專利名稱：芽孢表面展示系統(tǒng)用于n-乙酰神經(jīng)氨酸生產(chǎn)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種N-乙酰神經(jīng)氨酸生產(chǎn)的方法，尤其涉及芽孢表面展示系統(tǒng)展示 N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶用于N-乙酰神經(jīng)氨酸生產(chǎn)的方法。
背景技術(shù)：
芽孢表面展示技術(shù)作為微生物表面展示的一種，因所表達的異源蛋白無需經(jīng)過跨 膜過程及芽孢的抗逆性等獨特優(yōu)勢而備受研究者的關(guān)注。2001年，Pozzi以芽孢外衣蛋白 CotB為錨定蛋白建立了第一個芽孢表面展示系統(tǒng)，此后芽孢表面展示技術(shù)進入了快速發(fā)展 階段，不僅在疫苗生產(chǎn)方面得到了廣泛應用，在生物催化領(lǐng)域也開始嶄露頭角Isticato et al，2001 ；Kim et al,2005 ；Kwon et al，2007。由于芽孢的特殊形成機制，使得以芽孢 作為載體進行表面展示時，可一步實現(xiàn)異源蛋白的表達、純化和固定化，只需進行菌體的培 養(yǎng)即可得到固定化的蛋白，不僅解決了過程繁瑣的問題還解決了傳質(zhì)阻力的問題。同時，芽 孢形成的過程無需添加任何化學物質(zhì)進行誘導，保證了過程的安全性。唾液酸(Sialic acid)是神經(jīng)氨酸及其衍生物的總稱，是一類含有羧基的九碳氨 基糖類物質(zhì)，其直接參與多種生理活動，與其衍生物在治療流感、神經(jīng)性疾病、炎癥和腫瘤 等方面具有重要的作用，與人類的健康息息相關(guān)，具有廣泛的應用前景Traveling，1998 ； Schauer，2000。而 N—乙酉先神經(jīng)氛酸(N-acetyl-D-neuraminic acid, Neu5Ac)是分布最 廣的一類唾液酸，其本身及其類似物有重要的藥用前景。其中N-乙酰神經(jīng)氨酸的結(jié)構(gòu)類似 物——扎納米韋(Zanamivir)是1995年被批準用于臨床的抗流感病毒藥物Dreitlein et al.，2001。目前N-乙酰神經(jīng)氨酸的生產(chǎn)方法有多種，主要有生物提取、化學合成、發(fā)酵法和 酶催化法。從禽蛋中的蛋黃膜和臍帶中或牛乳乳清和酪蛋白可提取N-乙酰神經(jīng)氨酸，由于 含量較低，成分多樣，分離和提純過程比較復雜，收率較低，因此難以實施工業(yè)化Masskarn 1993；化學法合成N-乙酰神經(jīng)氨酸至少經(jīng)過十幾步反應，需要大量的保護和去保護過程， 形成了大量的中間產(chǎn)物，給N-乙酰神經(jīng)氨酸的后續(xù)分離過程造成了很大困難，同時由于化 學法的專一性較差，形成較多異構(gòu)體，導致N-乙酰神經(jīng)氨酸的手性純度較低；某些大腸桿 菌菌株在生長過程中能自身合成N-乙酰神經(jīng)氨酸的同聚合體——多聚唾液酸，經(jīng)酸或酶 水解后即可得到N-乙酰神經(jīng)氨酸Mamoru K.，1993，但產(chǎn)量較低，達不到工業(yè)化需要的水 平；酶催化方法具有高效性和專一性，步驟簡單，易于操作，產(chǎn)物單一，純度高，適合精細化 合物和藥物前體的大規(guī)模生產(chǎn)。酶法催化主要包括游離酶催化和全細胞催化，而其中主要用到的酶為N-乙酰神 經(jīng)氨酸醛縮酶(EC 4. 1. 3. 3)。以N-乙酰甘露糖胺和丙酮酸為底物，N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮 酶(EC 4. 1.3.3)的逆反應被應用于酶催化合成N-乙酰神經(jīng)氨酸。目前，使用游離酶催化 合成N-乙酰神經(jīng)氨酸的最高轉(zhuǎn)化率為94. 61%,N-乙酰神經(jīng)氨酸濃度為49. 52g/LHu et al，2010。該轉(zhuǎn)化過程所使用的催化劑為固定化的N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶，使用固定化酶 可重復5次催化N-乙酰神經(jīng)氨酸的合成。然而制備固定化酶的過程過于繁瑣，要經(jīng)過酶的表達、純化和固定化三個步驟才可得到最終的生物催化劑，并且在制備過程中游離酶活力 還存在不同程度的損失。為解決游離酶的這種缺陷，研究者們開始使用全細胞作為生物催 化過程中的催化劑。首次報道的使用全細胞進行N-乙酰神經(jīng)氨酸合成，是利用異源表達來源于集胞 藻(Synechocystis sp.) PCC6803的slrl975基因(該基因表達的酶具有GlcNAc異構(gòu)酶功 能)和來源于Escherichia coli K_1的N-乙酰神經(jīng)氨酸合成酶基因的重組大腸桿菌細胞 為催化劑，利用谷氨酸棒桿菌合成輔因子和底物磷酸烯醇式丙酮酸，在葡萄糖和N-乙酰葡 萄糖胺存在的條件下，使用三種完整細胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)N-乙酰神經(jīng)氨酸，但轉(zhuǎn)化率僅達到5% [Tabata,2002]。2007年Lee等利用來源于大腸桿菌(Escherichia coli)K12的N-乙酰神經(jīng)氨酸 醛縮酶和來源于Anabaena sp. CHl的N-乙酰葡萄糖胺異構(gòu)酶分別利用商品化的pET載體 系統(tǒng)在大腸桿菌中分別進行表達，以兩種混合細胞為催化劑，以N-乙酰葡萄糖胺和丙酮酸 為底物，催化合成N-乙酰神經(jīng)氨酸。由于該催化過程中使用的異構(gòu)酶與前面報道的酶學性 質(zhì)相比，ATP需求量低，酶活性高，才使得最高轉(zhuǎn)化率達到33. 3%，接近之前報道的酶催化 效率Lee et al，2007。中國發(fā)明專利(ZL2004100242223)報道了利用施氏假單胞菌SDM完整細胞與表達 有N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶的重組大腸桿菌E. coli BL21 (DE3)/pET15b-nanA為催化劑，以 乳酸鈉和化學異構(gòu)得到的N-乙酰甘露糖胺為底物，合成N-乙酰神經(jīng)氨酸的生產(chǎn)工藝，但是 該方法需要兩種細胞的參與。全細胞催化雖然可避免酶的純化，但是其仍存在傳質(zhì)阻力的問題。細胞表面的細 胞膜作為一層天然的屏障，阻礙了底物的進入和產(chǎn)物的釋放，降低了產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率；同時處 于休止狀態(tài)的細胞仍具有催化某些酶促反應的能力，從而造成了催化過程中副產(chǎn)物的產(chǎn)生 [Chen,2007 ；Ishige et al，2005。芽孢表面展示作為一種新型的技術(shù)可有效解決游離酶和全細胞催化過程中的限 制。經(jīng)檢索，目前未見芽孢表面展示N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶用于N-乙酰神經(jīng)氨酸生產(chǎn)的 研究或相關(guān)報道。參考文獻Traving C, and Schauer R.1998Cell. Mol. Life. Sci. 54 :1330_1349·Schauer R.2000Glycocon j. J. 17 :485_499·Dreitlein W B, Maratos J, Brocavich J. [2001] Clin.Ther. 23 :327-355.Masskarn S.1993US Patent 5, 270, 462.Mamoru K.1993US Patent 5, 223, 033.Tabata K, Koizumi S, Endo T, and Ozaki A.2002Enzyme. Microb. Technol.30:327-333.Lee Y C, Chien H C, Hsu W H.2007J. Biotechnol. 129 :453_460.Chen R R.2007Appl. Microbiol. Biotechnol. 74 :730_738.Ishige T，Honda K, Shimizu S.2005Curr. Opin. Chem. Biol. 9 :174-180.Isticato R, Cangiano G，Tran H T.2001 J. Bacteriol. 183 :6294_6301·Kim J H, Lee C S,Kim B G. [2005]Biochem. Biophys. Res. Commun. 331 :210_214.
