專利名稱：一種提高靈芝漆酶產(chǎn)量的發(fā)酵方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種工業(yè)用酶制劑的制備方法，具體涉及一種提高靈芝漆酶產(chǎn)量的發(fā) 酵方法。
背景技術(shù)：
漆酶(Iaccase)是一類含銅的多酚氧化酶(Eel. 10. 3. 2)，能夠氧化多種酚和芳 胺類化合物，在廢水處理、紙漿漂白、土壤凈化、染料脫色、免疫檢測等方面具有廣泛的應(yīng)用 [洪宇植等(2005)生物工程學(xué)報21 :547-552]，近年來成為國際酶工程學(xué)研究的一個熱點。 漆酶廣泛存在于植物、高等真菌、細菌和昆蟲中，可從多種途徑獲得，但最有工業(yè)化生產(chǎn)前 景的是微生物發(fā)酵法。擔(dān)子菌中的白腐菌是一類漆酶產(chǎn)量較高的微生物，其中靈芝 lucidum)作為一種重要的藥用真菌，近年來人們對其漆酶生產(chǎn)開展了較為廣泛的研究。但 目前包括靈芝在內(nèi)的高等真菌漆酶的生產(chǎn)因其產(chǎn)量較低，通常需要芳香類化合物或等重金 屬離子的誘導(dǎo)[Xiao YZ et al (2004) Mycologia 96:26-35]。這些誘導(dǎo)物一般都具有毒 性，且難于降解，添加后使發(fā)酵液處理成本增高，還易造成環(huán)境污染。近年來，人們一直在尋 求新的高效漆酶生產(chǎn)方法，并取得一定成果，如固態(tài)發(fā)酵和漆酶基因的異源表達。固態(tài)發(fā)酵 技術(shù)能夠緩解漆酶生產(chǎn)的環(huán)境污染問題，但發(fā)酵周期太長，不適合工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)需要；漆 酶基因的異源表達的產(chǎn)量往往也低于野生菌[Hong YZ et al (2006) FEMS Microbiol Lett 258:96-101]，這都限制了漆酶的工業(yè)化生產(chǎn)。真菌誘導(dǎo)子是來源于真菌的一種特定的化學(xué)信號物質(zhì)，具有誘導(dǎo)植物細胞中防衛(wèi) 基因表達、誘發(fā)植物過敏反應(yīng)和促進植物細胞中特定次生代謝產(chǎn)物的合成等多種功能。利 用真菌誘導(dǎo)子激活植物細胞中的次生代謝途徑已成為提高植物細胞培養(yǎng)物中目標產(chǎn)物產(chǎn) 量的有效手段之一[郭文娟等(2007)，中國藥學(xué)雜志42 (5):321-324]。近年來，利用真菌 誘導(dǎo)子處理植物培養(yǎng)細胞以促使細胞快速、大量合成目的次生代謝物質(zhì)已成為人們普遍重 視的新方法。然而，將真菌誘導(dǎo)子用于靈芝液體發(fā)酵培養(yǎng)以提高漆酶產(chǎn)量的研究目前尚未 見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服上述已有技術(shù)的不足而提供一種工藝簡單、成本低廉、效 果顯著，利用真菌誘導(dǎo)子提高靈芝漆酶產(chǎn)量的發(fā)酵方法，本方法可用于靈芝漆酶的工業(yè)化 生產(chǎn)。本發(fā)明的目的可以通過如下技術(shù)方案來實現(xiàn)一種提高靈芝漆酶產(chǎn)量的發(fā)酵方 法，包括以下步驟
(1)真菌誘導(dǎo)子的制備
