 1995Mar 14 ；1261 (1) 151-154)編碼的酪氨酸酶實(shí)質(zhì)上同一的酶。在本發(fā)明中，所謂與上述基因(melB基因、melD基因或melO基因)“實(shí)質(zhì)上同一”， 指的是和其中任一種以上基因，作為氨基酸序列具有70%以上、更優(yōu)選具有80%以上、最 優(yōu)選具有90%以上的相同性，并且具有酪氨酸酶活性或單酚氧化酶活性。這樣的酶從多巴 向多巴色素的反應(yīng)收率高，能夠有效降低在可以進(jìn)行氧化反應(yīng)的氧化工序中的最終多巴濃度。上述酶可以直接向反應(yīng)液中添加使用。此外，從提高酶的穩(wěn)定性、使用后的容易分 離程度、避免蛋白質(zhì)混入反應(yīng)系統(tǒng)的方面出發(fā)，也優(yōu)選制成固定化酶。酶的固定化方法沒有 特別限定，例如，可以列舉通過固定化載體將酶分子之間進(jìn)行交聯(lián)的方法、使之內(nèi)包在藻酸 凝膠這樣的凝膠中的方法等公知的固定化方法。酶既可以是含有來自生物夾雜物的粗標(biāo) 品，也可以是精制酶，但在固定化時，希望是精制的酶。〈顯示兒茶酚氧化酶活性的細(xì)胞〉作為顯示兒茶酚氧化酶活性的細(xì)胞，使用相當(dāng)于以下(a) (d)的1種以上的細(xì) 胞。(a)使編碼具有兒茶酚氧化酶活性的多肽的基因在比原本表達(dá)的啟動子更高活性 的啟動子的下游表達(dá)的細(xì)胞。(b)具有多拷貝的編碼具有兒茶酚氧化酶活性的多肽基因的細(xì)胞。(C)通過具有編碼具有兒茶酚氧化酶活性的多肽的突變基因而顯示高兒茶酚氧化 酶活性的細(xì)胞。(d)通過進(jìn)行酪氨酸酶活化處理而顯示高兒茶酚氧化酶活性的細(xì)胞。關(guān)于(a)，例如，將兒茶酚氧化酶基因克隆入在蛋白質(zhì)大量表達(dá)中通常使用的載體 中后，將該重組載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，培養(yǎng)以重組入宿主染色體中的狀態(tài)或者以質(zhì)粒狀態(tài) 含有該基因的宿主細(xì)胞，由此能夠大量產(chǎn)生兒茶酚氧化酶。由此，在比原本表達(dá)該基因的啟 動子更高活性的啟動子下游表達(dá)該基因即可。關(guān)于(b)，例如，使用將兒茶酚氧化酶基因?qū)肽軌虮３侄嗫截悆翰璺友趸富?的2倍體以上的細(xì)胞后的細(xì)胞即可。此外，例如在實(shí)用酵母中，因?yàn)橐泊嬖?倍體和4倍體 的細(xì)胞，所以這些也可以適合地使用。這樣，通過使該基因的拷貝數(shù)多于原本的拷貝數(shù)，就 能夠制成顯示高兒茶酚氧化酶活性的細(xì)胞。關(guān)于(C)，也可以使用通過兒茶酚氧化酶基因的突變而兒茶酚氧化酶活性變高的 細(xì)胞，或?qū)⑦@樣的突變兒茶酚氧化酶基因?qū)牒蟮募?xì)胞。這樣，通過制作顯示比天然型酶更 高活性的突變型酶，就能夠制成顯示高兒茶酚氧化酶活性的細(xì)胞。關(guān)于(d)，也可以使用通過實(shí)施使2價銅離子配位的處理、和以pH2. 8 3. 2的酸 性溶液的處理等，而提高了該兒茶酚氧化酶活性的細(xì)胞。其中，優(yōu)選(a)使編碼具有兒茶酚氧化酶活性的多肽的基因在比原本表達(dá)的啟動 子更高活性的啟動子的下游表達(dá)的細(xì)胞。產(chǎn)生兒茶酚氧化酶的細(xì)胞種類沒有特別的限定，但從容易大量培養(yǎng)方面出發(fā)，優(yōu) 選為微生物。作為容易使用的微生物，可以列舉大腸桿菌、酵母和絲狀菌。其中，酵母由于安全、兒茶酚氧化酶的產(chǎn)生效率高，而且是單細(xì)胞，并且細(xì)胞沉降速度快，因此在反應(yīng)后能夠 以轉(zhuǎn)速比較低的離心分離來進(jìn)行分離，因此優(yōu)選使用。其中，由于釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的菌體堅(jiān)固，因此能夠抑制來自菌體的蛋白質(zhì)向反應(yīng)液中流出，并且基因操作 容易，因此優(yōu)選使用。此外，從有效的利用、使用后分離的容易程度的方面出發(fā)，也可以使用以載體結(jié)合 法、包埋法、交聯(lián)法、光交聯(lián)法等公知的方法固定化的細(xì)胞。<活化處理>為了顯示酪氨酸酶等兒茶酚氧化酶活性，需要在催化活性中心配位2價銅離子。 在野生型細(xì)胞中，因?yàn)閮翰璺友趸傅谋磉_(dá)量少，所以，通過在該細(xì)胞內(nèi)存在的2價銅離子 的配位就顯示了充分的活性，但是在兒茶酚氧化酶表達(dá)量通過轉(zhuǎn)化等得以提高的細(xì)胞中， 有時不能得到充分的兒茶酚氧化酶活性。因此，在使用顯示兒茶酚氧化酶活性的酶、細(xì)胞的 任一種時，也優(yōu)選通過預(yù)先以2價銅離子處理酶或細(xì)胞，而使2價銅離子配位在兒茶酚氧化 酶的催化活性中心。具體來說，優(yōu)選通過將酶或轉(zhuǎn)化體懸浮在0. 1 2mM左右的硫酸銅溶 液等中，在30 40°C左右下靜置0. 5 2小時左右，使2價銅離子充分地配位在細(xì)胞內(nèi)的 兒茶酚氧化酶中。此外，在兒茶酚氧化酶中，酪氨酸酶，特別是來自米曲霉的酪氨酸酶通過以 PH2. 8 3. 2左右的酸性溶液處理而成熟化、活化。因此，在使用顯示兒茶酚氧化酶活性的 酶、細(xì)胞的任一種時，例如，也優(yōu)選通過懸浮在20 200mM左右的醋酸鈉緩沖溶液(pH = 3) 中，在0 40°C左右下靜置0. 5 1小時左右，進(jìn)一步提高兒茶酚氧化酶活性。此外，兒茶酚氧化酶也可以通過以胰蛋白酶等選擇性地切斷特定肽鍵的內(nèi)肽酶這 樣的蛋白酶處理來活化。通過蛋白酶處理，切除在酶的N末端和/或C末端側(cè)的序列，提高 酶活性。當(dāng)細(xì)胞是酵母時，使用L-DOPA作為底物時，優(yōu)選使用具有0. 1U/0D_以上、更優(yōu)選 具有0. 5U/0D_以上、進(jìn)一步優(yōu)選具有1U/0D600以上的兒茶酚氧化酶活性的細(xì)胞。當(dāng)為酵 母以外的細(xì)胞時，也可以使用具有同樣的兒茶酚氧化酶活性的細(xì)胞。