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發(fā)明內(nèi)容
針對上述現(xiàn)有催化合成N-乙酰神經(jīng)氨酸方法中，化學法過多的保護和去保護過 程，游離酶不易規(guī)?；苽洳⑶以谥苽溥^程中會引入有毒物質(zhì)的缺陷以及全細胞催化轉(zhuǎn)化 率較低，難以大規(guī)模生產(chǎn)的不足，本發(fā)明要解決的問題是提供一個芽孢表面展示系統(tǒng)，即一 個含有表面展示載體的芽孢表面展示系統(tǒng)，及其用于N-乙酰神經(jīng)氨酸生產(chǎn)的方法。本發(fā)明所述芽孢表面展示系統(tǒng)用于N-乙酰神經(jīng)氨酸生產(chǎn)的方法，步驟包括高拷 貝大腸桿菌_枯草芽孢桿菌穿梭載體PHPGD的構(gòu)建，高效芽孢表面展示系統(tǒng)枯草芽孢桿 菌(Bacilluus subtilis)WB600的構(gòu)建，以芽孢表面展示重組枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)WB600制備孢子懸液作為轉(zhuǎn)化反應的芽孢催化劑，利用所述芽孢催化劑生產(chǎn) N-乙酰神經(jīng)氨酸；其特征在于所述高拷貝大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭載體pHPGD構(gòu)建的出發(fā)載體是來源于大 腸桿菌的質(zhì)粒PHP13和來源于枯草芽孢桿菌168的質(zhì)粒pGDVl，其得到的高拷貝穿梭載體的 核苷酸序列如SEQ. ID. No. 7所示；該載體在大腸桿菌中使用pUC復制子表現(xiàn)為高拷貝載體， 每個細胞中為300拷貝左右，在枯草芽孢桿菌中使用pGDVl復制子也表現(xiàn)為高拷貝載體，每 個細胞中為150 200拷貝；含有氯霉素和紅霉素兩個抗性，全長4619bp。所述高效芽孢表面展示系統(tǒng)枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)WB600的構(gòu)建 是以構(gòu)建好的高拷貝穿梭載體PHPGD為出發(fā)載體，在多克隆位點按順序插入芽孢外衣蛋 白CotG基因和N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶(Neu5Ac aldolase)基因，得到芽孢表面展示載體 pHP⑶-cotG-nanA，或在多克隆位點順序插入芽孢外衣蛋白cotB基因和N-乙酰神經(jīng)氨酸醛 縮酶(Neu5Ac aldolase)基因，得到芽孢表面展示載體pHP⑶-cotB-nanA，或在多克隆位點 順序插入芽孢外衣蛋白cotC基因和N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶(Neu5Ac aldolase)基因，得 到芽孢表面展示載體pHPGD-cotC-nanA，然后分別電轉(zhuǎn)化來源于枯草芽孢桿菌168的、有六 個蛋白酶trpC2AnprE Δ aprE Δ epr Δ bpf Δ mpr Δ nprB缺失的枯草芽孢桿菌感受態(tài)的菌 株 WB600,經(jīng)篩選獲得重組枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) WB600 (pHPGD-cotG-nanA)、 重組枯草芽孢桿菌(Baci 1 Ius subtilis) WB600 (pHPGD-cotB-nanA)、重組枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis) WB600 (pHPGD-cotC-nanA)；其中所述芽孢外衣蛋白 CotB、CotC、CotG 基因選來源于枯草芽孢桿菌168 ；N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶基因選來源于豬、鼠或大腸桿菌 的N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶基因；進一步的，所述芽孢外衣蛋白CotG基因優(yōu)選來源于枯草芽 孢桿菌168的CotG基因，N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶基因nanA優(yōu)選來源于大腸桿菌K12 ATCC 25404的N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶基因。上述芽孢表面展示重組枯草芽孢桿菌的基因型為trpC2AnprEAaprE Aepr Abpf Δ mpr Δ nprB，其含有芽孢表面展示載體pHP⑶-cotB-nanA或pHP⑶-cotC-nanA或 pHPGD-cotG—nanA。上述電轉(zhuǎn)化之前枯草芽孢桿菌感受態(tài)的菌株WB600的誘導過程為枯草芽孢桿菌 WB600在37°C培養(yǎng)誘導1 3小時，待OD62tlnm吸光值為0. 3 1. O時，收集菌體制備電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞；將上述構(gòu)建的芽孢表面展示載體轉(zhuǎn)化進入制備的感受態(tài)細胞中即可得到本發(fā) 明所述的芽孢表面展示重組菌株_芽孢表面展示重組枯草芽孢桿菌。其中含有芽孢表面展 示載體的重組菌株誘導孢子產(chǎn)生的過程為重組菌株WB600培養(yǎng)溫度為16 45°C，可在含 有紅霉素和氯霉素的LB和GYS培養(yǎng)基中生長，培養(yǎng)10 48小時，得到重組枯草芽孢桿菌。上述制備缺失蛋白酶的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞時，誘導前菌株培養(yǎng)時間優(yōu)選1. 5 2 小時。上述的LB培養(yǎng)基配方為每升中加入5g酵母粉，IOg蛋白胨，IOg NaCl，調(diào)節(jié)pH值 為7.5，121°C濕熱滅菌20分鐘。GYS培養(yǎng)基的配方為每升中加入Ig葡萄糖，2g (NH4) 2S04， 0. Ig 檸檬酸三鈉，2g 酵母粉，3. 3g K2HPO4, 3. 33ml IM MgSO4,1. 44ml IM CaCl2, 59 μ 1 IM MnSO4 · H20,115°C濕熱滅菌20分鐘。上述芽孢表面展示重組枯草芽孢桿菌WB600的培養(yǎng)溫度優(yōu)選30 42°C。上述芽孢表面展示重組枯草芽孢桿菌WB600的培養(yǎng)時間優(yōu)選為22 26小時。本發(fā)明所述以芽孢表面展示重組枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)WB600制備 孢子懸液作為轉(zhuǎn)化反應的芽孢催化劑的方法為以體積比的量將重組枯草芽孢桿 菌(Bacillus subtilis) WB600 重懸于 pH = 8. 0、IOmM Tris-HCl 溶液中，并按 0. 