專利名稱：一種活性黑5染料高效脫色菌的提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬微生物細(xì)菌的分離純化領(lǐng)域，特別是涉及一種活性黑5染料高效脫色菌的提取方法。
背景技術(shù)：
全球每年染料生產(chǎn)量已超過7X105t，其中偶氮染料，含有一個(gè)或多個(gè)偶氮鍵(-N =N-)，占大約60% 70%。偶氮染料由于其廣泛的色光、牢度高、應(yīng)用方便、色澤鮮艷和能 耗低而廣泛的用作著色劑。然而高達(dá)50%的染料在染色工藝中流失掉。這些有色廢水不僅 產(chǎn)生視覺不悅而且其降解所產(chǎn)生的芳香胺具有潛在的誘變性和致癌性。染料廢水的去處方法有物理法、化學(xué)法和生物法。雖然物理法和化學(xué)法如混凝法、 沉淀法、吸附法和臭氧氧化法用于含染料廢水的處理，但是具有其費(fèi)用高、產(chǎn)生有害副產(chǎn)物 和能耗高等固有的缺點(diǎn)。因此，生物處理由于其耗能少、費(fèi)用低、效率高、不易產(chǎn)生二次污染 的優(yōu)點(diǎn)，使其在含染料廢水處理中的應(yīng)用得到了廣泛關(guān)注。然而，眾所周知在一定條件下微 生物可以降解甚至完全礦化許多活性染料。脫色過程產(chǎn)生的中間代謝產(chǎn)物如芳香胺能被微 生物產(chǎn)生的羥化酶和氧化酶降解?；钚匀玖铣３Ｊ窃趨捬鯒l件下通過生物催化脫色的，芳 香胺等中間產(chǎn)物在好氧或厭氧條件下通過多步生物轉(zhuǎn)化而被進(jìn)一步降解。雖然微生物降解染料的工作已有很多報(bào)道，但是微生物既能降解蒽醌染料又能降 解偶氮的報(bào)道還很少。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種活性黑5染料高效脫色菌的提取方法，該 方法從AAO工藝厭氧池的活性污泥中提取使染料活性黑5脫色菌株，種源易得且分離純化 方法簡便快捷，成本低，對(duì)環(huán)境友好；提取到的菌株對(duì)染料活性黑5 二十五小時(shí)的脫色率可 達(dá)90. 48 %，具有良好的應(yīng)用前景。本發(fā)明的一種使染料活性黑5染料高效脫色的菌株提取方法，包括(1)定向馴化培養(yǎng)取活性污泥(ΑΑ0厭氧池)按5%的接入量接種于無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，以梯度壓力式 馴化法馴化2個(gè)月；(2)菌株的厭氧富集將馴化的樣品按5%的接入量接種于富集培養(yǎng)液，于30°C下進(jìn)行厭氧培養(yǎng)，每5天 更換一次培養(yǎng)液，即取出IOml原培養(yǎng)液加入IOOml新鮮富集培養(yǎng)液中，此后每第二次更換 培養(yǎng)液時(shí)，富集培養(yǎng)液中染料的濃度要逐漸增大，染料濃度分別為0. 01,0. 03和0. 05g/L ；(3)菌株的分離和純化將上述染料濃度為0. 05g/L培養(yǎng)5天的培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋(稀釋濃度為10_6)，再于 固體培養(yǎng)基上進(jìn)行分離純化，確保長出純的單一菌株，加50wt%甘油儲(chǔ)存于4°C冰箱中，備用。
所述步驟(1)中的無機(jī)鹽培養(yǎng)基為KH2PO4L 8g/L，Na2HP04 · 12H20 3. 5g/L， MgSO4 ·7Η20 0. 2g/L, FeCl3 ·6Η20 0. Olg/L,葡萄糖 5. Og/L,蒸餾水 IOOOmL, pH = 6· 8 7· O。所述步驟(1)中的梯度壓力式馴化法為在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，分別依次加入活性黑5染料，使其濃度為10、30和50mg/L，改變濃度的間隔時(shí)間為10d，于30 35°C，靜置條件 下進(jìn)行馴化培養(yǎng)。所述步驟(2)中的富集培養(yǎng)液為牛肉膏3.0g/L，蛋白胨2.0g/L，蒸餾水IOOOmL, pH = 7. 0 7. 2。所述步驟(3)中的分離純化是指將稀釋后的菌液在固體培養(yǎng)基上劃線，將培養(yǎng)皿 倒置于30°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，，在電子顯微鏡下觀察菌落形態(tài)，反復(fù)2 4次，確保長出純 的單一菌株。所述的固體培養(yǎng)基為在富集培養(yǎng)液中加入18g/L的瓊脂粉，活性黑5染料，加熱融 化，冷卻后而形成的培養(yǎng)基，且固體培養(yǎng)基中的染料濃度與接入的培養(yǎng)液中染料濃度相同。