細(xì)胞的兒茶酚氧化酶 活性的上限沒有特別限定，通常為5U/0D_左右。當(dāng)使用顯示兒茶酚氧化酶活性的酶、細(xì)胞的任一種時，在使用Imol的L-DOPA作為 底物時，通常優(yōu)選在5X 105U/mol以上，更優(yōu)選在5X 106U/mol以上。每Imol L-DOPA的兒 茶酚氧化酶活性的上限沒有特別的限定，通常，只要是5X107U/mol左右就是充分的，在此 以上成本就變高。此外，在本發(fā)明中，酶或細(xì)胞的兒茶酚氧化酶活性，是以在30°C下使酶或細(xì)胞與 ImL含有0. 8 μ mol DOPA的溶液反應(yīng)5分鐘時，使在475nm的吸光度增加1個吸光度的活性 作為1U，細(xì)胞的兒茶酚氧化酶活性，是將其除以在反應(yīng)中使用的菌體密度(在600nm的吸光 度；OD6J 后的值(U/0D6QQ)。在本發(fā)明方法中，通過使兒茶酚氧化酶相對于底物為過剩存在的狀態(tài)，從底物化 合物生成的黑色素前體進(jìn)行進(jìn)一步聚合，黑色素生成速度更快，從底物化合物生成黑色素 前體，黑色素前體在反應(yīng)系統(tǒng)中高效地積累。< 反應(yīng) >反應(yīng)開始時的原料(底物化合物)的濃度，通常為10 60mM左右，更優(yōu)選為15
625mM左右。如果在上述范圍內(nèi)，則在能夠得到充分量的黑色素前體的同時，不會產(chǎn)生由黑色 素生成量過度增加而引起黑色素前體收率下降和未反應(yīng)底物的殘留。此外，當(dāng)使用D0PA、 Dopamine等作為原料時，作為染發(fā)劑的原料，在安全性上不理想。因此，優(yōu)選在本氧化工序 中消耗，使得在染發(fā)劑中實(shí)質(zhì)上不含有作為原料或中間體的DOPA或Dopamine。作為更優(yōu) 選的形態(tài)，可以列舉以L-DOPA為原料，使其濃度在反應(yīng)開始時在15mM以上，反應(yīng)結(jié)束時在 0. ImM以下的氧化工序。此外，在由酶催化的從DOPA開始的反應(yīng)工序中的多巴色素等的氧 化生成物的收率，在使其大概為30 70%的范圍是經(jīng)濟(jì)的，因而優(yōu)選。此外，反應(yīng)液的pH，只要是酶可以催化底物氧化反應(yīng)的范圍即可，但從抑制黑色素 的生成、在反應(yīng)液中使黑色素前體高效積累的方面出發(fā)，通常優(yōu)選維持在4 9左右，更優(yōu) 選維持在5 7左右。通過使用緩沖液作為反應(yīng)液，反應(yīng)液的pH也能夠維持在上述范圍內(nèi)， 但是由于鹽濃度一旦增高，有時就會因黑色素前體聚合而促進(jìn)黑色素生成，因此，優(yōu)選通過 少量添加氫氧化鉀、氫氧化鈉等強(qiáng)堿或硫酸、鹽酸等強(qiáng)酸來調(diào)整。反應(yīng)液中的細(xì)胞量，從反應(yīng)后的菌體分離容易、提高黑色素前體的收率的方面出 發(fā)，在實(shí)現(xiàn)上述兒茶酚氧化酶活性的范圍內(nèi)越少越好，細(xì)胞投入量優(yōu)選相對于反應(yīng)液在20 容量％以下，更優(yōu)選在10容量％以下。反應(yīng)溫度，只要是酶可以催化底物氧化反應(yīng)的范圍即可，但從充分地進(jìn)行氧化 反應(yīng)、防止酶失活、抑制黑色素化的方面出發(fā)，優(yōu)選維持在5 40°C，更優(yōu)選維持在15 350C，進(jìn)一步優(yōu)選維持在20 30°C。剛開始反應(yīng)后，因?yàn)樵谘趸磻?yīng)中必須有大量的氧，所以，優(yōu)選通過攪拌反應(yīng)液而 大量地通氣。但是，由于攪拌速度一過快，就會引起細(xì)胞的損傷等，所以，優(yōu)選監(jiān)視反應(yīng)液中 的氧濃度，如果氧濃度不再下降，就減少通氣量和攪拌速度。反應(yīng)液中的氧濃度優(yōu)選維持在 0. 1 Sppm左右，更優(yōu)選維持在1 2ppm左右。當(dāng)通過通氣和攪拌而在反應(yīng)液中產(chǎn)生大量 氣泡時，也可以添加有機(jī)硅樹脂那樣的消泡劑。反應(yīng)可以以間歇式和連續(xù)式中的任一種進(jìn)行，但從可以分離未反應(yīng)的底物和生成 物的方面出發(fā)，優(yōu)選間歇式。采用間歇式時的反應(yīng)時間，從將黑色素前體的聚合反應(yīng)抑制 在最小限度的同時將底物化合物充分地轉(zhuǎn)變?yōu)楹谏厍绑w的方面出發(fā)，通常優(yōu)選為10分 鐘 2小時左右，更優(yōu)選為30分鐘 1小時左右。采用連續(xù)式時，將底物供給含有細(xì)胞的反應(yīng)容器，使得底物濃度為10 60mM左 右，更為15 25mM左右，同時連續(xù)地回收反應(yīng)液即可。或者，向充填了將酶或細(xì)胞固定化 的載體柱中添加1 IOmM左右、更為3 6mM左右的底物，和作為電子供給體的2倍于底 物濃度的過氧化氫即可。當(dāng)使用酪氨酸或DOPA作為底物化合物時，通過上述酶反應(yīng)，底物化合物被氧化， 生成多巴色素(Dopachrome)。這里，如果使用抗壞血酸、連二亞硫酸等還原劑使反應(yīng)停止 和還原，作為黑色素前體，就可以得到5，6- 二羥基吲哚滿-2-羧酸。此外，如果進(jìn)一步保持 該反應(yīng)液，通過多巴色素的自發(fā)脫碳酸，就生成5，6- 二羥基吲哚，或者，通過在細(xì)胞中所含 的多巴色素互變異構(gòu)酶、或通過非酶的異構(gòu)化，從多巴色素生成5，6- 二羥基吲哚-2-羧酸。 由此，可以得到包含多巴色素、5，6_二羥基吲哚和5，6_二羥基吲哚-2-羧酸的黑色素前體。 這些黑色素前體的反應(yīng)收率，優(yōu)選為20 70%，更優(yōu)選為40 70%。此外，例如使用多巴胺(Dopamine)作為底物化合物時，通過底物化合物的氧化生成多巴胺的醌體。這里，如果使用連二亞硫酸等還原劑使反應(yīng)停止或還原，就可以得到5， 6-二羥基吲哚滿。此外，如果進(jìn)一步保持該反應(yīng)液，就生成二羥基吲哚。而且，在黑色素前 體中，有時也含有其2 5分子左右聚合的水溶性低聚物。