1 1. 5g/ L的量添加溶菌酶，37°C作用0. 1 5小時，然后用均含有ImM的苯甲基磺酰氟(PMSF)的IM NaClUM KCl和pH 7. 4、1/15M的PBS緩沖液各洗滌1-2遍，而后菌體重懸于pH 7. 4U/15M 的PBS緩沖液中，得到表面展示有N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶的重組芽孢桿菌芽孢催化劑。上述進一步優(yōu)選的實施方式是以體積比的量將重組枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis)WB600重懸于pH = 8. OUOmM Tris-HCl溶液中，并按0. 5g/L的量添力口 溶菌酶，37°C作用1 2小時，然后用均含有ImM的苯甲基磺酰氟(PMSF)的IM NaClUMKCl 和pH 7. 4、1/15M的PBS緩沖液各洗滌1遍，而后菌體重懸于pH 7. 4、1/15M的PBS緩沖液 中，得到表面展示有N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶的重組芽孢桿菌芽孢催化劑。本發(fā)明所述利用芽孢催化劑生產(chǎn)N-乙酰神經(jīng)氨酸的條件是反應體系中催化劑 N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶酶活為0. 1 1. 5U，N-乙酰甘露糖胺濃度為50 500mM，丙酮酸濃 度為200 1500mM，磷酸緩沖液濃度40 80mM，反應pH值為7 7. 8，反應溫度為25 70°C，反應時間為6 40小時，反應過程使用往復式搖床或控制發(fā)酵罐轉(zhuǎn)速使氧溶解度為 30 70%。上述進一步優(yōu)選的實施方式是反應體系中催化劑N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶酶活 為0. 3 0. 7U，N-乙酰甘露糖胺濃度為500mM，丙酮酸濃度為600 IOOOmM,磷酸緩沖液濃 度50 60mM，反應pH值為7. 4 7. 6，反應溫度為50 60°C，反應時間為6 20小時，反 應過程使用往復式搖床或控制發(fā)酵罐轉(zhuǎn)速使氧溶解度為50 60%。本發(fā)明所述芽孢表面展示重組枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) WB600 (pHP⑶-cotG-nanA)作為催化劑在酶法制備N-乙酰神經(jīng)氨酸中的應用。進一步的，本發(fā)明所述芽孢表面展示重組枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) WB600 (pHP⑶-cotG-nanA)作為催化劑用于N-乙酰神經(jīng)氨酸生產(chǎn)的具體方法是(1)在無菌條件下將枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) WB600 (pHP⑶-cotG-nanA)接種到含有0. 1 1. 5g/L氯霉素的LB中，置25 40°C下，振蕩 培養(yǎng)8 30小時，得到種子細胞。
(2)用(1)中的種子細胞，無菌條件下以體積比0. 5% 10%的接種量接種于GYS 產(chǎn)孢培養(yǎng)基，于25 40°C培養(yǎng)10 48小時。(3)將上述培養(yǎng)物以10，000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，并用PBS緩沖液清洗兩遍，得 到重組枯草芽孢桿菌芽孢。(4)將(3)中得到的芽孢菌液按照體積比5 % 20 %的加量添加IOmM Tris-HCKpH = 8. 0，含0. 25M EDTA)，按質(zhì)量比0. 1 1. 5g/L加量添加溶菌酶，37°C作用 0. 1 5小時。(5)將(4)中得到的菌液用均含有ImM的苯甲基磺酰氟(PMSF)的IM NaClUM KCl 和pH 7. 4、1/15M的PBS緩沖液各洗滌1遍，而后菌體重懸于pH 7. 4、1/15M的PBS緩沖液 中，得到表面展示有N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶的重組芽孢桿菌芽孢催化劑；進行N-乙酰神經(jīng) 氨酸醛縮酶酶活力測定并置于4°C保存。(6)應用(4)所述催化劑制備N-乙酰神經(jīng)氨酸的反應體系及反應條件是反應 體系中催化劑N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶酶活為0. 1 1. 5U，N-乙酰甘露糖胺濃度為50 500mM,丙酮酸濃度為200 1500mM，磷酸緩沖液濃度40 80mM，反應pH值為7 7. 8，反 應溫度為25 70°C，反應時間為6 40小時，反應過程使用往復式搖床或控制發(fā)酵罐轉(zhuǎn)速 使氧溶解度為30 70%。(7)將(6)的轉(zhuǎn)化液以8，000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，去除所加入的催化劑，利用高效 液相色譜(HPLC)法測定上清液中N-乙酰神經(jīng)氨酸的含量。其中，步驟⑴中使用的LB培養(yǎng)基配方為每升中加入5g酵母粉，IOg蛋白胨，IOg NaCl，調(diào)節(jié)pH值為7. 5，121 °C濕熱滅菌20分鐘。其中，步驟(1)中所述的種子細胞培養(yǎng)和制備催化劑細胞的優(yōu)選溫度是35 380C ；紅霉素的濃度優(yōu)選為0. 3 0. 8g/L，種子細胞培養(yǎng)時間優(yōu)選是20 26小時。其中，步驟(2)中所述的制備催化劑細胞中，優(yōu)選種子細胞接種量為3% 7%，培 養(yǎng)溫度35 38°C，培養(yǎng)時間優(yōu)選20 26小時。其中，步驟(2)中使用的GYS培養(yǎng)基配方為每升中加入Ig葡萄糖，2g (NH4)2SO4, O. Ig 檸檬酸三鈉，2g 酵母粉，3. 3g K2HPO4, 3. 33ml IM MgSO4,1. 44ml IM CaCl2, 59 μ 1 IM MnSO4 · H20,115°C濕熱滅菌20分鐘。其中，步驟(4)中所述的IOmM Tris-HCl (pH = 8. 0，含0· 25M EDTA)的添加量優(yōu)選 為12% 14%，溶菌酶的優(yōu)選添加量為0. 3 0. 7g/L。其中，步驟(5)中所述N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶酶活測量反應體系為20mM磷酸鉀 緩沖液(pH 7. 4) 350 μ 1,100 μ 1 N-乙酰神經(jīng)氨酸(5mg/ml)，50 μ 1酶液。酶活測量反應條 件為:37°C 反應 lOmin，加 0. 5ml 2，4 二硝基苯胼(DNP)，20min 后加 5mlNa0H(0. 4M)顯色。 于520nm比色。