將真菌誘導(dǎo)子菌種接種于PD液體培養(yǎng)基(用于絲狀真菌的培養(yǎng)和保藏。去皮馬鈴薯 200g,葡萄糖20g，馬鈴薯切塊后煮沸20-30分鐘，過濾收集上清溶液，加入葡萄糖，加水補充體積到1L，121°C滅菌20分鐘)，在25 30°C條件下、10(Tl80 r/min搖床中培養(yǎng)5 7天后， 過濾得到菌絲體，采用酸解法制備真菌誘導(dǎo)子，具體方法如下取菌體40g (濕重)，用0. 1 mol/L乙酸鈉(pH5. 6)懸浮菌體，轉(zhuǎn)至組織勻漿器中勻漿lOmin，再加入120mL乙酸乙酯攪拌 均勻后靜置24h?；旌衔锝?jīng)減壓抽慮后，菌體加入IOOmL去離子水，用鹽酸調(diào)pH值至2. 0， 然后121°C滅菌Ih后，再進行減壓抽慮，濾液用0. 5 mol/L的氫氧化鈉調(diào)pH至5. 8，得到真 菌誘導(dǎo)子。(2)靈芝種子液制備
將靈芝菌種接種到PD液體發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為搖床轉(zhuǎn)速10(Γ180 r/min，溫度25 30°C，時間5、天，得到靈芝種子液。(3)真菌誘導(dǎo)子對靈芝細胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)
將上述獲得的靈芝種子液轉(zhuǎn)入到新鮮PD液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，在靈芝細胞液 體發(fā)酵培養(yǎng)第廣5天，加入真菌誘導(dǎo)子，使真菌誘導(dǎo)子濃度達到4(Γ200 μ g/mL,然后繼續(xù)培 養(yǎng)5、天，過濾得發(fā)酵液。(4)制備漆酶
將所獲得的靈芝發(fā)酵液多次過濾，取上清液，即得漆酶粗酶液。所述的真菌誘導(dǎo)子菌種為枝頂孢屬真菌頂頭孢UcreMwi s trie turn),菌種編 號CGMCC No. 3. 2058 ；或木霉屬真菌木素木霉(viride),菌種編號為CGMCC No. 3. 2196 ；或木霉屬真菌木素木霉(Trichoderma viride)，菌種編號為CGMCC No. 3. 4423，購自中國微生物菌種保藏管理委員會，普通微生物中心。所述的發(fā)酵用靈芝菌種可選用泰山赤靈芝A/ciifo )，菌種編號為 CGMCC No. 5. 644 ；或京大靈芝(fe/ oi/e’/7 a Λ/cii/腫)菌種編號為 CGMCC No. 5. 533 ；或信 州靈芝Λ/cii/腫)菌種編號為CGMCC No. 5.534。靈芝菌種均購自中國微生物 菌種保藏管理委員會，普通微生物中心。靈芝細胞生長階段包括細胞生長延遲期、對數(shù)生長期、平穩(wěn)期和衰亡期，所述的真 菌誘導(dǎo)子對靈芝誘導(dǎo)培養(yǎng)步驟中，在對數(shù)生長后期加入真菌誘導(dǎo)子。所述的步驟(3)中真菌誘導(dǎo)子于靈芝發(fā)酵培養(yǎng)的第1天加入，然后繼續(xù)培養(yǎng)。所述的步驟(3)中真菌誘導(dǎo)子于靈芝發(fā)酵培養(yǎng)的第3天加入，然后繼續(xù)培養(yǎng)。所述的步驟(3)中真菌誘導(dǎo)子于靈芝發(fā)酵培養(yǎng)的第5天加入，然后繼續(xù)培養(yǎng)。本發(fā)明同已有技術(shù)相比有如下積極效果
1.本發(fā)明將真菌誘導(dǎo)子用于靈芝漆酶的液體發(fā)酵生產(chǎn)，大幅度提高靈芝漆酶產(chǎn)量，使 產(chǎn)量達到1068. 4 U/L，具有很好的工業(yè)化應(yīng)用前景。2.本發(fā)明所述真菌誘導(dǎo)子菌株來源廣泛，大多食用菌病原真菌制備的誘導(dǎo)子，均 具有很好的誘導(dǎo)效果，誘導(dǎo)子制備方法簡便，重復(fù)性好。3.本發(fā)明所采用的靈芝液體發(fā)酵工藝簡單，環(huán)保無毒，原材料成本低廉，更為重要 的是整個發(fā)酵過程可控，不受外部環(huán)境條件限制，非常適合工業(yè)化生產(chǎn)。
具體實施例方式
下面對本發(fā)明的具體實施方式