如果使用烷基酯作為底物化合物，則能夠制作生成黑色以外的黑色素的黑色素前 體。作為具體例子，如果使用酪氨酸乙酯、DOPA乙酯等作為原料，則由生成的黑色素前體聚 合后的黑色素就成為黃色，能夠用于染發(fā)劑的調(diào)色。-后處理工序(B)-作為在本發(fā)明的染發(fā)劑中使用的黑色素前體的制造方法的氧化工序(A)，是通過 以上所示的酶或菌體引起的反應(yīng)。以下，記述用于在染發(fā)劑中使用的后處理工序(B)。(1)黑色素前體的回收在含有通過氧化工序(A)得到的黑色素前體的反應(yīng)液中，除黑色素前體外，也包 含使用的酶或細(xì)胞，還包含因通氣和攪拌引起細(xì)胞破損而產(chǎn)生的蛋白質(zhì)或從細(xì)胞流出的蛋 白質(zhì)、和黑色素前體聚合后的黑色素。因此，為了作為染發(fā)劑用的染料而利用，需要將其從 反應(yīng)液中除去。酶或細(xì)胞的除去可以通過超濾、過濾、離心分離等方法進(jìn)行，回收后的酶或 細(xì)胞可以返回氧化工序用容器再利用。此外，蛋白質(zhì)和黑色素的除去可以通過超濾、凝膠過 濾色譜法等方法進(jìn)行。在氧化工序(A)中得到的黑色素前體，是成為分子量在3000以上的高分子物(黑 色素)之前的狀態(tài)，即從具有吲哚或吲哚滿骨架的各種單體至低聚物的狀態(tài)(分子量小于 3000)，主要包括多巴色素或5，6- 二羥基吲哚滿-2-羧酸。在本發(fā)明中，也可以將該粗黑色 素前體作為空氣氧化型染發(fā)劑的染料配合，配制組合物。此外，將在本發(fā)明的氧化工序中得到的黑色素前體進(jìn)行氧化聚合，作為分子量僅 為3000以上的黑色素，也能夠配合在毛發(fā)用化妝材料(免洗型或沖洗型)中。例如，可以 列舉洗發(fā)水、染發(fā)液、護(hù)發(fā)素、發(fā)膠、定型劑、電燙劑、蠟、亮發(fā)劑、生發(fā)劑等。(2)黑色素前體組成的調(diào)整在本發(fā)明中，根據(jù)目的，優(yōu)選在經(jīng)過提高以下所示的黑色素前體溶液中的5，6_ 二 羥基吲哚和5，6_ 二羥基吲哚-2-羧酸中的任一種的濃度的工序(工序(I ))之后，再配 合于染發(fā)劑中。本工序既可以在上述回收工序(除去來自反應(yīng)液的酶、細(xì)胞、蛋白質(zhì)、黑色 素等)之前進(jìn)行，也可以在之后進(jìn)行，還可以二者兼用，也可以在以下所示的工序(I )的 環(huán)境下進(jìn)行回收工序，在工序(I )的處理時間中包含回收工序的時間。優(yōu)選經(jīng)過提高 5,6- 二羥基吲哚和5，6- 二羥基吲哚-2-羧酸濃度的工序，再配合于染發(fā)劑中。作為更優(yōu) 選的形態(tài)，如果處于以5，6-二羥基吲哚為主要成分，與此相對含有少量的5，6-二羥基吲 哚-2-羧酸的狀態(tài)，則制成染發(fā)劑后就可以染為自然色調(diào)。作為提高在工序(I )中的上述任一種化合物濃度的方法，可以列舉(i)pH調(diào)整 處理、(ii)添加水溶性有機(jī)溶劑、(iii)添加無機(jī)鹽、(iv)利用緩沖液進(jìn)行處理、(ν)添加 抗氧化劑等。這些也可以組合2種以上使用，例如，在上述(i)pH調(diào)整處理時，組合(ii) (ν)的任一種以上，就可以更有效地完成本工序。(i)pH調(diào)整處理作為pH的調(diào)整范圍，優(yōu)選為pH5 11，更優(yōu)選為pH5 10，進(jìn)一步優(yōu)選為pH6 9， 只要在該范圍內(nèi)，就有效地進(jìn)行向吲哚衍生物的轉(zhuǎn)變。與此相對，在強(qiáng)酸性中發(fā)生沉淀，在
8強(qiáng)堿性中加速氧化聚合而生成黑色素。此外，優(yōu)選在厭氧條件下進(jìn)行處理，但在工序(I ) 時，只要能夠得到充分的收量，也不一定否定氧的存在。這里，通過將pH調(diào)整為中性 弱酸性側(cè)或堿性側(cè)，可以調(diào)整黑色素前體的組成， 使得所希望的化合物的比例提高。例如，從多巴色素或5，6_ 二羥基吲哚滿-2-羧酸向5， 6- 二羥基吲哚的轉(zhuǎn)變?nèi)菀自趐H5以上、8以下時發(fā)生，從5，6- 二羥基吲哚滿-2-羧酸向5， 6-二羥基吲哚-2-羧酸的轉(zhuǎn)變?nèi)菀自趐H8以上、11以下發(fā)生。即，在中性 酸性區(qū)域，生成 5,6- 二羥基吲哚，在堿性區(qū)域，有效地生成5，6- 二羥基吲哚-2-羧酸。pH調(diào)整時的溫度，優(yōu)選為5 40°C，更優(yōu)選為15 30°C，通常在室溫狀態(tài)進(jìn)行pH 調(diào)整即可。也可以將5，6_ 二羥基吲哚滿衍生物變化的時間作為指標(biāo)而保持處理時間。根 據(jù)溫度，也可以在30分鐘以上，因?yàn)檗D(zhuǎn)變物(5，6-二羥基吲哚衍生物)比較穩(wěn)定，所以，在 工序(I )后，如果在隔絕氧的狀態(tài)下，即使放置長時間，例如放置1周以上也沒有問題。(ii)添加水溶性有機(jī)溶劑作為水溶性有機(jī)溶劑，可以使用具有在水中10重量％以上相溶性(在90g水中溶 解IOg以上)的有機(jī)溶劑，例如，可以使用甲醇、乙醇、苯甲醇等醇類，聚乙二醇、甘油等多元 醇，丙酮等酮類，乳酸、檸檬酸等有機(jī)酸類，醋酸、丙酸等脂肪酸類，烷基胺類，一乙醇胺等烷 基醇胺類等。其中，從安全性出發(fā)，更優(yōu)選乙醇、丙酮。特別是通過醇類、多元醇類、酮類、有機(jī)酸類或脂肪酸類的添加，可以促進(jìn)從5， 6- 二羥基吲哚滿-2-羧酸向5，6_ 二羥基吲哚的轉(zhuǎn)變。例如，通過添加50重量％的乙醇， 從5，6- 二羥基吲哚滿-2-羧酸向5，6- 二羥基吲哚的轉(zhuǎn)變被促進(jìn)大約2倍。此外，通過上 述烷基胺類或烷醇胺類的添加，可以促進(jìn)從5，6_ 二羥基吲哚滿-2-羧酸向5，6_ 二羥基吲 哚-2-羧酸轉(zhuǎn)變。例如，通過添加5 50重量％的一乙醇胺，就能夠以70%以上的選擇性 從5，6- 二羥基吲哚滿-2-羧酸向5，6- 二羥基吲哚-2-羧酸轉(zhuǎn)變。