丙酮酸標準曲線配制IOmM的丙酮酸鈉溶液25ml，分別稀釋為0. 1,0. 2、 0. 4,0. 6,0. 8,1. OmM六種不同濃度。將測酶活反應體系中的50 μ 1酶液換成50 μ 1不同濃 度的丙酮酸鈉溶液。反應條件與測酶活條件相同。酶活定義為每分鐘分解N-乙酰神經(jīng)氨 酸生成1 μ mol丙酮酸所需酶量為一個酶活單位。其中，步驟(7)中涉及的采用HPLC分析的方法及條件為樣品沸水浴10分鐘后， 12，000轉(zhuǎn)/每分鐘，離心20分鐘，取離心液上清，用流動相稀釋至合適倍數(shù)，用0. 22 μ m濾 膜過濾，濾過液進行HPLC檢測。采用BioRad Aminex HPX-87H(300X7. 8mm)色譜柱對樣品進行分析方法及條件為柱溫為55°C，以IOmM硫酸水溶液為流動相，流速為0. 4ml/min，在 Agilent 1100高效液相色譜儀上運行，進樣量5 μ 1，檢測器為示差折光檢測器(RID)。本發(fā)明所述的芽孢表面展示系統(tǒng)含有安全無毒、操作方便的自誘導啟動子，通過 菌體的生長即可同時實現(xiàn)催化所用酶N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶的表達和固定化，從而可方 便、快捷、高效的得到固定化的催化劑。使用該芽孢表面展示系統(tǒng)可一步完成酶的表達、純 化和固定化，所展示的酶仍可具有較高的生物活性，并且芽孢易于分離，簡便了后續(xù)分離過 程，因此芽孢表面展示在生物催化領(lǐng)域生產(chǎn)高附加化合物方面起著重要的作用。應用本發(fā)明所述芽孢表面展示重組枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) WB600 (pHP⑶-cotG-nanA)在規(guī)?；呋a(chǎn)N-乙酰神經(jīng)氨酸過程中具有催化劑制備安全 簡捷高效，催化過程操作簡單，價格便宜，效率較高，易于提取等特點，具體為(1)本發(fā)明首次使用高拷貝穿梭載體構(gòu)建了高效芽孢表面展示系統(tǒng)，表面展示效 率大大提高。(2)本發(fā)明首次構(gòu)建了 N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶芽孢表面展示系統(tǒng)。使用該表面展 示系統(tǒng)可一步實現(xiàn)酶的表達、純化和固定化，并且無需任何誘導劑，不需外加其它物質(zhì)，過 程更為安全，操作更為方便。并且僅需要一次菌體培養(yǎng)即可得到固定化的N-乙酰神經(jīng)氨酸 醛縮酶。(3)本發(fā)明中使用芽孢外衣蛋白CotG自有啟動子作為重組載體的啟動子，其具有 嚴格的時序性，保證了芽孢的形成與蛋白的表達同時進行，提高了蛋白展示效率和有效定 位效率。(4)本發(fā)明中所涉及的融合蛋白CotG-NanA之間，有一個由5個氨基酸構(gòu)成的 linker，其降低了異源蛋白在表面展示中的空間位阻，增加了表面展示的折疊效率。(5)本發(fā)明中所使用的宿主菌為具有六個蛋白酶缺失的枯草芽孢桿菌WB600。使 用該菌株不僅增加了蛋白的表面展示效率，同時還提高了該系統(tǒng)的安全性。由于枯草芽孢 桿菌是公認的益生菌，因此其安全性更高，更可靠。(6)本發(fā)明中首次以芽孢作為N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶固定化載體。芽孢具有穩(wěn) 定、易于分離的特點，在后處理過程中易于分離。
具體實施例方式實施例1 :高拷貝穿梭載體pHP⑶的構(gòu)建l、p⑶Vl復制子的克隆采用常規(guī)的方法提取枯草芽孢桿菌168的質(zhì)粒pGDVl，該過程可參考科學出版社 出版的《精編分子生物學指南》中細菌質(zhì)粒的小量制備的方法。使用所合成的引物從提取 的質(zhì)粒pGDVl中PCR擴增得到高拷貝復制子基因。其中，ρ⑶Vl購自德國枯草基因保存中心(Bacillus Genetic Stock Center, BGSC)，查詢號為1E60 ；上述枯草芽孢桿菌作為復制子基因的來源菌，根據(jù)pGDVl已知序列， 設計引物上游引物 pGDVlF :5’ -ATCGGTCTCACGCCCGAGACCATGTATAAAAACAATCATG-3，，攜帶 有一個 BasI 酶切位點；下游引物 pGDVIR :5，-CCAAGGTCCCTTACTTCCAAAATCTAAA-3，，攜帶有 一個Eco0109I酶切位點。2、構(gòu)建穿梭載體pHP⑶
將PCR擴增所得到的ρ⑶Vl復制子片段經(jīng)BasI和Eco0109I酶切回收后，連接至 經(jīng)相同酶切處理后回收的質(zhì)粒PHP13。將連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，涂布帶有氯霉素 抗性的LB平板。得到的轉(zhuǎn)化子進行質(zhì)粒提取、酶切及序列測定驗證，保存正確轉(zhuǎn)化子，得到 穿梭載體PHP⑶。其中上述大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備方法可參考科學出版社出版的《精編分子生 物學指南》中大腸桿菌感受態(tài)制備方法。其中上述質(zhì)粒pHP13購自德國枯草基因保存中心(Bacillus Genetic Stock Center, BGSC)，查詢號為 ECE32。其中上述的LB平板配方為每升中加入5g酵母粉，IOg蛋白胨，IOg NaCl，15g瓊脂 粉，40mg氯霉素，調(diào)節(jié)pH值為7. 5，121°C濕熱滅菌20分鐘。實施例2 高效芽孢表面展示系統(tǒng)枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) WB600 (pHPGD-cotG-nanA)的構(gòu)建1、芽孢外衣蛋白CotG基因(cotG)克隆采用常規(guī)的方法制備枯草芽孢桿菌168的基因組DNA，該過程可參考科學出版社 出版的《精編分子生物學指南》中細菌基因組的小量制備的方法。使用合成的引物cotGF和 cotGR從枯草芽孢桿菌168的基因組DNA中PCR擴增得到cotG基因。其中，上述枯草芽孢桿菌168購自德國枯草基因保存中心(Bacillus Genetic Stock Center，BGSC)，查詢號為 IAl。根據(jù)已報道的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) 168的基因組序列和已報道的 cotG基因的序列，設計引物。上游引物cotGF:5，-GCCTTTGAATTCAGTGTCCCTAGCTCCGAGA-3，，攜帶一個 EcoRI 酶切位點；下游引物cotGR:5，-CTATTGACTAGTTGAACCCCCACCTCCTTTGTATTTCTTTTTGACTACC-3，，攜帶一個 SpeI 酶切位點。其中在下游引物序列中插入了一段編碼柔性連接手臂(linker)的基因，該手臂 由5個氨基酸Gly-Gly-Gly-Gly-Ser構(gòu)成，起著連接異源蛋白的作用。