作詳細說明 實施例1 菌種真菌誘導(dǎo)子菌種為枝頂孢屬真菌頂頭孢siricto )，由中國微生物 菌種保藏管理委員會，普通微生物中心購買，菌種編號為CGMCC No. 3.2058。靈芝菌種為泰山赤靈芝A/ciifo )，由中國微生物菌種保藏管理委員 會，普通微生物中心購買，菌種編號為CGMCC No. 5. 644。一種提高靈芝漆酶產(chǎn)量的發(fā)酵方法，具體步驟為 (1)真菌誘導(dǎo)子的制備
將真菌誘導(dǎo)子菌種接種于PD液體培養(yǎng)基(用于絲狀真菌的培養(yǎng)和保藏。去皮馬鈴薯 200g,葡萄糖20g，馬鈴薯切塊后煮沸20-30分鐘，過濾收集上清溶液，加入葡萄糖，加水補 充體積到1L，121°C滅菌20分鐘)中，接種量為5%，于25°C、100r/min搖床中培養(yǎng)7天后，過 濾得到菌絲體，采用酸解法制備真菌誘導(dǎo)子，具體方法如下取菌體40g(濕重)，用0. 1 mol/ L乙酸鈉(pH5. 6)懸浮菌體，轉(zhuǎn)至組織勻漿器中勻漿lOmin，再加入120mL乙酸乙酯攪拌均 勻后靜置24h?；旌衔锝?jīng)減壓抽慮后，菌體加入IOOmL去離子水，用鹽酸調(diào)pH值至2. 0，然 后121°C滅菌Ih后，再進行減壓抽慮，濾液用0. 5 mol/L的氫氧化鈉調(diào)pH至5. 8，得到真菌 誘導(dǎo)子。(2)靈芝種子液制備
將所獲得的靈芝發(fā)酵液多次過濾，取上清液，即得漆酶粗酶液。將靈芝菌種接種于PD 液體發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng)，接種量為2%，搖床轉(zhuǎn)速100 r/min，溫度25°C，時間8天。(3)真菌誘導(dǎo)子對靈芝細胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)
將上述獲得的靈芝種子液轉(zhuǎn)入到新鮮PD液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，在靈芝細胞液 體發(fā)酵培養(yǎng)第1天，加入真菌誘導(dǎo)子，使真菌誘導(dǎo)子濃度達到40 μ g/mL，然后繼續(xù)培養(yǎng)7天， 過濾得發(fā)酵液。(4)靈芝漆酶的提取和檢測
將發(fā)酵液經(jīng)多層紗布過濾，4000 r/min離心15 min，取上清液，即得漆酶粗酶液，漆酶 活力測定采用愈創(chuàng)木酚法進行，具體方法如下制備反應(yīng)混合液(含50 mmol/L琥珀酸鈉緩 沖液(pH 4. 5)，4 mmol/L愈創(chuàng)木酚和0. 5 mL粗酶液)，然后30°C反應(yīng)30 min后，用紫外可 見分光光度計于465 nm處測定吸光值，以酶液事先滅活后的反應(yīng)混合液(含50 mmol/L琥 珀酸鈉緩沖液(pH 4. 5)，4 mmol/L愈創(chuàng)木酚和0. 5 mL粗酶液)為對照。酶活力單位定義 每分鐘使0D465值改變0. 01為一個酶活單位(U/mL)。測得漆酶產(chǎn)量為783. 4 U/L (如表1 所示)。表1.不同處理條件下靈芝漆酶產(chǎn)量
處理接種量誘導(dǎo)子濃度(μ g/mL)酶活(U/L)實驗組2%40783. 42對照組2%0363. 42
實施例2 菌種同實施例1。一種提高靈芝漆酶產(chǎn)量的發(fā)酵方法，具體步驟為 (1)真菌誘導(dǎo)子的制備
將真菌誘導(dǎo)子菌種接種于PD液體培養(yǎng)基中，接種量為5%，于25°C、150r/min搖床中培 養(yǎng)7天后，過濾得到菌絲體，采用酸解法(同實施例1)制備真菌誘導(dǎo)子。(2)靈芝種子液制備
5將所獲得的靈芝發(fā)酵液多次過濾，取上清液，即得漆酶粗酶液。將靈芝菌種接種于PD 液體發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng)，接種量為3%，搖床轉(zhuǎn)速150 r/min，溫度25°C，時間8天。(3)真菌誘導(dǎo)子對靈芝細胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)