所述的活性黑5染料高效脫色菌經(jīng)16S rDNA序列測定，基因序列如下CAGAGAGCTTGCTCTCGGGTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTTGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAACGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGTGTTGTGGTTAATAACCGCAGCAATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTCGAAACTGGCAGGCTAGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGACTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCAGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTCTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGGTTAGGCCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGAIAAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGCATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAGAATGCTACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACC菌株16S rDNA的基因全序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中分析比較，鑒定為腸桿菌，其鑒定結(jié)果見圖2，系統(tǒng)進(jìn)化樹見圖3，同源性達(dá)到100%，命名為Enterobacter sp. GY-I ；所述的腸桿菌Enterobacter sp. GY-1革蘭氏染色為陰性，無芽孢，無莢膜，專性厭氧，營養(yǎng)要求不高，產(chǎn)生水溶性色素，其電鏡掃描見圖4 ；該菌為短桿菌，菌體長度為0. 2 0. 5um,菌落直徑大小為0. 5-2. 5mm,圓形，邊緣整齊，表面低凸面，有光澤，呈乳白色，半透 明；在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中的培養(yǎng)特征為乳白色懸濁；最適生長條件PH為9. O 10.0，溫度為 30 35 °C，靜置培養(yǎng)。該腸桿菌Enterobacter sp. GY-I質(zhì)粒檢測結(jié)果表明該菌不攜帶質(zhì)粒，因此脫色基 因編碼于染色體上，這一特性使得在利用質(zhì)粒進(jìn)行水平基因轉(zhuǎn)移的過程中，避免了質(zhì)粒的 不相容性，是構(gòu)建具備多種脫色能力的基因工程菌的良好材料，且對(duì)一般抗生素均無抗性， 且易于滅活，保證了使用的生態(tài)安全性。本發(fā)明的腸桿菌Enterobacteria sp. GY-I不僅可以利用使雙偶氮活性染料活性 黑5脫色，而且可使其它活性染料如活性紅180、分散染料如分散黃163、酸性染料如酸性黑 IOB和蒽醌染料如活性藍(lán)49等染料脫色；它對(duì)活性黑5的去除主要生物脫色而不是吸附作 用，從而對(duì)活性黑5達(dá)到很高的去除率(90%以上)，同時(shí)適量的外加碳源不但不會(huì)影響本 發(fā)明的菌株對(duì)活性黑5脫色作用，而且對(duì)其脫色具有促進(jìn)作用。在腸桿菌Enterobacteria sp. GY-I對(duì)活性黑5的脫色過程通過紫外分光光度計(jì) 測定，檢測結(jié)果見圖6，結(jié)果表明活性黑5經(jīng)該菌作用后，最大波長597nm處的特征吸收峰顯 著降低，25小時(shí)活性黑5的脫色率達(dá)90. 48%，該菌對(duì)活性黑5的脫色作用較為徹底。取本發(fā)明分離得到的活性黑5高效脫色菌的單一菌落于各自的富集培養(yǎng)基中，各 富集培養(yǎng)基中均含有50mg/L的活性黑5，在30°C、250mL錐形瓶中裝填量IOOmL的條件下進(jìn) 行培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為25h，培養(yǎng)后通過電子顯微鏡觀察細(xì)菌生長情況以及測定溶液中活性黑 5的剩余濃度。有益效果(1)本發(fā)明從實(shí)驗(yàn)室AAO厭氧池的活性污泥中提取活性黑5脫色菌株，種源易得且 分離純化方法簡便快捷，成本低，對(duì)環(huán)境友好；(2)提取的腸桿菌Enterobacter sp. GY-I可以有效地脫色活性黑5，25小時(shí)對(duì)活 性黑5的脫色率可達(dá)90%以上；該菌株是廢水處理系統(tǒng)中的優(yōu)勢菌株，因此該菌株能適應(yīng) 復(fù)雜的實(shí)際條件，這使得該菌的應(yīng)用前景廣闊；(3)提取的腸桿菌Enterobacter sp. GY-I不僅能有效的使活性染料脫色，而且對(duì) 蒽醌、偶氮等其它染料也具有較好的降解作用，對(duì)實(shí)際染料廢水的處理具有很好的應(yīng)用價(jià)值。