水溶性有機(jī)溶劑優(yōu)選以總量中的5 70重量％，更優(yōu)選為30 60重量％的濃度 添加于反應(yīng)液中。即使溶劑添加量多，也沒有特別的問題，相反，具有轉(zhuǎn)變速度變快、能夠除 去生成的黑色素這樣的效果，但只要上述范圍內(nèi)，就能夠在實(shí)際應(yīng)用上，在可以使5，6_ 二 羥基吲哚衍生物的比例提高的同時安全地進(jìn)行后處理。(iii)添加無機(jī)鹽作為無機(jī)鹽，可以使用選自鹽酸、硝酸、硫酸和碳酸的堿金屬鹽、堿土類金屬鹽或 銅(II )鹽。其中，銅(II )鹽可以促進(jìn)5，6_ 二羥基吲哚滿-2-羧酸向5，6_ 二羥基吲 哚-2-羧酸的轉(zhuǎn)變，此外，銅(II )鹽以外的無機(jī)鹽可以促進(jìn)5，6_ 二羥基吲哚滿-2-羧酸 向5，6_ 二羥基吲哚的轉(zhuǎn)變。從轉(zhuǎn)變效率、防止鹽和黑色素析出的方面出發(fā)，反應(yīng)液中的無 機(jī)鹽濃度優(yōu)選在40重量％以下，更優(yōu)選為0. 1 20重量％，進(jìn)一步優(yōu)選為1 5重量％。作為添加無機(jī)鹽，例如，列舉硫酸銅處理，通過向反應(yīng)液中添加添加硫酸銅，使其 為0. 1 20mM左右，優(yōu)選5 10mM，保存例如10 30分鐘左右，就促進(jìn)黑色素前體中的 5,6- 二羥基吲哚滿-2-羧酸向5，6- 二羥基吲哚-2-羧酸的轉(zhuǎn)變。(iv)利用緩沖液進(jìn)行處理作為緩沖液，可以列舉磷酸緩沖液。作為磷酸緩沖液，可以列舉磷酸鈉緩沖液、磷 酸鉀緩沖液、檸檬酸-磷酸鈉緩沖液、三磷酸緩沖液。通過磷酸緩沖液處理，可以促進(jìn)5， 6- 二羥基吲哚滿-2-羧酸向5，6- 二羥基吲哚-2-羧酸的轉(zhuǎn)變。
(ν)添加抗氧化劑作為抗氧化劑，可以使用抗壞血酸、抗壞血酸鈉、亞硫酸鈉等，若添加2. 5重量％ 的抗壞血酸鈉，則促進(jìn)從5，6- 二羥基吲哚滿-2-羧酸向5，6- 二羥基吲哚的轉(zhuǎn)變速度。(3)黑色素前體的濃縮·保存含有黑色素前體的液體，優(yōu)選以反滲透濃縮、噴霧干燥、冷凍濃縮等公知方法除去 水分、濃縮黑色素前體。進(jìn)而，黑色素前體的單獨(dú)品或混合物，還可以直接、以濃縮狀態(tài)、以 干燥粉末狀態(tài)等任意一種形態(tài)保存。進(jìn)而，例示特定的黑色素前體的保存方法，5，6_ 二羥基吲哚滿、5，6_ 二羥基吲哚 滿-2-羧酸等吲哚滿衍生物優(yōu)選以粉末狀的鹽形態(tài)(優(yōu)選鹽酸鹽、溴酸鹽等)，優(yōu)選在無氧 條件下保存。此外，5，6_ 二羥基吲哚、5，6_ 二羥基吲哚-2-羧酸等吲哚衍生物可以在實(shí)質(zhì) 上無氧的條件下，以溶液或粉末狀態(tài)保存。作為以染發(fā)劑利用的形態(tài)，5，6- 二羥基吲哚滿、5，6- 二羥基吲哚滿-2-羧酸等吲 哚滿衍生物，優(yōu)選在使用前以無氧狀態(tài)并且與水隔絕的狀態(tài)(包含粉末狀、油劑中的懸浮 狀態(tài))保管，在臨使用前，和水、堿劑等一般的染發(fā)劑基劑混合，直接涂布在毛發(fā)上作為染 發(fā)劑使用。此時，雖然是空氣氧化型染發(fā)劑，但是從黑色素前體的穩(wěn)定性出發(fā)，優(yōu)選制成伴 隨混合等操作的雙劑型或三劑型。另一方面，由于5，6- 二羥基吲哚、5，6- 二羥基吲哚-2-羧酸等吲哚衍生物只要在 無氧狀態(tài)下，即使在水溶液中也是穩(wěn)定的，所以，可以制成單劑型的空氣氧化型染發(fā)劑，從 使用簡單方面出發(fā)是優(yōu)選的。從制造的容易程度、穩(wěn)定性和染發(fā)性能出發(fā)，優(yōu)選5，6_ 二羥 基吲哚，在黑色素前體中的5，6- 二羥基吲哚的比例，以在280nm的吸光度面積比計(jì)，優(yōu)選在 60%以上。另-方面，由于5，6_ 二羥基吲哚-2-羧酸聚合得到的黑色素的水溶性高，因此 可以在臨時染色用的染發(fā)劑組合物中利用。-染發(fā)劑組合物_通過在染發(fā)劑中配合如上操作而得到的黑色素前體，就能夠成為僅從容器取出附 著在頭發(fā)上暫時放置的簡便的單劑型空氣氧化型染發(fā)劑，能夠?qū)装l(fā)染成黑色素的自然色 調(diào)。為了制成單劑型染發(fā)劑，在黑色素前體中優(yōu)選5，6_ 二羥基吲哚，但只要發(fā)揮染發(fā)性能， 也可以含有至一半左右的其它黑色素前體。在本發(fā)明的染發(fā)劑組合物中的黑色素前體的含量，從染發(fā)性能的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選 為0.01 10重量％，更優(yōu)選為0.05 5重量％，進(jìn)一步優(yōu)選為0. 1 1重量％。該含量 可以根據(jù)染發(fā)劑的使用目的而適當(dāng)變化，當(dāng)通過一次染發(fā)就染濃(黑)到目的水平時，優(yōu)選 為0. 5 1重量％，當(dāng)為慢慢地反復(fù)染發(fā)，使白發(fā)不明顯的染發(fā)劑時，優(yōu)選為0. 1 0. 4重 量％。此外，如果配合量在0.01重量％以上，則由于每次以極少量就能夠染發(fā)，因此可以在 以手處理的染發(fā)劑或彩色染發(fā)劑用染料、頭發(fā)用化妝材料的情況下等使用。在本發(fā)明中使用的黑色素前體的制造中，通過使用和生物體內(nèi)同樣的酶反應(yīng)，具 有不需要用于除去由催化劑引起的化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的副產(chǎn)物的復(fù)雜的精制操作的優(yōu)點(diǎn)。由于 黑色素相關(guān)物質(zhì)以外的副產(chǎn)物幾乎不存在，使用和天然存在的物質(zhì)同樣的黑色素前體，所 以，相比于其它的通過化學(xué)合成的制造方法或一般的氧化染發(fā)劑，在安全性方面也具有優(yōu) 異的效果。本發(fā)明的染發(fā)劑組合物的pH優(yōu)選調(diào)整為6 11，更優(yōu)選調(diào)整為7 10. 5。在pH調(diào)整中，例如，可以使用氫氧化鈉、氫氧化鉀、氨、胍、烷基胺、堿性氨基酸、碳酸鹽等堿劑。