2、N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶基因(nanA)克隆采用常規(guī)的方法制備菌株大腸桿菌K12ATCC 25404 (購自American Type Culture Collection，美國標準菌庫)的基因組DNA，該過程可參考科學出版社出版的《精編分子生 物學指南》中細菌基因組的小量制備的方法；使用合成的引物nanAF和nanAR從大腸桿菌 K12的基因組DNA中PCR擴增得到N-乙酰神經(jīng)氨酸酶基因nanA。其中，根據(jù)已測序的大腸桿菌K12ATCC 25404的基因組序列及已報道的nanA的序 列信息，設計引物上游弓丨物nanAF 5，-GAGACTAGTATGGCAACGAATTTACG-3，，攜帶一個 SpeI 酶切位點； 下游引物 nanAR :5，-CTCCTGCAGTCACCCGCGCTCTT-3，，攜帶一個 PstI 酶切位點。3、融合基因cotG-nanA的構(gòu)建(1)將PCR擴增得到的cotG基因，經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoRI和SpeI處理回收后，與 經(jīng)相同限制性內(nèi)切酶處理的載體PEASY-T3相連，使用T4DNA連接酶16°C連接過夜。(2)將(1)中的連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌Mach Tl的感受態(tài)細胞，涂布帶有氨芐青霉素抗性的LB平板，37°C培養(yǎng)過夜。(3)挑取(2)中平板上所生長的轉(zhuǎn)化子單菌落至LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后提取質(zhì)粒， 利用EcoRI和SpeI雙酶切驗證其正確性，同時進行DNA測序以保證其準確性。最后保存正 確轉(zhuǎn)化子，得到載體pEASY-cotG。(4)將PCR擴增得到的nanA基因，經(jīng)限制性內(nèi)切酶SpeI和PstI處理回收后，與經(jīng) 相同限制性內(nèi)切酶處理的載體pEASY-cotG相連，使用T4DNA連接酶16°C連接過夜。(5)將(4)中的連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞Mach Tl，涂布帶有氨芐青霉素抗 性的LB平板，37°C培養(yǎng)過夜。(6)挑取(5)中平板上所生長的轉(zhuǎn)化子單菌落至LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后提取質(zhì)粒， 利用SpeI和PstI雙酶切驗證其正確性，同時進行DNA測序以保證其準確性。最后保存正 確轉(zhuǎn)化子，得到含有融合基因cotG-nanA的載體pEASY-cotG_nanA。其中，上述大腸桿菌Mach Tl的感受態(tài)制備過程可參考科學出版社出版的《精編分 子生物學指南》中大腸桿菌感受態(tài)CaCl2制備方法。其中上述的LB平板配方為每升中加入5g酵母粉，IOg蛋白胨，IOg NaCl，15g瓊脂 粉，IOOmg氨芐青霉素，調(diào)節(jié)pH值為7. 5，121°C濕熱滅菌20分鐘。4、高效芽孢表面展示系統(tǒng)枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) WB600 (pHPGD-cotG-nanA)的構(gòu)建(1)將獲得的載體pEASY-cotG-nanA經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoRI和PstI處理回收后 得到融合基因cotG-nanA，然后與經(jīng)相同限制性內(nèi)切酶處理的高拷貝穿梭載體pHPGD，使用 T4DNA連接酶16 °C連接過夜。(2)將(1)中的連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞Mach Tl，涂布帶有氯霉素抗性的 LB平板，37°C培養(yǎng)過夜。(3)挑取(2)中平板上所生長的轉(zhuǎn)化子單菌落至LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后提取質(zhì)粒， 利用EcoRI和PstI雙酶切驗證其正確性，同時進行DNA測序以保證其準確性。最后保存正 確轉(zhuǎn)化子，得到表面展示載體pHP⑶-cotG-nanA。(4)從平板中挑取培養(yǎng)的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)WB600的單菌落，接 入LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)10 14小時。將所得培養(yǎng)物以6. 25%接種量，轉(zhuǎn)接至含有0. 5M山梨 醇的LB培養(yǎng)中，37°C培養(yǎng)至OD6tltlnm為0. 85 0. 95。然后將上述培養(yǎng)菌液置于冰水混合物 中10分鐘，4°C下5000Xg離心5分鐘，收集菌體。用預冷的電轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基重懸上述菌體， 4°C下5000 Xg離心5分鐘，棄去上清，如此漂洗上述菌體4次。最終將菌體重懸到原始培 養(yǎng)物體積的1/100的電轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中，得到枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)WB600的感 受態(tài)細胞。(5)將Iul表面展示載體pHP⑶-CotG-nanA與(4)中所制備的80ul枯草芽孢桿 菌(Bacillus subtilis) WB600感受態(tài)細胞加入冰預冷的電轉(zhuǎn)化杯中，冰上放置1 1. 5分 鐘。然后在電容25uF、電阻200Ω、電壓2500V條件下進行電擊。電擊完畢后取出電轉(zhuǎn)化杯 并立即加入Iml恢復培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)2. 5 3. 5小時。然后涂布帶有氯霉素抗性的LB平 板，37°C過夜培養(yǎng)。(6)挑取(5)中平板上的轉(zhuǎn)化子至LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后通過菌落PCR驗證轉(zhuǎn)化 子的正確性。上述菌落PCR以各轉(zhuǎn)化子菌液為模板，以cotGF和nanAR為引物，擴增融合基因cotG-nanA，驗證轉(zhuǎn)化子的正確性。最后保存正確轉(zhuǎn)化子，得到高效芽孢表面展示系統(tǒng)枯 草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) WB600 (pHPGD-cotG-nanA)。