圖1為活性黑5的分子結(jié)構(gòu)式；圖 2 為 Enterobacter sp. GY-I 的掃描電鏡；圖 3 為 Enterobacter sp. GY-I 的系統(tǒng)進(jìn)化樹；圖4為缺氧和好氧條件下菌株對(duì)染料的脫色效果圖；圖5為菌株對(duì)其它染料脫色效果圖；圖6為活性黑5代謝中間產(chǎn)物的紫外可見光譜圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定 的范圍。實(shí)施例1(1)取自實(shí)驗(yàn)室AAO的活性污泥5ml接種于IOOmL無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，其中無機(jī)培養(yǎng) 基為 KH2PO4L 8g/L, Na2HPO4 · 12H20 3. 5g/L, MgSO4 · 7H20 0. 2g/L, FeCl3 · 6H20 0. 01g/L，葡 萄糖5. Og/L，蒸餾水1000mL，pH = 6. 8 7. 0。以梯度壓力式馴化法馴化，分別依次加入活 性黑5染料，使其濃度為10、30和50mg/L，改變濃度的間隔時(shí)間為10d，于30°C靜置條件下 馴化培養(yǎng)2個(gè)月；(2)吸取5ml污泥加入含有富集培養(yǎng)液IOOml的250ml的三角瓶中，在30°C的生 化培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)，每5天更換一次培養(yǎng)液，即取出IOml原培養(yǎng)液加入IOOml新鮮培養(yǎng) 液中，此后每第二次更換培養(yǎng)液時(shí)，富集培養(yǎng)液中染料的濃度要逐漸增大，染料濃度分別為 0. 01,0. 03和0. 05g/L ；其中富集培養(yǎng)液為牛肉膏3. Og/L，蛋白胨2. Og/L，蒸餾水IOOOmL, ρΗ = 7. 0 7. 2。(3)將上述染料濃度為0. 05g/L培養(yǎng)5天的培養(yǎng)液適當(dāng)稀釋(稀釋倍數(shù)10_6)，在 含有相同染料濃度的固體平板上多次分離劃線后，獲得純菌種，加50%甘油儲(chǔ)存于4°C冰 箱中待后續(xù)進(jìn)行脫色試驗(yàn)。其中，固體培養(yǎng)基為在富集培養(yǎng)液中加入18g/L的瓊脂粉，活性黑5染料，加熱融 化，冷卻后而形成的培養(yǎng)基，且固體培養(yǎng)基中的染料濃度與接入的培養(yǎng)液中染料濃度相同。實(shí)施例2(1)取ImL實(shí)施例1提取到的菌液加入到IOOmL的富集培養(yǎng)液(同上)中，30°C、 靜置培養(yǎng)12小時(shí)。在兩個(gè)含100mL(活性黑5濃度為50mg/L)富集培養(yǎng)液的250mL錐形瓶 中分別加入5mL的富集菌液，分別靜置于30°C的恒溫培養(yǎng)箱中和30°C、150r/min搖床中，培 養(yǎng)時(shí)間為35小時(shí)，培養(yǎng)后通過電子顯微鏡觀察細(xì)菌生長情況以及測定溶液中活性黑5的剩 余濃度，從而確定出對(duì)活性黑5具有高效脫色作用的菌株。(2)取ImL實(shí)施例1提取到的菌液加入到IOOmL的富集培養(yǎng)液(同上)中，30°C、 靜置培養(yǎng)12小時(shí)。在含100mL(活性黑5濃度為50mg/L)富集培養(yǎng)液的250mL錐形瓶中加 入5mL的富集菌液，靜置于30°C的恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)時(shí)間為25小時(shí)，培養(yǎng)后通過電子顯微 鏡觀察細(xì)菌生長情況以及測定溶液中活性黑5的剩余濃度，從而確定出對(duì)活性黑5具有高 效脫色作用的菌株。本發(fā)明所提供的一株活性黑5高效脫色菌，在初始ρΗ值為7. 0左右，溫度為30°C， 250mL錐形瓶的裝液量為IOOmL富集培養(yǎng)液的條件下，菌株接種量為8mL，活性黑5初始 濃度為50mg/L，培養(yǎng)時(shí)間25h，然后利用紫外分光光計(jì)進(jìn)行測定，活性黑5的脫色率高達(dá) 90. 48%。
權(quán)利要求