將上述獲得的靈芝種子液轉(zhuǎn)入到新鮮PD液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，在靈芝細胞液 體發(fā)酵培養(yǎng)第3天，加入真菌誘導(dǎo)子，使真菌誘導(dǎo)子濃度達到80 μ g/mL，然后繼續(xù)培養(yǎng)5天， 過濾得發(fā)酵液。(4)靈芝漆酶的提取和檢測
將發(fā)酵液經(jīng)多層紗布過濾，4000 r/min離心15 min，取上清液，即得漆酶粗酶液，漆酶 活力測定采用愈創(chuàng)木酚法進行(同實施例1)，測得漆酶產(chǎn)量為878. 2 U/L (如表2所示)。
表2.不同處理條件下靈芝漆酶產(chǎn)量
實施例3 菌種同實施例1。一種提高靈芝漆酶產(chǎn)量的發(fā)酵方法，具體步驟為 (1)真菌誘導(dǎo)子的制備
將真菌誘導(dǎo)子菌種接種于PD液體培養(yǎng)基中，接種量為5%，于25°c、150r/min搖床中培 養(yǎng)7天后，過濾得到菌絲體，采用酸解法(同實施例1)制備真菌誘導(dǎo)子。(2)靈芝種子液制備
將所獲得的靈芝發(fā)酵液多次過濾，取上清液，即得漆酶粗酶液。將靈芝菌種接種于PD 液體發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng)，接種量為5%，搖床轉(zhuǎn)速150 r/min，溫度25°C，時間8天。(3)真菌誘導(dǎo)子對靈芝細胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)
將上述獲得的靈芝種子液轉(zhuǎn)入到新鮮PD液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，在靈芝細胞液 體發(fā)酵培養(yǎng)第5天，加入真菌誘導(dǎo)子，使真菌誘導(dǎo)子濃度達到120 μ g/mL,然后繼續(xù)培養(yǎng)3 天，過濾得發(fā)酵液。(4)靈芝漆酶的提取和檢測
將發(fā)酵液經(jīng)多層紗布過濾，4000 r/min離心15 min，取上清液，即得漆酶粗酶液，漆酶 活力測定采用愈創(chuàng)木酚法(同實施例1)進行，測得漆酶產(chǎn)量為1068.4 U/L (如表3所示)。
表3.不同處理條件下靈芝漆酶產(chǎn)量
本發(fā)明真菌誘導(dǎo)子菌種還可采用其他同類菌種，靈芝菌種也可采用其他普通栽培品種。
權(quán)利要求
一種提高靈芝漆酶產(chǎn)量的發(fā)酵方法，其特征在于，包括以下步驟(1)真菌誘導(dǎo)子的制備將真菌誘導(dǎo)子菌株接種于PD液體培養(yǎng)基(馬鈴薯 葡萄糖培養(yǎng)基)，搖床振蕩培養(yǎng)5 8天，收集菌絲，采用酸解法制備真菌誘導(dǎo)子； (2)靈芝種子液制備將靈芝接種于PD液體培養(yǎng)基中，采用常規(guī)搖床振蕩培養(yǎng)方法進行暗培養(yǎng)，制備靈芝種子液；(3)真菌誘導(dǎo)子對靈芝細胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)將所獲得的靈芝種子液轉(zhuǎn)入到新鮮PD液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)，在細胞生長到一定時期向搖瓶中加入真菌誘導(dǎo)子繼續(xù)培養(yǎng)，過濾得到靈芝發(fā)酵液；(4)制備漆酶將所獲得的靈芝發(fā)酵液多次過濾，取上清液，即得漆酶粗酶液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種提高靈芝漆酶產(chǎn)量的發(fā)酵方法，其特征在于靈芝細胞生 長階段包括細胞生長延遲期、對數(shù)生長期、平穩(wěn)期和衰亡期，所述的真菌誘導(dǎo)子對靈芝誘導(dǎo) 培養(yǎng)步驟中，在對數(shù)生長后期加入真菌誘導(dǎo)子。