其中，上述用于制備枯草芽孢桿菌感受態(tài)的菌株WB600來源于枯草芽孢桿菌168， 含有六個蛋白酶 trpC2 Δ nprE Δ aprE Δ epr Abpf Δ mpr Δ nprB 的缺失。其中上述的LB平板配方為每升蒸餾水中加入5g酵母粉，IOg蛋白胨，IOg NaCl, 15g瓊脂粉，40mg氯霉素，調(diào)節(jié)pH值為7. 5，121°C濕熱滅菌20分鐘。其中，(4)所述的電轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基配方為每升超純水中加入91g山梨醇，91g甘露醇， IOOg甘油，115°C濕熱滅菌20分鐘。其中，(5)所述的恢復培養(yǎng)基配方為每升蒸餾水中加入5g酵母粉，IOg蛋白胨，IOg NaCl, 69. 2g甘露醇，調(diào)節(jié)pH值為7. 5，115°C濕熱滅菌20分鐘。實施例3 芽孢表面展示系統(tǒng)用于N-乙酰神經(jīng)氨酸生產(chǎn)的方法(1)平板培養(yǎng)將上述枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) WB600 (pHP⑶-cotG-nanA)菌株劃線到含有質(zhì)量體積比為1. 5%瓊脂并含40 μ g/ml的氯霉 素LB平板上，37°C培養(yǎng)12小時。(2) 一級種子在無菌的條件下，用無菌的牙簽挑取步驟(1)平板上的一個單菌 落，然后接種到5ml的含40μ g/ml氯霉素的液體培養(yǎng)基中，37°C搖床振蕩培養(yǎng)12小時。(3)搖瓶培養(yǎng)在無菌條件下，取步驟(2)所培養(yǎng)的培養(yǎng)液以體積比為5%的接種 量，接種到IL含有40 μ g/ml的氯霉素的GYS培養(yǎng)基中，37°C搖床振蕩培養(yǎng)24小時。其中，上述(2)中的LB培養(yǎng)基的配方為每升蒸餾水中加入5g酵母粉，IOg蛋白 B, IOg NaCl，調(diào)節(jié) pH 為 7. 0 ；115°C滅菌 20 分鐘。其中，上述(3)中的GYS培養(yǎng)基的配方為每升蒸餾水中加入Ig葡萄糖， 2g(NH4)2S04，0. Ig檸檬酸三鈉，2g酵母粉，3. 3g K2HPO4, 3. 33ml IM MgSO4,1. 44ml IM CaCl2, 59 μ 1 IM MnSO4 · H20,115°C濕熱滅菌 20 分鐘。(4)收集菌體將步驟(3)培養(yǎng)得到的培養(yǎng)物4°C條件下，5，000轉(zhuǎn)/分鐘離心10 分鐘，收集菌體，棄去上清，并用無菌蒸餾水洗滌菌體一遍。(5)孢子懸液即芽孢催化劑的制備將步驟⑷中所得的菌體按照體積比重懸 Λ IOmM Tris-HCl (pH = 8· 0，含0· 25Μ EDTA)，并按照質(zhì)量體積比0. 05%添加溶菌酶，37°C 下在水浴搖床保溫1小時。經(jīng)溶菌酶處理后的培養(yǎng)物用IM NaCl, IM KCl和pH 7. 4U/15M 的PBS緩沖液各洗滌一遍，最后重懸入原始培養(yǎng)物體積的1/50的1/15M的PBS緩沖液中， 得到表面展示有N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶的重組芽孢桿菌芽孢催化劑。檢測得N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶的酶活力為0. 9U/ml，將所得重組芽孢置于4°C的 冰箱中冷藏，待用。其中，上述所用的IM NaCl,lM KCl和pH 7. 4、1/15M的PBS緩沖液中都含有ImM 的苯甲基磺酰氟(PMSF)。其中，上述溶菌酶購自美國Sigma公司，酶活力為40，000U。其中，上述N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶活性測定方法如下酶活測量反應體系20mM磷酸鉀緩沖液(pH 7. 4) 350 μ 1,100 μ 1 N-乙酰神經(jīng)氨 酸(5mg/ml)，50 μ 1酶液。酶活測量反應條件為37°C反應10分鐘，加0. 5ml DNP溶液顯色 20分鐘后，加NaOH (0. 4M) 5ml顯色。于520nm比色。
(6)利用上述重組芽孢作為催化劑生產(chǎn)N-乙酰神經(jīng)氨酸將步驟(5)中得到的生 物催化劑即重組枯草芽孢桿菌(Bacillus subtil is) WB600 (pHPGD-cotG-nanA)的N-乙酰 神經(jīng)氨酸醛縮酶總活性調(diào)節(jié)約至0. IU。在25°C，pH 7. 4條件下，丙酮酸濃度為1，OOOmM, N-乙酰甘露糖胺濃度為500mM，在往復式搖床振蕩反應30小時，得到含N-乙酰神經(jīng)氨酸轉(zhuǎn) 化液。(7)將轉(zhuǎn)化液以8，000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，去除所加入的生物催化劑，利用高效液 相色譜(HPLC)法測定上清液中N-乙酰神經(jīng)氨酸的含量為50. 22g/L.上述HPLC檢測反應體系方法為樣品處理方法如下。樣品沸水浴10分鐘后， 12，000轉(zhuǎn)/分鐘，離心20分鐘。取離心液上清，用流動相稀釋至合適倍數(shù)，用0. 22 μ m濾膜 過濾，濾過液進行HPLC檢測。使用BioRad Aminex HPX-87H(300X7. 8mm)色譜柱對樣品進 行分析。柱溫為55°C，以IOmM硫酸水溶液為流動相，流速為0. 4ml/分鐘，在AgilentllOO 高效液相色譜儀上運行，進樣量5 μ 1，檢測器為示差折光檢測器(RID)。實施例4 芽孢表面展示系統(tǒng)用于N-乙酰神經(jīng)氨酸生產(chǎn)的方法(1)平板培養(yǎng)將上述枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) WB600 (pHP⑶-cotG-nanA)菌株劃線到含有質(zhì)量體積比為1. 5%瓊脂并含40 μ g/ml的氯霉 素LB平板上，37°C培養(yǎng)12小時。(2) 一級種子在無菌的條件下，用無菌的牙簽挑取步驟(1)平板上的一個單菌 落，然后接種到5ml的含40μ g/ml氯霉素的液體培養(yǎng)基中，37°C搖床振蕩培養(yǎng)12小時。(3)搖瓶培養(yǎng)在無菌條件下，取步驟(2)所培養(yǎng)的培養(yǎng)液以體積比為5%的接種 量，接種到IL含有40 μ g/ml的氯霉素的GYS培養(yǎng)基中，37°C搖床振蕩培養(yǎng)24小時。其中，上述(2)中的LB培養(yǎng)基的配方為每升蒸餾水中加入5g酵母粉，IOg蛋白 B, IOg NaCl，調(diào)節(jié) pH 為 7. 0 ；115°C滅菌 20 分鐘。其中，上述(3)中的GYS培養(yǎng)基的配方為每升蒸餾水中加入Ig葡萄糖， 2g(NH4)2S04，0. Ig檸檬酸三鈉，2g酵母粉，3. 