一種活性黑5染料高效脫色菌的提取方法，包括(1)定向馴化培養(yǎng)取厭氧-缺氧-好氧系統(tǒng)中厭氧池活性污泥按5％的接入量接種于無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，以梯度壓力式馴化法馴化2個(gè)月；(2)菌株的厭氧富集將馴化的樣品按5％的接入量接種于富集培養(yǎng)液，于30℃下進(jìn)行厭氧培養(yǎng)，每5天更換一次培養(yǎng)液，即取出10ml原培養(yǎng)液加入100ml新鮮富集培養(yǎng)液中，此后每第二次更換培養(yǎng)液時(shí)，富集培養(yǎng)液中染料的濃度要逐漸增大，染料濃度分別為0.01、0.03和0.05g/L；(3)菌株的分離和純化將上述染料濃度為0.05g/L培養(yǎng)5天的培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋，稀釋濃度為10-6，再于固體培養(yǎng)基上進(jìn)行分離純化，確保長出純的單一菌株，加50wt％甘油儲(chǔ)存于4℃冰箱中，備用。
2.根據(jù)權(quán)利要1所述的一種活性黑5染料高效脫色菌的提取方法，其特征在于所述 步驟(1)中的無機(jī)鹽培養(yǎng)基為 KH2PO4 1. 8g/L，Na2HPO4 · 12H20 3. 5g/L，MgSO4 · 7H20 0. 2g/ L, FeCl3 · 6H20 0. Olg/L,葡萄糖 5. Og/L,蒸餾水 IOOOmL, pH = 6. 8 7. 0。
3.根據(jù)權(quán)利要1所述的一種活性黑5染料高效脫色菌的提取方法，其特征在于所述 步驟(1)中的梯度壓力式馴化法為在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，分別依次加入活性黑5染料，使其濃 度為10、30和50mg/L，改變濃度的間隔時(shí)間為10d，于30 35°C，靜置條件下進(jìn)行馴化培 養(yǎng)。
4.根據(jù)權(quán)利要1所述的一種活性黑5染料高效脫色菌的提取方法，其特征在于所 述步驟(2)中的富集培養(yǎng)液為無機(jī)鹽培養(yǎng)基中牛肉膏3.(^/1，蛋白胨2.(^/1，調(diào)制？!1為 7. 0 7. 2。
5.根據(jù)權(quán)利要1所述的一種活性黑5染料高效脫色菌的提取方法，其特征在于所述 步驟(3)中的分離純化是指將稀釋后的菌液在固體培養(yǎng)基上劃線，將培養(yǎng)皿倒置于30°C培 養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，，在電子顯微鏡下觀察菌落形態(tài)，反復(fù)2 4次，確保長出純的單一菌株。
6.根據(jù)權(quán)利要1或5所述的一種活性黑5染料高效脫色菌的提取方法，其特征在于 所述的固體培養(yǎng)基為在富集培養(yǎng)液中加入18g/L的瓊脂粉，活性黑5染料，加熱融化，冷卻 后而形成的培養(yǎng)基，且固體培養(yǎng)基中的染料濃度與接入的培養(yǎng)液中染料濃度相同。
7.根據(jù)權(quán)利要1所述的一種活性黑5染料高效脫色菌的提取方法，其特征在于所述 的活性黑5高效脫色菌經(jīng)16S rDNA序列測定和分析比較，鑒定該菌株為變形假單胞菌，命 名為Enterobacter sp. GY，菌體長度為0. 2 0. 5um，菌落直徑大小為0. 5-2. 5mm,圓形，邊 緣整齊，表面低凸面，有光澤，呈乳白色，半透明，無芽孢，無莢膜，專性厭氧，營養(yǎng)要求不高， 產(chǎn)生水溶性色素，革蘭氏染色為陰性；最適生長條件PH為8 10，溫度為30 35°C，靜置。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種活性黑5染料高效脫色菌的提取方法，包括(1)取活性污泥接種于無機(jī)鹽培養(yǎng)基中進(jìn)行梯度壓力式馴化2個(gè)月；然后接入量接種于富集培養(yǎng)液，于30℃下進(jìn)行厭氧培養(yǎng)，同時(shí)增加培養(yǎng)液中的染料濃度；最后于固體培養(yǎng)基上進(jìn)行分離純化，確保長出純的單一菌株，加50wt％甘油儲(chǔ)存于4℃冰箱中，備用。該方法從AAO系統(tǒng)厭氧活性污泥中提取活性黑5脫色菌株，種源易得且分離純化方法簡便快捷，成本低，對(duì)環(huán)境友好；提取到的菌株對(duì)活性黑5的脫色率可達(dá)90.48％，具有良好的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12R1/01GK101845411SQ20101013258
公開日2010年9月29日 申請(qǐng)日期2010年3月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月25日
發(fā)明者劉鑫, 李俊生, 陳東輝, 陳亮, 陳剛, 陳曄, 韓曉芳, 黃滿紅 申請(qǐng)人:東華大學(xué)