專利名稱：：一種醋糟發(fā)酵復(fù)合微生物菌劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于有機(jī)廢棄物農(nóng)用資源化的微生物技術(shù)處理領(lǐng)域，涉及一種能促進(jìn)醋糟發(fā)酵的復(fù)合微生物菌劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
：醋糟是食醋工廠淋醋后的下腳料，由于酸性強(qiáng)、含水量高且含有大量的粗纖維(稻殼)，長期以來沒有很好地開發(fā)利用，這些下腳料長年廢棄堆積，不僅嚴(yán)重污染環(huán)境，同時(shí)也制約了企業(yè)自身的發(fā)展。因此，如何對(duì)其進(jìn)行處理并加以利用是目前制醋行業(yè)面臨的一大難題，也是當(dāng)?shù)丨h(huán)保部門的工作重點(diǎn)之一。目前，除少量新鮮醋渣直接出售外，大部分醋渣經(jīng)干燥、粉碎制成醋渣粉干飼料。此法能耗大，產(chǎn)品中粗纖維含量高達(dá)36%，粗蛋白質(zhì)含量僅9%，其飼用價(jià)值低，利用效果較差。因此，目前研究的主要內(nèi)容之一是如何利用微生物發(fā)酵，提高醋渣的飼用價(jià)值。除此之外，越來越多的研究表明醋糟經(jīng)發(fā)酵后可被利用為食用菌和設(shè)施作物的育苗和栽培基質(zhì)，且效果較好。隨著設(shè)施園藝的迅速發(fā)展和固體栽培基質(zhì)(尤其是有機(jī)基質(zhì))需求量的大大增加，該用途已被認(rèn)為是解決醋糟資源化利用最具發(fā)展?jié)摿Φ闹匾绞健Ｒ陨喜还軐?duì)于醋糟作為飼料用途還是栽培基質(zhì)用途，均需要解決醋糟原料由于含水量高、酸性強(qiáng)而導(dǎo)致的發(fā)酵周期長的問題。目前已有針對(duì)醋糟原料適宜發(fā)酵微生物的篩選及其初步效果諸多報(bào)道，但目前大部分仍停留在實(shí)驗(yàn)室階段，且還必須對(duì)醋糟的PH和C/N比進(jìn)行預(yù)調(diào)節(jié)后才能使用。這不但加重了生產(chǎn)負(fù)擔(dān)還提高了投入，很大程度上限制了工業(yè)上發(fā)酵產(chǎn)品的生產(chǎn)效率。因此，針對(duì)這一問題，如何篩選出適合醋糟原料發(fā)酵的微生物成為醋糟進(jìn)一步資源化利用的關(guān)鍵。本發(fā)明即從這一基本點(diǎn)出發(fā)，進(jìn)行了醋糟原料適宜發(fā)酵微生物的篩選，并通過發(fā)酵對(duì)比試驗(yàn)，篩選出發(fā)酵效率高、同時(shí)又能增加其營養(yǎng)價(jià)值(包括提高全量養(yǎng)分N、P、K含量和有效成分含量等)的最優(yōu)組合菌群。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有新鮮醋糟原料發(fā)酵難、周期長的技術(shù)難點(diǎn)，并提供一種能加快發(fā)酵、同時(shí)又能增加發(fā)酵產(chǎn)物營養(yǎng)含量的發(fā)酵菌劑及其制備方法。一種醋糟發(fā)酵復(fù)合微生物菌劑，由酸熱芽孢桿菌(Bacillusacidocaldarius.)、黑根霉菌(Rhizopusstolonifer)和綠色木霉菌(Trichodermaviride)單菌種菌劑按重量比111復(fù)合配比而成，其中所述的單菌種菌劑首先分別將三種菌的原種通過一級(jí)試管擴(kuò)繁、二級(jí)液體分別培養(yǎng)制成種菌；然后按米糠5060%麩皮5040%的重量百分比把米糠和麩皮混合攪拌均勻成混合物料，按菌種與混合物料110(體積質(zhì)量比)分別接種培養(yǎng)好的種菌，制成單種菌菌劑?！