3g K2HPO4, 3. 33ml IM MgSO4,1. 44ml IM CaCl2, 59 μ 1 IM MnSO4 · H20,115°C濕熱滅菌 20 分鐘。(4)收集菌體將步驟(3)培養(yǎng)得到的培養(yǎng)物4°C條件下，5，000轉(zhuǎn)/分鐘離心10 分鐘，收集菌體，棄去上清，并用無菌蒸餾水洗滌菌體一遍。(5)孢子懸液的制備將步驟⑷中所得的菌體按照體積比重懸入IOmM Tris-HCl (pH = 8. 0，含0. 25M EDTA)，并按照質(zhì)量體積比0. 05%添加溶菌酶，37°C下在水浴 搖床保溫1小時。經(jīng)溶菌酶處 后的培養(yǎng)物用IM NaCl, IM KCl和pH 7. 4U/15M的PBS緩 沖液各洗滌一遍，最后重懸入原始培養(yǎng)物體積的1/50的1/15M的PBS緩沖液中，得到表面 展示有N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶的重組芽孢懸液，即芽孢催化劑。測得N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶的酶活力為0. 9U/ml，將所得重組芽孢置于4°C的冰 箱中冷藏，待用。其中，上述所用的IM NaCl,lM KCl和pH 7. 4、1/15M的PBS緩沖液中都含有ImM 的苯甲基磺酰氟(PMSF)。其中，上述溶菌酶購自美國Sigma公司，酶活力為40000U。其中，上述N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶活性測定方法為如下。酶活測量反應體系 20mM磷酸鉀緩沖液(pH 7. 4) 350 μ 1，100 μ 1 N-乙酰神經(jīng)氨酸(5mg/ml)，50 μ 1酶液。酶活測量反應條件為37°C反應10分鐘，加0. 5ml DNP溶液顯色20分鐘后，加NaOH (0. 4M) 5ml 顯色。于520nm比色。(6)利用上述重組芽孢作為催化劑生產(chǎn)N-乙酰神經(jīng)氨酸將步驟(5)中得到的生 物催化劑即重組枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)WB600(pHPffl)-cotG-nanA)的芽孢醛縮 酶總活性調(diào)節(jié)約至0. 7U。在70°C，pH 7. 4條件下，丙酮酸濃度為1200mM，N_乙酰甘露糖胺 濃度為IOOmM,在往復式搖床振蕩反應18小時，得到含N-乙酰神經(jīng)氨酸轉(zhuǎn)化液。(7)將轉(zhuǎn)化液以8，000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，去除所加入的生物催化劑，利用高效液 相色譜(HPLC)法測定上清液中N-乙酰神經(jīng)氨酸的含量為23. 78g/L.上述HPLC檢測反應體系方法為樣品處理方法如下。樣品沸水浴10分鐘后， 12，000轉(zhuǎn)/分鐘，離心20分鐘。取離心液上清，用流動相稀釋至合適倍數(shù)，用0. 22 μ m濾膜 過濾，濾過液進行HPLC檢測。使用BioRad Aminex HPX-87H(300X 7. 8mm)色譜柱對樣品進 行分析。柱溫為55°C，以IOmM硫酸水溶液為流動相，流速為0. 4ml/分鐘，在AgilentllOO 高效液相色譜儀上運行，進樣量5μ 1，檢測器為示差折光檢測器(RID)。實施例5 芽孢表面展示系統(tǒng)用于N-乙酰神經(jīng)氨酸生產(chǎn)的方法(1)平板培養(yǎng)將上述枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) WB600 (pHP⑶-cotG-nanA)菌株劃線到含有質(zhì)量體積比為1. 5%瓊脂并含40 μ g/ml的氯霉 素LB平板上，37°C培養(yǎng)12小時。(2) 一級種子在無菌的條件下，用無菌的牙簽挑取步驟(1)平板上的一個單菌 落，然后接種到5ml的含40μ g/ml氯霉素的液體培養(yǎng)基中，37°C搖床振蕩培養(yǎng)12小時。(3)搖瓶培養(yǎng)在無菌條件下，取步驟(2)所培養(yǎng)的培養(yǎng)液以體積比為5%的接種 量，接種到IL含有40 μ g/ml的氯霉素的GYS培養(yǎng)基中，37°C搖床振蕩培養(yǎng)24小時。其中，上述(2)中的LB培養(yǎng)基的配方為每升蒸餾水中加入5g酵母粉，IOg蛋白 B, IOg NaCl，調(diào)節(jié) pH 為 7. 0 ；115°C滅菌 20 分鐘。其中，上述(3)中的GYS培養(yǎng)基的配方為每升蒸餾水中加入Ig葡萄糖， 2g(NH4)2S04，0. Ig檸檬酸三鈉，2g酵母粉，3. 3g K2HPO4, 3. 33ml IM MgSO4,1. 44ml IM CaCl2, 59 μ 1 IM MnSO4 · H20,115°C濕熱滅菌 20 分鐘。(4)收集菌體將步驟(3)培養(yǎng)得到的培養(yǎng)物4°C條件下，5，000轉(zhuǎn)/分鐘離心10 分鐘，收集菌體，棄去上清，并用無菌蒸餾水洗滌菌體一遍。(5)孢子懸液的制備將步驟⑷中所得的菌體按照體積比重懸入IOmM Tris-HCl (pH = 8. 0，含0. 25M EDTA)，并按照質(zhì)量體積比0. 05%添加溶菌酶，37°C下在水浴 搖床保溫1小時。經(jīng)溶菌酶處理后的培養(yǎng)物用IM NaCl, IM KCl和pH 7. 4U/15M的PBS緩 沖液各洗滌一遍，最后重懸入原始培養(yǎng)物體積的1/50的1/15M的PBS緩沖液中，得到表面 展示有N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶的重組芽孢懸液，即芽孢催化劑。測得N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶的酶活力為0. 9U/ml，將所得重組芽孢置于4°C的冰 箱中冷藏，待用。其中，上述所用的IM NaCl,lM KCl和pH 7. 4、1/15M的PBS緩沖液中都含有ImM 的苯甲基磺酰氟(PMSF)。其中，上述溶菌酶購自美國Sigma公司，酶活力為40000U。其中，上述N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶活性測定方法為如下。酶活測量反應體系