作 為烷基胺，可以列舉一乙醇胺，作為堿性氨基酸的具體例子，可以列舉精氨酸、賴氨酸、組氨 酸等，作為碳酸鹽的具體例子，可以列舉碳酸鈉、碳酸鉀、碳酸胍、碳酸氫鈉。此外，可以適當(dāng) 使用鹽酸、硫酸、磷酸、檸檬酸、乳酸等的無機(jī)或有機(jī)酸和堿劑并用。PH調(diào)整劑也可以并用2 種以上，此外，其含量優(yōu)選為全部組成的0. 01 20重量％，更優(yōu)選為0. 1 10重量％。作為染發(fā)劑的補(bǔ)充成分，可以含有水溶性有機(jī)溶劑。作為水溶性有機(jī)溶劑，可以 列舉乙醇、丙醇等低級醇；乙二醇、丙二醇等二醇類；乙二醇單甲醚、乙二醇單乙醚、乙二醇 單丁醚等乙二醇單醚；二乙二醇單乙醚、二乙二醇單丁醚等卡必醇類；芐氧基乙醇、苯甲醇 等，其中，優(yōu)選上述低級醇和二醇類。水溶性有機(jī)溶劑也可以并用2種以上，特別是當(dāng)使用 芐氧基乙醇、苯甲醇時，優(yōu)選并用其它溶劑，特別是低級醇、二醇類。水溶性有機(jī)溶劑的含 量，從染色性方面出發(fā)，優(yōu)選為全部組成的5 50重量％，更優(yōu)選為10 40重量％，進(jìn)一 步優(yōu)選為15 30重量％。在本發(fā)明的染發(fā)劑中，作為調(diào)色成分，可以添加氨基酸(特別是半胱氨酸)和現(xiàn) 有的氧化染料、直接染料(酸性染料、堿性染料、分離型染料)。根據(jù)目的，其含量優(yōu)選為 0. 001 5重量％，更優(yōu)選為0.01 2重量％，進(jìn)一步優(yōu)選為0.05 1重量％。本發(fā)明的染發(fā)劑組合物可通過添加增粘劑而進(jìn)行粘度調(diào)整，由此成為乳劑、凝膠、 洗劑、泡沫等形態(tài)。作為增粘劑，可以列舉羥乙基纖維素、羥乙基纖維素和環(huán)氧丙基三甲基 氯化銨的醚、甲基纖維素、羧甲基纖維素等纖維素衍生物；黃原膠、瓜爾豆膠等天然樹膠類； 聚乙烯吡咯烷酮、交聯(lián)型聚丙烯酸或其鹽、聚丙烯酸或其鹽、聚丙烯酰胺等合成高分子。其 配合種類和配合量可以根據(jù)目的粘度決定，粘度優(yōu)選為100 50000mPa*S。本發(fā)明的染發(fā) 劑組合物，在不增粘時可以得到輕的使用感覺，而通過添加增粘劑使之增粘，就能夠不損傷 染色能力，并且使用不用擔(dān)心滴液。此外，在本發(fā)明的染發(fā)劑組合物中，作為起泡劑和/或均勻劑，可以含有非離子表 面活性劑。作為非離子表面活性劑，可以列舉聚氧乙烯油酰醚、聚氧乙烯硬脂酰醚等聚氧乙 烯烷基醚；聚氧乙烯壬基苯基醚、聚氧乙烯辛基苯基醚等聚氧乙烯烷基苯基醚；聚氧乙烯 山梨醇酐脂肪酸酯、脂肪酸烷基醇酰胺、聚氧乙烯-仲十四烷基醚等。非離子表面活性劑的 含量優(yōu)選為0.01 30重量％，更優(yōu)選為0. 1 10重量％。此外，在本發(fā)明的染發(fā)劑組合物中，為了確保安全性，希望添加抗氧化劑。作為抗 氧化劑，可以列舉抗壞血酸、抗壞血酸鈉、抗壞血酸酯等抗壞血酸類、亞硫酸鈉等無機(jī)鹽類、 半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸等半胱氨酸衍生物、迷迭香提取物、茶提取物等顯示抗氧化作 用的植物提取物、生育酚、醋酸生育酚等維生素類、BHT等的清除劑類等。其中，優(yōu)選抗壞血 酸類，如果考慮使用PH，則優(yōu)選抗壞血酸鈉。此外，作為使穩(wěn)定性提高的成分，也可以使用 EDTA或其鹽、1-羥基乙烷-1，1- 二磺酸或其鹽等螯合劑。在本發(fā)明的染發(fā)劑組合物中，在上述成分以外，根據(jù)目的，可以適當(dāng)配合在通常染 發(fā)劑中使用的成分，例如，上述以外的表面活性劑、穩(wěn)定劑、緩沖劑、香料、觸感改善劑、螯合 劑、增溶劑、防腐劑等。作為本發(fā)明的染發(fā)劑組合物的優(yōu)選形態(tài)，可以列舉反復(fù)使用的徐染型染發(fā)劑。此 外，優(yōu)選氣溶膠的形態(tài)。為了將本發(fā)明的染發(fā)劑組合物制成氣溶膠型，向耐壓容器(氣溶膠罐等)中和染
11發(fā)劑組合物一起充填噴射劑即可。作為噴射劑，可以使用在一般氣溶膠制品中使用的壓縮 氣體、液化氣體等，作為壓縮氣體，可以列舉氮?dú)?、碳酸氣、氬氣等，作為液化氣體，可以列舉 液化石油氣、低級飽和烴類、二甲醚等。這些噴射劑也可以并用2種以上，為了得到適度的 噴射速度，在全部組成中優(yōu)選含有1 20重量％，更優(yōu)選含有3 15重量％。此外，優(yōu)選 將充填后的氣溶膠罐的內(nèi)壓調(diào)整為3 5kg/cm2G(25°C )。此外，將在本發(fā)明的氧化工序中得到的黑色素前體進(jìn)行氧化聚合，作為分子量僅 在3000以上的黑色素，能夠在頭發(fā)用化妝材料(免洗型或沖洗型)配合。作為這樣的頭發(fā) 化妝材料，例如，可以列舉洗發(fā)水、染發(fā)液、護(hù)發(fā)素、發(fā)膠、定型劑、電燙劑、蠟、亮發(fā)劑、生發(fā) 劑等。作為劑型，可以列舉氣溶膠、泡沫、乳劑、液狀、糊狀等。實(shí)施例制造例1黑色素前體的制造1.米曲霉的酪氨酸酶基因的克隆克隆曲霉屬菌米曲霉(Aspergillus oryzae)的melB酪氨酸酶基因。在蒸米中接種曲霉屬菌米曲霉(Aspergillus oryzae) 0SI-1013株(FERM P-16528)，稱量1.5g酒曲制作后的酒曲，在液氮中完全破碎。使用日本Gene社生產(chǎn)的 ISOGEN,提取 240 μ g 的總 RNA。使用 TaKaRa 株式會社生產(chǎn)的 01igotex_dT30<Super>，從 120 μ g 的總 RNA 中精制了mRNA。采用 Clontech 社生產(chǎn)的 SMART cDNA Library Construction Kit 將該 mRNA 制成 cDNA 文庫，通過 PCR 只擴(kuò)增 melB cDNA。將得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳，確認(rèn)只擴(kuò)增了約l.SKbp的目的條帶。此外， 堿基序列分析的結(jié)果也確認(rèn)內(nèi)含子序列被正常地除去。