N醋糟發(fā)酵復(fù)合微生物菌劑的制備方法，其步驟為1))將上述三種菌的原種分別通過一級(jí)試管擴(kuò)繁、二級(jí)液體(PDA培養(yǎng)基)搖床培養(yǎng)48h后制成種菌；2)按下述重量百分比把米糠和麩皮混合攪拌均勻成混合物料，米糠5060%、麩皮5040%；3)將上述培養(yǎng)好的三種種菌分別按110(體積質(zhì)量比)接種米糠和麩皮的混合物料上，制成單種菌菌劑；4)再將各單種菌菌劑按重量比111混合，包裝。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)1)本方法提供的復(fù)合微生物菌劑較其它現(xiàn)有微生物菌劑能提高醋糟堆肥的發(fā)酵溫度，加速發(fā)酵進(jìn)程，縮短發(fā)酵周期；2)本方法提供的菌劑耐酸性強(qiáng)，可適合pH小于5的發(fā)酵原料；3)使用本方法提供的復(fù)合微生物菌劑時(shí)不用調(diào)節(jié)醋糟原料的pH和C/N比，可縮短生產(chǎn)工藝流程，節(jié)省人力物力，提高生產(chǎn)效率；4)使用本方法提供的復(fù)合微生物菌劑發(fā)酵醋糟，其發(fā)酵成品全量養(yǎng)分(氮、磷、鉀)含量高，營養(yǎng)好。具體實(shí)施例方式1.醋糟發(fā)酵單菌株的篩選為了確保篩選出真正適合醋糟原料的微生物，本研究的采用從新鮮醋糟本身和已自然發(fā)酵的醋糟原料中進(jìn)行初步篩選。分別采集新鮮醋糟和已發(fā)酵醋糟，按濃度稀釋法劃線接種在TSA培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基于28°C進(jìn)行培養(yǎng)，通過進(jìn)行多次分離，初步獲得13個(gè)典型單菌落；通過固體初篩培養(yǎng)基(CMC平板培養(yǎng)基)和液體發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)下CMC纖維素酶活力(均為常用方法)的測定，根據(jù)分離菌株分解CMC纖維素能力的強(qiáng)弱，對(duì)已分離菌株進(jìn)行進(jìn)一步的篩選，經(jīng)多次傳代(68代)培養(yǎng)，對(duì)已分離菌株進(jìn)行進(jìn)一步的篩選，最終篩選出分解纖維素能力比較強(qiáng)的3株菌株，分別編號(hào)為0P-2、FMUSL02。經(jīng)參考《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》和《真菌鑒定手冊》進(jìn)行鑒定，0P-2為酸熱芽孢桿菌(BacillusacidocaldariusDarland&Brock1971，9·)，F(xiàn)Ml為漂根霉(Rhizopusstolonifer)，SL02為綠木霉(TrichodermaviridePers.exFr.)本實(shí)驗(yàn)所用到的培養(yǎng)基馬鈴薯培養(yǎng)基(簡稱PDA)和牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(簡稱TSA)均為常用配方。固體初篩培養(yǎng)基(CMC平板培養(yǎng)基)配方為CMC_Na15g,MgS04.7H200.5g,NH4N031.0g，KH2P041.0g，瓊脂20g，H20IOOOmL0121°C滅菌25min，過夜備用。液體發(fā)酵培養(yǎng)基=KH2PO41.0g,MgSO4·7H200.6g，NaCl0.lg，NaNO32.5g，CaCl2O.05g,FeCl30.Olg,醋糟(干燥后)20g,去離子水IOOOmL,pH自然，121°C滅菌25min。2.