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種提高靈芝漆酶產(chǎn)量的發(fā)酵方法，其特征在于所述的步驟 (3)中真菌誘導(dǎo)子于靈芝發(fā)酵培養(yǎng)的第1天加入，然后繼續(xù)培養(yǎng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種提高靈芝漆酶產(chǎn)量的發(fā)酵方法，其特征在于所述的步驟 (3)中真菌誘導(dǎo)子于靈芝發(fā)酵培養(yǎng)的第3天加入，然后繼續(xù)培養(yǎng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種提高靈芝漆酶產(chǎn)量的發(fā)酵方法，其特征在于所述的步驟 (3)中真菌誘導(dǎo)子于靈芝發(fā)酵培養(yǎng)的第5天加入，然后繼續(xù)培養(yǎng)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種提高靈芝漆酶產(chǎn)量的發(fā)酵方法，其特征在于所述的步驟 (3)中加入的真菌誘導(dǎo)子終濃度為20-160 yg/mL。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種提高靈芝漆酶產(chǎn)量的發(fā)酵方法，其特征在于所述的步驟 (3)中加入真菌誘導(dǎo)子后繼續(xù)培養(yǎng)5-8天，從發(fā)酵液中制備漆酶。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種提高靈芝漆酶產(chǎn)量的發(fā)酵方法，其特征在于所述的步驟(1)中真菌誘導(dǎo)子菌種為枝頂孢屬真菌頂頭孢Ucremoniums trie turn),或木霉屬真菌木素 木霉(Trichoderma viride )，或木霉屬真菌木素木霉(Trichoderma viride )。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種提高靈芝漆酶產(chǎn)量的發(fā)酵方法，其特征在于所述的步驟(2)中發(fā)酵用靈芝菌種為普通栽培品種lucidum).
全文摘要
本發(fā)明涉及了一種提高靈芝漆酶產(chǎn)量的發(fā)酵方法。該技術(shù)是利用靈芝細胞的液體培養(yǎng)，通過在細胞生長的適宜階段，加入真菌誘導(dǎo)子，誘導(dǎo)一定時間后，可顯著提高靈芝漆酶產(chǎn)量，真菌誘導(dǎo)子誘導(dǎo)5-8天后，可使靈芝漆酶酶活最高達到1068.4U/L，是對照組的2.2倍。本發(fā)明可以快速、大規(guī)模地利用靈芝發(fā)酵方法生產(chǎn)漆酶，所生產(chǎn)的漆酶可用于廢水處理、紙漿漂白、土壤凈化、染料脫色、免疫檢測等方面，本方法工藝簡單、成本低、效果顯著，靈芝漆酶產(chǎn)量高，是一種極具工業(yè)化前景的生產(chǎn)方法。
文檔編號C12N9/02GK101928699SQ20101015114
公開日2010年12月29日 申請日期2010年4月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月20日
發(fā)明者任海霞, 任鵬飛, 劉巖, 姚強, 宮志遠, 曲玲, 李瑾, 王宗秀, 高興喜 申請人:山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所