2.重組入酵母將由上述1得到的cDNA以能夠表達(dá)的狀態(tài)連接于Invitrogen社生產(chǎn)的大腸桿菌 用表達(dá)載體pET23b、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)用表達(dá)載體(日本專利特開 2003-265177號公報)、曲霉屬菌米曲霉(Aspergillus oryzae)表達(dá)載體(日本專利特開 2001-224381號公報)，由此就能夠在各菌體內(nèi)大量表達(dá)酪氨酸酶。特別表示在酵母中表達(dá)的例子(以日本專利特開2003-265177號公報為基準(zhǔn))，在 具有SEDl啟動子和ADHl終止子的表達(dá)載體的啟動子的直接下游的Smal部位，插入由PCR 擴(kuò)增后的melB cDNA。通過在URA3標(biāo)記內(nèi)部存在的Stu I部位切斷而得到含有melB cDNA 的片斷，將該片斷作為導(dǎo)入用盒而進(jìn)行精制。此時，作為宿主的酵母，使用來自在清酒釀造 中使用的實(shí)用酵母·協(xié)會9號的尿嘧啶缺陷株。3.重組酵母的酪氨酸酶活化和測定(3-1)酪氨酸酶活性測定菌體的酪氨酸酶活性的測定如下進(jìn)行。將一部分菌體懸浮在水中，向該0. ImL懸 濁液中添加0. 8mL 30°C的IOmM L-D0PA (溶解在0. 005N的鹽酸中)和0. ImL的IM磷酸鈉 緩沖液(PH6. 0)，在30°C下反應(yīng)5分鐘后，以15000rpm進(jìn)行30秒鐘離心分離，由此除去菌 體，測定在作為DOPA吸收極大波長的475nm的吸光度。調(diào)整菌體量，使得在反應(yīng)后的反應(yīng) 液的475nm的吸光度在0. 1 0. 3內(nèi)。(3-2)酪氨酸酶活化處理以常規(guī)方法培養(yǎng)在上述2中得到的重組酵母，通過離心分離回收菌體，然后以蒸餾水洗凈。將菌體懸浮在10倍于菌體重量左右的含有2mM硫酸銅的50mM Tris-HCl緩沖 液(PH8.0)中，在4°C靜置一夜。通過離心分離回收菌體，為了除去過剩的銅離子，以0. IM 的EDTA溶液洗凈。將洗凈后的菌體懸浮在0.2M的醋酸緩沖液(pH3.0)中，在室溫靜置1 小時?；罨蟮木w通過離心分離回收，成為活化菌體。通過上述(3-1)的測定方法測定活化菌體的酪氨酸酶活性，為1. 9 4. 4U/0D_。 以下使用這樣測定后的各轉(zhuǎn)化株。4.多巴色素的積累反應(yīng)使用在上述3中得到的酵母轉(zhuǎn)化體，以L-DOPA為底物，進(jìn)行作為黑色素前體的多 巴色素的積累反應(yīng)。將7. 9g的L-DOPA溶解在500mL的0. 03N硫酸中后，使用2N的氫氧化鉀調(diào)整至 PH5. 5。在該L-DOPA溶液中，向5L容積反應(yīng)槽中投入由步驟3得到的2. 7X 105U/L(每IL 反應(yīng)液的菌體活性值為1. 35X 105U/L的量)重組酵母菌體，使反應(yīng)液量為2L，開始反應(yīng)。將反應(yīng)溫度調(diào)節(jié)至25°C。反應(yīng)剛開始后，因?yàn)樾枰罅康难酰?，將通氣量和?拌調(diào)至最大。通過添加硫酸和氫氧化鉀將PH調(diào)節(jié)至5. 5。進(jìn)行40分鐘的反應(yīng)。以DO (容存氧量)為指標(biāo)，調(diào)節(jié)反應(yīng)液中的攪拌和通氣量至2 7ppm。在反應(yīng)中 進(jìn)行適當(dāng)取樣，以下述所示的定量方法測定多巴色素、5，6-二羥基吲哚。在圖1中表示反應(yīng) 液中的L-DOPA濃度和黑色素前體濃度的推移。在該反應(yīng)條件下，由于5，6_ 二羥基吲哚羧酸的生成是極其微量的，所以，前體濃 度以多巴色素濃度和5，6_ 二羥基吲哚濃度的合計(jì)值表示。根據(jù)條件而多少有所不同，但反 應(yīng)結(jié)束時的多巴色素濃度比5，6-二羥基吲哚濃度高3 5倍，可以說主要成分是多巴色 素。此外，以處于將L-DOPA完全消耗(在通過HPLC測定的檢出界限以下)的狀態(tài)設(shè)定為 反應(yīng)結(jié)束的判斷基準(zhǔn)。以該檢出界限以下的狀態(tài)定義為實(shí)質(zhì)上不含有。核對黑色素前體濃度的經(jīng)時變化和記錄的氧濃度及用于維持pH的酸、堿添加量 的經(jīng)時變化等，此外，為了完全消耗D0PA，進(jìn)行40分鐘的反應(yīng)。<黑色素前體各成分的定量方法>使用Waters社生產(chǎn)的HPLC Alliance2695_2996，用以下的條件檢出和定量黑色 素前體的各成分。在成分的分離中，使用Imtakt社生產(chǎn)的反相柱Unison UK-C18 (4. 6X 150mm)，流 動相使用1.5%磷酸溶液(A液)和99.9%甲醇(B液)，設(shè)定流動相中的B液的梯度為，開 始為0%，5分鐘后變?yōu)?0%。流速為1. OmL/分鐘。注入的樣品通過下述方法配置相對10 μ L樣品，添加100 μ L的20mM的連二亞硫 酸鈉(Na2S2O4)和890 μ L的1. 5%的磷酸(H3PO4)溶液，以0. 45 μ m的濾器過濾。將20 μ L 該樣品注入上述柱中，進(jìn)行測定。多巴的檢出通過在極大吸收波長280nm的吸光度進(jìn)行監(jiān)控。多巴色素作為以上述 測定條件被還原的無色多巴色素(5，6-二羥基吲哚滿-2-羧酸)而被定量。5，6-二羥基吲 哚以標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(5，6_ 二乙酰氧基吲哚的堿水解物)為根據(jù)來定量，5，6-二羥基吲哚-2-羧 酸通過在280nm的峰區(qū)面積的比例進(jìn)行比較。5，6- 二羥基吲哚的極大吸收波長為300nm， 5,6- 二羥基吲哚羧酸的極大吸收波長為320nm。5.黑色素前體溶液的除蛋白