單個(gè)菌種的培養(yǎng)與制備1)斜面培養(yǎng)3種菌分別接斜面，按常規(guī)工藝進(jìn)行培養(yǎng)；2)菌種的培養(yǎng)3種菌的培養(yǎng)均使用常規(guī)的PDA培養(yǎng)基(pH自然)，將配制好的培養(yǎng)基高壓滅菌后，分別接種3種菌，放入28°C搖床培養(yǎng)箱120轉(zhuǎn)/分，振蕩培養(yǎng)48h；3)菌劑的制備將上述培養(yǎng)好的種菌分別按110(體積質(zhì)量)比附著于米糠-麩皮(米糠5060%、麩皮5040%)混合載體上，制成單菌種的菌劑。3.不同單菌種菌劑進(jìn)行組合，進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)對(duì)比，遴選最佳菌劑組合將以上篩選出的3個(gè)菌種進(jìn)行完全方案的組合設(shè)計(jì)，試驗(yàn)共計(jì)7個(gè)處理(編號(hào)為17)，其中編號(hào)13為添加單個(gè)菌種的菌劑處理，編號(hào)47為添加兩種或三種菌的復(fù)合菌劑處理(各處理所接菌劑組合具體見表1)，按照接種總量相等的原則和各菌劑11的比例進(jìn)行接種，總接種比例為0.5%(重量比)。各處理(17)所用新鮮醋糟均為5噸，將菌劑與新鮮醋糟混合均勻后進(jìn)行條垛式堆制發(fā)酵，不調(diào)節(jié)PH和碳氮比(C/N)。以所用的常規(guī)發(fā)酵菌劑(EM菌劑即EffectiveMicroorganisms菌劑，商品名為有機(jī)肥料發(fā)酵微生物_堆肥接種劑，購自佛山市碧沃豐生物科技有限公司)為對(duì)照處理(簡稱常規(guī)，表1)，先通過添加輔助物石灰、雞糞調(diào)節(jié)醋糟的PH(6.0左右)和C/N(251左右)，再進(jìn)行常規(guī)菌劑的接種，接種量為0.5%，所用新鮮醋糟均為5噸，混勻后即進(jìn)行發(fā)酵。發(fā)酵過程中，每天10:00左右以用溫度計(jì)測量堆溫(堆肥表面從上至下約IOcm處)，堆肥前期4天翻堆一次，后期7天翻堆一次。每次翻堆混勻物料后四分法取樣。通過對(duì)比不同處理下發(fā)酵溫度以及全量養(yǎng)分(N、P、K)含量等指標(biāo)的變化，以綜合評(píng)價(jià)不同處理的發(fā)酵效果。表1單菌種與多菌種的固態(tài)發(fā)酵試驗(yàn)對(duì)比效果<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>注‘‘+”號(hào)表示添加相應(yīng)的菌種。結(jié)果表明以同時(shí)添加3種菌的復(fù)合菌處理7具有更好的發(fā)酵效果，溫度升高快(較常規(guī)處理提前7天升到70°C)，且高溫維持時(shí)間長的優(yōu)勢，且發(fā)酵成品養(yǎng)分含量高，全氮、全磷、全鉀含量(總量)可達(dá)到4.1%，較常規(guī)處理增加24%。4.發(fā)酵復(fù)合菌劑的培養(yǎng)與制備方法根據(jù)篩選結(jié)果，發(fā)酵效果最好的菌劑為一種復(fù)合菌劑，包括3種菌，酸熱芽孢桿菌、黑根霉菌和綠木霉菌。該復(fù)合菌劑的制備包括以下步驟1)將酸熱芽孢桿菌、黑根霉和綠木霉三種菌的原種分別通過一級(jí)試管擴(kuò)繁、二級(jí)液體(PDA培養(yǎng)基)放入28°C搖床培養(yǎng)箱(120轉(zhuǎn)/分)培養(yǎng)48h后制成種菌；2)按下述重量百分比把米糠和麩皮混合攪拌均勻成混合物料，米糠5060%、麩皮5040%；3)單種菌菌劑的制備將培養(yǎng)好的種菌分別按110(體積質(zhì)量比)接種米糠和麩皮的混合載體上，制成單種菌菌劑。