1320mM磷酸鉀緩沖液(pH 7. 4) 350 μ 1，100 μ 1 N-乙酰神經(jīng)氨酸(5mg/ml)，50 μ 1酶液。酶 活測量反應條件為37°C反應10分鐘，加0. 5ml DNP溶液顯色20分鐘后，加NaOH (0. 4M) 5ml 顯色。于520nm比色。(6)利用上述重組芽孢作為催化劑生產(chǎn)N-乙酰神經(jīng)氨酸將步驟(5)中得到的生 物催化劑即重組枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)WB600(pHPffl)-cotG-nanA)的芽孢醛縮 酶總活性調(diào)節(jié)約至0. 3U。在50°C，pH 7. 4條件下，丙酮酸濃度為600mM，N-乙酰甘露糖胺 濃度為500mM，在往復式搖床振蕩反應6小時，得到含N-乙酰神經(jīng)氨酸轉(zhuǎn)化液。(7)將轉(zhuǎn)化液以8，000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，去除所加入的生物催化劑，利用高效液 相色譜(HPLC)法測定上清液中N-乙酰神經(jīng)氨酸的含量為54. 70g/L上述HPLC檢測反應體系方法為樣品處理方法如下。樣品沸水浴10分鐘后， 12，000轉(zhuǎn)/分鐘，離心20分鐘。取離心液上清，用流動相稀釋至合適倍數(shù)，用0. 22 μ m濾膜 過濾，濾過液進行HPLC檢測。使用BioRad Aminex HPX-87H(300X7. 8mm)色譜柱對樣品進 行分析。柱溫為55°C，以IOmM硫酸水溶液為流動相，流速為0. 4ml/分鐘，在AgilentllOO 高效液相色譜儀上運行，進樣量5μ 1，檢測器為示差折光檢測器(RID)。
權(quán)利要求
芽孢表面展示系統(tǒng)用于N 乙酰神經(jīng)氨酸生產(chǎn)的方法，步驟包括高拷貝大腸桿菌 枯草芽孢桿菌穿梭載體pHPGD的構(gòu)建，高效芽孢表面展示系統(tǒng)枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)WB600的構(gòu)建，以芽孢表面展示重組枯草芽孢桿菌WB600制備孢子懸液作為轉(zhuǎn)化反應的芽孢催化劑，利用所述芽孢催化劑生產(chǎn)N 乙酰神經(jīng)氨酸；其特征在于所述高拷貝大腸桿菌 枯草芽孢桿菌穿梭載體pHPGD構(gòu)建的出發(fā)載體是來源于大腸桿菌的質(zhì)粒pHP13和來源于枯草芽孢桿菌168的質(zhì)粒pGDV1，其得到的高拷貝穿梭載體的核苷酸序列如SEQ.ID.No.7所示；所述高效芽孢表面展示系統(tǒng)枯草芽孢桿菌WB600的構(gòu)建是以構(gòu)建好的高拷貝穿梭載體pHPGD為出發(fā)載體，在多克隆位點按順序插入芽孢外衣蛋白CotG基因和N 乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶基因，得到芽孢表面展示載體pHPGD cotG nanA，或在多克隆位點順序插入芽孢外衣蛋白cotB基因和N 乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶基因，得到芽孢表面展示載體pHPGD cotB nanA，或在多克隆位點順序插入芽孢外衣蛋白cotC基因和N 乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶基因，得到芽孢表面展示載體pHPGD cotC nanA，然后分別電轉(zhuǎn)來源于枯草芽孢桿菌168的、有六個蛋白酶trpC2ΔnprEΔaprEΔeprΔbpfΔmprΔnprB缺失的枯草芽孢桿菌感受態(tài)的菌株WB600，經(jīng)篩選獲得；所述以芽孢表面展示重組枯草芽孢桿菌WB600制備孢子懸液作為轉(zhuǎn)化反應催化劑的方法為以體積比1％ 2％的量將重組枯草芽孢桿菌WB600重懸于pH＝8.0、10mM Tris HCl溶液中，并按0.1～1.5g/L的量添加溶菌酶，37℃作用0.1～5小時，然后用均含有1mM的苯甲基磺酰氟的1M NaCl、1M KCl和pH 7.4、1/15M的PBS緩沖液各洗滌1 2遍，而后菌體重懸于pH 7.4、1/15M的PBS緩沖液中，得到表面展示有N 乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶的重組芽孢桿菌芽孢催化劑；所述利用芽孢催化劑生產(chǎn)N 乙酰神經(jīng)氨酸的條件是反應體系中催化劑N 乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶酶活為0.1～1.5U，N 乙酰甘露糖胺濃度為50～500mM，丙酮酸濃度為200～1500mM，磷酸緩沖液濃度40～80mM，反應pH值為7～7.8，反應溫度為25～70℃，反應時間為6～40小時，反應過程使用往復式搖床或控制發(fā)酵罐轉(zhuǎn)速使氧溶解度為30～70％。
2.如權(quán)利要求1所述芽孢表面展示系統(tǒng)用于N-乙酰神經(jīng)氨酸生產(chǎn)的方法，其特征在 于所述以芽孢表面展示重組枯草芽孢桿菌WB600制備孢子懸液作為轉(zhuǎn)化反應催化劑的方 法為以體積比1 %的量將重組枯草芽孢桿菌WB600重懸于pH = 8. OUOmM Tris-HCl溶液 中，并按0. 5g/L的量添加溶菌酶，37°C作用1 2小時，然后用均含有ImM的苯甲基磺酰氟 的IM NaClUM KCl和pH 7. 4、1/15M的PBS緩沖液各洗滌1遍，而后菌體重懸于pH 7.4、 1/15M的PBS緩沖液中，得到表面展示有N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶的重組芽孢桿菌芽孢催化 劑。
3.如權(quán)利要求1所述芽孢表面展示系統(tǒng)用于N-乙酰神經(jīng)氨酸生產(chǎn)的方法，其特征 在于所述利用芽孢催化劑生產(chǎn)N-乙酰神經(jīng)氨酸的條件是反應體系中催化劑N-乙酰神 經(jīng)氨酸醛縮酶酶活為0. 3 0. 7U，N-乙酰甘露糖胺濃度為500mM，丙酮酸濃度為600 IOOOmM,磷酸緩沖液濃度50 60mM，反應pH值為7. 4 7. 6，反應溫度為50 60°C，反應 時間為6 20小時，反應過程使用往復式搖床或控制發(fā)酵罐轉(zhuǎn)速使氧溶解度為50 60%。全文摘要
本發(fā)明公開了一種芽孢表面展示系統(tǒng)用于N-乙酰神經(jīng)氨酸生產(chǎn)的方法，該方法利用高拷貝穿梭載體，與芽孢外衣蛋白基因和N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶基因重組后，構(gòu)建表面展示表達載體，并轉(zhuǎn)化入枯草芽孢桿菌得到重組菌株，該重組菌株的芽孢可催化N-乙酰神經(jīng)氨酸的合成。與本領(lǐng)域其它方法相比，本發(fā)明可一步完成酶的表達、純化和固定化，操作過程簡捷高效。此外，利用枯草芽孢桿菌芽孢穩(wěn)定易于分離和抗逆性的特點，簡便了后續(xù)分離過程，提高了N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶的穩(wěn)定性并增加了整個催化過程的安全性。
文檔編號C12N1/21GK101906449SQ20101020780
公開日2010年12月8日 申請日期2010年6月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月24日
發(fā)明者徐小曼, 許平, 馬翠卿 申請人:山東大學