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由于使用具有堅(jiān)固細(xì)胞壁的酵母細(xì)胞，所以，在上述4的工序中得到的黑色素前 體溶液中不存在或幾乎不存在黑色素前體溶液中存在的菌體的碎片和從菌體流出的蛋白 質(zhì)。但是，當(dāng)作為染發(fā)劑使用時，由于微量含有的蛋白質(zhì)有成為變應(yīng)原的可能性，所以通過 超濾除去蛋白質(zhì)。作為超濾裝置，使用Daicen Membrane社生產(chǎn)的超濾模塊· A七, FS10-FUS0181 (截留分子量為1萬)。將由過濾得到的溶液進(jìn)行SDS-PAGE和銀染，由此確 認(rèn)蛋白質(zhì)被除去。之所以沒有采用如通常進(jìn)行的測定在280nm的吸光度的方法，原因在于 多巴色素本身在280nm附近有吸收，而且，由于吲哚的反應(yīng)性高，所以容易和顯色試劑發(fā)生 反應(yīng)等。銀染的結(jié)果為，在超濾后沒有檢出可認(rèn)為蛋白質(zhì)的條帶。6.從多巴色素向5，6_ 二羥基吲哚和5，6_二羥基吲哚-2-羧酸的轉(zhuǎn)變(黑色素前 體的轉(zhuǎn)變方法)在上述5的工序中得到的溶液中所含的黑色素前體主要為多巴色素，即5，6_二羥 基吲哚滿-2-羧酸，但作為染發(fā)劑，為了生成染發(fā)性能或保存穩(wěn)定性優(yōu)異的5，6_ 二羥基吲 哚和5，6- 二羥基吲哚-2-羧酸要進(jìn)行轉(zhuǎn)變黑色素前體的非酶處理。方法為pH調(diào)整、添加 有機(jī)溶劑、添加磷酸緩沖液、金屬離子處理等，以任任一種方法都可以有效地轉(zhuǎn)變。此外，以下所示的黑色素前體的存在比例，是通過在280nm的吸光度面積比而得 的。(6-1)通過pH調(diào)整對前體溶液組成的控制對在上述5的工序中得到的黑色素前體溶液(主要含有多巴色素)，通過pH進(jìn)行 前體的調(diào)整。在無氧狀態(tài)下，在40°C下保存2小時。如果以酸性 中性附近(pH在5以上、 8以下)進(jìn)行處理，則5，6_ 二羥基吲哚的比例就提高(在前體中在50%以上，在最佳條件 下在80%以上)；如果以pH8 11進(jìn)行處理，則5，6_ 二羥基吲哚-2-羧酸的比例提高。此 外，在pH2 4時生成沉淀，是不適于處理的。(6-2)通過有機(jī)溶劑的添加對前體溶液組成的控制向在上述5的工序中得到的黑色素前體溶液(主要含有多巴色素)添加乙醇，使 其為全部量的50容量％，在室溫下處理2小時。多巴色素被有效地轉(zhuǎn)變?yōu)?，6-二羥基吲 哚(5，6_ 二羥基吲哚相對5，6_ 二羥基吲哚-2-羧酸的比例在10倍以上)。使用甲醇、丙 酮、2-丙醇或乙腈代替乙醇時，也可見同樣的效果。此外，向在上述5的工序中得到的黑色素前體溶液中添加2-氨基乙醇，使其為全 部量的50容量％，在室溫處理2小時。多巴色素被有效地轉(zhuǎn)變?yōu)?，6-二羥基吲哚-2-羧 酸(5，6_ 二羥基吲哚-2-羧酸相對5，6_ 二羥基吲哚的比例在5倍以上)。(6-3)通過磷酸緩沖液對前體溶液組成的控制通過向在上述5的工序中得到的黑色素前體溶液(主要含有多巴色素)中添加IM 磷酸緩沖液，制成含有黑色素前體的PH6. 0的0. IM磷酸緩沖液。將該前體溶液在_20°C左 右保存7天。通過在含有作為酸成分的磷酸的磷酸緩沖液中低溫保存，多巴色素被有效地 轉(zhuǎn)變?yōu)?，6- 二羥基吲哚-2-羧酸(5，6- 二羥基吲哚-2-羧酸相對5，6- 二羥基吲哚的比例 在5倍以上)。(6-4)通過氯化鈉或抗壞血酸鈉對前體溶液組成的控制如果向在上述5的工序中得到的黑色素前體溶液(主要含有多巴色素)添加氯化鈉，使其最終濃度為2. 5%，在室溫下靜置45分鐘，則相比于未添加的系統(tǒng)，促進(jìn)了多巴色 素向5，6_ 二羥基吲哚的轉(zhuǎn)變。此外，如果添加抗壞血酸鈉溶液代替氯化鈉，則顯著量的5， 6- 二羥基吲哚積累(黑色素前體中的5，6_ 二羥基吲哚的存在比例為90% )。(6-5)通過銅(II )鹽對前體溶液組成的控制向上述5的工序中得到的黑色素前體溶液(主要含有多巴色素)中添加硫酸銅， 使其最終為ImM，在室溫下靜置15分鐘，促進(jìn)了多巴色素向5，6- 二羥基吲哚_2_羧酸的轉(zhuǎn) 變(5，6- 二羥基吲哚-2-羧酸相對5，6- 二羥基吲哚的比例在3倍以上)。7.黑色素前體溶液的濃縮黑色素前體溶液(多巴色素、5，6_ 二羥基吲哚和5，6_ 二羥基吲哚-2-羧酸)可 以如下操作進(jìn)行濃縮。使用在從海水制造純水中使用的錯流型反滲透濃縮裝置(日東電工 Matex社生產(chǎn))用于濃縮。該裝置使溶液在加入有黑色素前體溶液的密閉槽和反滲透濃縮 模塊NTR7410-HG-S4F之間進(jìn)行循環(huán)，由反滲透濃縮模塊生成的純水從該模塊導(dǎo)入濾過水 槽。伴隨純水的生成，黑色素前體在槽內(nèi)被濃縮。循環(huán)通過泵以2MPa的壓力進(jìn)行。通過約 30分鐘的操作，將在步驟5得到的約31L黑色素前體溶液被濃縮為約4L。在該濃縮操作 中，在黑色素前體濾過液中幾乎不生成高分子黑色素，作為指標(biāo)的5，6-二羥基吲哚的濃度 從約9mM上升至約67mM，回收率極高。實(shí)施例11.染發(fā)劑組合物的配制(1)使用以下物質(zhì)作為染發(fā)劑用的黑色素前體組合物。在使用具有1. 9 4. 4U/0D_的酪氨酸酶活性的導(dǎo)入了來自曲霉菌的酪氨酸酶基 因(melB)的重組酵母(Saccharomyces cerevisiae 釀酒酵母)的氧化工序中，從約20mM 的L-DOPA生成多巴色素(約10 15mM)，將其作為離心分離的上清回收(工序收率約 50 65% )。進(jìn)而，通過以pH6附近的處理和超濾、反滲透膜濃縮，得到約1重量％的黑色素前 體溶液1。本溶液在HPLC法中，在280nm作為黑色素前體被檢出的物質(zhì)，其90%以上為5， 6-二羥基吲哚，其10%以下為5，6_ 二羥基-2-羧酸。吲哚滿類在以下。原料L-DOPA 未能檢出。通過SDS-聚丙烯酰胺電泳法確認(rèn)不含蛋白質(zhì)。通過本方法可以有效地制造以 適合染發(fā)劑的5，6-二羥基吲哚為主要成分(黑色素前體含量在90%以上)的黑色素前體。(2)使用30g (含有黑色素前體約0.3g)上述黑色素前體溶液1，配制IOOg下述組 成的染發(fā)劑(本發(fā)明品1)。在配制時，為了防止氧混入而在厭氧條件下進(jìn)行。將其作為原 液，和噴射劑(LPG) —起各自充填于氣溶膠容器中(原液噴射劑=90 10，重量比)。黑色素前體溶液130g (黑色素前體約0. 3g)黃原膠0. 2g氨水(28重量 ％)0. 5g乙醇IOg乂 7夕7 —卟90 (日本觸媒社生產(chǎn)) 0. 5g水余量抗氧化劑適量合計(jì)IOOg