4)將分別接有以上3種菌的單種菌菌劑按重量比111混合，即為醋糟發(fā)酵的復(fù)合菌劑。實(shí)施一首先將酸熱芽孢桿菌、黑根霉和綠木霉三種菌的原種接斜面，按常規(guī)工藝培養(yǎng)進(jìn)行擴(kuò)繁；然后進(jìn)行二級(jí)液體(PDA培養(yǎng)基，pH自然)培養(yǎng)，28°C搖床培養(yǎng)箱120轉(zhuǎn)/分下振蕩培養(yǎng)48h制成種菌；再將上述培養(yǎng)好的種菌分別按110(體積質(zhì)量)比附著于米糠-麩皮(各占50%)混合載體上，制成單菌種的菌劑；將接有3個(gè)種菌的單種菌菌劑分別按重量比111混合，即為醋糟發(fā)酵的復(fù)合菌劑。將復(fù)合菌劑接于20噸新鮮醋糟進(jìn)行條垛式堆制發(fā)酵，接種比例為0.5%(重量比)，不調(diào)節(jié)pH和碳氮比(C/N)。試驗(yàn)以所用的常規(guī)EM菌劑為對(duì)照(簡稱常規(guī)處理)。常規(guī)處理先通過添加輔助物石灰、雞糞調(diào)節(jié)醋糟的PH(至6.0左右)和C/N(至251左右)，再進(jìn)行EM菌劑的接種，接種量為0.5%，所用新鮮醋糟為20噸。發(fā)酵時(shí)氣溫(上午10:00左右氣溫23.136.3°C)，發(fā)酵過程中，每天1000左右以用溫度計(jì)測量堆溫(堆肥表面從上至下約IOcm處)，堆肥前期4天翻堆一次，后期7天翻堆一次。發(fā)酵效果為發(fā)酵開始5天后，接該發(fā)明菌劑處理發(fā)酵溫度可達(dá)到70.8°C，而常規(guī)處理10天后溫度升到70°C，接該發(fā)明菌劑處理較常規(guī)處理提前5天；接該發(fā)明菌劑處理發(fā)酵周期(從開始到結(jié)束發(fā)酵)為39天，常規(guī)處理為45天，接該發(fā)明菌劑處理較常規(guī)處理發(fā)酵周期縮短6天；接該發(fā)明菌劑處理發(fā)酵成品養(yǎng)分含量高，全氮、全磷和全鉀含量分別為3.2%、0.61%和0.29%，常規(guī)處理則分別為2.7%、0.41%和0.17%，接該發(fā)明菌劑處理較常規(guī)處理全氮、全磷和全鉀含量分別提高18.5%、48.8%和70.6%，總?cè)筐B(yǎng)分(氮、磷、鉀)含量提高25%。實(shí)施二首先將將酸熱芽孢桿菌、黑根霉和綠木霉三種菌的原種接斜面，按常規(guī)工藝培養(yǎng)進(jìn)行擴(kuò)繁；然后進(jìn)行二級(jí)液體(PDA培養(yǎng)基，pH自然)培養(yǎng)，28°C搖床培養(yǎng)箱120轉(zhuǎn)/分下振蕩培養(yǎng)48h制成種菌；再將上述培養(yǎng)好的種菌分別按110(體積質(zhì)量)比附著于米糠_麩皮(米糠60%、麩皮40%)混合載體上，制成單菌種的菌劑；將接有3個(gè)種菌的單種菌菌劑分別按重量比111混合，即為醋糟發(fā)酵的復(fù)合菌劑。將復(fù)合菌劑接于20噸新鮮醋糟進(jìn)行條垛式堆制發(fā)酵，接種比例為0.7%(重量比)，不調(diào)節(jié)pH和碳氮比(C/N)。試驗(yàn)以所用的常規(guī)EM菌劑為對(duì)照(簡稱常規(guī)處理)。常規(guī)處理先通過添加輔助物石灰、雞糞調(diào)節(jié)醋糟的PH(至6.0左右)和C/N(至251左右)，再進(jìn)行EM菌劑的接種，接種量為0.7%，所用新鮮醋糟也為20噸。發(fā)酵時(shí)氣溫(上午10:00左右氣溫23.136.3°C)，發(fā)酵過程中，每天1000左右以用溫度計(jì)測量堆溫(堆肥表面從上至下約IOcm處)，堆肥前期4天翻堆一次，后期7天翻堆一次。