2.染發(fā)試驗(yàn)(以測色計(jì)進(jìn)行評價)將Ig在1中得到的染發(fā)劑適用于Ig的白發(fā)束，在30°C下染色15分鐘。然后，水 洗、洗發(fā)、染發(fā)，接著干燥。每隔7天重復(fù)該操作，共計(jì)5次。以分光測色計(jì)(Minolta社生 產(chǎn)的CM-2002)測定染色后的發(fā)束，根據(jù)以下式算出的色差(ΔΕ)進(jìn)行評價。Δ E = {(L1-L0)2+ (ara0)2+ (brb0)2}1/2(L0, a0, b。)染色前的白發(fā)束的測色值(L1, ai; ID1)染色后的白發(fā)束的測色值白發(fā)束的ΔΕ值在第1次為15、在第3次為28、在第5次為38，慢慢地變黑。3.穩(wěn)定性在40°C下保存2周后，以HPLC測定的主峰的定量值幾乎不變，確認(rèn)具有高穩(wěn)定性。實(shí)施例2染發(fā)劑組合物(泡沫型)混合5g黑色素前體溶液1 (含有黑色素前體約0. 05g)、0. 5g、” ”一 90、 0. Ig黃原膠、0.3g十八烷基三甲基氯化銨、0. Olg聚氧乙烯·甲基聚硅氧烷共聚物、IOg乙 醇和余量水，配制IOOg染發(fā)劑。為了防止在配制時混入氧，在厭氧條件下進(jìn)行。將其作為 原液，和噴射劑(LPG) —起各自充填于氣溶膠容器中(原液噴射劑=90 ；10，重量比)。
1權(quán)利要求
一種黑色素前體的制造方法，其特征在于包括工序(a)，在反應(yīng)液中，使用選自曲霉(Aspergillus)屬、脈胞菌(Neurospora)屬、根毛霉(Rhizomucor)屬、木霉(Trichoderma)屬和青霉(Penicillium)屬的絲狀菌的兒茶酚氧化酶或表達(dá)所述酶的細(xì)胞，對酪氨酸或其衍生物進(jìn)行氧化，將其轉(zhuǎn)變?yōu)楹谏厍绑w的工序；工序(b)，從所述反應(yīng)液中除去所述酶或所述細(xì)胞的工序；工序(c)，在所述工序(a)或(b)后，對所述反應(yīng)液進(jìn)行處理，提高5，6 二羥基吲哚和/或5，6 二羥基吲哚 2 羧酸的濃度的工序；所述黑色素前體包含多巴色素(Dopachrome)、5，6 二羥基吲哚和5，6 二羥基吲哚 2 羧酸。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述5，6- 二羥基吲哚和/或5，6- 二羥基吲哚-2-羧酸的濃度通過選自(i) pH調(diào)節(jié)處 理、(ii)添加水溶性有機(jī)溶劑、(iii)添加無機(jī)鹽、(iv)利用緩沖液進(jìn)行處理、和(ν)添加 抗氧化劑中的1種以上處理來提高。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述兒茶酚氧化酶是酪氨酸酶，所述酪氨酸酶與米曲霉(Aspergillus oryzae)的 melB酪氨酸酶基因、米曲霉的melD酪氨酸酶基因或米曲霉的melO酪氨酸酶基因所編碼的 酪氨酸酶實(shí)質(zhì)上相同。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述方法使用表達(dá)所述兒茶酚氧化酶的所述細(xì)胞，所述細(xì)胞是大腸桿菌、酵母或絲狀 菌的細(xì)胞。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述兒茶酚氧化酶的底物包含L-DOPA，L-DOPA的濃度在所述工序(a)的轉(zhuǎn)變反應(yīng)開始 時為15mM以上，在所述工序(a)的轉(zhuǎn)變反應(yīng)結(jié)束時為0. ImM以下。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述黑色素前體包含5，6- 二羥基吲哚，所述黑色素前體中的5，6- 二羥基吲哚的比例， 以280nm處的吸光度的面積比計(jì)，為60%以上。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述黑色素前體是使用DOPA酯或酪氨酸酯作為所述兒茶酚氧化酶的底物來調(diào)制的。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于使用DOPA或多巴胺作為原料或中間體。
全文摘要
本發(fā)明提供一種黑色素前體的制造方法，包括工序(a)，在反應(yīng)液中，使用選自曲霉(Aspergillus)屬、脈胞菌(Neurospora)屬、根毛霉(Rhizomucor)屬、木霉(Trichoderma)屬和青霉(Penicillium)屬的絲狀菌的兒茶酚氧化酶或表達(dá)所述酶的細(xì)胞，對酪氨酸或其衍生物進(jìn)行氧化，將其轉(zhuǎn)變?yōu)楹谏厍绑w的工序；工序(b)，從所述反應(yīng)液中除去所述酶或所述細(xì)胞的工序；工序(c)，在所述工序(a)或(b)后，對所述反應(yīng)液進(jìn)行處理，提高5，6-二羥基吲哚和/或5，6-二羥基吲哚-2-羧酸的濃度的工序；所述黑色素前體包含多巴色素(Dopachrome)、5，6-二羥基吲哚和5，6-二羥基吲哚-2-羧酸。
文檔編號C12P17/10GK101914585SQ20101021624
公開日2010年12月15日 申請日期2005年12月6日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月8日
發(fā)明者中村幸宏, 小池謙造, 小畑浩, 秦洋二, 齊藤芳紀(jì) 申請人:花王株式會社;月桂冠株式會社