發(fā)酵效果為發(fā)酵開始4天后，接該發(fā)明菌劑處理發(fā)酵溫度可達(dá)到71.2°C，常規(guī)處理11天后溫度升到70°c以上，接該發(fā)明菌劑處理較常規(guī)處理提前7天；接該發(fā)明菌劑處理發(fā)酵周期(從開始到結(jié)束發(fā)酵)為38天，常規(guī)處理為46天，接該發(fā)明菌劑處理較常規(guī)處理發(fā)酵周期縮短8天；接該發(fā)明菌劑處理發(fā)酵成品全氮、全磷和全鉀含量分別為3.4%,0.62%和0.29%，較常規(guī)處理則分別提高25.9%、51.2%和70.5%，總?cè)筐B(yǎng)分含量提高約30%。從以上2個(gè)實(shí)施舉例及其結(jié)果可以看出，該發(fā)明菌劑更適合新鮮醋糟(pH為4.5左右)的發(fā)酵，不但可以較常規(guī)菌劑加快發(fā)酵進(jìn)程，縮短發(fā)酵周期，發(fā)酵時(shí)不需要調(diào)節(jié)醋糟原料的PH和C/N，工藝簡單，節(jié)省人力物力，提高生產(chǎn)效率，并且發(fā)酵產(chǎn)品全量養(yǎng)分(氮、磷和鉀)含量。權(quán)利要求一種醋糟發(fā)酵復(fù)合微生物菌劑，其特征在于由酸熱芽孢桿菌(Bacillusacidocaldarius.)、黑根霉菌(Rhizopusstolonifer)和綠色木霉菌(Trichodermaviride)單菌種菌劑按重量比1∶1∶1復(fù)合配比而成，其中所述的單菌種菌劑首先分別將三種菌的原種通過一級(jí)試管擴(kuò)繁、二級(jí)液體分別培養(yǎng)制成種菌；然后按米糠50～60％∶麩皮50～40％的重量百分比把米糠和麩皮混合攪拌均勻成混合物料，按菌種與混合物料體積與質(zhì)量比1∶10的比例分別接種培養(yǎng)好的種菌，制成單種菌菌劑。2.一種醋糟發(fā)酵復(fù)合微生物菌劑的制備方法，其特征在于其步驟為1))將上述酸熱芽孢桿菌(Bacillusacidocaldarius.)、黑根霉菌(Rhizopusstolonifer)和綠色木霉菌(Trichodermaviride)三種菌的原種分別通過一級(jí)試管擴(kuò)繁、二級(jí)液體(PDA培養(yǎng)基)搖床培養(yǎng)48h后制成種菌；2)按下述重量百分比把米糠和麩皮混合攪拌均勻成混合物料，米糠5060%、麩皮5040%；3)將上述培養(yǎng)好的三種種菌分別按體積與質(zhì)量110的比例接種米糠和麩皮的混合物料上，制成單種菌菌劑；4)再將各單種菌菌劑按重量比111混合，包裝。全文摘要本發(fā)明公開了一種醋糟發(fā)酵復(fù)合微生物菌劑的制備方法，由酸熱芽孢桿菌(Bacillusacidocaldarius.)、黑根霉菌(Rhizopusstolonifer)和綠色木霉菌(Trichodermaviride)單菌種菌劑按重量比1∶1∶1復(fù)合配比而成，其中所述的單菌種菌劑首先分別將三種菌的原種通過一級(jí)試管擴(kuò)繁、二級(jí)液體分別培養(yǎng)制成種菌；然后按米糠50～60％∶麩皮50～40％的重量百分比把米糠和麩皮混合攪拌均勻成混合物料，按菌種與混合物料體積與質(zhì)量比1∶10的比例分別接種培養(yǎng)好的種菌，制成單種菌菌劑。本方法提供的復(fù)合微生物菌劑較其它現(xiàn)有微生物菌劑能提高醋糟堆肥的發(fā)酵溫度，加速發(fā)酵進(jìn)程，其發(fā)酵成品全量養(yǎng)分(氮、磷、鉀)含量高，營養(yǎng)好。文檔編號(hào)C12R1/885GK101805697SQ201010137319公開日2010年8月18日申請(qǐng)日期2010年4月1日優(yōu)先權(quán)日2010年4月1日發(fā)明者吳沿友,孫德民,朱詠莉,李萍萍,楊運(yùn)克申請(qǐng)人:江蘇大學(xué)